ES2738632T3 - Complejos de hierro para la reducción de la colonización del tracto gastrointestinal por Campylobacter - Google Patents

Complejos de hierro para la reducción de la colonización del tracto gastrointestinal por Campylobacter Download PDF

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Abstract

Un compuesto para su uso en un método seleccionado de: un método para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal y, por lo tanto, desinfectar al animal; un método para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de animales con Campylobacter; o un método para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal, o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal y desinfectar de este modo al animal; en donde el compuesto para su uso está opcionalmente en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto, y en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: a) un complejo de tirosina con Fe III**Fórmula** b) quinato férrico; y c) un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III**Fórmula**

Description

DESCRIPCIÓN
Complejos de hierro para la reducción de la colonización del tracto gastrointestinal por Campylobacter
La presente invención se refiere a usos y métodos para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de un animal con Campylobacter. En particular, se refiere a la reducción o la prevención de la colonización del tracto gastrointestinal de aves de corral con Campylobacter.
Campylobacter es la causa bacteriana más común de gastroenteritis en el Reino Unido y en el mundo industrializado. Campylobacter jejuni (C. jejuni) es responsable de aproximadamente el 90 % de las infecciones por Campylobacter, estando la mayoría del resto causada por C. coli. Campylobacter forma parte de la flora gastrointestinal natural de muchas aves y animales domésticos, pero se cree que los pollos constituyen la mayor fuente de infección humana. Los pollos infectados son asintomáticos a pesar de albergar hasta 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de contenido intestinal. La carne, en particular la carne de pollo, a menudo se contamina con contenidos intestinales, incluyendo Campylobacter, durante el sacrificio. En los seres humanos, las especies de Campylobacter causan enfermedades que varían en gravedad, desde diarrea acuosa leve hasta disentería sanguinolenta. En un pequeño subgrupo de pacientes, la fase aguda de la enfermedad es seguida por secuelas graves, incluyendo síndrome de Guillain-Barré y artritis reactiva.
Por lo tanto, es de gran interés proporcionar métodos para reducir y prevenir el riesgo de contaminación de la carne con Campylobacter y, por lo tanto, el riesgo de infección humana con Campylobacter. También es de interés proporcionar nuevos tratamientos para la infección humana con Campylobacter (campilobacteriosis).
Por consiguiente, de acuerdo con la reivindicación 1, la presente invención proporciona un compuesto para su uso en un método para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal y desinfectar así al animal, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
a) un complejo de tirosina con Fe III
Figure imgf000002_0001
a) quinato férrico; y
b) un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III
Figure imgf000003_0001
Opcionalmente, el compuesto para su uso está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 2, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente, para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal no humano y, por lo tanto, desinfectar al animal, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se ha definido anteriormente, en una cantidad efectiva para dicho animal para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de dicho animal y luego sacrificar al animal. Opcionalmente, en uso, el compuesto está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 3, la presente invención también proporciona un método para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de dicho animal no humano y, por lo tanto, desinfectar el animal antes del sacrificio, comprendiendo el método: i) administrar al menos un compuesto como se ha definido anteriormente en una cantidad efectiva a dicho animal para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de dicho animal; y ii) sacrificar al animal. Opcionalmente, el compuesto para su uso tiene la forma de un alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
La presente invención, de acuerdo con la reivindicación 1, también proporciona un compuesto como se ha definido anteriormente para su uso en un método para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de animales con Campylobacter. Opcionalmente, el compuesto para su uso está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 2, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de animales no humanos con Campylobacter, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se ha definido anteriormente a dicho animal y, después, sacrificar al animal. Opcionalmente, en uso, el compuesto está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
La presente invención también proporciona, de acuerdo con la reivindicación 1, un compuesto como se ha definido anteriormente para su uso en un método para prevenir que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal, y desinfectar de este modo al animal. Opcionalmente, el compuesto para su uso está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 2, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente, para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal no humano, o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal y desinfectar de este modo al animal, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se ha definido anteriormente en una cantidad efectiva a dicho animal para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal y, a continuación, sacrificar al animal. Opcionalmente, en uso, el compuesto está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 4, la presente invención también proporciona un método para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal no humano o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal y desinfectar de este modo al animal, comprendiendo el método: i) administrar al menos un compuesto como se ha definido anteriormente en una cantidad efectiva a dicho animal para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal; y ii) sacrificar al animal. Opcionalmente, el compuesto para su uso en el método está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 5, la presente invención también proporciona un compuesto como se ha definido anteriormente para su uso en un método para prevenir o reducir la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal a otro; en el que el método comprende administrar el compuesto a dichos animales en una cantidad eficaz para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal. Opcionalmente, el compuesto para su uso está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 6, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente para la prevención o reducción de la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal no humano a otro; por un método que comprende la administración del compuesto a dichos animales en una cantidad eficaz para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal y, después, sacrificar a los animales. Opcionalmente, en uso, el compuesto está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
La presente invención también proporciona, de acuerdo con la reivindicación 7, un método para prevenir o reducir la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal no humano a otro antes del sacrificio, por ejemplo, prevenir o reducir la propagación de la infección por Campylobacter dentro de una manada o rebaño de animales, por ejemplo, prevenir la propagación de la infección por Campylobacter dentro de una bandada de pollos; comprendiendo dicho método administrar a dichos animales, por ejemplo dicho rebaño o bandada de animales, por ejemplo dicha bandada de pollos, al menos un compuesto como se ha definido anteriormente en una cantidad efectiva para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal; y sacrificar a los animales.
Los usos y métodos de la presente invención pueden permitir la desinfección, prevención de la formación de biopelícula y reducción de la transmisión de Campylobacter entre animales al prevenir o reducir la adherencia de Campylobacter al tracto gastrointestinal de dichos animales. Esto es ventajoso porque la menor cantidad de Campylobacter que se encuentra en el tracto gastrointestinal de un animal en el momento del sacrificio, cuanto menor sea el riesgo de contaminación de la carne del animal con Campylobacter. Cuanto menos Campylobacter haya en el tracto gastrointestinal de un animal, menor será la posibilidad de que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal del animal. Cuantos menos Campylobacter estén en el tracto gastrointestinal de un animal, menor será la probabilidad de que el Campylobacter se propague de un animal a otro, por ejemplo dentro de una manada o bandada de animales.
Los usos y métodos de la presente invención pueden utilizarse para reducir la cantidad de colonización del tracto gastrointestinal de cualquier animal con Campylobacter. Es particularmente ventajoso proporcionar los compuestos a animales que serán sacrificados para consumo humano, tales como, por ejemplo, ganado, ovejas, cerdos, cabras, ciervo, pescado, mariscos y aves de corral. Las aves de corral incluyen aves que se utilizan para el consumo humano, tales como pollos, gansos, pavos y patos. Es particularmente ventajoso usar los compuestos de la presente invención para reducir o prevenir la colonización del tracto gastrointestinal de aves de corral, en particular pollos, con Campylobacter porque los pollos son una fuente importante de infección humana con Campylobacter.
Campylobacter son bacterias gramnegativas en forma de bacilo en espiral con un solo flagelo en uno o ambos polos. Pertenecen a la clase de proteobacterias épsilon y están estrechamente relacionadas con Helicobacter y Wolinella. Aunque estas especies están relacionadas, tienen requisitos de cultivo muy diferentes y huéspedes diferentes. Las especies de Campylobacter por lo general viven en el intestino de los animales, en particular, de los pollos, mientras Helicobacter vive en el estómago de los seres humanos. Aunque exigentes en sus requisitos de cultivo, las especies de Campylobacter, particularmente C. jejuni y C. coli, son importantes patógenos humanos, que causan gastroenteritis de gravedad variable. En circunstancias normales, la gastroenteritis es autolimitante, pero las secuelas asociadas con la campilobacteriosis, como el síndrome de Guillain-Barré, son potencialmente mortales. Hay muchos reservorios diferentes para Campylobacter pero el más importante es la carne contaminada, particularmente aves de corral.
El número de Campylobacter en los tractos gastrointestinales de los animales puede reducirse por los usos y métodos de la presente invención. En una realización, el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de Campylobacter en el tracto gastrointestinal de un animal tratado con los compuestos de la presente invención puede reducirse en un 50 %, en un 60 %, en un 70%, en un 80 %, en un 90 % o en un 100 %. En una realización, Campylobacter puede erradicarse sustancialmente del tracto gastrointestinal de animales tratados mediante los usos o el método de la presente invención.
Basta con 10.000 UFC de Campylobacter para el éxito de la colonización de pollos. Bastan 1.000 UFC de Campylobacter para infectar a un ser humano y causar una enfermedad en un ser humano. Por lo tanto, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención es suficiente del compuesto para reducir el número de Campylobacter en el tracto gastrointestinal de un animal a un número que es poco probable que cause infección en seres humanos. El número de UFC de Campylobacter que sería ingerido por un ser humano si comiera carne de un animal infectado puede estar relacionado con el número de Campylobacter en el tracto gastrointestinal del animal en el momento del sacrificio, pero también depende de otros factores como la cantidad de contaminación de la carne con el contenido del tracto gastrointestinal del animal en el momento del sacrificio.
Una cantidad eficaz del compuesto de la presente invención es suficiente del compuesto para prevenir la colonización del tracto gastrointestinal del animal con Campylobacter.
En una realización, los compuestos de la presente invención pueden hacer que Campylobacter sea menos virulento y menos capaz de infectar a los seres humanos incluso si el número total de Campylobacter en el tracto gastrointestinal no disminuye. En esta realización, la administración de un compuesto de la presente invención a un animal puede afectar al metabolismo de Campylobacter y hacer que se adapten menos al medio ambiente, por lo que no pueden colonizar el tracto gastrointestinal y es menos probable que se transmitan a otros animales o a seres humanos.
Una cantidad eficaz de un compuesto proporcionado a un animal debe ser suficiente para proporcionar el grado requerido de reducción de la colonización por Campylobacter. Esto puede depender del tipo de compuesto y/o el tamaño del animal. En una realización, una cantidad eficaz del compuesto puede ser de 0,3 a 32 mg/día/kg de peso corporal del animal.
Los usos y métodos de la presente invención reducen, preferentemente, la colonización del tracto gastrointestinal con especies de Campylobacter, por ejemplo Campylobacter jejuni o Campylobacter coli.
Esto es ventajoso porque Campylobacter jejuni es la causa bacteriana más común comunicada de gastroenteritis en el Reino Unido y en el mundo industrializado. Campylobacter jejuni (C. jejuni) es responsable de aproximadamente el 90 % de las infecciones por Campylobacter, estando la mayoría del resto causada por C. coli. Campylobacter forma parte de la flora gastrointestinal natural de muchas aves y animales domésticos y, por lo tanto, existe un alto riesgo de contaminación de los cadáveres de estos animales cuando son sacrificados.
El compuesto usado en los usos y métodos de la presente invención es, preferentemente, un compuesto que bloquea la interacción de MOMP o FlaA en la superficie de Campylobacter con las células del tracto gastrointestinal. Preferentemente, el compuesto se une a MOMP o FlaA e inhibe competitivamente o no competitivamente la unión de MOMP o FlaA en Campylobacter con las células del tracto gastrointestinal. Preferentemente, el compuesto usado en la presente invención puede unirse a MOMP en la superficie de Campylobacter jejuni. Preferentemente, el compuesto usado en el método de la presente invención se une específicamente a al menos uno de los restos de aminoácidos Arg352, Lys278, Lys385, Asn258, Leu290, Tyr294, Phe395 Ile337, Arg381, Asp261 y Ser397 de MOMP. En otra realización, el compuesto de la presente invención reduce la interacción entre al menos uno de los restos de aminoácidos Arg352, Lys278, Lys385, Asn258, Leu290, Tyr294, Phe395 Ile337, Arg381, Asp261 y Ser397 de MOMP y el tracto gastrointestinal de un animal.
El compuesto usado en los usos y métodos de la presente invención puede ser quinato férrico.
Como alternativa, el compuesto utilizado en los usos y métodos de la presente invención puede tener una de las siguientes estructuras:
a) complejo de DOPA con Fe III (3,4 dihidroxifenilalanina)
Figure imgf000006_0001
o
b) complejo de tirosina con Fe III
Figure imgf000006_0002
El compuesto usado en los usos y el método de la presente invención se puede administrar por vía oral. Esto es ventajoso porque es fácil administrar compuestos por vía oral a los animales. La administración oral también es un método preferido para administrar un compuesto para asegurar que llegue al tracto gastrointestinal.
Preferentemente, el compuesto se puede administrar en un alimento o agua para beber de un animal.
En los usos y métodos de la presente invención, el compuesto puede administrarse al animal en cualquier momento durante su vida útil. En una realización, el compuesto se administra al animal al menos una vez al día durante un período de tiempo antes del sacrificio del animal. Por ejemplo, el compuesto se puede administrar al animal entre 1 y 10 días, preferentemente entre 1 y 8 días, entre 1 y 6 días, entre 1 y 4 días, antes del sacrificio o durante 2 o 1 días. En una realización, se puede administrar una dosis única del compuesto al animal entre 1 y 4 días antes del sacrificio. En una realización, el compuesto se puede administrar al animal todos los días durante 3 días, 4 días o 5 días antes del sacrificio. Los pollos a menudo son colonizados por Campylobacter entre 7 y 10 días antes del sacrificio. Por lo tanto, en una realización, el compuesto se puede administrar a un pollo menos de 10 días antes del sacrificio para desinfectar el pollo y reducir la colonización del tracto gastrointestinal del pollo antes del sacrificio. En otra realización, el compuesto de la presente invención se puede administrar a un animal antes de la colonización del tracto gastrointestinal del animal con Campylobacter para prevenir la colonización del tracto gastrointestinal del animal con Campylobacter. En una realización, el compuesto de la presente invención se administra a un pollo más de 10 días antes del sacrificio para evitar la transmisión de Campylobacter dentro de una bandada de pollos.
Es ventajoso administrar el compuesto al animal poco tiempo antes del sacrificio porque la cantidad de Campylobacter en el tracto gastrointestinal del animal se reduce en el momento del sacrificio, de modo que existe un menor riesgo de contaminación de la carcasa con Campylobacter.
En una realización de la presente invención, el compuesto se puede administrar a un animal en una dosis de 0,3-32 mg/día/kilo como una solución que tiene un intervalo de concentración de 34-340 ^M (0,02-0,2 g/l). Una concentración de 0,2 g/l tiene un efecto sobre la colonización durante los primeros tres días posteriores a la infección y también sobre la unión de Campylobacter a los antígenos del grupo sanguíneo que pueden reducirse en un 60 %. En otra realización, el compuesto se puede administrar a una concentración de 2 g/l, que puede prevenir la colonización por Campylobacter del tracto gastrointestinal del animal y/o reducir el número de Campylobacter en el tracto gastrointestinal del animal a sustancialmente cero.
La presente invención también proporciona, de acuerdo con la reivindicación 18, el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente para reducir la cantidad de Camplyobacter en la carne por un método que comprende las etapas de: proporcionar a un animal no humano, o a una bandada o rebaño de animales no humanos, un compuesto como se ha definido anteriormente; y preparar un producto cárnico del animal. Opcionalmente, en uso, el compuesto está en forma de alimento para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
De acuerdo con la reivindicación 19, la presente invención también proporciona un método para reducir la cantidad de Campylobacter en la carne que comprende las etapas de:
proporcionar a un animal no humano, o a una bandada o rebaño de animales no humanos, un compuesto como se ha definido anteriormente; y preparar un producto cárnico del animal. El animal puede ser cualquier tipo de animal, preferentemente un ave de corral, preferentemente un pollo.
Los compuestos como se han definido anteriormente que son útiles en los usos y métodos de la presente invención pueden incluirse en la alimentación animal, como ingrediente alimenticio o como suplemento alimenticio. La alimentación animal, el ingrediente o suplemento alimenticio puede ser adecuado para cualquier animal, en particular, los animales que serán sacrificados para el consumo humano, preferentemente aves de corral, más preferentemente pollos.
Los compuestos como se han definido anteriormente que son útiles en los usos y métodos de la presente invención pueden proporcionarse a un animal en forma líquida o sólida o como un polvo. Pueden incluirse como ingrediente en pienso o alimentos para animales o como ingrediente en alimentos o suplementos alimenticios. En una realización, los compuestos se proporcionan a pollos en el pienso para pollos o como ingrediente de pienso mezclado con pienso para pollos.
Un alimento puede ser un alimento destinado o adecuado para el consumo por parte de los animales. Un alimento o un producto alimenticio puede ser un alimento destinado o adecuado para el consumo humano.
Por consiguiente, la presente invención también proporciona, de acuerdo con la reivindicación 23, un pienso para animales, que comprende un compuesto como ingrediente alimenticio o como suplemento alimenticio, en el que el pienso para animales es un alimento destinado o adecuado para el consumo por parte de animales, y el compuesto es:
un complejo de tirosina con Fe III
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en el que el pienso para animales comprende el compuesto en una cantidad efectiva para reducir o prevenir la colonización del tracto gastrointestinal de un animal con Campylobacter.
La presente invención también proporciona, de acuerdo con la reivindicación 24, una composición oral, pienso para animales o agua potable para animales, que comprende un compuesto que es: un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III
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en el que la composición oral, en el pienso para animales, o el agua potable para animales, comprende el compuesto en una cantidad efectiva para reducir o prevenir la colonización del tracto gastrointestinal de un animal con Campylobacter.
De acuerdo con la reivindicación 27, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto, como se ha definido en la reivindicación 23 o 24, como suplemento alimenticio o ingrediente alimenticio, en la fabricación de un pienso para animales, o como aditivo en la fabricación de agua potable para animales, tal como se ha definido anteriormente.
De acuerdo con la reivindicación 28, la presente invención también proporciona un método para la fabricación de un pienso para animales o agua potable para animales como se ha definido anteriormente, en el que el método comprende el uso de un compuesto, como se ha definido en la reivindicación 23 o 24, como suplemento alimenticio o ingrediente alimentario en la fabricación del pienso para animales, o como aditivo en la fabricación de agua potable para animales.
La presente invención proporciona, de acuerdo con la reivindicación 29, un método para desinfectar un producto alimenticio o un alimento, que comprende administrar un compuesto como se ha definido anteriormente en una cantidad eficaz en el producto alimenticio para reducir la cantidad de Campylobacter en el producto alimenticio. Análogamente, de acuerdo con la reivindicación 30, la presente invención también proporciona el uso de un compuesto como se ha definido anteriormente para desinfectar un producto alimenticio, administrando una cantidad eficaz del compuesto al producto alimenticio para reducir la cantidad de Campylobacter en el producto alimenticio. Esto es ventajoso porque reduce el riesgo de infección con Campylobacter en los seres humanos que consumen el producto alimenticio.
Un producto alimenticio o un alimento puede ser para consumo humano, en particular el alimento puede ser un producto cárnico, por ejemplo, un producto de carne fresca, un producto de carne procesada, un producto de carne refrigerada, un producto de carne congelada o un producto de carne cocida. El producto cárnico puede ser, por ejemplo una carne de res, de cordero, de cerdo, de pato, de pollo, de ganso, de pavo, de conejo, de pescado o de marisco. Preferentemente, el producto cárnico puede ser un producto de carne de ave de corral, más preferentemente un producto de carne de pollo.
La presente invención también proporciona un compuesto como se ha definido anteriormente para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la infección por Campylobacter en seres humanos. Un compuesto como se ha definido anteriormente se puede usar en la fabricación de un medicamento para la profilaxis o el tratamiento de la infección por Campylobacter en seres humanos.
El compuesto se puede proporcionar a los humanos para prevenir o tratar la infección de humanos con Campylobacter (campilobacteriosis). Esto es ventajoso porque los compuestos previenen o reducen la adhesión de Campylobacter a las células epiteliales en el tracto gastrointestinal. Esto puede prevenir o reducir la infección con Campylobacter porque Campylobacter se adhiere a las células en el tracto gastrointestinal humano al acoplarse a los antígenos del grupo histo-sanguíneo humano que se expresan en las células del tracto gastrointestinal. Los compuestos pueden competir con los antígenos del grupo histo-sanguíneo humano natural que se encuentran en las células epiteliales para la unión de MOMP y FlaA y, por lo tanto, reducen la cantidad de unión de Campylobacter a las células.
La presente solicitud también desvela un método para tratar o prevenir la infección por Campylobacter en seres humanos que comprende administrar al ser humano una cantidad eficaz de un compuesto como se ha definido anteriormente.
La presente solicitud también desvela un kit que comprende:
a) al menos un compuesto como se describe en la presente invención y, opcionalmente, instrucciones para usar el kit.
A continuación se incluye a modo de ejemplo solamente una descripción detallada de la presente invención con referencia a los dibujos adjuntos, en los que;
la Figura 1 muestra el efecto competitivo de los glicoconjugados solubles, es decir, H-II, Leb o Ley sobre la unión de la cepa NCTC11168 a una serie de BgA. A) Se recubrió una placa ELISA con una selección de BgAg. La unión específica se calculó restando los valores de BSA (control negativo) de la absorbancia de BgAg. La unión de la cepa NCTC11168 a BgAg se inhibió significativamente (p <0,05) mediante la preincubación de células con glicoconjugados solubles antes de añadirlos a la placa de ELISA. Barras de error; media de los valores por triplicado ± SEM, el número de experimentos repetidos fue de 3. Cada grupo de barras, de izquierda a derecha, NCTC11168, NCTC11168-H-II, NCTC11168-Leb, NCTC11168-Ley.
B) Identificación de proteínas de unión a BgAg de la cepa NCTC11168 mediante el uso del método reetiquetado. Se identificaron dos proteínas en tamaños de 45 y 59 kDa, correspondientes a MOMP y FlaA, respectivamente. La Figura 2 muestra A) Inhibición de la unión de la cepa NCTC11168 al glicoconjugado H-II en ausencia de un inhibidor (no tratado, nT) y en presencia de MOMP purificada de Cj-281 (MOMP (-)), cepa de unión baja). MOMP purificada de NCTC11168 (MOMP (+)) y preincubación de células bacterianas NCTC11168 con glicoconjugado H-II (H-II). El tratamiento previo de todas las MOMP y H-II examinadas se redujo significativamente (p <0,001, ***) La unión bacteriana al antígeno H-II. Por el contrario, MOMP (-) tuvo un efecto menor en comparación con H-II o MOMP (+) debido a la menor afinidad por el antígeno H-II. B) La placa de ELISA se recubrió con una selección de BgAg. La unión específica se calculó restando los valores de BSA (control negativo) de la absorbancia de BgAg a 405 nm. La cepa NCTC11168 y Cj-266 (cepa de unión alta) y los mutantes correspondientes de AflaA, se han examinado para determinar la unión a Leb, H-II, H-I, Lex t Lea. La prueba t confirmó que la reducción de la unión observada con los mutantes era significativa (Leb; p=2,5E-05, H-II; p=0,012, H-I; p<0,001, Lex; p=0,029 y Lea; p = 0,000) en la cepa NCTC11168. Sin embargo, la mutación CJ-266AflaA no tuvo efecto en la unión, lo que indica que la capacidad de unión fue compensada por la proteína MOMP. Cada grupo de barras de izquierda a derecha: NCTC11168, 11168-AflaA, Cj-266, Cj-266AflaA. C) Se construyó un doble mutante (DM) de AflaA y una sustitución simple del sitio de glicosilación en la proteína MOMP (Thr268 se sustituyó con Gly) en ambas cepas NCTC11168 y Cj-266, y se examinó la unión a Leb H-I y H-II. La unión se redujo significativamente en NCTC11168-MOMPT/G, pero la unión reducida no fue significativa en Cj-266-MOMPT/G. Aunque la prueba t confirmó la reducción en la unión observada con los mutantes NCTC11168-DM y Cj-266-DM era significativa (p <0,05). Cada grupo de barras de izquierda a derecha: Leb, H-II, H-1.
La Figura 3 muestra una visión general del análisis de espectrometría de masas por LC-MS/MS para la identificación de proteínas y la caracterización de péptidos glicosilados. A) Cromatograma de los picos de base: Los péptidos trípticos se cargan en una columna C18 acoplada en línea y se eluyen en el espectrómetro de masas para su análisis. B y C) Exploración del precursor de MS del péptido glicosilado doblemente cargado a m/z 978,91 C) Espectro CID-Ms/Ms del ion seleccionado. D) Detección del constituyente glicano de MOMP purificada de diferentes cepas utilizando lectinas marcadas biotiniladas. GSL II: lectina II de Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia, DSL: lectina de Datura Stramonium, ECL: lectina de Erythrina cristagalli, LEL: lectina de Lycopersicon esculentum (tomate), STL: lectina de Solanum tuberosum (patata), VVA: aglutinina y Jacalina de Vicia villosa: lectina de Artocarpus integrifolia.
La lectina de jacalina mostró una unión significativa a la MOMP purificada con NCTC11168 que las otras lectinas utilizadas. La lectina de jacalina reconoce específicamente Galp1-3GalNAcai-Ser/Thr (antígeno T) y/o GalNAc.
E) Se reveló un análisis adicional utilizando un anticuerpo contra el antígeno T para confirmar la especificidad de jacalina. Las MOMP de las cepas 255, 281 (aislamientos clínicos de baja unión) y MOMPT/G no revelaron una unión significativa a la lectina de jacalina o al antígeno anti-T en comparación con la MOMP purificada de la cepa NCTC11168 de tipo salvaje. Barras de error = media de valores triplicados ± SED, N.° 2. Dos experimentos independientes (valor de p). Para cada par de barras: barra izquierda - lectina de jacalina, Barra derecha -Antígeno anti-T.
La Figura 4 muestra una representación de MOMP (A, derecha) y MOMP glicosilada (A, izquierda) en los límites aproximados de la parte hidrófoba de la membrana externa (ME). B), la estructura de energía más baja superpuesta de MOMP (verde) en la estructura de energía más baja de MOMP glicosilada (magenta) con RMSD de 1,291. Los bucles se muestran en colores; las hebras p son verdes, L1 (restos 41-60, rojo), L2 (restos 87-109, magenta), L3 (restos 128-147, naranja), L4 (restos 169-200 amarillo) L5 (restos 227-233, negro), L6 (restos 256­ 274, azul), L7 (restos 296-333, gris), L8 (restos 360-379, cián) y L9 (restos 399-414, púrpura).
La Figura 5 muestra un dibujo estéreo del esqueleto de MOMP vista desde el lado extracelular: las hebras p son verdes, L1 (rojo), L2 (magenta), L3 (naranja), L4 (amarillo) L5 (negro) (L5), L6 (azul), L7 (gris), L8 (cián) y L9 (púrpura) y su vista lateral. Los cambios conformacionales en el grupo glicosilato inducidos por la introducción de los ligandos en la cavidad de MOMP glicosilada. Los complejos con Leb (A) y H-II (D). Asimismo, los enlaces de hidrógeno mostrados en azul claro implicados en las interacciones de MOMP (B y E) y su forma glicosilada (C y F) con Leb y H-II, respectivamente, en sus sitios activos.
La Figura 6 muestra ejemplos de compuestos que se pueden usar en la presente invención.
La Figura 7 muestra el efecto de una serie de antígenos del grupo histo-sanguíneo en la formación de biopelículas. Comparación de la formación de biopelículas entre NCTC11168-WT y los mutantes correspondientes, Afla A y MOMP-T/G en presencia y ausencia de azúcares libres. A) La disminución más significativa en la formación de biopelículas se observa en la cepa de tipo salvaje en comparación con los mutantes. Sin embargo, la formación de biopelículas de la cepa MOMP268T/G es comparable a AflaA, lo que indica que la O-glicosilación de MOMP también juega un papel importante para esta formación. Para cada grupo de barras de izquierda a derecha: NCTC11168, NCTC11168 (azúcar), mOm P-T/G, MOMP-T/G (azúcar). B) Se observaron resultados similares, excepto para el núcleo II, otros azúcares examinados redujeron significativamente la formación de biopelículas. Para cada grupo de barras de izquierda a derecha: NCTC11168, NCTC11168 (azúcar), Afla A, Afla A (azúcar).
La Figura 8 muestra la estructura de energía más baja de MOMP desde la simulación de MD con dibujo estéreo del esqueleto de MOMP visto desde el lado extracelular. MOMP forma canales hidrófilos a través de la membrana externa. El plegado de las OMP en barril p promueve el ensamblaje del trímero y la integración del canal en la membrana externa. Adicionalmente, el análisis cristalográfico bidimensional mostró que la MOMP está relacionada estructuralmente con la familia de las porinas bacterianas triméricas.
El análisis por espectroscopia de CD también demostró que el monómero plegado comprendía principalmente una estructura secundaria en lámina p, de acuerdo con la denominada estructura en barril p de las porinas. Los monómeros plegados de MOMP pueden formar canales en bicapas lipídicas artificiales con las mismas propiedades de conductancia que los monómeros incrustados en trímeros, lo que sugiere que el monómero plegado es la unidad funcional de la porina MOMP.
La Figura 9 muestra las moléculas utilizadas en el modelado de moléculas que se unen a MOMP.
La Figura 10 muestra los niveles de colonización de los pollos expuestos a la cepa NCT11168-0 de Campylobacter de tipo salvaje o la cepa MOMP268T/G de Campylobacter mutante.
La Figura 11 muestra el quinato férrico de ácido 1, 3, 4, 5-tetrahidroxi ciclohexancarboxílico
La Figura 12 muestra el potencial inhibidor de quinato férrico Fe(QA)3 sobre la adherencia de C. jejuni analizado mediante ELISA utilizando BgAg (Core-I, Core-II, H-I, H-II, Leb, Ley y Lex).
La Figura 13 muestra el potencial inhibitorio de quinato férrico Fe(QA)3 sobre la adherencia de C. jejuni analizado mediante ELISA utilizando BgAg (Core-I, Core-II, H-I, H-II, Leb, Ley y Lex).
La Figura 14 muestra la colonización de pollos por C. jejuni 11168-0 después del tratamiento con FeQ (0,034 mM).
La Figura 15 muestra la colonización de pollos por C. jejuni 11168-0 después del tratamiento con FeQ (0,34 mM).
La Figura 16 muestra el análisis metagenómico de la población tratada con FeQ a nivel de género/especie. La Figura 17 muestra el análisis metagenómico de la población tratada con FeQ a nivel de filo.
1-Ley R, Backhed F, Turnbaugh P, Lozupone C, Knight R, Gordon J (2005). "Obesity alters gut microbial ecology". Proc Natl Acad Sci USA 102 (31): 11070-5. doi:10.1073/pnas.0504978102. PMC 1176910. PMID 16033867
2- Ley R, Turnbaugh P, Klein S, Gordon J (2006). "Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity". Nature 444 (7122): 1022-3. doi:10.1038/4441022a. PMID 17183309.
3- Turnbaugh P, Ley R, Mahowald M, Magrini V, Mardis E, Gordon J (2006). "An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest". Nature 444 (7122): 1027-31. doi:10.1038/nature05414. PMID 17183312.
Campylobacter jejuni es una causa importante de gastroenteritis transmitida por los alimentos. A pesar de la alta prevalencia e importancia médica de la infección por C. jejuni, los aspectos fundamentales de la patogenia siguen siendo poco conocidos, en particular las interacciones moleculares detalladas entre el huésped y el patógeno. Los antígenos del grupo histo-sanguíneo humano (BgAg) a menudo son utilizados por los organismos de la mucosa como palancas de adherencia antes de la invasión. Utilizando un enfoque de reetiquetado, las correspondientes adhesinas de unión a BgAg expuestas a la superficie de C. jejuni se identificaron como la proteína de la subunidad mayor de los flagelos (FlaA) y la proteína principal de la membrana externa (MOMP). La O-glicosilación de FlaA se ha notificado previamente y es necesaria para el ensamblaje de filamentos y para modular la funcionalidad de los flagelos. La MOMP purificada como FlaA se O-glicosiló. La O-glicosilación se localizó en Thr268 y se sugirió como Galp1_3-(GalNAc)3-a1-Thr268. La sustitución dirigida por sitio de MOMP Thr268/Gly condujo a una reducción significativa en la unión a BgAg. Adicionalmente, las técnicas de modelado de simulación de dinámica molecular (DM) sugirieron que la O-glicosilación de MOMP tiene un efecto notable en la conformación de la proteína. Por lo tanto, C. jejuni utiliza la O-glicosilación de proteínas expuestas en la superficie para modular la conformación y la capacidad de unión.
La prevención y el tratamiento de la infección humana con Campylobacter y sus consecuencias se ven obstaculizadas por una mala comprensión de la interacción molecular detallada entre el huésped y el patógeno. Los estudios realizados por los presentes inventores han demostrado que C. jejuni se une específicamente a todos los BgAg humanos e identifica los ligandos bacterianos responsables de la unión. Estas son la proteína flagelina FlaA y la principal proteína de la membrana externa MOMP.
Los estudios actuales también han descubierto que MOMP está O-glicosilada y comparte un sitio de unión a BgAg común con FlaA, que ya se ha demostrado que está O-glicosilada. La glicosilación de MOMP hace que sufra cambios conformacionales que alteran su afinidad por la unión de, y por lo tanto el reconocimiento de, los BgAg en comparación con la proteína MOMP no glicosilada. Los epítopos de MOMP conformacionales son importantes en la inmunidad del huésped y la variación en las regiones expuestas a la superficie probablemente se produce como resultado de una selección inmune positiva durante la infección. La identificación del perfil de glicosilación de proteínas de C. jejuni, en la membrana externa es útil para entender la patogeneicidad diversa de las cepas de C. jejuni entre los diferentes huéspedes.
Los presentes estudios han creado un modelo in silico de MOMP glicosilada, que se han usado para identificar los aminoácidos que participan en la unión bacteriana a BgAg. El modelo y los aminoácidos que son esenciales para la unión a BgAg se pueden usar para identificar las dianas de los fármacos candidatos. El modelo también se puede usar para predecir qué moléculas se unirán a MOMP y pueden reducir adherencia del Campylobacter portador de MOMP a las paredes celulares.
Los presentes estudios han descubierto que los BgAg pueden inhibir la adherencia bacteriana y la formación de biopelículas y han identificado moléculas que se pueden usar (a) para el tratamiento de seres humanos que sufren campilobacteriosis; (b) para prevenir la colonización de pollos con especies de Campylobacter, y (c) eliminar la colonización de pollos en bandadas infectadas.
Los intentos anteriores para reducir el riesgo de infección humana con especies de Campylobacter implicaron el uso de vacunas que emplean ácidos nucleicos que codifican las proteínas de Campylobacter, en particular, flagelina (documento US2007/249553).
Esto es completamente diferente del enfoque descrito por la presente solicitud que utiliza compuestos específicos para bloquear el sitio de unión al ligando de Campylobacter y, por lo tanto, inhibir la adherencia y colonización de Campylobacter en el tracto gastrointestinal de pollo.
En una realización, en la presente invención se puede usar quinato férrico (Fe-Q).
Ejemplos
C. je jun i se une a una amplia gama de BgAg humanos.
Para determinar el intervalo y la especificidad de los BgAg que se unen a C. jejuni, Core-I, Core-II, H-I, H-II, Leb, Lex y Ley se inmovilizaron en placas de ELISA especializadas de 96 pocillos y se incubaron con la cepa de C. jejuni NCTC11168 marcada con digoxigenina (Dig) en fase logarítmica. La cepa se unió a todos los BgAg examinados, variando el grado solo marginalmente entre BgAg (S1-Fig.).
Los antígenos del grupo sanguíneo se obtuvieron de IsoSep (Suecia). La cepa de laboratorio (ATCC11168) se obtuvo del banco de la ATCC y las cepas clínicas de una colección pertenecen al profesor Julian M. Ketley (Departamento de Genética, Universidad de Leicester, Leicester LE17RH, Reino Unido).
La preincubación de bacterias o placas recubiertas con BgAg solubles inhibió la unión, confirmando la especificidad (Fig. 1A). Asimismo, se llevaron a cabo ensayos de adherencia mediante el co-cultivo de la cepa de C. jejuni NCTC11168 y células Caco-II. El H-II soluble causó una reducción significativa en la unión bacteriana a las células huésped. Asimismo, se utilizó el mismo intervalo de BgAg inmovilizados para probar la capacidad de 39 aislados clínicos de C. jejuni. Todos los aislados de C. jejuni se unieron a todos los BgAg examinados, aunque en un grado variable. Se realizó análisis de correlación entre cada azúcar y análisis de componentes principales. Permite una visualización de las correlaciones: cuanto más cerca están estructuralmente los azúcares, son más similares en términos de capacidad de unión.
El alto grado de especificidad de las adherencias de unión a BgAg de H. pylori contrasta con nuestros hallazgos con C. jejuni, que parece unirse a una amplia gama de antígenos relacionados. Esto puede reflejar el hecho de que H. pylori tiene una gama de huéspedes muy restringido (que infecta solo a los seres humanos), mientras que C. jejuni es capaz de establecer la infección en una amplia gama de aves y mamíferos y puede haber ganado una ventaja evolutiva al ampliar su especificidad y maximizar su supervivencia en diferentes huéspedes.
FlaA y MOMP de C. je jun i participan en la unión a una amplia gama de BgAg humanos.
Para la identificación y purificación de adhesinas bacterianas de unión a BgAg, se utilizó una técnica de reetiquetado. Dos bandas de proteína generadas en la figura 1B identificadas por espectrometría de masas como la proteína principal de la membrana externa (MOMP, 45 kDa) y FlaA (el componente principal de los flagelos, 59 kDa), respectivamente. La MOMP de C. jejuni es una porina multifuncional y es esencial para la supervivencia bacteriana; se predice que comprende beta que se extienden sobre la membrana externa y separa los bucles periplásmicos y expuestos en la superficie. Que está codificado por el gen porA que es extremadamente genéticamente diverso y la variabilidad de los bucles de superficie porA proporciona evidencia de que la selección inmune influye fuertemente en la diversidad de esta proteína. Curiosamente, la mayor variación tanto en la secuencia de aminoácidos putativa como en la longitud se formó en el bucle 4.
La MOMP se purificó en condiciones nativas de la cepa NCTC11168 y el ELISA de inhibición y los experimentos confocales mostraron que tanto la MOMP purificada como la H-II inhibían significativamente la unión de NCTC11168 al antígeno H-II (Fig. 2A).
Se construyeron mutantes por deleción de AflaA en las cepas NCTC11168 y Cj-266 (un aislado clínico). Esto había reducido significativamente la capacidad de unión a todos los BgAg examinados, excepto Lex en la cepa NCTC11168 (Fig. 2B). Por el contrario, la deleción de AflaA en la cepa Cj-266 no mostró una unión reducida a BgAg (Fig. 2B), lo que indica que MOMP per se es suficiente para adherirse a los BgAg.
Las propiedades invasivas se podrían restaurar parcialmente mediante la centrifugación de los mutantes en las células de cultivo de tejidos, lo que indica que la motilidad es un importante, pero no el único, factor implicado. En este caso, los inventores identificaron las correspondientes adhesinas de C. jejuni, que median en la unión bacteriana a BgAg.
Capacidad de MOMP268T/G para colonizar polluelos
Se determinó la capacidad de MOMP268T/G para colonizar polluelos. Se expuso a aves de 6 semanas de edad (n = 10 por grupo) a 3 x 103 UFC de la cepa NCTC11168-O de tipo salvaje o su mutante isogénico MOMP268T/G por sonda oral. Los niveles de colonización cecal se determinaron en aves de cada grupo a los 7 días de la exposición. Los resultados muestran una reducción significativa en la media geométrica de los niveles de colonización en el ciego en el grupo MOMP268T/G en comparación con el tipo salvaje (véase la figura 10). Asimismo, se examinó la capacidad de la cepa mutante para invadir el hígado del pollo. Los resultados mostraron que MOMP268T/G fue completamente incapaz de invadir en comparación con la cepa de tipo salvaje, Estos resultados confirman la importancia y la importancia biológica de la glicosilación de MOMP en el establecimiento de la colonización in vivo. Los valores menores de 100 en la Figura 10 son cifras arbitrarias y no se recuperó Campylobacter.
Quinato férrico; un inhibidor de la adherencia de C. je juni
Una serie de compuestos fenólicos, incluidos los ácidos cafeico y quínico (Baqar et al.), se ha demostrado que tienen niveles altos de actividad antioxidante y otros efectos potencialmente beneficiosos para la salud in vitro. Asimismo, el ácido quínico se produce en el té, el café, las frutas y los vegetales. En particular, las plantas utilizan el ácido D -(-)-quínico de baja masa molecular (Baqar et al.) para la movilización del hierro y el uso posterior de este metal por las estructuras celulares en las rutas metabólicas (Menelaou et al., 2009).
Se ha identificado que el quinato ferroso Fe(QA)3 tiene efectos inhibidores prometedores in vitro e in vivo sobre la adhesión de C. jejuni a los BgAg.
El potencial inhibitorio del quinato férrico Fe(QA)3 en la adherencia de C. jejuni se analizó mediante ELISA utilizando BgAg (Core-I, Core-II, H-I, H-II, Leb, Ley y Lex). C. jejuni se preincubó con Fe(QA)334 pM y también se analizó la inhibición específica por postratamiento de C. jejuni con Fe(QA)3 que se unió a los BgAg en ese momento. El resultado mostró que el Fe(QA)3 confería un 90 % de inhibición de la unión, mientras que el ácido quínico solo no proporcionó inhibición de la unión de C. jejuni a todos los BgAg examinados. Además, los resultados del enfoque del cultivo bacteriano (MH) que contiene Fe(QA)3 también demostraron una inhibición reproducible de la adherencia microbiana. Asimismo, los pases secuenciales (P) de las bacterias a la nueva placa que contiene Fe(QA)3 no causaron ninguna resistencia con respecto a las capacidades de unión (véanse las Figuras 12 y 13).
Para aclarar aún más las propiedades de efecto de crecimiento de Fe(QA)3, los inventores investigaron el efecto de la adición de Fe(QA)3 al medio de cultivo. La suplementación con las diferentes concentraciones de Fe(QA)3, (34 y 340 pM), no afectaron el crecimiento de C. jejuni NCTC11168.
Estas propiedades inhibitorias contra la adherencia de C. jejuni a BgAg se analizaron in vivo. Se usó quinato férrico como aditivo para el agua (0,034-0,34 mM) y como inhibidor de la adherencia de la cepa NCTC11168 de C. jejuni y, por lo tanto, la colonización, en el tracto intestinal del pollo. Se expuso a aves de 6 semanas de edad (n = 10 por grupo) a 3 x 103'5 UFC de la cepa NCTC11168-O de tipo salvaje por sonda oral. Los niveles de colonización cecal se determinaron en aves de cada grupo a los 3 y 7 días posteriores a la exposición.
El complejo redujo significativamente la adherencia de C. jejuni (2-3 Log a una concentración de 0,34 mM) a la mucosa intestinal y al revestimiento epitelial al inhibir la unión entre las adhesinas bacterianas, tales como MOMP (confirmado por el modelo), puede FlaA, y los sitios de unión correspondientes en el epitelio intestinal del huésped, véanse las Figuras 14 y 15.
En un análisis metagenómico de la población tratada con FeQ a nivel de género/especie, se puede observar una diferencia entre las aves tratadas con FeQ y las no tratadas el día 7, hay un cambio en la población con el aumento del filo Bacteriodetes, especialmente Bacteroides feacalis (1, 2, 3).
MOMP está O-glicosilada.
Campylobacter modifica específicamente sus proteínas flagelares con glicanos unidos a O que pueden constituir hasta el 10 % de la masa proteica. Estas modificaciones son necesarias para el ensamblaje del flagelo y, por lo tanto, afectan a la secreción de proteínas moduladoras de la virulencia, la colonización bacteriana del tracto gastrointestinal, la autoaglutinación y la formación de biopelículas.
MOMP se purificó a partir de las cepas NCTC11168 y Cj-281 en condiciones nativas y se analizó mediante Nanoflow LC-MS/MS FT/ICR después de la digestión de proteínas en gel como se describe en A. Shevchenko, M. Wilm, O. Vorm, M. Mann, Anal Chem 68, 850 (Mar 1, 1996). La migración de péptidos MOMP digeridos con tripsina de ambas cepas fue esencialmente idéntica excepto por un péptido correspondiente a los aminoácidos 268-278, correspondiente al bucle previsto 6: el péptido de la cepa NCTC11168 mostró una mayor masa; El análisis MS/MS confirmó que la glicosilación de Thr-268 con una Hex-(HexN-acetilamina)3 (donde Hex puede ser glucosa o galactosa) fue responsable del cambio observado (Fig. 3A, B y C). La alineación de la secuencia FASTA de aislados clínicos indicó que Thr-268 en el bucle 6 de la cepa NCTC11168 parece conservarse en el 52 % de los aislados. La sustitución de Thr268 por Gly dirigida al sitio se realizó en MOMP de la cepa NCTC11168 y un aislado clínico Cj-266 (que produjo MOMP268T 1 G, S5-Tabla). Esta sustitución provocó un claro cambio en la migración de la proteína, lo que sugiere fuertemente la pérdida de su glicosilación (S5). Se examinó la capacidad de este mutante para unirse a una serie de BgAg en un ensayo ELISA y se demostró que tenía una reducción en la unión a cada uno de los BgAg examinados (Fig. 2A). Asimismo, se observó la formación de una biopelícula reducida, lo que indica que la O-glicosilación de MOMP juega un papel importante en este contexto (S8-Fig. A y B).
El papel de las PglB y PseD transferasas sobre la glicosilación de MOMP.
La flagelina es la única proteína de C. jejuni O-glicosilada que se ha informado y los glucanos constituyen aproximadamente el 10 % en peso de esta proteína. Los O-glicanos predominantes unidos al flagelo de Campylobacter son derivados de ácido pseudamínico o ácido legionamínico, que son azúcares C9 que están relacionados con los ácidos siálicos. Asimismo, el patógeno gástrico humano relacionado H. pylori también O-glicosila sus flagelos con Pse, de manera similar a C. jejuni y se requiere una modificación para la motilidad bacteriana y el ensamblaje flagelar.
Curiosamente, la pérdida específica de Pse5Am debido a la mutación del gen A de la biosíntesis de Pse (pseA) en C. jejuni subsp. jejuni 81-176 produjo una pérdida de autoaglutinación y redujo la adherencia y la invasión de células epiteliales intestinales in vitro, y redujo la virulencia en el modelo de hurón.
Asimismo, la PseD como una PseAm transferasa putativa mostró que la mutación en pseD carecía de PseAm en la flagelina y no se autoaglutinaba.
La ruta general de la glicosilación de proteínas (Pgl) involucra varias enzimas "Pgl" clave, de las cuales PglB es crucial para la N-glicosilación proteica, es decir, la transferencia de las primeras moléculas de glicano a las proteínas diana en restos específicos de Asn.
Con el fin de evaluar la contribución de las PseD y PglB transferasas en la glicosilación de MOMP de C. jejuni y su papel en la actividad de unión bacteriana, se creó un mutante de deleción de pglB en la cepa Cj81-176 y de deleción de pseD en la cepa NCTC11168; la deleción de pglB no tuvo un impacto detectable en la migración en gel de MOMP, tinción con glicano (datos no mostrados), o unión bacteriana a cualquiera de los BgAg examinados (S7-Fig. A). Sin embargo, la deleción en la cepa NCTC11168-pseD dio como resultado una reducción significativa en la unión a todos los BgA examinados y la formación de biopelículas (datos no mostrados).
Estos hallazgos indican que la cepa NCTC11168 de C. jejuni codifica una transferasa que participa en la modificación postraduccional de la proteína, que desempeña un papel importante en la adhesión bacteriana y revela modificaciones postraduccionales inusuales; una Hex-(HexNAc)3 unida a Hex en Thr268. Estas modificaciones postraduccionales pueden sufrir variaciones de fase y también pueden variar en la estructura de una generación de C. jejuni a la siguiente, y pueden tener una función de escape inmune. Adicionalmente, estos hallazgos proporcionan nuevos conocimientos sobre la estructura de MOMP y resuelven problemas de larga duración con respecto a las moléculas de adhesión que median la unión bacteriana a los BgAg. La patogenia y estudio de los efectos sobre procesos como la colonización, invasión, y la capacidad para estimular la respuesta inflamatoria del huésped aún no se ha dilucidado.
Determinación de la composición de glicanos de MOMP.
Se usó el kit de lectina para la determinación del constituyente de la glicosilación de MOMP. El kit consta de 7 lectinas diferentes con especificidad superpuesta. El NCTC11168-MOMP purificado en una matriz de lectina reveló una unión significativa a la lectina jacalina y, en menor medida, a GSL y lEl (Fig. 3D). Entre las lectinas específicas de galactosa, la lectina de Artocarpus integrifolia, conocida en la literatura como jacalina, exhibe especificidad hacia el disacárido de Thomsen-Friedenreich específico del tumor humano (antígeno T, Galpi_3GalNAcai-Ser/Thr).
Adicionalmente, para confirmar la especificidad de unión de jacalina, se utilizó el anti-antígeno T monoclonal contra la MOMP purificada aislada de diferentes cepas (NCTC11168-MOMP, NCTC11168 MOMP268T/G y dos aislados clínicos con baja actividad de unión; Cj281 y Cj-255). La Figura 3E muestra que el anticuerpo anti-antígeno T y la lectina jacalina reaccionaron específicamente con NCTC11168-MOMP purificada. La observación de que NCTC11168-MOMP interacciona con jacalina y el anti-antígeno T pero no la MOMP aislada de las cepas de unión baja y NCTC11168 MOMP268T/G (Fig. 3E) indica que es probable que la cepa TC11168-MOMP sea la forma trimérica unida a O del antígeno T (Galpi_3GalNAcpi_4GalNAcpi_4GalNAcai-Thr268).
La glicosilación de MOMP con el antígeno T presentado en el presente documento proporciona una información importante sobre el papel de la glicosilación para la actividad de unión de C. jejuni a los antígenos de Lewis y en la inmunogenicidad de MOMP. La determinación adicional de las otras proteínas de la membrana externa glicosiladas en N y O puede arrojar luz sobre el desarrollo de una vacuna basada en glucoconjugado en el futuro.
El papel del glicano en la unión de MOMP a BgAg
Los avances en tecnología informática y las nuevas técnicas de modelado han facilitado las simulaciones de plegamiento de péptidos a nivel atómico. Aunque las bacterias gramnegativas poseen una homología bastante diferente en las secuencias primarias de sus porinas, son notablemente similares en su estructura de barril beta. Por tanto, los inventores emplearon la estructura de barril beta de Comamonas acidovorans (1E54.pdb) como plantilla y construyeron un modelo basado en este supuesto. Con el fin de comprender mejor el papel de la glicosilación MOMP en la unión de C. jejuni a los BgAg, los inventores presentaron las propiedades de construcción y dinámica molecular de MOMP y su forma glicosilada.
La estructura inicial se construyó y se mostró que tenía 9 bucles y 18 cadenas beta. La estructura de energía más baja obtenida a partir de simulaciones de dinámica molecular (MD) a 300 Kelvin (K). Esta estructura estaba glicosilada en el resto 268 con un grupo glicosilo. La estructura de energía más baja de MOMP glicosilada (gly-MOMP) obtenida de las simulaciones de MD se superpuso a la estructura de energía más baja de MOMP para ver los cambios conformacionales inducidos por la introducción de glicosilación como se presenta en la Figura 4B. Muestra que los principales cambios se producen en los bucles 4, 6 y 7, construidos aproximadamente entre 169­ 200, 256-274 y 296-333, donde el bucle 6 contiene el grupo glicosilo. Sin embargo, esto demuestra que un pequeño cambio aparece en los barriles. Los límites aproximados de dos proteínas en la parte hidrófoba de la membrana externa se indican mediante líneas horizontales como se representa en la Figura 4A. Curiosamente, el resto galactosilo tiene una interacción favorable con el resto Arg328 como se indica en la Figura 4, pero en el complejo con H-II, el resto glicosilado experimenta cambios conformacionales considerables donde esta interacción desaparece y el grupo tiende a moverse hacia el bucle 4 para interaccionar con Thr186 y 187 (Fig. 4A). Por el contrario, este cambio conformacional no se produjo en el caso de gly-MOMP con Leb.
La proteína MOMP tiene una cavidad similar a un canal, que se espera que sea capaz de alojar moléculas muy grandes. Un imitador del antígeno de Lewis, el determinante de carbohidrato de Lewis de tipo 1 (Leb) y el antígeno H-II de tipo 2 se acoplaron en la cavidad de MOMP y gly-MOMP. Estos complejos se computaron para simulaciones de MD. La introducción de los ligandos dentro de la cavidad de MOMP conduce a un efecto notable en los cambios conformacionales en los bucles, Especialmente en los bucles 4 y 7. Estos dos bucles son los más largos entre el resto y, obviamente, experimentan cambios conformacionales significativos en comparación con los demás. Curiosamente, se descubrió que gly-MOMP tiene una estructura relativamente estable ya que muestra que solo el bucle 7 experimenta cambios conformacionales en este complejo. Esto puede significar que la glicosilación aumenta la estabilidad de la proteína y permite que sea inmunológicamente inerte a través de la mimetización molecular de su huésped.
Los aminoácidos de MOMP correspondientes, que median en la unión a los antígenos Leb y H-II.
Las interacciones involucradas en los complejos de ambas proteínas con Leb y H-II se representan en la Figura 5A-F. El canal de estas proteínas de barril contiene en gran parte restos de arginina y lisina, los cuales son probablemente responsables del reconocimiento de estos azúcares. Es evidente que gly-MOMP tiene interacciones favorables con Leb en comparación con MOMP. Los restos Arg352, Lys278 y 385 parecen ser los principales contribuyentes a la interacción de la proteína glicosilada con Leb a través de puentes de hidrógeno, mientras que solo los restos Asn258 y Lys278 están implicados en la interacción de MOMP con Leb. Los restos 352 y 385 son los miembros del beta-barril 7, que son la parte del bucle 7. Este bucle, como se ha mencionado anteriormente, en su mayoría sufre cambios de conformación durante la simulación dinámica molecular (Fig. 4B). El grupo glicosilo interacciona con este bucle, por lo tanto, conduce a un cambio conformacional favorable para la interacción y, en consecuencia, resulta en una buena orientación de estos restos para interaccionar con Leb. El grupo glicosilo está intercalado entre los bucles 4 y 7, probablemente influyendo en la dinámica de estos bucles, de modo que contribuye a la capacidad de unión de la proteína. Los cálculos también muestran que la proteína glicosilada tiene interacciones de van der Waals (vdw) más favorables en comparación con la MOMP. Parece que los restos Leu290, Tyr294, Phe395 e Ile337 están bien localizados sobre la superficie hidrofóbica de Leb en el complejo de gly-MOMP en comparación con MOMP (Fig. 5B y C). Esto se refleja en la diferencia de energía de 67 kcal/mol vdw entre dos complejos. Parece que la H-II está unida a proteínas con un modo similar a Leb. Los restos Lys278, Arg352 y 381 están involucrados en el complejo de ambas proteínas con H-II (Fig. 5E y F). La única diferencia está en los restos Asp261 y Ser397, el primero está involucrado en el complejo de MOMP y el segundo en gly-MOMP. La energía de unión muy grande obtenida para el complejo de H-II por Mm PBSA no pudo explicarse, pero todavía muestra que la gly-MOMP se une a H-II mejor que la MOMP en sí misma.
El otro resultado obtenido de los cálculos de MD es la conformación y alineación de los ligandos dentro de las cavidades de dos proteínas. Muestran que ambos ligandos tienen diferentes orientaciones conformacionales en los sitios activos de las proteínas.
En conclusión, aunque las simulaciones de MD se llevaron a cabo en un corto tiempo de simulación de MD y en un medio de salvación implícito, todavía muestra que la glicosilación de las principales proteínas de la membrana externa proporciona mejores cambios de conformación y, en consecuencia, afinidad para la unión y, por lo tanto, el reconocimiento de los antígenos de Lewis en comparación con su proteína original. Los epítopos de MOMP conformacionales son importantes en la inmunidad del huésped y la variación en las regiones expuestas a la superficie probablemente se produce como resultado de una selección inmune positiva durante la infección. La diversidad de porA se ha explotado en estudios de genotipado que utilizan secuencias de nucleótidos altamente discriminatorias para identificar casos potencialmente epidemiológicamente vinculados de manifestaciones clínicas de la infección por C. jejuni. Curiosamente, se ha sugerido que la respuesta inmune del huésped desempeña un papel en la definición de complejos clonales más antigénicamente homogéneos, y esto también podría reflejar una adaptación de nicho. Por ejemplo, la alineación de las secuencias de MOMP aisladas de cepas asociadas a humanos y pollos demuestra que difieren predominantemente en el bucle 4, por lo tanto, la variación del bucle 4 podría influir en la capacidad de unión bacteriana y, por consiguiente, en la adaptación del nicho.
Adicionalmente, la identificación del perfil de glicosilación de proteínas de C. jejuni, principalmente las relacionadas con la membrana externa, son fundamentales para comprender la diversa patogenicidad de las cepas de C. jejuni entre diferentes huéspedes. El modelo puede usarse para subredes de interés biológico, tales como aminoácidos esenciales que sugieren objetivos de fármacos candidatos. De manera importante, algunas interacciones de baja confianza pueden ser biológicamente significativas mediante validación experimental.
El modelo para la interacción de C. jejuni con los antígenos Leb y H-II mediados por MOMP generado aquí aumenta sustancialmente nuestro conocimiento sobre la proteína y su glicosilación y el papel en las interacciones detectadas hasta ahora para la membrana externa de C. jejuni.
Por lo tanto, la glicobiología estructural desempeñará un papel clave en el desenmarañamiento de otras estructuras de glicanos que median la interacción de las bacterias huésped a través de las proteínas MOMP/FlaA, contribuyendo decisivamente a la identificación y validación de nuevos receptores de glicanos para estas lectinas bacterianas. Esta información será de gran importancia para la mejora y el diseño de nuevas terapias para superar la infección por C. jejuni.
Formación de biopelículas
Se ha demostrado que la autoaglutinación (AAG) es crítica para la virulencia de varios patógenos y puede desempeñar un papel en la adherencia, la formación de microcolonias, la formación de biopelículas y la resistencia al ácido y la fagocitosis. En dos estudios previos en AAG de C. jejuni (N. Misawa, M. J. Blaser, Infect Immun 68, 6168 (Nov, 2000) y N. J. Golden, D. W. Acheson, Infect Immun 70, 1761 (Apr, 2002)), parecía haber una asociación con la adherencia o invasión de las células epiteliales intestinales.
Se examinó el impacto de la mutación flaA y/o la sustitución MOMP-T/G en la biopelícula. Las biopelículas se generaron durante 48 horas en placas de poliestireno a 42 °C en condiciones microaerófilas y se tiñeron con violeta cristal antes de evaluarlas mediante la medición de opacidad, usando un lector de placas de ELISA a A595. En muestras de control sin azúcar añadido, la formación de biopelículas de la cepa NCTC11168-deleción AflaA y MOMPT/G fue significativamente menor que la cepa de tipo salvaje (WT). Ya conocida por estudios previos, la glicosilación de la flagelina ligada a O es necesaria para el correcto ensamblaje de los filamentos de flagelos, también la mutación flaA conduce a la reducción en la formación de biopelículas debido a la motilidad reducida. Para determinar el papel de BgAg del huésped en la inhibición de la formación de biopelículas, se añadieron diversos antígenos a los medios inoculados con diferentes cepas. Se observó una formación reducida de biopelículas en presencia de estructuras de azúcar libre en los medios; el descenso más dramático se ve en WT. Para cepas de tipo salvaje, el H-II produjo la mayor reducción en un 90 % y seguido por la estructura de Leb con un 80 % en comparación con otros BgAg examinados. Probablemente, la mayor reducción se debe a la mayor afinidad, lo que afecta a la ecuación de equilibrio y requiere más tiempo para separar el azúcar libre de las moléculas de la superficie y evita la formación de biopelículas. Aunque cuanto más fuerte es la afinidad de unión más se interrumpe la formación de biopelícula. Estos datos sugieren que los BgAg compiten con los AAG y los determinantes de biopelículas en flagelina y MOMP, también confirmaron la validez del modelo y subrayó el papel crítico de la O-glicosilación en la formación de biopelículas (Figura 7-Figura A y B).
Este experimento se repitió y se logró el mismo patrón. Teniendo en cuenta que la posición de la placa puede afectar al crecimiento; se añadieron las muestras y su control en posición idéntica en diferentes placas. Asimismo, se tomó una alícuota de cada muestra y se cultivó en CCDA, mostró que el crecimiento fue igual en todas.
La estructura de energía más baja de la proteína MOMP.
Los estudios funcionales y estructurales de las proteínas de la membrana externa de las bacterias gramnegativas se llevan a cabo con frecuencia utilizando proteínas replegadas. Aunque varias estructuras de PME (proteínas de la membrana externa) bacterianas ya están disponibles, un gran número de estas proteínas todavía están estructural y funcionalmente mal caracterizadas. Se generó un modelo para MOMP de C. jejuni para estudiar el efecto de la glicosilación en la conformación de MOMP y también su papel en la actividad de unión bacteriana. El modelo se puede usar para predecir las funciones de proteínas no caracterizadas y para mapear vías funcionales en C. jejuni y otros procariotas. Los datos pueden proporcionar un marco para comprender los procesos biológicos dinámicos, tal como la unión primaria de C. jejuni a los antígenos del grupo histo-sanguíneo.
Alineación de porA de diferentes aislamientos bacterianos
Alineación de múltiple secuencia CLUSTAL W (1.81) utilizando la matriz de ponderación BLOSUM, de las principales secuencias de la membrana externa de Campylobacter jejuni descargadas de la base de datos Uniprot (http://www.uniprot.org/). Asimismo, se añadieron tres aislamientos clínicos no aglutinantes (NB) y tres aglutinantes altos (HB) a esta serie (secuenciación interna). Las posiciones de los aminoácidos se refieren a las posiciones en la cepa NCTC11168 (P80672).
La alineación mostró que los principales contribuyentes de la interacción de la MOMP glicosilada con Leb a través de enlaces de hidrógeno son los restos 352 (Arg), 381 (Arg) y 278 (Lys), mientras que solo los restos 352 y 278 están involucrados en la interacción de MOMP no glicosilada con Leb. Las alineaciones de secuencias de aminoácidos que indican los sitios activos de MOMP de aislamientos de C. jejuni de diferentes pacientes han sido lo suficientemente estables para este propósito. Curiosamente, el resto 278 (Lys) está semiconservado en 16 aislamientos y se sustituyó por Arg, que puede mediar el enlace a través del enlace de hidrógeno de manera similar a los restos 381 (Arg) y 352 (Arg).
Asimismo, la alineación de estas secuencias también demuestra que difieren predominantemente en el bucle 4, pero el espacio de unión entre el bucle 4 y 7 está relativamente conservado. Un estudio definitivo sobre la asociación del huésped de MOMP requeriría datos de análisis de glicosilación para aislamientos de una amplia variedad de

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto para su uso en un método seleccionado de:
    un método para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal y, por lo tanto, desinfectar al animal;
    un método para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de animales con Campylobacter; o un método para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal, o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal y desinfectar de este modo al animal;
    en donde el compuesto para su uso está opcionalmente en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto, y
    en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
    a) un complejo de tirosina con Fe III
    Figure imgf000103_0001
    b) quinato férrico; y
    c) un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III
    Figure imgf000103_0002
    2. Uso de un compuesto como se define en la reivindicación 1,
    en el que el compuesto, en uso, está opcionalmente en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto;
    en donde dicho uso se selecciona de un uso:
    para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal no humano y, por lo tanto, desinfectar al animal, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se define en la reivindicación 1 en una cantidad efectiva a dicho animal para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de dicho animal y, luego, sacrificar al animal;
    para prevenir o reducir la colonización del tracto gastrointestinal de animales no humanos con Campylobacter, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se define en la reivindicación 1 a dicho animal y, a continuación sacrificar al animal; o
    para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal no humano, o reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de un animal no humano y, de este modo, desinfectar al animal, por un método que comprende administrar al menos un compuesto como se define en la reivindicación 1 en una cantidad efectiva a dicho animal para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal y, a continuación, sacrificar al animal.
    3. Un procedimiento para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de un animal no humano y, de este modo, desinfectar al animal antes del sacrificio, comprendiendo el método:
    i) administrar al menos un compuesto como se define en la reivindicación 1 en una cantidad efectiva a dicho animal para reducir el número de Campylobacter presente en el tracto gastrointestinal de dicho animal, opcionalmente, en donde el compuesto para su uso está en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto; y
    ii) sacrificar al animal.
    4. Un procedimiento para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de un animal no humano, o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal y desinfectar de este modo al animal antes del sacrificio, comprendiendo el método:
    i) administrar al menos un compuesto como se ha definido en la reivindicación 1 en una cantidad efectiva a dicho animal para evitar que Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal, opcionalmente, en el que el compuesto para su uso está en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto; y
    ii) sacrificar al animal.
    5. Un compuesto como se define en la reivindicación 1 para su uso en un método para la prevención o la reducción de la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal a otro,
    en donde el compuesto para su uso está opcionalmente en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto; y
    en donde el método comprende administrar el compuesto a dichos animales en una cantidad eficaz para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal.
    6. Uso de un compuesto como se define en la reivindicación 1 para la prevención o la reducción de la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal no humano a otro,
    en el que el compuesto, en uso, está opcionalmente en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto;
    por un método que comprende la administración del compuesto a dichos animales en una cantidad eficaz para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formada por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal y, después, sacrificar a los animales.
    7. Un método para prevenir o reducir la transmisión de la infección por Campylobacter de un animal no humano a otro antes del sacrificio, comprendiendo el método:
    i) administrar al menos un compuesto como se define en la reivindicación 1 a dichos animales en una cantidad eficaz para evitar que dicho Campylobacter forme una biopelícula en el tracto gastrointestinal de dicho animal o para reducir la cantidad de biopelícula formado por Campylobacter en el tracto intestinal de dicho animal, opcionalmente, en donde el compuesto para su uso está en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto; y
    ii) sacrificar a los animales.
    8. Un compuesto para su uso de acuerdo con la reivindicación 5, el uso de la reivindicación 6 o un método de acuerdo con la reivindicación 7, para prevenir o reducir la propagación de la infección por Campylobacter dentro de una bandada o rebaño de animales, por ejemplo, para prevenir la propagación de la infección por Campylobacter dentro de una bandada de pollos.
    9. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5 u 8, el uso de las reivindicaciones 2, 6 u 8, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7 u 8, en donde Campylobacter es Campylobacter jejuni o Campylobacter coli.
    10. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9, en donde el compuesto es un complejo de tirosina con Fe III
    Figure imgf000105_0001
    11. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9, en el que el compuesto es quinato férrico.
    12. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9, en donde el compuesto es un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III
    Figure imgf000105_0002
    13. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 12, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 12, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 12, en el que el compuesto se administra por vía oral.
    14. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 13, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 13, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 13, en el que el compuesto se administra al animal en el pienso o el agua potable del animal.
    15. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 14, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 14, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 14, en donde el animal es un animal no humano y en donde el compuesto se administra diariamente entre 1 y 10 días, o entre 3 y 5 días antes del sacrificio del animal.
    16. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 14, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 14, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 14, en donde el compuesto se administra a un pollo más de 10 días antes del sacrificio para prevenir la transmisión de Campylobacter dentro de una bandada de pollos.
    17. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 16, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 16, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 16, en donde el compuesto se administra en una cantidad de 0,3-32 mg/día/kilo de peso corporal del animal.
    18. Uso de un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12 para reducir la cantidad de Camplyobacter en la carne por un método que comprende las etapas de:
    (i) proporcionar a un animal no humano, o a una bandada o a un rebaño de animales no humanos, un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12; y
    (ii) preparar un producto cárnico del animal; y
    opcionalmente, en donde el compuesto, en uso, tiene la forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto.
    19. Un método para reducir la cantidad de Camplyobacter en la carne que comprende las etapas de:
    (i) proporcionar a un animal no humano, o a una bandada o a un rebaño de animales no humanos, un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12, opcionalmente, en donde el compuesto para su uso está en forma de un pienso para animales, agua potable para animales, ingrediente alimenticio o suplemento alimenticio que comprende el compuesto; y
    (ii) preparar un producto cárnico a partir del animal.
    20. El compuesto para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 5, 8 o 9 a 17, el uso de las reivindicaciones 2, 6, 8 o 9 a 17, o el método de acuerdo con las reivindicaciones 3, 4, 7, 8 o 9 a 17, el uso de acuerdo con la reivindicación 18, o el método de acuerdo con la reivindicación 19, en donde el animal se selecciona de ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras, ciervo, pescado, mariscos y aves de corral.
    21. El compuesto para su uso, el uso o el método, de la reivindicación 20, en donde el animal es un ave de corral, tal como un pollo, ganso, pavo o pato, y, preferentemente, un pollo.
    22. El compuesto para su uso, el uso o el método, de las reivindicaciones 20 o 21, en donde el animal está en una bandada o un rebaño.
    23. Un pienso para animales, que comprende un compuesto como ingrediente alimenticio o como suplemento alimenticio, en donde el pienso para animales es un alimento destinado o adecuado para el consumo por parte de animales, y el compuesto es:
    un complejo de tirosina con Fe III
    Figure imgf000106_0001
    y
    en donde el pienso para animales comprende el compuesto en una cantidad efectiva para reducir o prevenir la colonización del tracto gastrointestinal de un animal con Campylobacter.
    24. Una composición oral, pienso para animales o agua potable para animales, que comprende un compuesto que es un complejo de 3,4 dihidroxifenilalanina con Fe III
    Figure imgf000107_0001
    en donde la composición oral, en el pienso para animales, o el agua potable para animales, comprende el compuesto en una cantidad efectiva para reducir o prevenir la colonización del tracto gastrointestinal de un animal con Campylobacter.
    25. Un pienso para animales de acuerdo con la reivindicación 23, o una composición oral, pienso para animales o agua potable para animales de acuerdo con la reivindicación 24, que es para un animal seleccionado de ganado bovino, ovejas, cerdos, cabras, ciervo, pescado, mariscos y aves de corral.
    26. Un pienso para animales de acuerdo con la reivindicación 23, o una composición oral, pienso para animales o agua potable para animales de acuerdo con la reivindicación 24, que es para un ave de corral, tal como un pollo, ganso, pavo o pato, y, preferentemente, un pollo.
    27. Uso de un compuesto, como se ha definido en las reivindicaciones 23 o 24, como suplemento alimenticio o ingrediente alimenticio en la fabricación de un pienso para animales, o como un aditivo en la fabricación de agua potable para animales.
    28. Un método para la fabricación de un pienso para animales o agua potable para animales, en donde el método comprende el uso de un compuesto, como se define en la reivindicación 23 o la reivindicación 24, como suplemento alimenticio o ingrediente alimentario en la fabricación del pienso para animales, o como aditivo en la fabricación de agua potable para animales.
    29. Un método para desinfectar un producto alimenticio que comprende administrar un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12 en una cantidad efectiva al producto alimenticio para reducir la cantidad de Campylobacter en el producto alimenticio.
    30. Uso de un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12 para desinfectar un producto alimenticio, administrando en una cantidad eficaz del compuesto al producto alimenticio para reducir la cantidad de Campylobacter en el producto alimenticio.
    31. El método de la reivindicación 29 o el uso de la reivindicación 30, en donde el producto alimenticio es un alimento para consumo humano.
    32. El método de las reivindicaciones 29 o 31, o el uso de las reivindicaciones 30 o 31, en donde el producto alimenticio es un producto cárnico, por ejemplo, un producto de carne fresca, un producto de carne procesada, un producto de carne refrigerada, un producto de carne congelada o un producto de carne cocida.
    33. El método o uso de la reivindicación 32, en el que el producto cárnico se selecciona de una carne de vacuno, de cordero, de cerdo, de pato, de pollo, de ganso, de pavo, de conejo, de pescado o de marisco.
    34. Un compuesto como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 10, 11 o 12 para su uso en la profilaxis o el tratamiento de la infección por Campylobacter en seres humanos.
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