ES2730384T3

ES2730384T3 - Score of lymphocyte infiltration of tumors

Info

Publication number: ES2730384T3
Application number: ES15804189T
Authority: ES
Inventors: Yinyin Yuan
Original assignee: Institute of Cancer Research
Current assignee: Institute of Cancer Research
Priority date: 2014-11-24
Filing date: 2015-11-24
Publication date: 2019-11-11
Anticipated expiration: 2035-11-24
Also published as: GB201420859D0; US10346973B2; WO2016083791A1; EP3224624A1; US20170365053A1; EP3224624B1

Abstract

Un procedimiento implementado por ordenador ex vivo para medir la infiltración inmunitaria en un tumor, comprendiendo el procedimiento: proporcionar una imagen del tumor en el que se han identificado linfocitos y células cancerosas; obtener una medición de linfocitos respecto al cáncer para cada linfocito, que comprende aplicar una estimación de la densidad para obtener un modelo de la densidad de células cancerosas; y determinar la proximidad de cada linfocito a la densidad de células cancerosas; clasificar un subconjunto de linfocitos como linfocitos intratumorales según su medición de linfocitos a cáncer, en donde un linfocito se clasifica como linfocito intratumoral si su medición de linfocitos a cáncer está por encima de un valor umbral; cuantificar los linfocitos intratumorales y las células cancerosas en la imagen del tumor; y calcular la relación de linfocitos intratumorales (RLIT) como la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas, en donde la RLIT es una medida de la infiltración inmunitaria en el tumor.An ex vivo computer-implemented method for measuring immune infiltration into a tumor, the method comprising: providing an image of the tumor in which lymphocytes and cancer cells have been identified; obtaining a measure of lymphocytes relative to cancer for each lymphocyte, comprising applying density estimation to obtain a model of cancer cell density; and determining the proximity of each lymphocyte to the cancer cell density; classifying a subset of lymphocytes as intratumoral lymphocytes based on their lymphocyte-to-cancer measurement, wherein a lymphocyte is classified as an intratumoral lymphocyte if its lymphocyte-to-cancer measurement is above a threshold value; quantify intratumoral lymphocytes and cancer cells in the tumor image; and calculating the intratumoral lymphocyte ratio (ILRT) as the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells, wherein the RLIT is a measure of immune infiltration into the tumor.

Description

DESCRIPCIÓNDESCRIPTION

Puntuación de la infiltración linfocitaria de los tumoresScore of lymphocyte infiltration of tumors

Campo de la invenciónField of the Invention

La presente invención se refiere al análisis de tumores y al pronóstico del cáncer. En particular, la presente invención se refiere a procedimientos de análisis de tumores para determinar un pronóstico en cáncer.The present invention relates to tumor analysis and cancer prognosis. In particular, the present invention relates to tumor analysis procedures for determining a prognosis in cancer.

AntecedentesBackground

El cáncer es una enfermedad compleja y dinámica y se han desarrollado muchas formas diferentes de analizar y clasificar los tumores con el objetivo de determinar el grado de progresión o capacidad de invasión del tumor y el pronóstico para el paciente, e informar sobre las decisiones de tratamiento.Cancer is a complex and dynamic disease and many different ways of analyzing and classifying tumors have been developed in order to determine the degree of progression or invasion capacity of the tumor and the prognosis for the patient, and report treatment decisions. .

Los procedimientos de análisis de tumores incluyen la evaluación de la morfología celular en tumores (realizada normalmente por anatomopatólogos), medición de la expresión génica en tumores (por ejemplo, mediante análisis de micromatrices), determinación del estado de mutación génica en células tumorales y evaluación de la expresión de proteínas dentro de tumores (por ejemplo, mediante evaluación inmunohistoquímica de secciones de tumores). Estos procedimientos de análisis de tumores son importantes no solo para predecir el resultado clínico, sino también para indicar las decisiones sobre la terapia del paciente.Tumor analysis procedures include the evaluation of cell morphology in tumors (usually performed by pathologists), measurement of gene expression in tumors (for example, by microarray analysis), determination of the state of gene mutation in tumor cells and evaluation of protein expression within tumors (for example, by immunohistochemical evaluation of tumor sections). These tumor analysis procedures are important not only to predict the clinical outcome, but also to indicate decisions about patient therapy.

Más recientemente, se ha hecho evidente que el estado inmunológico de los tumores puede proporcionar información pronóstica útil. Cada vez hay más evidencia que apoya la importancia clínica de la respuesta inmunitaria en muchos tipos de cáncer (Galon et al. 2006, Denkert et al. 2010, Loi et al.). Estudios consistentes han indicado asociaciones entre la actividad inmune y el resultado de la enfermedad, así como la respuesta al tratamiento (Galon et al. 2006, Denkert et al. 2010, Loi et al., Liu et al., Lee et al., DeNardo et al.).More recently, it has become apparent that the immune status of tumors can provide useful prognostic information. There is increasing evidence to support the clinical importance of the immune response in many types of cancer (Galon et al. 2006, Denkert et al. 2010, Loi et al.). Consistent studies have indicated associations between immune activity and disease outcome, as well as response to treatment (Galon et al. 2006, Denkert et al. 2010, Loi et al., Liu et al., Lee et al., DeNardo et al.).

Además, la evidencia creciente de los ensayos clínicos apoya el potencial de las terapias que apuntan a la actividad inmunológica en ciertos tipos de cáncer (Robert et al., Stagg et al.). Este es quizás el mejor ejemplo de ello en el melanoma en estadio tardío, en el que los ensayos clínicos recientes han demostrado una mayor ventaja de supervivencia en pacientes que reciben el anticuerpo monoclonal ipilimumab, que está dirigido al receptor de la proteína CTLA4 que se expresa en la superficie de los linfocitos T (Robert et al.). Esto ha conducido al desarrollo de procedimientos más estandarizados para caracterizar el infiltrado inmune de tumores en cánceres como la "evaluación inmunitaria" que pretende cuantificar el infiltrado inmune in situ además de los parámetros clínicos estandarizados para ayudar al pronóstico y la selección de pacientes para inmunoterapia en cánceres colorrectales (Galon et al. 2014). In addition, increasing evidence from clinical trials supports the potential of therapies that point to immune activity in certain types of cancer (Robert et al., Stagg et al.). This is perhaps the best example of this in late stage melanoma, in which recent clinical trials have shown a greater survival advantage in patients receiving the ipilimumab monoclonal antibody, which is directed at the CTLA4 protein receptor that is expressed on the surface of T lymphocytes (Robert et al.). This has led to the development of more standardized procedures to characterize the immune infiltrate of tumors in cancers as the "immune evaluation" that aims to quantify the immune infiltrate in situ in addition to the standardized clinical parameters to help the prognosis and selection of patients for immunotherapy in colorectal cancers (Galon et al. 2014).

Sin embargo, para facilitar la estandarización y la reproducibilidad de la puntuación inmunitaria de la infiltración, se necesitan con urgencia enfoques objetivos (Galon et al. 2014). Además, estos enfoques deben tener en cuenta la complejidad de la infiltración inmunitaria en los tumores. La abundancia, la heterogeneidad espacial y el tipo de células inmunitarias son los parámetros clave de la infiltración inmunitaria (Galon et al. 2014, Fridman et al.). Por ejemplo, se ha demostrado que las ubicaciones espaciales de las células inmunitarias son útiles para predecir el pronóstico del cáncer colorrectal (Galon et al. 2006). De hecho, la "puntuación inmunitaria" patológica se basa en la numeración de dos poblaciones de linfocitos (células CD8+ y CD45RO+), tanto en el núcleo del tumor como en el margen invasivo que maximiza la potencia pronóstica (Galon et al. 2014).However, to facilitate the standardization and reproducibility of the infiltration immune score, objective approaches are urgently needed (Galon et al. 2014). In addition, these approaches should take into account the complexity of immune infiltration in tumors. Abundance, spatial heterogeneity and the type of immune cells are the key parameters of immune infiltration (Galon et al. 2014, Fridman et al.). For example, it has been shown that the spatial locations of immune cells are useful for predicting the prognosis of colorectal cancer (Galon et al. 2006). In fact, the pathological "immune score" is based on the numbering of two lymphocyte populations (CD8 + and CD45RO + cells), both in the tumor nucleus and in the invasive margin that maximizes prognostic potency (Galon et al. 2014).

Asimismo, se ha demostrado en estudios a gran escala de cáncer de mama que la evaluación patológica de los linfocitos de infiltración tumoral basados en biopsias con aguja gruesa teñidas con hematoxilina y eosina (H y E) es un factor pronóstico importante para la respuesta a la quimioterapia neoadyuvante en 1.058 muestras de cáncer de mama (Denkert et al., 2010). Recientemente, un estudio prospectivo demostró que en el cáncer de mama negativo para HER2, los linfocitos estromales pueden ser un factor predictivo independiente de respuesta a la quimioterapia neoadyuvante (Issa-Nummer et al.). Por lo tanto, la organización espacial de la infiltración linfocitaria en el contexto de las células cancerosas cercanas es una importante característica clínico-patológica de los tumores.Likewise, it has been shown in large-scale studies of breast cancer that the pathological evaluation of tumor infiltration lymphocytes based on thick needle biopsies stained with hematoxylin and eosin (H and E) is an important prognostic factor for the response to neoadjuvant chemotherapy in 1,058 breast cancer samples (Denkert et al., 2010). Recently, a prospective study showed that in HER2-negative breast cancer, stromal lymphocytes may be an independent predictive factor in response to neoadjuvant chemotherapy (Issa-Nummer et al.). Therefore, the spatial organization of lymphocyte infiltration in the context of nearby cancer cells is an important clinical-pathological characteristic of tumors.

Galon et al. 2014 se refiere a una metodología llamada "puntuación inmunitaria" para cuantificar el infiltrado de células inmunes in situ. 2013 se refiere a procedimientos de análisis de imágenes digitales para integrar la abundancia celular, métrica de distancia, relaciones de vecindad y heterogeneidad de la muestra en la evaluación integral de los infiltrados inmunes.Galon et al. 2014 refers to a methodology called "immune score" to quantify the infiltration of immune cells in situ. 2013 refers to digital image analysis procedures to integrate cell abundance, distance metrics, neighborhood relationships and heterogeneity of the sample in the integral evaluation of immune infiltrates.

En el cáncer de mama triple negativo (TNBC), una respuesta inmunitaria activa se ha asociado a un pronóstico favorable (Loi et al., Denkert et al.). Un estudio de inmunohistoquímica a gran escala de 3.400 muestras de cáncer de mama ha demostrado que el TNBC es el único subtipo de cáncer de mama que demuestra una relación significativa entre las células inmunitarias positivas para CD8 y un buen pronóstico (Liu et al.). La evaluación de la infiltración linfocitaria basada en secciones de H y E de todo el tumor se ha asociado a un resultado favorable en 256 pacientes después de la quimioterapia basada en antraciclina (Loi et al.). Un estudio prospectivo reciente mostró que la presencia de linfocitos infiltrantes de tumores en tumores residuales después de la quimioterapia neoadyuvante predice un buen pronóstico en TNBC (Dieci et al.). Dada la actual falta de tratamiento molecular dirigido y el mal resultado clínico de TNBC, esto puede sugerir nuevas oportunidades terapéuticas para este tipo de tumor agresivo (Stagg et al.). Por ejemplo, la acumulación de datos sugiere que las antraciclinas median su acción a través de la activación de las respuestas de los linfocitos T CD8+, por lo tanto, la combinación con ciertas inmunoterapias podría ser especialmente efectiva para el TNBC (Stagg et al.).In triple negative breast cancer (TNBC), an active immune response has been associated with a favorable prognosis (Loi et al., Denkert et al.). A large-scale immunohistochemical study of 3,400 breast cancer samples has shown that TNBC is the only breast cancer subtype that demonstrates a significant relationship between CD8 positive immune cells and a good prognosis (Liu et al.). Evaluation of lymphocytic infiltration based on sections of H and E of the entire tumor has been associated with a favorable outcome in 256 patients after anthracycline-based chemotherapy (Loi et al.). A recent prospective study showed that the presence of tumor infiltrating lymphocytes in residual tumors after neoadjuvant chemotherapy predicts a good prognosis in TNBC (Dieci et al.). Given the current lack of targeted molecular treatment and the poor clinical outcome of TNBC, this may suggest new therapeutic opportunities for this type of aggressive tumor (Stagg et al.). For example, the accumulation of data suggests that anthracyclines mediate their action through the activation of CD8 + T lymphocyte responses, therefore, the combination with certain immunotherapies could be especially effective for TNBC (Stagg et al.) .

Sin embargo, a pesar de estos avances en la comprensión de la importancia de la infiltración inmunitaria en el cáncer, hay una falta de enfoques reproducibles para evaluar objetivamente la infiltración inmunitaria basada en secciones patológicas.However, despite these advances in understanding the importance of immune infiltration in cancer, there is a lack of reproducible approaches to objectively assess immune infiltration based on pathological sections.

Sumario de la invenciónSummary of the invention

La infiltración linfocitaria en los tumores a menudo se asocia a un pronóstico favorable y predice la respuesta a la quimioterapia en muchos tipos de cáncer. Sin embargo, no se comprende bien porque los altos niveles de heterogeneidad espacial y molecular dentro de los tumores dificultan el análisis mediante la evaluación patológica tradicional.Lymphocytic infiltration in tumors is often associated with a favorable prognosis and predicts the response to chemotherapy in many types of cancer. However, it is not well understood because high levels of spatial and molecular heterogeneity within tumors make analysis difficult by traditional pathological evaluation.

La identificación de los tipos de células por los anatomopatólogos en la evaluación de la infiltración inmunitaria proporciona información cualitativa en escalas ordinales gruesas. Dicha información no es adecuada para analizar grandes colecciones de datos, en parte porque la gran cantidad de aportes humanos requeridos hace que los estudios a gran escala requieran mucho tiempo y dinero, en parte porque la naturaleza subjetiva de la evaluación causa un grado inaceptable de variabilidad en la información y en parte porque los datos cualitativos generados no se prestan para el análisis estadístico.The identification of cell types by pathologists in the evaluation of immune infiltration provides qualitative information on thick ordinal scales. Such information is not adequate to analyze large collections of data, partly because the large amount of human contributions required makes large-scale studies require a lot of time and money, partly because the subjective nature of the evaluation causes an unacceptable degree of variability. in the information and partly because the qualitative data generated is not suitable for statistical analysis.

El inventor ha ideado un procedimiento robusto y reproducible para evaluar objetivamente la infiltración inmunitaria en tumores. El procedimiento se realiza en una imagen tumoral en la que se han identificado linfocitos y células cancerosas.The inventor has devised a robust and reproducible procedure to objectively assess immune infiltration in tumors. The procedure is performed on a tumor image in which lymphocytes and cancer cells have been identified.

El procedimiento puede realizarse en imágenes de cortes de tumores teñidos con hematoxilina y eosina (H y E). Las secciones teñidas con H y E y las imágenes de secciones teñidas con H y E, a menudo están fácilmente disponibles como parte de los conjuntos de datos recopilados para grupos de estudio de cáncer, tal como el grupo METABRIC (Curtis, 2012) y el grupo Cancer Genome Atlas (TCGA) (TCGA, 2012), lo que hace que los procedimientos de la presente invención sean fácilmente adaptables para su uso para analizar tumores de diversos tipos de cáncer. El procedimiento puede comprender una etapa de tratar una sección de tumor con una tinción, tal como H y E, en el que la presencia de estructuras subcelulares, tales como los núcleos, crea complejos entre la tinción y la estructura subcelular.The procedure can be performed on images of tumor sections stained with hematoxylin and eosin (H and E). The sections stained with H and E and the images of sections stained with H and E are often readily available as part of the data sets collected for cancer study groups, such as the METABRIC group (Curtis, 2012) and the Cancer Genome Atlas (TCGA) group (TCGA, 2012), which makes the methods of the present invention easily adaptable for use in analyzing tumors of various types of cancer. The method may comprise a step of treating a tumor section with a stain, such as H and E, in which the presence of subcellular structures, such as nuclei, creates complexes between staining and the subcellular structure.

La presente invención se refiere a un procedimiento para medir la infiltración inmunitaria en un tumor. En particular, un procedimiento para determinar una medición objetiva de la infiltración inmunitaria en un tumor, referido en el presente documento como RLIT. La RLIT (relación de linfocitos intratumorales) es la proporción de linfocitos intratumorales a células cancerosas en el tumor expresada como una fracción decimal. Por ejemplo, una relación de 11 linfocitos intratumorales a 1000 células cancerosas corresponde a una RLIT de 0,011.The present invention relates to a method for measuring immune infiltration in a tumor. In particular, a procedure for determining an objective measurement of immune infiltration in a tumor, referred to herein as RLIT. RLIT (ratio of intratumoral lymphocytes) is the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells in the tumor expressed as a decimal fraction. For example, a ratio of 11 intratumoral lymphocytes to 1000 cancer cells corresponds to an RLIT of 0.011.

El procedimiento de la invención en su sentido general es un procedimiento implementado por ordenador ex vivo para medir la infiltración inmunitaria en un tumor, comprendiendo el procedimiento:The method of the invention in its general sense is a procedure implemented by ex vivo computer to measure immune infiltration in a tumor, the procedure comprising:

proporcionar una imagen del tumor en el que se han identificado linfocitos y células cancerosas;provide an image of the tumor in which lymphocytes and cancer cells have been identified;

obtener una medición de linfocitos respecto al cáncer para cada linfocito, que comprende aplicar una estimación de la densidad para obtener un modelo de la densidad de células cancerosas; y determinar la proximidad de cada linfocito a la densidad de células cancerosas; clasificar una subpoblación de los linfocitos como linfocitos intratumorales según su relación linfocito a cáncer, en el que un linfocito se clasifica como linfocito intratumoral si su medición de linfocito a cáncer supera un valor umbral;obtaining a measurement of lymphocytes with respect to cancer for each lymphocyte, which comprises applying a density estimate to obtain a model of cancer cell density; and determine the proximity of each lymphocyte to the density of cancer cells; classify a subpopulation of lymphocytes as intratumoral lymphocytes according to their lymphocyte to cancer ratio, in which a lymphocyte is classified as an intratumoral lymphocyte if its measurement of lymphocyte to cancer exceeds a threshold value;

cuantificar los linfocitos intratumorales y las células cancerosas en la imagen del tumor; y calcular la relación de linfocitos intratumorales (RLIT) como la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas, en el que la RLIT es una medida de la infiltración inmunitaria en el tumor.quantify intratumoral lymphocytes and cancer cells in the tumor image; and calculate the ratio of intratumoral lymphocytes (RLIT) as the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells, in which RLIT is a measure of immune infiltration into the tumor.

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar un valor de corte para la RLIT para su uso en la determinación de un pronóstico en cáncer, en el que una RLIT por debajo del valor de corte indica un mal pronóstico. El procedimiento comprende determinar la RLIT para una pluralidad de tumores, en el que cada tumor es de un paciente con cáncer respectivo en una cohorte de pacientes con cáncer y seleccionar un valor de corte para la RLIT en el que los pacientes con una RLIT más baja que el valor de corte tienen un peor pronóstico en comparación con los pacientes con una RLIT igual a o más alta que el valor de corte.The present invention relates to a method for determining a cut-off value for RLIT for use in determining a prognosis in cancer, in which an RLIT below the cut-off value indicates a poor prognosis. The method comprises determining the RLIT for a plurality of tumors, in which each tumor is from a respective cancer patient in a cohort of cancer patients and selecting a cut-off value for the RLIT in which patients with a lower RLIT that the cut-off value has a worse prognosis compared to patients with an RLIT equal to or higher than the cut-off value.

En consecuencia, un aspecto de la invención proporciona un procedimiento para determinar un valor de corte de la RLIT para un tipo o subtipo de cáncer, para su uso en proporcionar un pronóstico en un paciente con cáncer que tiene ese tipo de cáncer, comprendiendo el procedimiento: Accordingly, one aspect of the invention provides a method for determining a cut-off value of the RLIT for a type or subtype of cancer, for use in providing a prognosis in a cancer patient having that type of cancer, the method comprising :

medir la infiltración inmunitaria en un tumor de cada miembro de una cohorte de pacientes con cáncer que tienen el tipo o subtipo de cáncer de acuerdo con los procedimientos de la invención, calculando así la RLIT para cada tumor;measure immune infiltration in a tumor of each member of a cohort of cancer patients who have the type or subtype of cancer according to the methods of the invention, thereby calculating the RLIT for each tumor;

relacionar la RLIT para cada tumor con el resultado clínico de cada paciente con cáncer en la cohorte de pacientes con cáncer; y seleccionar un valor de corte para la RLIT, en el que una RLIT igual o inferior al valor de corte se asocia a un resultado clínico significativamente peor en la cohorte de pacientes con cáncer que una RLIT por encima del valor de corterelate the RLIT for each tumor to the clinical outcome of each cancer patient in the cohort of cancer patients; and select a cut-off value for the RLIT, in which an RLIT equal to or less than the cut-off value is associated with a significantly worse clinical outcome in the cohort of cancer patients than an RLIT above the cut-off value.

La presente invención se refiere a un procedimiento para proporcionar un pronóstico en cáncer. En particular, un procedimiento para utilizar la RLIT como biomarcador pronóstico para un paciente con cáncer. El procedimiento puede comprender medir la RLIT de un tumor de un paciente con cáncer y usar la RLIT para determinar un pronóstico para el paciente. El procedimiento puede comprender determinar la RLIT en un tumor de un paciente con cáncer y usar la RLIT para determinar un pronóstico para el paciente, en el que una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado indica un mal pronóstico.The present invention relates to a method for providing a prognosis in cancer. In particular, a procedure to use RLIT as a prognostic biomarker for a cancer patient. The procedure may comprise measuring the RLIT of a tumor of a cancer patient and using the RLIT to determine a prognosis for the patient. The procedure may comprise determining the RLIT in a tumor of a cancer patient and using the RLIT to determine a prognosis for the patient, in which an RLIT below a predetermined cut-off value indicates a poor prognosis.

En consecuencia, un aspecto de la invención proporciona un procedimiento para proporcionar un pronóstico en un paciente con cáncer, comprendiendo el procedimiento:Accordingly, one aspect of the invention provides a method for providing a prognosis in a cancer patient, the procedure comprising:

medir la infiltración inmunitaria en un tumor del paciente con cáncer de acuerdo con los procedimientos de la invención, calculando de este modo la RLIT para el tumor,measure immune infiltration in a tumor of the cancer patient according to the methods of the invention, thereby calculating the RLIT for the tumor,

en el que una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado de RLIT indica un mal pronóstico.in which an RLIT below a predetermined cut-off value of RLIT indicates a poor prognosis.

La presente invención proporciona además un antagonista de CTLA4, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que el paciente de cáncer tiene cáncer de mama triple negativo, en el que, en el procedimiento, el régimen terapéutico comprende la administración de un antagonista de CTLA4, y en el que el paciente con cáncer se trata de acuerdo con el régimen terapéutico si la RLIT determinada de acuerdo con la reivindicación 1 está por encima de un valor de corte predeterminado.The present invention further provides a CTLA4 antagonist, for use in a cancer treatment procedure, in which the cancer patient has triple negative breast cancer, in which, in the procedure, the therapeutic regimen comprises the administration of a CTLA4 antagonist, and wherein the cancer patient is treated according to the therapeutic regimen if the RLIT determined according to claim 1 is above a predetermined cut-off value.

Sumario de las figurasSummary of the figures

Figura 1. Heterogeneidad intratumoral de las células cancerosas y las distribuciones de linfocitos.Figure 1. Intratumoral heterogeneity of cancer cells and lymphocyte distributions.

A . Paisajes en 3D que ilustran la heterogeneidad espacial de las células cancerosas y los linfocitos en una sección de tumores de mama de H y E. La altura de las colinas en el paisaje 3D representa la densidad de las células. B. El análisis combinado de la distribución espacial del cáncer y los linfocitos puede conducir a la cuantificación de la infiltración linfocitaria. Se muestra una pequeña imagen de H y E y el mapa 3D de densidad de cáncer correspondiente, que facilitan la medición de la proximidad espacial al cáncer para cada linfocito en la imagen. A. 3D landscapes illustrating the spatial heterogeneity of cancer cells and lymphocytes in a section of H and E breast tumors. The height of the hills in the 3D landscape represents the density of cells. B. The combined analysis of the spatial distribution of cancer and lymphocytes can lead to quantification of lymphocyte infiltration. A small image of H and E and the corresponding 3D density map of cancer are shown, which facilitate the measurement of the spatial proximity to cancer for each lymphocyte in the image.

Figura 2. Cuantificación de la heterogeneidad intratumoral de la infiltración linfocitaria.Figure 2. Quantification of intratumoral heterogeneity of lymphocyte infiltration.

A. Representación esquemática de la cartera computacional ilustrada con una pequeña región de una sección de H y E de cáncer de mama: Imagen de H y E; células clasificadas utilizando análisis automatizado de imágenes; un mapa de la densidad del cáncer basado en el resultado del análisis de imagen para cuantificar las relaciones espaciales inmunes al cáncer. B. El descubrimiento de tres categorías de linfocitos con agrupamiento no supervisado basado en las proximidades espaciales de los linfocitos al cáncer en una subpoblación de muestras de TNBC. Estos datos se utilizaron para predecir las categorías de todos los linfocitos en todas las muestras de TNBC. C. El número óptimo de agrupaciones K como lo sugiere BIC a lo largo de 200 muestreos aleatorios es 3 en el 97 % del tiempo y 5 (3 %). Las curvas BIC para el muestreo 200 se muestran a la izquierda y el diagrama de cajas muestra las medias de los grupos para K = 3 soluciones en 200 muestreos a la derecha. D. Ilustración de la distancia a la dmin de la célula cancerosa más cercana y de la distancia al centroide de la región del casco convexo formada por 10 células cancerosas cercanas dcentroid. E. Gráficos de cajas para mostrar las diferencias entre las clases de linfocitos en términos de dmin y dcentroid (valores de p por prueba de t). F. Gráfico de dispersión que muestra dmin y dcentroid para 1.000 linfocitos seleccionados al azar, coloreado basado en las tres clases; elipses discontinuas que muestran tres grupos ajustados a dmin y dcentroid. A. Schematic representation of the computer portfolio illustrated with a small region of an H and E section of breast cancer: Image of H and E; cells classified using automated image analysis; a map of cancer density based on the result of the image analysis to quantify the spatial relationships immune to cancer. B. The discovery of three categories of lymphocytes with unsupervised clustering based on spatial proximity of lymphocytes to cancer in a subpopulation of TNBC samples These data were used to predict the categories of all lymphocytes in all TNBC samples. C. The optimal number of K clusters as suggested by BIC over 200 random samples is 3 in 97% of the time and 5 (3%). The BIC curves for sampling 200 are shown on the left and the box diagram shows the means of the groups for K = 3 solutions in 200 samples on the right. D. Illustration of the distance at d min of the nearest cancer cell and the distance to the centroid of the region of the convex hull formed by 10 nearby cancer cells d centroid. E. Box graphs to show the differences between lymphocyte classes in terms of d min and d centroid (p values per t test). F. Scatter plot showing d min and d centroid for 1,000 randomly selected lymphocytes, colored based on the three classes; discontinuous ellipses showing three groups adjusted to d min and d centroid.

Figura 3. Un ejemplo representativo que ilustra tres clases de linfocitos en el mapa de densidad de cáncer de un tumor (sección media). Figure 3. A representative example illustrating three kinds of lymphocytes in the tumor density map of a tumor ( middle section).

A . Mapa de densidad del cáncer y la distribución espacial de tres clases de linfocitos (puntos espaciales coloreados según las clases). Las líneas de contorno negras indican umbrales de corte para las tres clases de linfocitos según la densidad del cáncer. B. Histograma que muestra los tres tipos de linfocitos en esta muestra. C. Una imagen de mayor resolución de una región en esta muestra; los códigos de color siguen a A. A. Cancer density map and spatial distribution of three classes of lymphocytes (colored spatial points according to classes). Black contour lines indicate cut thresholds for the three classes of lymphocytes according to cancer density. B. Histogram showing the three types of lymphocytes in this sample. C. A higher resolution image of a region in this sample; the color codes follow A.

Figura 4. Asociación entre RLIT y parámetros clínicos de TNBC.Figure 4. Association between RLIT and clinical parameters of TNBC.

A . Proporciones de tres clases de linfocitos en 181 TNBC. B. Diagrama del triángulo para mostrar la composición de los linfocitos para cada tumor (cada punto negro representa un tumor; las líneas finas marcan el 50 % del eje correspondiente). C. Diagrama de cajas para mostrar la correlación entre las puntuaciones patológicas y la RLIT; valor de p de la prueba de JT; n = número de paciente es cada grupo; los bigotes se extienden a 1,5 rango intercuartílico. D. Asociación entre la RLIT y el tamaño del tumor, estado de nodo y mutaciones TP53; los bigotes se extienden a 1,5 rango intercuartílico. E. Distribución de la RLIT en dos cohortes con cortes óptimos marcados como líneas rojas discontinuas. F. Las curvas de Kaplan-Meier para ilustrar las probabilidades de supervivencia específicas de la enfermedad de los grupos de pacientes en dos cohortes de TNBC estratificadas por RLIT utilizando el valor de corte seleccionado en la cohorte 1. Los números en la leyenda muestran el número de pacientes en cada grupo y los números entre paréntesis muestran el número de muertes específicas por enfermedad. G . El uso de la Cohorte 2 como la cohorte de descubrimiento y la Cohorte 1 como la cohorte de validación produjo un corte óptimo similar. A. Proportions of three kinds of lymphocytes in 181 TNBC. B. Diagram of the triangle to show the composition of the lymphocytes for each tumor (each black dot represents a tumor; the fine lines mark 50% of the corresponding axis). C. Box diagram to show the correlation between pathological scores and RLIT; P value of the JT test; n = patient number is each group; the whiskers extend to 1.5 range interquartile D. Association between RLIT and tumor size, node status and TP53 mutations ; The whiskers extend to 1.5 interquartile range. E. Distribution of the RLIT in two cohorts with optimal cuts marked as dashed red lines. F. The Kaplan-Meier curves to illustrate the disease-specific survival probabilities of the patient groups in two TNBC cohorts stratified by RLIT using the cut-off value selected in cohort 1. The numbers in the legend show the number of patients in each group and the numbers in brackets show the number of specific deaths due to illness. G. The use of Cohort 2 as the discovery cohort and Cohort 1 as the validation cohort produced a similar optimal cut.

Figura 5. Comparación de RLIT con otras firmas inmunitarias.Figure 5. Comparison of RLIT with other immune signatures.

Los valores óptimos de corte se seleccionaron en la cohorte 1 y se probaron en la cohorte 2 para A . Abundancia de linfocitos basados en imágenes (Lym); B. Firma inmune de la expresión génica por Calabro et al. (18); C. Optimal cut-off values were selected in cohort 1 and tested in cohort 2 for A. Abundance of image-based lymphocytes (Lym); B. Immune signature of gene expression by Calabro et al. (18); C.

Ascierto et al. (19); D. Firma de IL8 (20); E. expresión de CXCL13. F. Comparación de cortes óptimos seleccionados en dos cohortes. Los datos se centraron en 0 y se escalaron para tener la desviación estándar 1 y los puntos de corte se asignaron a los datos escalados. Las firmas cerca de la línea diagonal tienen cortes similares en dos cohortes.Ascierto et al. (19); D. Signature of IL8 (20); E. CXCL13 expression. F. Comparison of optimal cuts selected in two cohorts. The data was centered at 0 and scaled to have standard deviation 1 and the cut-off points were assigned to the scaled data. Signatures near the diagonal line have similar cuts in two cohorts.

Figura 6. Módulos genéticos asociados a RLIT.Figure 6. Genetic modules associated with RLIT.

A . Las curvas de Kaplan-Meier para ilustrar las diferencias en la supervivencia específica de la enfermedad de grupos de pacientes de igual tamaño estratificados en función de la expresión de genes clave en tres módulos. B. Curvas de Kaplan-Meier para ilustrar las diferencias en la supervivencia específica de la enfermedad de los grupos de pacientes estratificados con expresión de CTLA4 por los 25 percentiles más bajos, 50 en el medio y 25 más altos, RLIT, y CTLA4 e RLIT combinados. La diferencia de supervivencia entre la estratificación alta y baja de CTLA dentro del grupo alto de RLIT se da como un valor de p. A. The Kaplan-Meier curves to illustrate the differences in disease-specific survival of groups of patients of equal size stratified according to the expression of key genes in three modules. B. Kaplan-Meier curves to illustrate the differences in disease-specific survival of groups of patients stratified with CTLA4 expression by the lowest 25 percentiles, 50 in the middle and 25 highest, RLIT, and CTLA4 and RLIT combined. The difference in survival between the high and low stratification of CTLA within the high RLIT group is given as a value of p.

Figura 7. Las curvas de Kaplan-Meier para ilustrar las probabilidades de supervivencia específicas de la enfermedad de los grupos de pacientes en dos cohortes de TNBC estratificadas por RLAT (adyacente) y RLTD (distal). Figure 7. The Kaplan-Meier curves to illustrate the disease-specific survival probabilities of the patient groups in two TNBC cohorts stratified by RLAT ( adjacent) and RLTD ( distal).

Las firmas se dicotomizaron usando un corte seleccionado en un rango de percentiles basado en la cohorte 1 (las columnas izquierda y central) y se probaron en la cohorte 2 (la columna derecha). Las líneas discontinuas en los gráficos de la izquierda marcan el umbral de significación de p = 0,05, y las líneas verticales continuas muestran los mejores cortes. Para las curvas de Kaplan-Meier, los números en la leyenda muestran el número de pacientes en cada grupo y los números entre paréntesis muestran el número de muertes específicas por enfermedad. Signatures were dichotomized using a cut selected in a percentile range based on cohort 1 (the left and center columns) and tested on cohort 2 (the right column). The dashed lines in the graphs on the left mark the threshold of significance of p = 0.05, and the continuous vertical lines show the best cuts. For the Kaplan-Meier curves, the numbers in the legend show the number of patients in each group and the numbers in brackets show the number of specific deaths due to illness.

Figura 8. Las curvas de Kaplan-Meier para ilustrar las probabilidades de supervivencia específicas de la enfermedad de los grupos de pacientes en dos cohortes de TNBC estratificadas por RLAT (adyacente) y RLTD (distal). Figure 8. The Kaplan-Meier curves to illustrate the disease-specific survival probabilities of the patient groups in two TNBC cohorts stratified by RLAT ( adjacent) and RLTD ( distal).

Las firmas se dicotomizaron usando un corte seleccionado en un rango de percentiles basado en la cohorte 2 (las columnas izquierda y derecha) y se probaron en la cohorte 1 (la columna derecha).Signatures were dichotomized using a cut selected in a percentile range based on cohort 2 (the left and right columns) and tested on cohort 1 (the right column).

Figura 9. Las curvas de Kaplan-Meier ilustran las probabilidades de supervivencia específicas de la enfermedad de los grupos de pacientes en dos cohortes de TNBC estratificadas por nueve firmas inmunitarias.Figure 9. The Kaplan-Meier curves illustrate the disease-specific survival probabilities of the patient groups in two TNBC cohorts stratified by nine immune signatures.

Figura 10. Las curvas de Kaplan-Meier ilustran las probabilidades de supervivencia específicas de la enfermedad de los grupos de pacientes en dos cohortes de TNBC estratificadas por nueve firmas inmunitarias.Figure 10. The Kaplan-Meier curves illustrate the disease-specific survival probabilities of patient groups in two TNBC cohorts stratified by nine immune signatures.

Las firmas se dicotomizaron usando un corte seleccionado en un rango de percentiles basado en la cohorte 2 (las columnas izquierda y derecha) y se probaron en la cohorte 1 (la columna derecha). Las líneas discontinuas en los gráficos de la izquierda marcan el umbral de significación de p = 0,05, y las líneas verticales continuas muestran los mejores cortes. Para las curvas de Kaplan-Meier, los números en la leyenda muestran el número de pacientes en cada grupo y los números entre paréntesis muestran el número de muertes específicas por enfermedad. Signatures were dichotomized using a cut selected in a percentile range based on cohort 2 (the left and right columns) and tested on cohort 1 (the right column). The dashed lines in the graphs on the left mark the threshold of significance of p = 0.05, and the continuous vertical lines show the best cuts. For the Kaplan-Meier curves, the numbers in the legend show the number of patients in each group and the numbers in brackets show the number of specific deaths due to illness.

Figura 11. Los diagramas de dispersión muestran la correlación entre la RLIT y la expresión de los genes asociados a RLIT en TNBC.Figure 11. Dispersion diagrams show the correlation between RLIT and the expression of RLIT-associated genes in TNBC.

Figura 12. Compare el valor pronóstico de los 100 genes principales asociados a RLIT y la RLIT al incluir ambos en el modelo de análisis multivariado de Cox, un gen cada vez.Figure 12. Compare the prognostic value of the 100 main genes associated with RLIT and RLIT by including both in the Cox multivariate analysis model, one gene at a time.

Cada punto denota análisis para un gen, los valores trazados son -log (valor p del rango logarítmico) para el análisis. Each point denotes analysis for a gene, the plotted values are -log (p-value of the logarithmic range) for the analysis.

Figura 13. Las curvas de Kaplan-Meier ilustran las diferencias en la supervivencia específica de la enfermedad de los pacientes con TNBC estratificados con otros parámetros conocidos, incluyendo PAM50 (Perou et al., 2000), evaluación patológica de la infiltración linfocitaria (IL), el tamaño del tumor y el grado. Figure 13. The Kaplan-Meier curves illustrate the differences in disease-specific survival of patients with TNBC stratified with other known parameters, including PAM50 ( Perou et al., 2000), pathological evaluation of lymphocyte infiltration ( IL) , tumor size and grade.

Figura 14. Las curvas de Kaplan-Meier ilustran las diferencias en la supervivencia general a 5 años de los pacientes con cáncer de ovarios de los grupos de pacientes estratificados por RLIT, por "Lym" (Yuan et al., 2012), por lymPath (abundancia de linfocitos evaluada por el anatomopatólogo), grado tumoral, tipo histológico o estadificación tumoral. Figure 14. The Kaplan-Meier curves illustrate the differences in overall 5-year survival of ovarian cancer patients from the RLIT stratified patient groups, by "Lym" ( Yuan et al., 2012), by lymPath ( lymphocyte abundance evaluated by the pathologist), tumor grade, histological type or tumor staging.

Figura 15. A. Histograma que muestra la agrupación de células de tumores TNBC en agrupación que tiene una expresión de CTLA4 relativamente alta y una agrupación que tiene una expresión de CTLA4 relativamente baja. B. Curva de Kaplan-Meier que ilustra la diferencia en la supervivencia entre los pacientes con baja expresión de CLTA4 y alta expresión de CTLA4.Figure 15. A. Histogram showing clustering of TNBC tumor cells in a cluster that has a relatively high CTLA4 expression and a cluster that has a relatively low CTLA4 expression. B. Kaplan-Meier curve illustrating the difference in survival between patients with low expression of CLTA4 and high expression of CTLA4.

Descripción detallada de la invenciónDetailed description of the invention

Ciertos aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras descritas anteriormente.Certain aspects and embodiments of the invention will now be illustrated by way of example and with reference to the figures described above.

El inventor ha ideado una nueva forma de modelar estadísticamente la heterogeneidad espacial de los linfocitos en los tumores, que permite la determinación de una medida cuantitativa de infiltración inmunitaria (RLIT). La RLIT (relación de linfocitos intratumorales) es la proporción de linfocitos intratumorales a células cancerosas en un tumor. Esta medida cuantitativa de la infiltración inmunitaria (RLIT) ha mejorado el poder predictivo en el pronóstico del cáncer en comparación con los indicadores previos de infiltración inmunitaria. Esta medición de la infiltración inmunitaria se desarrolló basándose en un estudio de tumores de pacientes con cáncer de mama triple negativo (TNBC) del conjunto de datos METABRIC, pero es generalmente más útil y aplicable a otros subtipos de cáncer de mama y otros tipos de cáncer. La naturaleza generalizable de la RLIT se demuestra mediante los datos en el presente documento que muestran que la RLIT también es un indicador pronóstico en el cáncer de ovarios.The inventor has devised a new way to statistically model the spatial heterogeneity of lymphocytes in tumors, which allows the determination of a quantitative measure of immune infiltration (RLIT). RLIT (ratio of intratumoral lymphocytes) is the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells in a tumor. This quantitative measure of immune infiltration (RLIT) has improved predictive power in cancer prognosis compared to previous indicators of immune infiltration. This measurement of immune infiltration was developed based on a study of tumors of patients with triple negative breast cancer (TNBC) from the METABRIC dataset, but is generally more useful and applicable to other subtypes of breast cancer and other types of cancer. . The generalizable nature of RLIT is demonstrated by the data in this document that show that RLIT is also a prognostic indicator in ovarian cancer.

En el presente documento se describe el primer estudio que identifica estadísticamente las categorías de linfocitos en función de la heterogeneidad espacial del tumor y demuestra sus implicaciones clínicas utilizando muestras de un gran número de pacientes. Esto permite una forma de modelar la heterogeneidad espacial en tumores que aborda la necesidad de medir la heterogeneidad de la infiltración linfocitaria en tumores. La capacidad para generar evaluaciones cuantitativas reproducibles brindan nuevas oportunidades para incorporar la infiltración inmunitaria en la estadificación del cáncer (es decir, la clasificación de los tumores), como en el uso de puntuación inmunitaria para el cáncer colorrectal (Galon, 2014).This paper describes the first study that statistically identifies lymphocyte categories based on the spatial heterogeneity of the tumor and demonstrates its clinical implications using samples from a large number of patients. This allows a way to model spatial heterogeneity in tumors that addresses the need to measure the heterogeneity of lymphocyte infiltration in tumors. The ability to generate reproducible quantitative evaluations provides new opportunities to incorporate immune infiltration into cancer staging (i.e. tumor classification), as in the use of immune scoring for colorectal cancer (Galon, 2014).

La presente invención se refiere a un procedimiento para medir la infiltración inmunitaria en tumores. En particular, un procedimiento para determinar una medición objetiva de la infiltración inmunitaria en un tumor (RLIT), cuya medida es la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas.The present invention relates to a method for measuring immune infiltration in tumors. In particular, a procedure to determine an objective measurement of immune infiltration in a tumor (RLIT), whose measure is the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells.

En consecuencia, un aspecto de la invención proporciona un procedimiento implementado por ordenador ex vivo para medir la infiltración inmunitaria en un tumor, comprendiendo el procedimiento:Accordingly, one aspect of the invention provides a computer implemented method for measuring ex vivo the immune infiltration into a tumor, the method comprising:

Los procedimientos descritos en el presente documento se realizan utilizando una imagen tumoral en la que se han identificado linfocitos y células cancerosas. Los linfocitos y las células cancerosas se pueden haber identificado mediante el análisis automatizado de imágenes.The procedures described herein are performed using a tumor image in which lymphocytes and cancer cells have been identified. Lymphocytes and cancer cells may have been identified by automated image analysis.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender además una etapa de identificación de células cancerosas y linfocitos en una imagen tumoral mediante análisis de imagen automatizado. Los procedimientos pueden comprender los pasos para generar una imagen tumoral y luego identificar linfocitos y células cancerosas en la imagen tumoral mediante análisis de imagen automatizado.The procedures described herein may further comprise a step of identifying cancer cells and lymphocytes in a tumor image by automated image analysis. The procedures may comprise the steps to generate a tumor image and then identify lymphocytes and cancer cells in the tumor image by automated image analysis.

La etapa de la identificación de células cancerosas y linfocitos en un tumor mediante el análisis automatizado de imágenes puede basarse en las diferentes morfologías nucleares de las células cancerosas y los linfocitos. Esta etapa se puede realizar en secciones de tumores, tales como portaobjetos de la sección de tumor entero. La sección del tumor puede estar teñida con H y E. Los tipos y / o ubicaciones espaciales de al menos aproximadamente 10.000 células pueden registrarse en esta etapa. Los tipos y / o ubicaciones espaciales de al menos aproximadamente 20.000, al menos de aproximadamente 50.000, al menos de aproximadamente 90.000, al menos 100.000, al menos de aproximadamente 110.000, de aproximadamente 10.000 a 150.000, de aproximadamente 50.000 a 120.000 o de aproximadamente 100.000 a 120.000 células pueden registrarse en esta etapa. Los tipos y / o ubicaciones espaciales de, o aproximadamente 90.000, aproximadamente 100.000 o aproximadamente 110.000 células pueden registrarse en esta etapa. Las células pueden ser linfocitos. Esta etapa puede usar cualquier herramienta de análisis de imágenes automatizada capaz de identificar linfocitos y células cancerosas. La herramienta de análisis de imagen automatizada puede ser la herramienta descrita en Yuan et al., 2012.The stage of the identification of cancer cells and lymphocytes in a tumor by automated image analysis can be based on the different nuclear morphologies of cancer cells and lymphocytes. This stage can be performed on tumor sections, such as slides of the entire tumor section. The tumor section may be stained with H and E. The types and / or spatial locations of at least about 10,000 Cells can be registered at this stage. Space types and / or locations of at least about 20,000, at least about 50,000, at least about 90,000, at least 100,000, at least about 110,000, about 10,000 to 150,000, about 50,000 to 120,000 or about 100,000 120,000 cells can be registered at this stage. The types and / or spatial locations of, or about 90,000, about 100,000 or about 110,000 cells can be registered at this stage. The cells can be lymphocytes. This stage can use any automated image analysis tool capable of identifying lymphocytes and cancer cells. The automated image analysis tool may be the tool described in Yuan et al., 2012.

La herramienta de análisis de imágenes descrita en Yuan et al., 2012, que se incorpora por referencia en su totalidad en la presente memoria, identifica el cáncer, los linfocitos y las células estromales que abarcan los fibroblastos y las células endoteliales se basan en sus morfologías nucleares en los portaobjetos de la sección de tumores completos de H y E. El componente principal de esta herramienta es un clasificador entrenado por anatomopatólogos en regiones tumorales seleccionadas al azar y validada en 564 tumores de mama con 90 % de precisión. La herramienta de análisis de imágenes descrita en Yuan et al clasifica las células en tres categorías: cáncer, linfocitos o células estromales basados en características morfológicas utilizando una máquina de vectores de soporte.The image analysis tool described in Yuan et al., 2012, which is incorporated by reference in its entirety herein, identifies cancer, lymphocytes and stromal cells that encompass fibroblasts and endothelial cells are based on their Nuclear morphologies on the slides of the section of complete tumors of H and E. The main component of this tool is a classifier trained by pathologists in randomly selected tumor regions and validated in 564 breast tumors with 90% accuracy. The image analysis tool described in Yuan et al classifies cells into three categories: cancer, lymphocytes or stromal cells based on morphological characteristics using a support vector machine.

La herramienta de análisis de imágenes descrita en Yuan et al., 2012 identificó células cancerosas por sus núcleos redondos, normalmente grandes (> 10 pm). La clase de estroma se entrenó en núcleos de células estromales en forma de huso (que probablemente sean fibroblastos) y puede abarcar otras células estromales con una morfología similar, tal como las células endoteliales. La clase de linfocitos se entrenó en células inmunes con la morfología distintiva de los linfocitos: núcleos pequeños (<8 pm) oscuros y poco citoplasma.The image analysis tool described in Yuan et al., 2012 identified cancer cells by their round nuclei, normally large (> 10 pm). The stroma class was trained in spindle-shaped stromal cell nuclei (which are probably fibroblasts) and can encompass other stromal cells with a similar morphology, such as endothelial cells. The lymphocyte class was trained in immune cells with the distinctive morphology of lymphocytes: small (<8 pm) dark nuclei and little cytoplasm.

La herramienta de análisis de imágenes descrita en Yuan et al se entrenó utilizando imágenes de tumores de mama. Las herramientas automatizadas de análisis de imágenes, como las descritos en Yuan et al 2012, pueden ser entrenadas en tipos de cáncer distintos al cáncer de mama (incluidos los tipos y subtipos de cáncer mencionados en el presente documento) para identificar linfocitos y células cancerosas en los tumores de otros tipos de cáncer. The image analysis tool described in Yuan et al. Was trained using breast tumor images. Automated image analysis tools, such as those described in Yuan et al 2012, can be trained in types of cancer other than breast cancer (including the types and subtypes of cancer mentioned in this document) to identify lymphocytes and cancer cells in tumors of other types of cancer.

En la técnica se conocen varias herramientas automatizadas de análisis de imágenes. Por ejemplo, las herramientas descritas en Failmezger et al (CRImage), en particular Janowczyj et al, y Basavanhally et al, que se incorporan en el presente documento como referencia en su totalidad. Cualquier herramienta de este tipo puede ser adecuada para, o adaptada para, utilizar en los procedimientos descritos en el presente documento.Several automated image analysis tools are known in the art. For example, the tools described in Failmezger et al (CRImage), in particular Janowczyj et al, and Basavanhally et al, which are incorporated herein by reference in their entirety. Any such tool may be suitable for, or adapted to, use in the procedures described herein.

Como resultado del análisis automatizado de imágenes, los tipos y las ubicaciones espaciales de un gran número de células se registran en cada imagen del tumor. El análisis de imágenes automatizado puede permitir el mapeo de distribuciones espaciales de todos, o esencialmente todos, células cancerosas y linfocitos dentro de una imagen tumoral.As a result of automated image analysis, the types and spatial locations of a large number of cells are recorded in each tumor image. Automated image analysis can allow mapping of spatial distributions of all, or essentially all, cancer cells and lymphocytes within a tumor image.

Después de una etapa para identificar las células cancerosas y los linfocitos mediante el análisis automático de imágenes, se analizan las relaciones espaciales de linfocitos y células cancerosas.After a stage to identify cancer cells and lymphocytes by automatic image analysis, the spatial relationships of lymphocytes and cancer cells are analyzed.

Los procedimientos descritos en el presente documento comprenden una etapa para obtener una medición de linfocitos a cáncer para cada linfocito. Esto proporciona una medida cuantitativa de la proximidad de cada linfocito a las células cancerosas y la ubicación espacial en relación con las células cancerosas.The procedures described herein comprise a step to obtain a measurement of cancer lymphocytes for each lymphocyte. This provides a quantitative measure of the proximity of each lymphocyte to the cancer cells and the spatial location in relation to the cancer cells.

La etapa para obtener una medición de linfocitos a cáncer para cada linfocito se puede llevar a cabo utilizando el conducto estadístico que se ilustra en la Fig. 1B. En primer lugar, para perfilar globalmente la distribución espacial de las células cancerosas, se cuantifica la densidad celular del cáncer, por ejemplo, utilizando una estimación de kernel (Hastie et al, 2001). Como alternativa, se puede usar una estimación de cambio media (Cheng, 1995) o una estimación de espacio de escala (Witkin, 1983). Esto construye un "paisaje de cáncer" donde las colinas indican regiones tumorales densamente pobladas con células cancerosas. La altura de una colina se correlaciona con la densidad del cáncer (densidad del tumor) en una ubicación específica en el tumor (Fig.1B). En segundo lugar, por cada linfocito, su proximidad espacial al cáncer se cuantifica directamente con el paisaje de densidad del cáncer en su ubicación específica para proporcionar una medición de "linfocitos a cáncer" para cada linfocito. De este modo, se obtiene una medición cuantitativa de la proximidad espacial a las células cancerosas para cada linfocito (Fig. 1B).The step to obtain a measurement of cancer lymphocytes for each lymphocyte can be carried out using the statistical conduit illustrated in Fig. 1B. First, to globally profile the spatial distribution of cancer cells, cancer cell density is quantified, for example, using a kernel estimate (Hastie et al, 2001). Alternatively, an average change estimate (Cheng, 1995) or a scale-space estimate (Witkin, 1983) can be used. This builds a "cancer landscape" where the hills indicate densely populated tumor regions with cancer cells. The height of a hill correlates with cancer density (tumor density) at a specific location in the tumor (Fig. 1B). Second, for each lymphocyte, its spatial proximity to cancer is quantified directly with the cancer density landscape at its specific location to provide a "cancer lymphocyte" measurement for each lymphocyte. In this way, a quantitative measurement of the spatial proximity to the cancer cells for each lymphocyte is obtained (Fig. 1B).

En los estudios descritos en el presente documento (véase la Sección Experimental), se identificaron células cancerosas y linfocitos, y luego se cuantificaron sus relaciones espaciales utilizando un procedimiento de densidad del núcleo. Después, utilizando aprendizaje no supervisado, se identificaron tres categorías de linfocitos (intratumorales, tumor adyacente y tumor distal) según sus proximidades espaciales y su posicionamiento espacial en relación con las células cancerosas. Estas categorías de linfocitos son consistentes con un esquema de cuantificación patológica que considera compartimentos de estroma intratumoral, estroma adyacente y estroma distante (Mahmoud, 2011). Estadísticamente, estos grupos son estables, notificados como la solución de agrupamiento óptima el 97 % del tiempo en muestras repetidas.In the studies described herein (see Experimental Section), cancer cells and lymphocytes were identified, and then their spatial relationships were quantified using a core density procedure. Then, using unsupervised learning, three categories of lymphocytes (intratumoral, adjacent tumor and distal tumor) were identified according to their spatial proximity and their spatial positioning in relation to cancer cells. These categories of lymphocytes are consistent with a pathological quantification scheme that considers intratumoral stroma compartments, adjacent stroma and distant stroma (Mahmoud, 2011). Statistically, these groups are stable, reported as the optimal clustering solution 97% of the time in repeated samples.

En consecuencia, los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender una etapa para obtener una medición de linfocitos a cáncer para cada linfocito utilizando una estimación de la densidad, tal como una estimación del núcleo, para modelar la distribución espacial de las células cancerosas. El procedimiento comprende una etapa para determinar la proximidad de cada linfocito al cáncer al determinar la densidad de las células cancerosas en la ubicación de cada linfocito, para dar una medición de linfocitos a cáncer para cada linfocito. Luego, los linfocitos se agrupan de acuerdo con sus mediciones de linfocitos a cáncer. Un procedimiento de aprendizaje no supervisado, tales como la agrupación de mezcla de Gauss, se pueden usar para agrupar los linfocitos de acuerdo con su proximidad al cáncer. El número de grupos puede ser 2, 3, 4 o más.Consequently, the procedures described herein may comprise a step to obtain a measurement of cancer lymphocytes for each lymphocyte using an estimate of density, such as an estimate of the nucleus, to model the spatial distribution of cancer cells. The procedure comprises a step to determine the proximity of each lymphocyte to cancer by determining the density of cancer cells at the location of each lymphocyte, to give a measurement of lymphocytes to cancer for each lymphocyte. The lymphocytes are then grouped according to their measurements of cancer lymphocytes. An unsupervised learning procedure, such as the Gaussian mixture cluster, can be used to group the lymphocytes according to their proximity to the cancer. The number of groups can be 2, 3, 4 or more.

En el estudio de TNBC descrito en el presente documento (véase la Sección Experimental), cuando los linfocitos se agruparon de acuerdo con sus mediciones de linfocitos a cáncer, el número de grupos fue de tres (k = 3), correspondiente a los linfocitos intratumorales (LIT), linfocitos tumorales adyacentes (lTa ) y linfocitos tumorales distales (LTD).In the TNBC study described herein (see Experimental Section), when lymphocytes were grouped according to their cancer lymphocyte measurements, the number of groups was three (k = 3), corresponding to intratumoral lymphocytes (LIT), adjacent tumor lymphocytes (lTa) and distal tumor lymphocytes (LTD).

En TNBC, Los linfocitos que tienen una medición de linfocitos a cáncer por encima del valor umbral de 0,10507473 se clasificaron como LIT, Los linfocitos que tenían una medición de linfocitos a cáncer por debajo del valor umbral de 0,10507473 y por encima del valor umbral de 0,03662728 se clasificaron como LTA y los linfocitos que tenían una medición de linfocitos por cáncer por debajo del valor de umbral de 0,03662728 se clasificaron como LTD. En la determinación de la RLIT, la distinción importante es entre los linfocitos intratumorales (LIT) y los linfocitos no intratumorales (L no IT). Así en TNBC, los linfocitos que tenían una medición de linfocitos a cáncer igual o superior al valor umbral de 0,10507473 se clasificaron como LIT, y los linfocitos restantes se clasificaron como L no IT.In TNBC, lymphocytes that have a measurement of cancer lymphocytes above the threshold value of 0.10507473 were classified as LIT, lymphocytes that had a measurement of cancer lymphocytes below the threshold value of 0.10507473 and above the Threshold value of 0.03662728 was classified as LTA and lymphocytes that had a measurement of cancer lymphocytes below the threshold value of 0.03662728 were classified as LTD. In determining the RLIT, the important distinction is between intratumoral lymphocytes (LIT) and non-intratumoral lymphocytes (non-IT L). Thus in TNBC, lymphocytes that had a measurement of cancer lymphocytes equal to or greater than the threshold value of 0.10507473 were classified as LIT, and the remaining lymphocytes were classified as non-IT L.

En el estudio de cáncer de ovario descrito en el presente documento, cuando los linfocitos se agruparon de acuerdo con sus mediciones de linfocitos a cáncer, el número de grupos fue dos (k = 2), que corresponde a los linfocitos intratumorales y los linfocitos no intratumorales.In the ovarian cancer study described herein, when lymphocytes were grouped according to their measurements of cancer lymphocytes, the number of groups was two (k = 2), which corresponds to intratumoral lymphocytes and non-lymphocytes. intratumoral

En el cáncer de ovario, los linfocitos que tenían una medición de linfocitos a cáncer por encima del valor umbral de 0,03114299 se clasificaron como LIT. Los linfocitos que tienen una medición de linfocitos a cáncer por debajo de este valor de umbral se clasificaron como L no IT.In ovarian cancer, lymphocytes that had a measurement of cancer lymphocytes above the threshold value of 0.03114299 were classified as LIT. Lymphocytes that have a measurement of cancer lymphocytes below this threshold value were classified as L non-IT.

Como alternativa al uso de la densidad del cáncer en una ubicación de linfocitos para obtener una medición de linfocitos a tumores que sea indicativa de la proximidad de los linfocitos al cáncer (es decir, la proximidad de los linfocitos al cáncer), la etapa para obtener una medición de linfocitos a cáncer para cada linfocito se puede realizar basándose en una medida de distancia entre un linfocito y una o más células cancerosas, tal como la distancia euclidiana. A continuación, los linfocitos se agrupan de acuerdo con sus mediciones de linfocitos a cáncer, tal como se ha descrito anteriormente, por ejemplo, utilizando un procedimiento de aprendizaje no supervisado, tal como la agrupación de mezcla gaussiana. En este contexto, cuando la medición de linfocitos a cáncer es indicativa de la distancia (en lugar de la proximidad) al cáncer, un linfocito puede clasificarse como un LIT si tiene una medición de linfocito a cáncer por debajo de un valor de umbral.As an alternative to using cancer density at a lymphocyte location to obtain a measurement of lymphocytes to tumors that is indicative of the proximity of lymphocytes to cancer (i.e., the proximity of lymphocytes to cancer), the stage to obtain A measurement of cancer lymphocytes for each lymphocyte can be performed based on a measure of distance between a lymphocyte and one or more cancer cells, such as the Euclidean distance. The lymphocytes are then grouped according to their measurements of lymphocytes to cancer, as described above, for example, using an unsupervised learning procedure, such as the Gaussian mixing cluster. In this context, when the measurement of lymphocytes to cancer is indicative of the distance (rather than proximity) to the cancer, a lymphocyte can be classified as a LIT if it has a measurement of lymphocyte to cancer below a threshold value.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender clasificar los linfocitos como linfocitos intratumorales. Es decir, los procedimientos pueden comprender clasificar un subconjunto de células identificadas como linfocitos en la imagen del tumor como linfocitos intratumorales. La clasificación de los linfocitos puede comprender determinar si la medición de linfocitos a cáncer está por encima de un cierto valor de umbral. El valor umbral, por ejemplo en TNBC, puede ser de aproximadamente 0,1, de aproximadamente 0,105 o de aproximadamente 0,10507473. El valor umbral, por ejemplo en el cáncer de ovario, puede ser de aproximadamente 0,03, de aproximadamente 0,0311 o de aproximadamente 0,03114299.The procedures described herein may comprise classifying lymphocytes as intratumoral lymphocytes. That is, the procedures may comprise classifying a subset of cells identified as lymphocytes in the tumor image as intratumoral lymphocytes. The lymphocyte classification may comprise determining whether the measurement of lymphocytes to cancer is above a certain threshold value. The threshold value, for example in TNBC, can be about 0.1, about 0.105 or about 0.10507473. The threshold value, for example in ovarian cancer, can be about 0.03, about 0.0311 or about 0.03114299.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden comprender la determinación de un valor umbral para una medición de linfocitos a cáncer, para usar en la clasificación de un linfocito como un linfocito intratumoral o un linfocito no intratumoral. Por ejemplo, cuando la medición de linfocitos a cáncer es indicativa de la proximidad de los linfocitos al cáncer, el linfocito puede clasificarse como un linfocito intratumoral si tiene una medición de linfocitos a cáncer por encima del valor umbral de medición de linfocitos a cáncer. Determinar un valor de umbral para una medición de linfocitos a cáncer puede incluir determinar mediciones de linfocitos a cáncer para una población de linfocitos y agrupar los linfocitos mediante aprendizaje no supervisado, y tomar el valor mínimo del grupo más proximal de cáncer (el grupo con mediciones más altas) como el valor de umbral para clasificar los linfocitos intratumorales. Un linfocito puede clasificarse como un linfocito intratumoral si tiene una medición de linfocito a cáncer por encima (o igual o superior a) del valor de umbral.The procedures described herein may comprise the determination of a threshold value for a measurement of lymphocytes to cancer, for use in the classification of a lymphocyte as an intratumoral lymphocyte or a non-intratumoral lymphocyte. For example, when the measurement of lymphocytes to cancer is indicative of the proximity of lymphocytes to cancer, the lymphocyte can be classified as an intratumoral lymphocyte if it has a measurement of lymphocytes to cancer above the threshold value of measurement of lymphocytes to cancer. Determining a threshold value for a measurement of cancer lymphocytes may include determining cancer lymphocyte measurements for a lymphocyte population and grouping the lymphocytes by unsupervised learning, and taking the minimum value from the most proximal cancer group (the group with measurements higher) as the threshold value for classifying intratumoral lymphocytes. A lymphocyte can be classified as an intratumoral lymphocyte if it has a cancer lymphocyte measurement above (or equal to or greater than) the threshold value.

La determinación del valor de umbral puede comprender además probar la estabilidad de la agrupación mediante el muestreo de la población de linfocitos, agrupar la población muestreada de linfocitos y determinar que la solución de agrupamiento (k = x donde x es el número de agrupamientos) es estable. El número de agrupaciones es estable cuando k para la población muestreada es la misma para 200 muestras repetidas al menos un 90 %, al menos un 95 % o al menos un 97 % del tiempo.The determination of the threshold value may further comprise testing the stability of the cluster by sampling the lymphocyte population, grouping the sampled population of lymphocytes and determining that the clustering solution (k = x where x is the number of clusters) is stable. The number of clusters is stable when k for the sampled population is the same for 200 repeated samples at least 90%, at least 95% or at least 97% of the time.

Además, el inventor ha mostrado diferencias significativas entre las categorías de linfocitos tanto en la distancia espacial a la célula cancerosa más cercana como en la posición espacial de las células cancerosas circundantes, apoyando su relevancia biológica. Por ejemplo, en el estudio actualmente divulgado de tumores de pacientes con TNBC del conjunto de datos METABRIC, un linfocito intratumoral está en un promedio de 7 |jm de distancia de una célula cancerosa y 3 jm desde el centroide de la región del casco convexo formado por células cancerosas cercanas. Un linfocito de tumor adyacente también puede estar cerca de las células cancerosas más cercanas, pero estaría más lejos del centroide de la región del casco convexo porque no está rodeado por células cancerosas. Por lo tanto, el nuevo enfoque de clasificación divulgado en el presente documento se basa en medidas espaciales que dan cuenta del posicionamiento espacial de las células cancerosas y, al mismo tiempo, son lo suficientemente eficientes computacionalmente para analizar secciones de tumores completos. En comparación con una medida informada anteriormente de la abundancia de linfocitos como resultado directo del análisis de imágenes (Yuan, 2012), una ventaja de este nuevo enfoque es que explica la heterogeneidad espacial de la infiltración inmunitaria, que se reconoce como una propiedad importante de la infiltración inmunitaria (Galon, 2006) pero rara vez se analiza cuantitativamente. In addition, the inventor has shown significant differences between lymphocyte categories both in spatial distance to the nearest cancer cell and in the spatial position of the surrounding cancer cells, supporting its biological relevance. For example, in the currently reported study of tumors of patients with TNBC from the METABRIC data set, an intratumoral lymphocyte is an average of 7 | jm away from a cancer cell and 3 jm from the centroid of the formed convex hull region by nearby cancer cells. An adjacent tumor lymphocyte may also be near the nearest cancer cells, but it would be further from the centroid of the convex hull region because it is not surrounded by cancer cells. Therefore, the new classification approach disclosed in this document is based on spatial measures that account for the spatial positioning of cancer cells and, at the same time, are computationally efficient enough to analyze sections of entire tumors. Compared to a previously reported measure of lymphocyte abundance as a direct result of image analysis (Yuan, 2012), an advantage of this new approach is that it explains the spatial heterogeneity of immune infiltration, which is recognized as an important property of immune infiltration (Galon, 2006) but is rarely analyzed quantitatively.

Tras la etapa de clasificar los linfocitos como linfocitos intratumorales, se calcula la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas. Esta relación es la RLIT (la relación de linfocitos intratumorales), que es una medida objetiva y cuantitativa de la infiltración inmunitaria en tumores. La RLIT es la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas en el tumor expresada como una fracción decimal. Por ejemplo, una RLIT de 0,011 representa un 1,1 % de linfocitos intratumorales a células cancerosas, es decir, una proporción de 11 linfocitos intratumorales a 1000 células cancerosas.After the stage of classifying lymphocytes as intratumoral lymphocytes, the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells is calculated. This relationship is RLIT (the ratio of intratumoral lymphocytes), which is an objective and quantitative measure of immune infiltration in tumors. RLIT is the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells in the tumor expressed as a decimal fraction. For example, an RLIT of 0.011 represents 1.1% of intratumoral lymphocytes to cancer cells, that is, a proportion of 11 intratumoral lymphocytes to 1000 cancer cells.

El inventor ha demostrado que la RLIT es un indicador pronóstico robusto y potente en el cáncer de mama triple negativo (TNBC), como se tratará a continuación, y también en cáncer de ovario. Dado que la infiltración inmunitaria está implicada en muchos tipos de cáncer, como se analiza a continuación con más detalle, incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal (Galon, 2014), melanoma y cáncer de pulmón no microcítico, la RLIT también puede usarse como un indicador de pronóstico en varios tipos de cáncer.The inventor has shown that RLIT is a robust and potent prognostic indicator in triple negative breast cancer (TNBC), as will be discussed below, and also in ovarian cancer. Since immune infiltration is implicated in many types of cancer, as discussed below in more detail, including breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer (Galon, 2014), melanoma and non-small cell lung cancer, RLIT also It can be used as a prognostic indicator in several types of cancer.

Para el pronóstico en el TNBC, el valor de corte de RLIT de 0,011 se seleccionó basándose en imágenes de tumores de la cohorte METABRIC. Los pacientes cuyos tumores tenían un RLIT por debajo del valor de corte de 0,011 tuvieron un resultado clínico significativamente peor en términos de supervivencia específica de la enfermedad en comparación con los pacientes cuyos tumores tenían un RLIT por encima del valor de corte.For the TNBC prognosis, the RLIT cut-off value of 0.011 was selected based on tumor images from the METABRIC cohort. Patients whose tumors had an RLIT below the cut-off value of 0.011 had a significantly worse clinical outcome in terms of disease-specific survival compared to patients whose tumors had an RLIT above the cut-off value.

Para el pronóstico en el cáncer de ovario, el valor de corte de la RLIT de 0,06086 se seleccionó en función de las imágenes de tumores de una cohorte de tumores no publicados. Los pacientes cuyos tumores tenían un RLIT por debajo del valor de corte tuvieron un resultado clínico significativamente peor en términos de supervivencia general en comparación con los pacientes cuyos tumores tenían una RLIT por encima del valor de corte.For the prognosis in ovarian cancer, the RLIT cut-off value of 0.06086 was selected based on the tumor images of a cohort of unpublished tumors. Patients whose tumors had an RLIT below the cutoff value had a significantly worse clinical outcome in terms of overall survival compared to patients whose tumors had an RLIT above the cutoff value.

La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar un valor de corte para la RLIT para su uso en la determinación de un pronóstico en cáncer, en el que una RLIT por debajo del valor de corte indica un mal pronóstico. El procedimiento comprende determinar la RLIT para una pluralidad de tumores, en el que cada tumor es de un paciente con cáncer respectivo en una cohorte de pacientes con cáncer, y seleccionando un valor de corte para la RLIT en donde los pacientes con un RLIT igual o inferior al valor de corte tienen un pronóstico significativamente peor en comparación con los pacientes con RLIT por encima del valor de corte.The present invention relates to a method for determining a cut-off value for RLIT for use in determining a prognosis in cancer, in which an RLIT below the cut-off value indicates a poor prognosis. The method comprises determining the RLIT for a plurality of tumors, in which each tumor is from a respective cancer patient in a cohort of cancer patients, and selecting a cut-off value for the RLIT where the patients with an equal RLIT or Below the cut-off value they have a significantly worse prognosis compared to patients with RLIT above the cut-off value.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para determinar un valor de corte de RLIT para un tipo o subtipo de cáncer, para usar en proporcionar un pronóstico en un paciente con cáncer que tenga ese tipo o subtipo de cáncer, comprendiendo el procedimiento:Accordingly, one aspect of the present invention provides a method for determining a cut-off value of RLIT for a type or subtype of cancer, for use in providing a prognosis in a cancer patient having that type or subtype of cancer, comprising the process:

relacionar la RLIT para cada tumor con el resultado clínico de cada paciente con cáncer en la cohorte de pacientes con cáncer; y seleccionar un valor de corte para la RLIT, en el que una RLIT igual o inferior al valor de corte se asocia a un resultado clínico significativamente diferente en la cohorte de pacientes con cáncer que una RLIT por encima del valor de corte.relate the RLIT for each tumor to the clinical outcome of each cancer patient in the cohort of cancer patients; and selecting a cut-off value for the RLIT, in which an RLIT equal to or less than the cut-off value is associated with a significantly different clinical outcome in the cohort of cancer patients than an RLIT above the cut-off value.

Una RLIT igual o inferior al valor de corte puede estar asociado a un resultado clínico significativamente peor que una RLIT por encima del valor de corte. Una RLIT igual o inferior al valor de corte puede estar asociado a un resultado clínico significativamente mejor que una RLIT por encima del valor de corte.An RLIT equal to or less than the cut-off value may be associated with a clinical outcome significantly worse than an RLIT above the cut-off value. An RLIT equal to or less than the cut-off value may be associated with a significantly better clinical outcome than an RLIT above the cut-off value.

La selección del valor de corte para RLIT sirve para dicotomizar el rango continuo de valores de RLIT para las imágenes de tumores de una cohorte de pacientes. El valor de corte de la RLIT se selecciona de manera que haya una diferencia significativa en el resultado clínico entre los pacientes con una RLIT por debajo del límite y los pacientes con una RLIT por encima del valor de corte. En general, el valor de corte de RLIT se selecciona de modo que los pacientes que tienen un RLIT inferior o igual al valor de corte (es decir, los pacientes que tienen un tumor con una RLIT inferior o igual al valor de corte) tienen un pronóstico significativamente peor que los pacientes que tienen una RLIT que está por encima del valor de corte (es decir, pacientes que tienen un tumor con una RLIT igual o superior al valor de corte). The selection of the cut-off value for RLIT serves to dichotomize the continuous range of RLIT values for tumor images of a patient cohort. The cut-off value of the RLIT is selected so that there is a significant difference in the clinical outcome between patients with an RLIT below the limit and patients with an RLIT above the cut-off value. In general, the cut-off value of RLIT is selected so that patients who have an RLIT less than or equal to the cut-off value (that is, patients who have a tumor with an RLIT less than or equal to the cut-off value) have a prognosis significantly worse than patients who have an RLIT that is above the cut-off value (that is, patients who have a tumor with an RLIT equal to or greater than the cut-off value).

En el contexto de la presente invención, una diferencia significativa en el pronóstico se refiere a un resultado clínico que es significativamente diferente según la prueba de rango log. Preferentemente p <0,0500, p<0,0250, p<0,0100, p<0,0090, p<0,0065, p <0,0010 o p <0,0001 de acuerdo con la prueba de rango de registro.In the context of the present invention, a significant difference in prognosis refers to a clinical outcome that is significantly different according to the log range test. Preferably p <0.0500, p <0.0250, p <0.0100, p <0.0090, p <0.0065, p <0.0010 op <0.0001 according to the registration range test .

La selección del valor de corte de RLIT puede comprender identificar un valor de RLIT en el que aproximadamente del 20 % al 80 % de la cohorte de pacientes tiene una RLIT por debajo de ese valor. La selección del valor de corte de RLIT puede comprender identificar un valor de RLIT en el que aproximadamente del 20 % al 80 % de la cohorte de pacientes tiene una RLIT por debajo de ese valor y en el que los pacientes que tienen una RLIT por debajo del valor de corte tienen un pronóstico significativamente peor que los pacientes tener una RLIT que esté por encima del valor de corte.The selection of the cut-off value of RLIT may comprise identifying an RLIT value in which approximately 20% to 80% of the patient cohort has an RLIT below that value. The selection of the cut-off value of RLIT may comprise identifying an RLIT value in which approximately 20% to 80% of the patient cohort has an RLIT below that value and in which patients who have a RLIT below of the cut-off value have a significantly worse prognosis than patients have an RLIT that is above the cut-off value.

El resultado clínico puede ser la supervivencia específica de la enfermedad, supervivencia libre de enfermedad, supervivencia global, supervivencia libre de recaída, supervivencia libre de progresión, tasa de supervivencia o tiempo de supervivencia. El resultado clínico puede ser la supervivencia específica de la enfermedad. La supervivencia específica de la enfermedad se puede definir con el tiempo como máximo 5 años o 10 años desde el diagnóstico y el evento como muerte por cáncer (la supervivencia específica de la enfermedad a 5 años y la supervivencia específica a la enfermedad de 10 años respectivamente). La supervivencia general se puede definir con el tiempo como máximo 5 años o 10 años desde el diagnóstico y el evento como muerte por cualquier causa. La supervivencia sin recaída se puede definir con el tiempo como máximo 10 años desde el diagnóstico y el evento como recaída del tumor. Un mal pronóstico se refiere a una predicción de un mal resultado clínico, mientras que un pronóstico positivo se refiere a una predicción de un resultado clínico positivo.The clinical outcome may be disease-specific survival, disease-free survival, overall survival, relapse-free survival, progression-free survival, survival rate or survival time. The clinical outcome may be the specific survival of the disease. The disease-specific survival can be defined over a maximum of 5 years or 10 years after diagnosis and the event as cancer death (the disease-specific survival at 5 years and the disease-specific survival of 10 years respectively). ). Overall survival can be defined with a maximum of 5 years or 10 years from the diagnosis and the event as death from any cause. Survival without relapse can be defined over a maximum of 10 years after diagnosis and the event as a tumor relapse. A poor prognosis refers to a prediction of a bad clinical outcome, while a positive prognosis refers to a prediction of a positive clinical outcome.

Los procedimientos descritos en el presente documento pueden utilizar una cohorte de pacientes con cáncer del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) como la cohorte de "descubrimiento". Este conjunto de datos, con sus datos de perfilado molecular de H y E y pareados, será una cohorte extremadamente útil para validar la utilidad de RLIT y para seleccionar y refinar los valores de corte de RLIT para uso en procedimientos de pronóstico y / o terapéuticos. El TCGA ha elegido los cánceres para el estudio en función de criterios que incluyen un pronóstico desfavorable y el impacto general en la salud pública, y la disponibilidad de muestras de tejido normal y tumor humano que cumplan con los estándares de TCGA para la calidad y cantidad del consentimiento del paciente.The procedures described herein can use a cohort of cancer patients from the Cancer Genome Atlas (TCGA) as the "discovery" cohort. This data set, with its molecular profiling data of H and E and couplets, will be an extremely useful cohort to validate the usefulness of RLIT and to select and refine RLIT cut-off values for use in prognostic and / or therapeutic procedures. . The TCGA has chosen cancers for the study based on criteria that include an unfavorable prognosis and the general impact on public health, and the availability of normal tissue and human tumor samples that meet the TCGA standards for quality and quantity of the patient's consent.

Los experimentos desvelados en el presente documento muestran la utilidad de RLIT en el TNBC y en cáncer de ovario. La RLIT es una medida generalizable para las LIT y, por lo tanto, será útil como una medida de la infiltración inmunitaria en otros tipos / subtipos de cáncer, especialmente dado que la evaluación manual de la ITLS ha notificado valor en muchos tipos / subtipos de cáncer.The experiments disclosed herein show the usefulness of RLIT in TNBC and in ovarian cancer. RLIT is a generalizable measure for LITs and, therefore, will be useful as a measure of immune infiltration in other cancer types / subtypes, especially since the manual evaluation of the ITLS has reported value in many types / subtypes of Cancer.

Tal como ya se ha mencionado anteriormente, la infiltración inmunitaria está implicada en muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, melanoma y cáncer de pulmón no microcítico, la RLIT también puede usarse como un indicador de pronóstico en varios tipos de cáncer.As already mentioned above, immune infiltration is implicated in many types of cancer, including breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, melanoma and non-small cell lung cancer, RLIT can also be used as a prognostic indicator in Several types of cancer.

La infiltración inmunitaria está implicada en muchos cánceres, incluido el cáncer de mama (incluido el carcinoma ductal de mama y el carcinoma lobular de mama) (Dieci 2014; Loi S 2013; Kruger JM 2013; Liu S,2012; Ascierto ML 2012, Rody A, 2011; Mahmoud SMA, 2011; Denkert C, 2010; Ueno T, 2000) cáncer del sistema nervioso central (incluido el glioblastoma multiforme y el glioma de grado inferior) (Kmiecik J, 2013; Yang I, 2010; McNamara MG, 2014; Crane CA, 2014; Bambury RM; Alexiou GA, 2013; Vauleon E, 2013) cáncer endocrino (incluyendo carcinoma adrenocortical, carcinoma tiroideo papilar, paraganglioma y feocromocitoma) (Papewalis C; Huang CT; Mukherji B) cáncer gastrointestinal (incluido el colangiocarcinoma, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular del hígado, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de estómago-esófago) (Kono K, 20116; Wu G; Gao Q; Hiraoka N) cáncer ginecológico (incluyendo cáncer cervical (Zhang Y, 2014; Ancuta E, 2009), cistadenocarcinoma seroso ovárico (Townsend KN, 2013; Milne K,, 2009; Clarke B, 2009), carcinosarcoma uterino, carcinoma de endometrio del cuerpo uterino) (Ohno S, 2004) cáncer de cabeza y cuello (incluido el carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma uveal) (Spanos WC, 2009; Pretscher D, 2009) cáncer hematológico (incluida la leucemia mieloide aguda, timoma, linfoma) (Yong AS, 2011; Dave SS, 2004;) cáncer de piel (incluido el melanoma cutáneo) (Tjin EP,2014; Erdag G, 2012; Bystryn JC, 1992; Halliday G, 1995) cáncer de tejidos blandos (incluido el sarcoma) (Kim JR, 2016; Sorbye SW 2011; Fiorelli V, 1998) cáncer torácico (incluido el adenocarcinoma de pulmón, el carcinoma de células escamosas de pulmón, el mesotelioma) (Suzuki K, 2013; Welsh TJ, 2005; Villegas FR, 2002; Hegmans JP, 2006; Dieu-Nosjean MC) cáncer urológico (incluido el carcinoma renal de células cromófobas, carcinoma renal de células claras, carcinoma renal papilar, adenocarcinoma de próstata, cáncer de células germinales de testículo, carcinoma de vejiga urotelial) ^{(Davidsson S, 2013; Thompson}rH, ^{2007; Webster WS, 2006; Gannon PO, 2009; Sjodahl G, 2014).} Immune infiltration is implicated in many cancers, including breast cancer (including breast ductal carcinoma and lobular carcinoma of the breast) (Dieci 2014; Loi S 2013; Kruger JM 2013; Liu S, 2012; Ascierto ML 2012, Rody A, 2011; Mahmoud SMA, 2011; Denkert C, 2010; Ueno T, 2000) central nervous system cancer (including glioblastoma multiforme and lower grade glioma) (Kmiecik J, 2013; Yang I, 2010; McNamara MG, 2014; Crane CA, 2014; Bambury RM; Alexiou GA, 2013; Vauleon E, 2013) endocrine cancer (including adrenocortical carcinoma, papillary thyroid carcinoma, paraganglioma and pheochromocytoma) (Papewalis C; Huang CT; Mukherji B) gastrointestinal cancer (including cholangiocarcinoma, colorectal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma of the liver, pancreatic ductal adenocarcinoma, stomach-esophageal cancer) (Kono K, 20116; Wu G; Gao Q; Hiraoka N) gynecological cancer (including cervical cancer (Zhang Y, 2014; Ancuta E, 2009), cystadenocarcinom to ovarian serous (Townsend KN, 2013; Milne K ,, 2009; Clarke B, 2009), uterine carcinosarcoma, endometrial carcinoma of the uterine body) (Ohno S, 2004) head and neck cancer (including squamous cell carcinoma of the head and neck, uveal melanoma) (Spanos WC, 2009; Pretscher D , 2009) hematologic cancer (including acute myeloid leukemia, thymoma, lymphoma) (Yong AS, 2011; Dave SS, 2004;) skin cancer (including cutaneous melanoma) (Tjin EP, 2014; Erdag G, 2012; Bystryn JC , 1992; Halliday G, 1995) soft tissue cancer (including sarcoma) (Kim JR, 2016; Sorbye SW 2011; Fiorelli V, 1998) thoracic cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, mesothelioma) (Suzuki K, 2013; Welsh TJ, 2005; Villegas FR, 2002; Hegmans JP, 2006; Dieu-Nosjean MC) urological cancer (including chromophobic renal cell carcinoma, clear cell renal carcinoma, papillary renal carcinoma, adenocarcinoma of prostate, testicular germ cell cancer, veji carcinoma urothelial ga) ^{(Davidsson S, 2013; Thompson} rH, ^{2007; Webster WS, 2006; Gannon PO, 2009; Sjodahl G, 2014).}

Los procedimientos de la presente invención pueden aplicarse en cualquiera de los tipos o subtipos de cáncer mencionados anteriormente.The methods of the present invention can be applied in any of the types or subtypes of cancer mentioned above.

La RLIT es un indicador cuantitativo objetivo de la infiltración linfocitaria en tumores. El inventor ha demostrado la importancia de utilizar una medida cuantitativa de la infiltración linfocitaria para predecir el resultado clínico en el cáncer. RLIT is an objective quantitative indicator of lymphocyte infiltration in tumors. The inventor has demonstrated the importance of using a quantitative measure of lymphocyte infiltration to predict the clinical outcome in cancer.

La RLIT es una nueva medida espacial y cuantitativa de linfocitos intratumorales (LIT). Esta medida es un predictor consistente, estable e independiente de la supervivencia específica de la enfermedad en dos cohortes independientes de 181 pacientes con TNBC en total. Esta medida puede usar un valor de corte de 0,011 (1.1 % de linfocitos intratumorales a células cancerosas) que dicotomiza la puntuación de la RLIT. El ~ 20 % de los pacientes con TNBC con puntuaciones de RLIT más bajas que este límite tienen una supervivencia específica de la enfermedad significativamente peor que los pacientes con puntuaciones más altas, y esta asociación es independiente de los parámetros clínicos estándar. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la utilidad de RLIT como biomarcador pronóstico para el cáncer, incluyendo TNBC. En consecuencia, en el presente documento se describe un sistema de puntuación objetivo y completamente automatizado para la evaluación estandarizada de la infiltración inmunitaria que se puede usar en el contexto de ensayos clínicos y posteriormente ayuda al proceso de toma de decisiones sobre el tratamiento.RLIT is a new spatial and quantitative measure of intratumoral lymphocytes (LIT). This measure is a consistent, stable and independent predictor of disease-specific survival in two independent cohorts of 181 patients with TNBC in total. This measure can use a cut-off value of 0.011 (1.1% of intratumoral lymphocytes to cancer cells) that dichotomizes the RLIT score. ~ 20% of patients with TNBC with RLIT scores lower than this limit have a significantly worse disease-specific survival than patients with higher scores, and this association is independent of standard clinical parameters. Taken together, these data support the usefulness of RLIT as a prognostic biomarker for cancer, including TNBC. Consequently, this document describes an objective and fully automated scoring system for the standardized evaluation of immune infiltration that can be used in the context of clinical trials and subsequently assists the decision-making process about treatment.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención puede comprender además usar la RLIT como un biomarcador pronóstico. El procedimiento puede comprender medir la RLIT de un tumor de un paciente con cáncer y usar la RLIT para determinar un pronóstico para el paciente. El procedimiento puede comprender determinar la RLIT en un tumor de un paciente con cáncer y usar la RLIT para determinar un pronóstico para el paciente, en el que una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado indica un mal pronóstico. El procedimiento puede comprender determinar la RLIT en un tumor de un paciente con cáncer y usar la RLIT para determinar un pronóstico para el paciente, en el que una RLIT por encima de un valor de corte predeterminado indica un mal pronóstico.Accordingly, one aspect of the present invention may further comprise using RLIT as a prognostic biomarker. The procedure may comprise measuring the RLIT of a tumor of a cancer patient and using the RLIT to determine a prognosis for the patient. The procedure may comprise determining the RLIT in a tumor of a cancer patient and using the RLIT to determine a prognosis for the patient, in which an RLIT below a predetermined cut-off value indicates a poor prognosis. The procedure may comprise determining the RLIT in a tumor of a cancer patient and using the RLIT to determine a prognosis for the patient, in which an RLIT above a predetermined cut-off value indicates a poor prognosis.

En particular, un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para proporcionar un pronóstico en un paciente con cáncer, comprendiendo el procedimiento:In particular, one aspect of the present invention provides a method for providing a prognosis in a cancer patient, the procedure comprising:

medir la infiltración inmunitaria en un tumor del paciente con cáncer de acuerdo con un procedimiento de la invención, calculando de este modo la RLIT para el tumor,measure immune infiltration in a tumor of the cancer patient according to a method of the invention, thereby calculating the RLIT for the tumor,

Un aspecto de la presente invención proporciona un procedimiento para proporcionar un pronóstico en un paciente con cáncer, que comprende un procedimiento implementado por ordenador ex vivo que comprende: One aspect of the present invention provides a method for providing a prognosis in a cancer patient, comprising an ex vivo computer-implemented procedure comprising:

obtener una medición de linfocitos respecto al cáncer para cada linfocito, que comprende aplicar una estimación de la densidad para obtener un modelo de la densidad de células cancerosas; y determinar la proximidad de cada linfocito a la densidad de células cancerosas; clasificar un subconjunto de linfocitos como linfocitos intratumorales según su medición de linfocitos a cáncer, en el que un linfocito se clasifica como linfocito intratumoral si su medición de linfocitos a cáncer está por encima de un valor umbral;obtaining a measurement of lymphocytes with respect to cancer for each lymphocyte, which comprises applying a density estimate to obtain a model of cancer cell density; and determine the proximity of each lymphocyte to the density of cancer cells; classify a subset of lymphocytes as intratumoral lymphocytes according to their measurement of cancer lymphocytes, in which a lymphocyte is classified as intratumoral lymphocyte if its measurement of cancer lymphocytes is above a threshold value;

cuantificar los linfocitos intratumorales y las células cancerosas en la imagen del tumor; y calcular la relación de linfocitos intratumorales (RLIT) como la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas, en el que la RLIT es una medida de infiltración inmunitaria en el tumor,quantify intratumoral lymphocytes and cancer cells in the tumor image; and calculate the ratio of intratumoral lymphocytes (RLIT) as the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells, in which RLIT is a measure of immune infiltration into the tumor,

y en el que una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado de RLIT indica un mal pronóstico.and in which an RLIT below a predetermined cut-off value of RLIT indicates a poor prognosis.

El inventor ha demostrado que la RLIT es un predictor independiente del resultado clínico en el cáncer. Es decir, la RLIT predice el resultado clínico sin utilizar ningún otro biomarcador (como un biomarcador de expresión génica) o un indicador clínico (como el tamaño del tumor). Por ejemplo, el inventor ha demostrado que la RLIT es un factor predictivo independiente del resultado clínico en el cáncer de mama triple negativo (TNBC) y en el cáncer de ovario. Por ejemplo, en los estudios descritos en el presente documento no hubo correlación entre la RLIT y el tamaño del tumor, el estado del ganglio y el estado de mutación TP53 (Fig. 4D) y, por tanto, la RLIT es independiente de dichos indicadores y biomarcadores clínicos. Preferentemente, si la RLIT está por debajo de un valor de corte predeterminado (o igual o por debajo de un valor de corte predeterminado), esto indica un mal pronóstico (es decir, un mal resultado clínico). Un mal pronóstico, o un mal resultado clínico, puede ser una mala supervivencia específica de la enfermedad.The inventor has shown that RLIT is an independent predictor of the clinical outcome in cancer. That is, the RLIT predicts the clinical outcome without using any other biomarker (such as a gene expression biomarker) or a clinical indicator (such as tumor size). For example, the inventor has shown that RLIT is an independent predictive factor of the clinical outcome in triple negative breast cancer (TNBC) and in ovarian cancer. For example, in the studies described herein there was no correlation between RLIT and tumor size, ganglion status and TP53 mutation status (Fig. 4D) and, therefore, RLIT is independent of these indicators and clinical biomarkers. Preferably, if the RLIT is below a predetermined cut-off value (or equal to or below a predetermined cut-off value), this indicates a poor prognosis (i.e., a poor clinical outcome). A poor prognosis, or a poor clinical outcome, can be a poor specific survival of the disease.

En el presente contexto, una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado puede denominarse una RLIT baja, o RLIT baja. Por el contrario, una RLIT por encima de un valor de corte predeterminado puede denominarse una RLIT ^{alta o}ILTr ^{alta. Un valor de corte predeterminado para una RLIT puede simplemente referirse en el presente}documento como un valor de corte de la RLIT.In the present context, an RLIT below a predetermined cut-off value may be referred to as a low RLIT, or low RLIT. On the contrary, an RLIT above a predetermined cut-off value can be called a ^high RLIT ^or ^high ILTr ^{. A predetermined cut-off value for an RLIT can simply be referred to} herein as a cut-off value of the RLIT.

Un mal pronóstico significa que el paciente tiene un peor pronóstico que un paciente con un valor de RLIT por encima del valor de corte de RLIT. Por ejemplo, un pronóstico desfavorable puede significar que se espera que el paciente tenga un tiempo de supervivencia específico de la enfermedad más corto que un paciente con un valor de RLIT por encima del valor límite de RLIT. Un mal pronóstico puede significar que el paciente tiene un peor pronóstico que un paciente con un valor de RLIT por encima del valor de corte de RLIT. La relación de riesgo entre el grupo de pacientes que tiene una RLIT por debajo del valor de corte de RLIT y el grupo que tiene una RLIT por encima del valor de corte de RLIT puede ser de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4, puede ser desde aproximadamente 0,25 a aproximadamente 0,36, puede ser aproximadamente 0,25 o puede ser aproximadamente 0,36. Esto significa que un paciente con una RLIT más alta que el valor de corte tiene de 0,25-0,36 veces menos probabilidades de morir de cáncer de mama que un paciente con una RLIT más baja que el valor de corte. Un mal pronóstico puede significar que un paciente tiene una probabilidad de supervivencia de aproximadamente el 50 %, o aproximadamente el 49 %, cinco años desde el diagnóstico o diez años desde el diagnóstico. Un buen pronóstico puede significar que un paciente tiene una probabilidad de supervivencia de aproximadamente el 80 % cinco años desde el diagnóstico o diez años desde el diagnóstico.A poor prognosis means that the patient has a worse prognosis than a patient with an RLIT value above the cut-off value of RLIT. For example, an unfavorable prognosis may mean that the patient is expected to have a shorter disease-specific survival time than a patient with an RLIT value above the RLIT limit value. A poor prognosis may mean that the patient has a worse prognosis than a patient with an RLIT value above the cutoff value of RLIT. The risk ratio between the group of patients that has an RLIT below the cut-off value of RLIT and the group that has an RLIT above the cut-off value of RLIT can be from about 0.2 to about 0.4, it can be from about 0.25 to about 0.36, it can be about 0.25 or it can be about 0.36. This means that a patient with an RLIT higher than the cut-off value is 0.25-0.36 times less likely to die of breast cancer than a patient with a lower RLIT than the cut-off value. A bad prognosis can mean that a patient has a probability of survival of approximately 50%, or approximately 49%, five years from diagnosis or ten years from diagnosis. A good prognosis can mean that a patient has a survival probability of approximately 80% five years from diagnosis or ten years from diagnosis.

Un valor de corte de RLIT predeterminado puede ser de aproximadamente 0,011, o aproximadamente 0,061. El valor de corte puede ser de aproximadamente 0,005 a aproximadamente 0,070, desde aproximadamente 0,010 hasta aproximadamente 0,070, de aproximadamente -0,010 a aproximadamente 0,012, o de aproximadamente -0,050 a aproximadamente 0,070. Un valor de corte de RLIT predeterminado para TNBC puede ser de aproximadamente 0,011 y para el cáncer de ovario puede ser de aproximadamente 0,061.A predetermined RLIT cut-off value may be about 0.011, or about 0.061. The cut-off value may be from about 0.005 to about 0.070, from about 0.010 to about 0.070, from about -0.010 to about 0.012, or from about -0.050 to about 0.070. A predetermined RLIT cut-off value for TNBC can be about 0.011 and for ovarian cancer it can be about 0.061.

La RLIT se probó en dos cohortes independientes de TNBC y demostró ser predictiva de la supervivencia específica de la enfermedad. Cuando se usó la Cohorte 1 de TNBC como la cohorte de descubrimiento, se seleccionó un valor de corte de RLIT de 0,011 (es decir, los pacientes que tenían una RLIT por debajo de este valor mostraron una supervivencia significativamente más específica para la enfermedad que los pacientes que tenían una RLIT por encima de este valor) y en la cohorte 2 y una RLIT por debajo de 0,011 se asociaron a una supervivencia significativamente más específica de la enfermedad que los pacientes con una RLIT por encima de 0,011 (prueba del rango logarítmico p = 0,0063, Fig. 4F). Asimismo, cuando se utilizó la cohorte 2 de TNBC como cohorte de descubrimiento, se seleccionó un límite de RLIT de 0,011, y en la cohorte 1 un RLIT de menos de 0,011 se asoció con una supervivencia significativamente más específica de la enfermedad que los pacientes con un RLIT de más de 0,011 (p = 0,0037, Fig. 4F).The RLIT was tested in two independent TNBC cohorts and proved to be predictive of disease-specific survival. When TNBC Cohort 1 was used as the discovery cohort, an RLIT cut-off value of 0.011 was selected (that is, patients who had an RLIT below this value showed significantly more disease-specific survival than those patients who had an RLIT above this value) and in cohort 2 and an RLIT below 0.011 were associated with a significantly more disease-specific survival than patients with an RLIT above 0.011 (p-logarithmic range test = 0.0063, Fig. 4F). Likewise, when TNBC cohort 2 was used as a discovery cohort, an RLIT limit of 0.011 was selected, and in cohort 1 an RLIT of less than 0.011 was associated with a significantly more disease-specific survival than patients with an RLIT of more than 0.011 (p = 0.0037, Fig. 4F).

La potencia pronóstica de RLIT se compara favorablemente con el de los indicadores de pronóstico publicados previamente. La RLIT es un indicador de pronóstico más potente que el indicador "Lym" publicado anteriormente (un indicador basado en imágenes de tumores de la abundancia de linfocitos; Yuan et al., 2012) y varios indicadores publicados basados en firmas genéticas (Calabro et al., Ascierto et al., Rody et al, Ma et ál., Gu-Trantien et al). The prognostic power of RLIT compares favorably with that of previously published forecast indicators. RLIT is a more powerful prognostic indicator than the "Lym" indicator published previously (an indicator based on images of lymphocyte abundance tumors; Yuan et al., 2012) and several published indicators based on genetic signatures (Calabro et al ., Ascierto et al., Rody et al., Ma et al., Gu-Trantien et al).

El mismo enfoque de selección de corte utilizado para seleccionar el corte de RLIT se utilizó para probar el poder de pronóstico de "Lym" (una medida basada en imágenes de la abundancia de linfocitos en secciones de tumores) y varias firmas de expresión génica en TNBC y en cáncer de ovario. Ninguno de estos otros indicadores pronósticos se correlacionó consistentemente con el pronóstico tanto en la cohorte 1 como en la cohorte 2. Por el contrario, la RLIT estratificó de forma consistente a los pacientes en dos grupos de resultados clínicos diferentes. (Véase las Fig. 4, Fig. 5., Fig. 14)The same cut-off approach used to select the RLIT cut was used to test the prognostic power of "Lym" (an image-based measure of lymphocyte abundance in tumor sections) and several gene expression signatures in TNBC and in ovarian cancer. None of these other prognostic indicators was consistently correlated with the prognosis in both cohort 1 and cohort 2. In contrast, RLIT consistently stratified patients into two different clinical outcome groups. (See Fig. 4, Fig. 5., Fig. 14)

En comparación con las firmas de expresión génica publicadas, la RLIT fue también la única firma que mostró una correlación significativa con la supervivencia específica de la enfermedad en el modelo multivariado de riesgos proporcionales de Cox junto con los parámetros clínicos estándar del estado ganglionar y el tamaño del tumor en ambas cohortes, se usó cualquier cohorte como la cohorte de descubrimiento (tablas 1 a 3).Compared to the published gene expression signatures, the RLIT was also the only firm that showed a significant correlation with the specific survival of the disease in the multivariate Cox proportional hazards model along with the standard clinical parameters of nodal status and size. of the tumor in both cohorts, any cohort was used as the discovery cohort (tables 1 to 3).

Usando muestras de ambas cohortes TNBC, RLIT tiene un valor p del rango logarítmico de 2,1x10'4 y un HR 0,32 (0,17-0,58). Para probar la robustez del modelo de Cox en la determinación del valor pronóstico de RLIT, se usó el análisis bootstrap en datos perturbados al azar y el análisis de regresión univariable y multivariable se repitió 1.000 veces. En el 95,6 % y el 94,7 % de los casos, la RLIT se mantuvo significativamente asociado al pronóstico en los análisis univariados y multivariados, respectivamente. Tomados en conjunto, estos datos apoyan la estabilidad y la robustez de la RLIT como un biomarcador pronóstico independiente en el TNBC.Using samples from both TNBC cohorts, RLIT has a p-value of the logarithmic range of 2.1x10'4 and a HR 0.32 (0.17-0.58). To test the robustness of the Cox model in determining the prognostic value of RLIT, bootstrap analysis was used in randomly disturbed data and the univariable and multivariable regression analysis was repeated 1,000 times. In 95.6% and 94.7% of cases, the RLIT remained significantly associated with the prognosis in the univariate and multivariate analyzes, respectively. Taken together, these data support the stability and robustness of RLIT as an independent prognostic biomarker in TNBC.

La RLIT mide la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas, por lo tanto, es diferente del enfoque de evaluación patológica descrito en estudios anteriores (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014), donde se informó la proporción de nidos tumorales infiltrados por linfocitos. Estos estudios previos concuerdan con los resultados descritos en el presente documento, porque muestran que los linfocitos de infiltración de tumores están significativamente correlacionados con un resultado favorable en TNBC. Estos enfoques anteriores, como los experimentos indicados en el presente documento, se basaron en muestras patológicas teñidas con H y E y, por lo tanto, respaldan la posición de que las medidas de infiltración linfocitaria pueden ser una herramienta útil para ayudar a las decisiones clínicas en el TNBC.RLIT measures the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells, therefore, it is different from the pathological evaluation approach described in previous studies (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014), where the proportion of infiltrated tumor nests was reported by lymphocytes. These previous studies agree with the results described herein, because they show that tumor infiltration lymphocytes are significantly correlated with a favorable outcome in TNBC. These earlier approaches, such as the experiments indicated herein, were based on pathological samples stained with H and E and, therefore, support the position that lymphocyte infiltration measures can be a useful tool to help clinical decisions in the TNBC.

A diferencia de los procedimientos de la invención (que se basan en el análisis de imágenes automatizado), los procedimientos anteriores se basan en la evaluación de secciones de tumores por parte de anatomopatólogos (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014; Salgado, 2014). Los procedimientos anteriores que analizan las proporciones de nidos tumorales infiltrados por linfocitos son, por lo tanto, subjetivos y, por lo tanto, están sujetos a sesgos y variabilidad, y generan resultados de manera relativamente lenta con mayores costes asociados, Los procedimientos anteriores son, por lo tanto, inadecuados para análisis a gran escala.Unlike the methods of the invention (which are based on automated image analysis), the above procedures are based on the evaluation of tumor sections by pathologists (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014; Salgado , 2014). The above procedures that analyze the proportions of tumor nests infiltrated by lymphocytes are, therefore, subjective and, therefore, are subject to bias and variability, and generate results relatively slowly with higher associated costs. The above procedures are, therefore, unsuitable for large-scale analysis.

El enfoque adoptado en la presente invención, de identificación de subtipos de linfocitos por análisis de imagen, Contrasta con los enfoques anteriores para evaluar la infiltración inmunitaria en tumores. Los enfoques anteriores que utilizan el análisis de imágenes (Yuan, 2012) solo han tenido en cuenta la abundancia de linfocitos en los tumores, mientras que los enfoques que intentan tomar en cuenta las ubicaciones espaciales de los linfocitos (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014) han utilizado solo procesos basados en procedimientos manuales (anatomopatólogos) y se han basado en la evaluación cualitativa y subjetiva de las constelaciones de células cancerosas y sus relaciones con los linfocitos (la presencia del "nido" de las células cancerosas y la proporción de nidos que contienen linfocitos). En contraste, el presente inventor ha adoptado el enfoque de usar técnicas de análisis de imágenes para identificar subtipos de linfocitos dentro de tumores y usar la abundancia relativa de un subtipo de linfocitos (LIT) a células cancerosas como una medida cuantitativa objetiva de la infiltración inmunológica. Las técnicas de análisis de imágenes de la presente invención son Preferentemente técnicas automatizadas o implementadas por ordenador, facilitando así el análisis de grandes números (del orden de 100.000, Preferentemente al menos 10.000, al menos 50.000, o al menos 100.000) de linfocitos por imagen de tumor y permitiendo análisis a gran escala de cohortes de pacientes que tienen varios tipos y subtipos de cáncer.The approach adopted in the present invention, of identification of lymphocyte subtypes by image analysis, contrasts with the previous approaches to assess immune infiltration in tumors. Previous approaches that use image analysis (Yuan, 2012) have only taken into account the abundance of lymphocytes in tumors, while approaches that attempt to take into account the spatial locations of lymphocytes (Denkert, 2010; Loi, 2013; Deici, 2014) have used only processes based on manual procedures (pathologists) and have been based on the qualitative and subjective evaluation of the constellations of cancer cells and their relations with lymphocytes (the presence of the "nest" of the cancer cells and the proportion of nests containing lymphocytes). In contrast, the present inventor has taken the approach of using image analysis techniques to identify lymphocyte subtypes within tumors and using the relative abundance of a lymphocyte subtype (LIT) to cancer cells as an objective quantitative measure of immune infiltration. . The image analysis techniques of the present invention are preferably automated or computer-implemented techniques, thus facilitating the analysis of large numbers (of the order of 100,000, preferably at least 10,000, at least 50,000, or at least 100,000) of lymphocytes per image. of tumor and allowing large-scale analysis of cohorts of patients who have various types and subtypes of cancer.

A diferencia de los procedimientos de la invención, que predicen con fuerza el resultado clínico, las puntuaciones patológicas de la infiltración inmunitaria (incluida la evaluación patológica de la infiltración linfocitaria) no se correlacionaron significativamente con el pronóstico (Figura 13). Las puntuaciones patológicas analizadas incluyeron PAM50 (Perou et al., 2000), evaluación patológica de la infiltración linfocitaria, el tamaño del tumor y el grado. La evaluación patológica de la infiltración linfocitaria para los fines de este estudio se puntuó como ausente, leve o severa: Ausente si no había linfocitos, leve si hubo una ligera dispersión de linfocitos, y grave si hubo un infiltrado linfocitario prominente.Unlike the methods of the invention, which strongly predict the clinical outcome, the pathological scores of immune infiltration (including the pathological evaluation of lymphocyte infiltration) did not significantly correlate with the prognosis (Figure 13). The pathological scores analyzed included PAM50 (Perou et al., 2000), pathological evaluation of lymphocyte infiltration, tumor size and grade. The pathological evaluation of lymphocyte infiltration for the purposes of this study was scored as absent, mild or severe: Absent if there were no lymphocytes, mild if there was a slight lymphocyte dispersion, and severe if there was a prominent lymphocyte infiltrate.

Los procedimientos pronósticos de la invención, que se basan en un indicador objetivo de la infiltración de células inmunes obtenida por un procedimiento automatizado, tienen varias ventajas sobre los procedimientos de pronóstico anteriores para el uso en el cáncer. Tal y como se ha explicado anteriormente, La RLIT tiene mayor poder predictivo que varios biomarcadores de cáncer e indicadores de pronóstico conocidos anteriormente y un mayor poder predictivo que las puntuaciones patológicas de infiltración inmunológica. Debido a que la RLIT se determina utilizando procedimientos automatizados, proporciona una medición objetiva de la infiltración de células inmunitarias en el cáncer (es decir, no está sujeta a sesgos subjetivos o errores humanos, lo que provoca variabilidad en los resultados), no requiere puntuaciones por un anatomopatólogo (y, por lo tanto, no requiere formación para los anatomopatólogos ni seguimiento de nuevas pautas) y es de coste relativamente bajo y rápido de obtener, lo que lo hace adecuado para el análisis a gran escala de datos de cáncer. Aunque la detección de firmas basadas en firmas de expresión génica puede ser automatizada, la RLIT, debido a que puede convenientemente basarse en imágenes de tumores como las secciones teñidas con H y E (las copias se pueden compartir y almacenar de manera fácil y económica a largo plazo), es un biomarcador de menor costo y más conveniente que los biomarcadores basados en firmas de expresión génica (que requieren acceso a muestras biológicas conservadas). La RLIT basada en imágenes supera a varias firmas basadas en la expresión génica utilizando el procedimiento de selección de corte óptimo. Además, Considerando el coste de la adquisición de datos de micromatrices, los enfoques basados en la RLIT descritos en el presente documento abren una nueva vía para el análisis a gran escala sobre muestras patológicas fácilmente disponibles. The prognostic methods of the invention, which are based on an objective indicator of immune cell infiltration obtained by an automated procedure, have several advantages over the foregoing prognostic procedures for use in cancer. As explained above, RLIT has greater predictive power than several previously known cancer biomarkers and prognostic indicators and greater predictive power than pathological immune infiltration scores. Because RLIT is determined using automated procedures, it provides an objective measurement of immune cell infiltration in cancer (i.e., it is not subject to subjective biases or human errors, which results in variability in results), it does not require scores by a pathologist (and, therefore, does not require training for pathologists or follow-up of new guidelines) and is relatively low cost and fast to obtain, which makes it suitable for large-scale analysis of cancer data. Although the detection of signatures based on gene expression signatures can be automated, the RLIT, because it can conveniently be based on images of tumors such as sections stained with H and E (copies can be shared and stored easily and economically to long term), is a biomarker of lower cost and more convenient than biomarkers based on gene expression signatures (which require access to conserved biological samples). The image-based RLIT outperforms several signatures based on gene expression using the optimal cut selection procedure. In addition, Considering the cost of acquiring microarray data, the RLIT-based approaches described in this document open a new way for large-scale analysis of readily available pathological samples.

Tabla 1. Resultados de regresión de Cox univariados y multivariados para la RLIT y otras firmas en dos cohortes de TNBC.Table 1. Univariate and multivariate Cox regression results for the RLIT and other signatures in two TNBC cohorts.

continuacióncontinuation

Tabla 2. Resultados de la regresión de Cox univariados y multivariados para la RLIT y otras ocho firmas usando los valores de corte óptimos seleccionados en la cohorte 1 y validados en la cohorte 2. Uni-: Regresión univariable de Cox; Multi-: Regresión multivariable de Cox; HR: Cociente de riesgo; IC: intervalo de confianza del 95 % inferior y superior; Conc: Table 2. Results of the univariate and multivariate Cox regression for the RLIT and eight other firms using the optimal cut-off values selected in cohort 1 and validated in cohort 2. Uni-: Univariable Cox Regression; Multi-: Cox multivariable regression; HR: Risk ratio; CI: 95 % confidence interval lower and upper; Conc:

_____________ _________ Concordancia; Inf: El modelo de Cox no pudo converger.____________________________________ _________ Concordance; Inf: The Cox model could not converge. _______________________

Cohort1 Cohort2Cohort1 Cohort2

HR(CI) valor p HR(CI) valor p conc Uni-LIT 0,36(0,17-0,77) 0,0063 0,25(0,09-0,69) 0,0036 0,659 Multi-LIT

0,32(0,15-0,7) 0,0042 0,15(0,05-0,43) 0,00051 0,76 Multi-nodo 0,63(0,29-1,4)

0,26 4,93(1,61-15,08)

0,0052

HR (CI) p value HR (CI) p conc value Uni-LIT 0.36 (0.17-0.77) 0.0063 0.25 (0.09-0.69) 0.0036 0.659 Multi-LIT

0.32 (0.15-0.7) 0.0042 0.15 (0.05-0.43) 0.00051 0.76 Multi-node 0.63 (0.29-1.4)

0.26 4.93 (1.61-15.08)

0.0052

Multi-tamaño 2,62(1,27-5,41) 0,0092 2,07(0,9-4,74) 0,087Multi-size 2.62 (1.27-5.41) 0.0092 2.07 (0.9-4.74) 0.087

HR(CI) valor p HR(CI) valor p conc Uni-Lym 0,47(0,21-1,02) 0,051 0,41(0,12-1,43) 0,15 0,575 Multi-Lym

0,48(0,22-1,05) 0,066 0,23(0,05-1,02) 0,053 0,735 Multi-nodo 0,69(0,32-1,5)

0,35 4,65(1,46-14,81)

0,0092

HR (CI) p-value HR (CI) p-value conc Uni-Lym 0.47 (0.21-1.02) 0.051 0.41 (0.12-1.43) 0.15 0.575 Multi-Lym

0.48 (0.22-1.05) 0.066 0.23 (0.05-1.02) 0.053 0.735 Multi-node 0.69 (0.32-1.5)

0.35 4.65 (1.46-14.81)

0.0092

Multi-tamaño 2,35(1,16-4,77) 0,018 1,66(0,65-4,25) 0,29Multi-size 2.35 (1.16-4.77) 0.018 1.66 (0.65-4.25) 0.29

HR(CI) valor p HR(CI) valor p conc Uni-Calabro 0,25(0,12-0,52) 0E,-05 0,5(0,18-1,39) 0,18 0,587 Multi-Calabro 0,27(0,13-0,56) ,00038 0,41(0,14-1,19) 0,1 0,744 Multi-nodo 0,75(0,35-1,6) 0,45 4,57(1,45-14,37) 0,0093 Multi-tamaño 2,26(1,07-4,76)

0,032

1,91(0,82-4,46)

0,13

HR (CI) p-value HR (CI) p-value conc Uni-Calabro 0.25 (0.12-0.52) 0E, -05 0.5 (0.18-1.39) 0.18 0.587 Multi- Calabro 0.27 (0.13-0.56), 00038 0.41 (0.14-1.19) 0.1 0.744 Multi-node 0.75 (0.35-1.6) 0.45 4 , 57 (1.45-14.37) 0.0093 Multi-size 2.26 (1.07-4.76)

0.032

1.91 (0.82-4.46)

0.13

continuacióncontinuation

Tabla 3. Resultados de la regresión de Cox univariados y multivariados para la RLIT y otras ocho firmas usando los valores de corte óptimos seleccionados en la cohorte 2 y validados en la cohorte 1. Uni-: Regresión univariable de Cox; Multi-: Regresión multivariable de Cox; HR: Cociente de riesgo; IC: intervalo de confianza del 95 % inferior y superior; Conc: Table 3. Results of the univariate and multivariate Cox regression for the RLIT and eight other firms using the optimal cut-off values selected in cohort 2 and validated in cohort 1. Uni-: Univariable Cox Regression; Multi-: Cox multivariable regression; HR: Risk ratio; CI: 95 % confidence interval lower and upper; Conc:

Concordancia.Agreement.

continuacióncontinuation

La RLIT como evaluación no sesgada de la infiltración inmunitaria puede facilitar el descubrimiento de correlaciones moleculares con este fenómeno clínicamente importante. Aunque la expresión de muchos genes relacionados con el sistema inmunológico en tumores se asoció significativamente con la RLIT, no está claro si estos genes se expresan en células cancerosas o linfocitos. Esto se debe a que los datos de la micromatriz se obtuvieron utilizando materiales de tumor completo sin microdisección.RLIT as an unbiased assessment of immune infiltration can facilitate the discovery of molecular correlations with this clinically important phenomenon. Although the expression of many genes related to the immune system in tumors was significantly associated with RLIT, it is not clear whether these genes are expressed in cancer cells or lymphocytes. This is because the microarray data was obtained using complete tumor materials without microdissection.

Los datos en el presente documento muestran que la expresión de ARN de la proteína 4 asociada a los linfocitos T citotóxicos (CTLA4), un receptor de la familia de las inmunoglobulinas y el objetivo de ipilimumab, se asoció significativamente con la RLIT, así como con una supervivencia más prolongada específica de la enfermedad en l TNBC. Esto es consistente con la observación reciente en los cánceres de pulmón de células no pequeñas de que la sobreexpresión de CTLA4 se asocia a una tasa de mortalidad reducida (Salvi, 2012). CTLA4 se expresa en células tumorales en diferentes tipos de cáncer (Contardi, 2005). En el cáncer de mama, se expresa tanto en las células tumorales como en linfocitos T y se ha informado previamente una correlación inversa entre la expresión de CTLA4 y el resultado clínico (es decir, una expresión alta de CTLA4 asociado a un resultado clínico deficiente) en 60 pacientes con diferentes subtipos de cáncer de mama (Mao, 2010), que contrasta con los datos de TNBC (véase a continuación) y que, por lo tanto, resalta los nuevos conocimientos moleculares sobre el cáncer producidos por RLIT. Un estudio reciente mostró que la expresión de ARNm in situ de otro receptor de la superfamilia de inmunoglobulinas, PDL1, se asocia a un aumento de la infiltración inmunitaria y una supervivencia sin recidiva favorable en diferentes subtipos de cáncer de mama (Schalper, 2014).The data herein show that the expression of RNA of protein 4 associated with cytotoxic T lymphocytes (CTLA4), a receptor of the immunoglobulin family and the target of ipilimumab, was significantly associated with RLIT, as well as with longer specific disease survival in TNBC. This is consistent with the recent observation in non-small cell lung cancers that overexpression of CTLA4 is associated with a reduced mortality rate (Salvi, 2012). CTLA4 is expressed in tumor cells in different types of cancer (Contardi, 2005). In breast cancer, it is expressed in both tumor cells and T lymphocytes and an inverse correlation between CTLA4 expression and clinical outcome has been previously reported (i.e. a high expression of CTLA4 associated with a poor clinical outcome) in 60 patients with different subtypes of breast cancer (Mao, 2010), which contrasts with TNBC data (see below) and, therefore, highlights the new molecular knowledge about cancer produced by RLIT. A recent study showed that in situ mRNA expression from another receptor of the immunoglobulin superfamily, PDL1, is associated with an increase in immune infiltration and a favorable non-recurrence survival in different breast cancer subtypes (Schalper, 2014).

Tomados en conjunto, los datos en el presente documento apoyan el potencial de las terapias dirigidas a CTLA4 en TNBC. CTLA4 es un regulador negativo de las células T, y por lo tanto su expresión reduce la destrucción de células cancerosas mediada por células T. Los datos en el presente documento muestran una asociación positiva entre la expresión de CLTA4 y la RLIT, consistente con la expresión LIT de CTLA4. La expresión de CTLA4 en los LIT puede explicar por qué en muchos tumores las células cancerosas no se eliminaron incluso en presencia de un alto número de LIT. El uso de antagonistas de CTLA4 para inhibir la tolerancia inmune al cáncer y para activar los LIT puede ser una estrategia de tratamiento eficaz para TNBC.Taken together, the data in this document support the potential of therapies targeting CTLA4 in TNBC. CTLA4 is a negative regulator of T cells, and therefore its expression reduces the destruction of cancer cells mediated by T cells. The data herein shows a positive association between the expression of CLTA4 and RLIT, consistent with the expression CTLA4 LIT. The expression of CTLA4 in the LITs can explain why in many tumors the cancer cells were not eliminated even in the presence of a high number of LITs. The use of CTLA4 antagonists to inhibit immune tolerance to cancer and to activate LITs can be an effective treatment strategy for TNBC.

La agrupación no supervisada con modelos de mezcla de Gauss para la expresión de CTLA4 en todos los 1.980 tumores METABRIC reveló dos agrupaciones, uno con alto y otro con bajo nivel de expresión de CTLA4 (Fig. 15 A). Usando esta definición de agrupación para los tumores TNBC, encontramos que los pacientes con TNBC con un nivel más alto de expresión de CTLA4 tienen una supervivencia significativamente mejor específica de la enfermedad que los pacientes con un nivel más bajo de expresión de CTLA4 (p = 0,018, HR = 0,61, CI = 0,41-0,92, Fig. 15 B. Unmonitored clustering with Gaussian mix models for the expression of CTLA4 in all 1,980 METABRIC tumors revealed two clusters, one with high and one with low level of CTLA4 expression (Fig. 15 A). Using this definition of clustering for TNBC tumors, we found that patients with TNBC with a higher level of CTLA4 expression have a significantly better disease-specific survival than patients with a lower level of CTLA4 expression (p = 0.018 , HR = 0.61, CI = 0.41-0.92, Fig. 15 B.

El análisis del módulo genético también reveló varios estrechamente conectados, módulos funcionalmente relacionados. Por ejemplo, un módulo contiene APOBEC3G (apolipoproteína B MRNA, enzima de edición, polipéptido catalítico similar a 3G), que se sabe que juega un papel importante en la inmunidad adaptativa e innata y se ha investigado ampliamente en infecciones virales (Mangeat, 2003), pero su papel en el cáncer de mama no ha sido investigado en detalle. Es un miembro de la enzima de edición de ARNm de apolipoproteína B, La familia de complejos de edición tipo polipéptido catalítico junto con APOBEC3B, que se descubrió que era una fuente de mutagénesis en muchos tipos de cáncer importantes, incluido el cáncer de mama (Kuong, 2013). En las muestras de TNBC en el presente documento estudiadas, La expresión de APOBEC3G está significativamente correlacionada con un pronóstico favorable (log-rank p = 0,02) pero no con otros miembros de APOBEC, incluyendo APOBEC3B (p = 0,29). APOBEC3G se expresa principalmente en linfocitos T CD4 , Macrófagos y células dendríticas (Monajemi, 2012). Los datos actuales revelaron una fuerte asociación entre APOBEC3G y el gen de la célula asesina natural NKG7 y las interleucinas en este módulo y respaldan la importancia de APOBEC3G en TNBC.The analysis of the genetic module also revealed several closely connected, functionally related modules. For example, a module contains APOBEC3G (apolipoprotein B MRNA, editing enzyme, catalytic polypeptide similar to 3G), which is known to play an important role in adaptive and innate immunity and has been extensively investigated in viral infections (Mangeat, 2003) , but its role in breast cancer has not been investigated in detail. It is a member of the apolipoprotein B mRNA editing enzyme, the family of catalytic polypeptide-type editing complexes together with APOBEC3B, which was found to be a source of mutagenesis in many major cancers, including breast cancer (Kuong , 2013). In the TNBC samples studied here, APOBEC3G expression is significantly correlated with a favorable prognosis (log-rank p = 0.02) but not with other APOBEC members, including APOBEC3B (p = 0.29). APOBEC3G is expressed primarily in CD4 T lymphocytes, macrophages and dendritic cells (Monajemi, 2012). Current data revealed a strong association between APOBEC3G and the natural killer cell gene NKG7 and the interleukins in this module and support the importance of APOBEC3G in TNBC.

Las asociaciones entre la RLIT y genes inmunológicamente relevantes, las rutas y los módulos respaldan la validez de la RLIT como medida de la infiltración linfocitaria y revelan las crregulaciones de los genes inmunitarios clave. The associations between the RLIT and immunologically relevant genes, the routes and the modules support the validity of the RLIT as a measure of lymphocyte infiltration and reveal the crregulations of the key immune genes.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para determinar un pronóstico en un paciente con cáncer de mama triple negativo, comprendiendo el procedimiento, determinar el nivel de expresión de APOBEC3G en una muestra de tumor obtenida del paciente, en donde el aumento de la expresión y / o la expresión de APOBEC3G indica un pronóstico positivo.One aspect of the present disclosure provides a method for determining a prognosis in a patient with triple negative breast cancer, the procedure comprising determining the level of APOBEC3G expression in a tumor sample obtained from the patient, wherein the increase in expression and / or APOBEC3G expression indicates a positive prognosis.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para determinar un pronóstico en un paciente con cáncer de mama triple negativo, comprendiendo el procedimiento, determinar el nivel de expresión de CTLA4 en una muestra de tumor obtenida del paciente, en donde el aumento de la expresión de CTLA4 indica un pronóstico positivo. El aumento de la expresión de CTLA4 puede ser expresión de CTLA4 por encima del percentil medio (50) para TNBC, o puede ser expresión de CLTA4 por encima del percentil (25) para TNBC. El aumento de la expresión de CTLA4 puede ser una expresión de CTLA4 que sea alta en relación con uno o más genes "de mantenimiento", como la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).One aspect of the present disclosure provides a method for determining a prognosis in a patient with triple negative breast cancer, the procedure comprising determining the level of CTLA4 expression in a tumor sample obtained from the patient, wherein the expression increase of CTLA4 indicates a positive prognosis. The increase in the expression of CTLA4 may be an expression of CTLA4 above the average percentile (50) for TNBC, or it may be an expression of CLTA4 above the percentile (25) for TNBC. The increased expression of CTLA4 may be an expression of CTLA4 that is high in relation to one or more "maintenance" genes, such as glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH).

Un procedimiento para determinar un pronóstico basado en la RLIT como se describe en el presente documento puede comprender además una etapa para medir la expresión de CTLA4 en un tumor obtenido del paciente con cáncer. El paciente con cáncer puede ser un paciente TNBC. La etapa de medir la expresión de CTLA4 puede implicar la hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, análisis basados en micromatrices) o técnicas inmunohistoquímicas. En tales procedimientos, la combinación de una RLIT por encima de un valor de corte predeterminado y un aumento de la expresión de CTLA4 indica un pronóstico positivo. El valor de corte predeterminado para la RLIT puede ser de aproximadamente 0,03 o de aproximadamente 0,032.A method for determining a prognosis based on RLIT as described herein may further comprise a step to measure the expression of CTLA4 in a tumor obtained from the cancer patient. The cancer patient can be a TNBC patient. The step of measuring the expression of CTLA4 may involve hybridization of nucleic acids (eg, microarray based analyzes) or immunohistochemical techniques. In such procedures, the combination of an RLIT above a predetermined cut-off value and an increase in CTLA4 expression indicates a positive prognosis. The predetermined cut-off value for the RLIT can be about 0.03 or about 0.032.

La RLIT es un indicador cuantitativo objetivo de la infiltración linfocitaria en tumores. Esta medida cuantitativa de la infiltración inmunitaria es útil para guiar las decisiones de tratamiento en el cáncer.RLIT is an objective quantitative indicator of lymphocyte infiltration in tumors. This quantitative measure of immune infiltration is useful to guide treatment decisions in cancer.

En consecuencia, un aspecto de la divulgación proporciona un procedimiento de uso de la RLIT para predecir si un paciente con cáncer responderá o no a una terapia.Consequently, one aspect of the disclosure provides a procedure for using RLIT to predict whether a cancer patient will respond or not to a therapy.

Dicho procedimiento puede ser un procedimiento para predecir si un paciente con cáncer responderá a un régimen terapéutico, comprendiendo el procedimiento medir la infiltración inmunitaria en un tumor del paciente con cáncer de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento, en el que una RLIT por encima de un valor de corte de RLIT indica que es probable que el paciente responda al régimen terapéutico.Said procedure may be a procedure to predict whether a cancer patient will respond to a therapeutic regimen, the method comprising measuring immune infiltration in a tumor of the cancer patient according to a procedure described herein, in which a RLIT by Above a cut-off value of RLIT indicates that the patient is likely to respond to the therapeutic regimen.

La RLIT es útil para informar decisiones de tratamiento para pacientes con cáncer. En consecuencia, un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar a un paciente con cáncer, en el que se ha determinado que la RLIT del tumor está por debajo, o por encima, de un valor de corte predeterminado. El paciente con cáncer puede ser un individuo del que se ha obtenido una imagen de un tumor. El procedimiento puede comprender determinar la RLIT en un tumor del paciente. El procedimiento de tratamiento puede comprender la administración de un régimen terapéutico.RLIT is useful for informing treatment decisions for cancer patients. Consequently, one aspect of the present disclosure provides a method for treating a cancer patient, in which it has been determined that the tumor RLIT is below, or above, a predetermined cut-off value. The cancer patient may be an individual from whom an image of a tumor has been obtained. The procedure may comprise determining the RLIT in a tumor of the patient. The treatment procedure may comprise the administration of a therapeutic regimen.

El régimen terapéutico puede ser radioterapia o quimioterapia o cualquier combinación de estos. Un régimen terapéutico que comprende quimioterapia puede comprender quimioterapia basada en antraciclina. Un régimen terapéutico puede comprender la administración de un agente terapéutico. En consecuencia, un aspecto de la presente divulgación proporciona un agente terapéutico para uso en el tratamiento del cáncer en un paciente con cáncer, en el que se ha obtenido un pronóstico para el paciente con cáncer usando un procedimiento como se divulga en el presente documento.The therapeutic regimen may be radiotherapy or chemotherapy or any combination of these. A therapeutic regimen comprising chemotherapy may comprise anthracycline-based chemotherapy. A therapeutic regimen may comprise the administration of a therapeutic agent. Accordingly, one aspect of the present disclosure provides a therapeutic agent for use in the treatment of cancer in a cancer patient, in which a prognosis for the cancer patient has been obtained using a method as disclosed herein.

La RLIT proporciona información para predecir un pronóstico a largo plazo y para notificarlas decisiones de tratamiento al paciente. Así, si un paciente tiene una RLIT baja y es probable que tenga un mal pronóstico, este paciente puede recibir un tratamiento más intensivo (por ejemplo, más ciclos de quimioterapia) que un paciente con una RLIT alta. The RLIT provides information to predict a long-term prognosis and to notify treatment decisions to the patient. Thus, if a patient has a low RLIT and is likely to have a poor prognosis, this patient may receive more intensive treatment (for example, more chemotherapy cycles) than a patient with a high RLIT.

En consecuencia, un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para tratar el cáncer en un paciente con cáncer de acuerdo con un régimen terapéutico, comprendiendo el procedimiento analizar una imagen tumoral del paciente con cáncer según un procedimiento descrito en el presente documento y tratar al paciente con cáncer según el régimen terapéutico dependiendo de si la RLIT está por debajo o por encima de un valor de corte predeterminado.Accordingly, one aspect of the present disclosure provides a method for treating cancer in a cancer patient according to a therapeutic regimen, the method comprising analyzing a tumor image of the cancer patient according to a procedure described herein and treating the cancer patient according to the therapeutic regimen depending on whether the RLIT is below or above a predetermined cut-off value.

La RLIT combinada con la expresión de CTLA4 proporciona más información de pronóstico. La expresión relativamente alta de CTLA4 puede estar asociado a una RLIT alta y la inhibición de CTLA4 puede activar los linfocitos T para destruir las células cancerosas. Por lo tanto, para un paciente que tiene una RLIT por encima de un valor de corte predeterminado y que tiene una expresión aumentada de CTLA4, el régimen terapéutico puede comprender la administración de un antagonista de CTLA4. El antagonista de CTLA4 puede ser un anticuerpo, por ejemplo ipilimumab.The RLIT combined with the expression of CTLA4 provides more prognostic information. The relatively high expression of CTLA4 may be associated with a high RLIT and inhibition of CTLA4 may activate T lymphocytes to kill cancer cells. Therefore, for a patient who has an RLIT above a predetermined cut-off value and who has an increased expression of CTLA4, the therapeutic regimen may comprise the administration of a CTLA4 antagonist. The CTLA4 antagonist can be an antibody, for example ipilimumab.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un antagonista de CTLA4 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que se ha determinado que un tumor del paciente tiene una RLIT alta. Un aspecto de la presente invención proporciona un antagonista de CTLA4 para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que se ha determinado que un tumor del paciente tiene una RLIT por encima de un valor de corte predeterminado de RLIT de acuerdo con un procedimiento de la invención. El cáncer puede ser un tipo o subtipo específico de cáncer y el valor de corte de RLIT predeterminado puede ser el valor de corte determinado para una cohorte de pacientes que tienen ese tipo o subtipo de cáncer. El subtipo de cáncer puede ser el cáncer de mama. El antagonista de CTLA4 puede ser un anticuerpo, que puede ser un anticuerpo anti-CTLA4. El anticuerpo anti-CTLA4 puede ser ipilimumab (también conocido como MDX-010 y MDX-101). El paciente con cáncer puede ser un paciente con TNBC y la terapia puede ser ipilimumab.One aspect of the present disclosure provides a CTLA4 antagonist for use in a cancer treatment procedure, in which it has been determined that a patient's tumor has a high RLIT. One aspect of the present invention provides a CTLA4 antagonist for use in a cancer treatment procedure, in which it has been determined that a patient's tumor has an RLIT above a predetermined cut-off value of RLIT according to a method of the invention The cancer may be a specific type or subtype of cancer and the predetermined cut-off value of RLIT may be the cut-off value determined for a cohort of patients having that type or subtype of cancer. The cancer subtype may be breast cancer. The CTLA4 antagonist can be an antibody, which can be an anti-CTLA4 antibody. The anti-CTLA4 antibody can be ipilimumab (also known as MDX-010 and MDX-101). The cancer patient can be a patient with TNBC and the therapy can be ipilimumab.

Los procedimientos de pronóstico y terapéuticos descritos en el presente documento pueden comprender además reseccionar quirúrgicamente un tumor de un paciente con cáncer, medir la infiltración inmunitaria en el tumor de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento, y determinar un pronóstico y / o tratar al paciente con cáncer de acuerdo con un régimen terapéutico basado en la RLIT del tumor. Un tumor resecado quirúrgicamente es un tumor extirpado quirúrgicamente. El procedimiento para medir la infiltración inmunitaria puede usar una sección de tumor completo.The prognostic and therapeutic procedures described herein may further comprise surgically resecting a tumor from a cancer patient, measuring immune infiltration into the tumor according to a procedure described herein, and determining a prognosis and / or treating to the cancer patient according to a therapeutic regimen based on the RLIT of the tumor. A surgically resected tumor is a surgically removed tumor. The procedure to measure immune infiltration can use a complete tumor section.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona un procedimiento para determinar la eficacia de un régimen terapéutico. El procedimiento puede comprender determinar la RLIT de una biopsia de tumor obtenida de un paciente antes de someterse al régimen terapéutico, determinar la RLIT de una biopsia de tumor obtenida del paciente después de someterse al agente terapéutico y asociar una RLIT incrementada con eficacia terapéutica (es decir, un efecto terapéutico).One aspect of the present disclosure provides a procedure for determining the efficacy of a therapeutic regimen. The method may comprise determining the RLIT of a tumor biopsy obtained from a patient before undergoing the therapeutic regimen, determining the RLIT of a tumor biopsy obtained from the patient after undergoing the therapeutic agent and associating an increased RLIT with therapeutic efficacy (ie say, a therapeutic effect).

Los procedimientos de análisis de tumores de acuerdo con la divulgación pueden modificarse para proporcionar información adicional sobre los subtipos de linfocitos y su relevancia en el cáncer. Se sabe que los linfocitos en los tumores abarcan diversas subclases, incluidas linfocitos T auxiliares, linfocitos T reguladoras, células asesinas naturales y linfocitos B con implicaciones sofisticadas para la respuesta al tratamiento (Fridman, 2012; Gu-Trantien, 2013; Andre, 2013). Se puede realizar un análisis inmunohistoquímico de secciones de tumores con marcadores de células inmunes, para lo cual se podrían desarrollar procedimientos automatizados de análisis de imágenes inmunohistoquímicas y modelos estadísticos para discernir las interacciones entre el cáncer y la respuesta inmune antitumoral.Tumor analysis procedures according to the disclosure can be modified to provide additional information on lymphocyte subtypes and their relevance in cancer. It is known that lymphocytes in tumors encompass various subclasses, including auxiliary T lymphocytes, regulatory T lymphocytes, natural killer cells and B lymphocytes with sophisticated implications for response to treatment (Fridman, 2012; Gu-Trantien, 2013; Andre, 2013) . An immunohistochemical analysis of tumor sections with immune cell markers can be performed, for which automated procedures for immunohistochemical image analysis and statistical models could be developed to discern the interactions between cancer and the antitumor immune response.

En el contexto de los procedimientos y agentes terapéuticos descritos en el presente documento, Una sección patológica puede ser una sección de tumor. Una sección de tumor puede ser una sección de tumor completo. Una sección de tumor completo es normalmente una sección cortada de un tumor resecado quirúrgicamente, representando así las características de todo el tumor. Por lo tanto, una sección de todo el tumor puede ser una sección resecada quirúrgicamente. Una sección patológica puede ser una biopsia obtenida de un tumor. La sección patológica está, preferentemente, teñida. La tinción facilita el análisis morfológico de las secciones del tumor coloreando las células, las estructuras subcelulares y los orgánulos. Se puede utilizar cualquier tipo de tinción, siempre que la tinción facilite el análisis morfológico. La sección patológica se puede teñir con hematoxilina y eosina (H y E). La tinción de H y E es la tinción más utilizada en histopatología para el diagnóstico médico, particularmente para el análisis de secciones de biopsia de cánceres sospechosos por anatomopatólogos. Por lo tanto, las secciones patológicas teñidas con H y E generalmente están disponibles como parte de grandes conjuntos de datos recopilados para el estudio del cáncer. La aplicabilidad de los presentes procedimientos a las secciones patológicas teñidas con H y E los hace particularmente adaptables para su uso en el análisis de conjuntos de datos de muchos tipos y subtipos de cáncer para determinar el valor pronóstico de RLIT y para determinar los valores de corte de RLIT para uso en los procedimientos descritos en el presente documento.In the context of the therapeutic procedures and agents described herein, a pathological section may be a tumor section. A tumor section may be a complete tumor section. A complete tumor section is usually a section cut from a surgically resected tumor, thus representing the characteristics of the entire tumor. Therefore, a section of the entire tumor may be a surgically resected section. A pathological section may be a biopsy obtained from a tumor. The pathological section is preferably stained. Staining facilitates morphological analysis of tumor sections by coloring cells, subcellular structures and organelles. Any type of staining can be used, provided the staining facilitates morphological analysis. The pathological section can be stained with hematoxylin and eosin (H and E). H and E staining is the most widely used staining in histopathology for medical diagnosis, particularly for the analysis of biopsy sections of suspected cancers by pathologists. Therefore, pathological sections stained with H and E are generally available as part of large datasets collected for the study of cancer. The applicability of the present procedures to the pathological sections stained with H and E makes them particularly adaptable for use in the analysis of data sets of many types and subtypes of cancer to determine the prognostic value of RLIT and to determine the cut-off values. of RLIT for use in the procedures described herein.

La referencia en el presente documento a la RLIT de un tumor también se refiere a la RLIT de una sección patológica, sección de tumor o imagen del tumor.The reference herein to the RLIT of a tumor also refers to the RLIT of a pathological section, tumor section or tumor image.

La referencia en el presente documento a un valor de RLIT que está por debajo de un valor de corte también puede referirse a que un valor de RLIT sea igual o inferior a un valor de corte.The reference herein to an RLIT value that is below a cut-off value may also refer to an RLIT value being equal to or less than a cutoff value.

En el presente contexto, el término imagen de tumor se refiere a una imagen de un tumor de un paciente. Una imagen de tumor puede ser una imagen de una sección patológica o de una sección de tumor. En la presente divulgación, se puede hacer referencia a un paciente que tiene una RLIT (por ejemplo, una RLIT por debajo de un valor de corte predeterminado), lo que significa que se ha determinado que una imagen de un tumor de ese paciente tiene una RLIT. La imagen del tumor puede ser de una sección de un tumor resecado quirúrgicamente, o puede ser una biopsia de un tumor.In the present context, the term "tumor image" refers to an image of a patient's tumor. A tumor image may be an image of a pathological section or a tumor section. In the present disclosure, reference may be made to a patient having an RLIT (for example, an RLIT below a predetermined cut-off value), which means that an image of a tumor of that patient has been determined to have a RLIT The tumor image may be from a section of a surgically resected tumor, or it may be a biopsy of a tumor.

En el presente contexto, la proporción de linfocitos intratumorales a células cancerosas (RLIT) es la proporción en la sección patológica, en un tumor, en una biopsia del tumor, en una sección del tumor o en una imagen del tumor, sección de tumor o sección patológica. El término RLIT también puede atribuirse a un paciente. Un paciente que tiene una RLIT de un valor particular se refiere a un paciente de quien una sección patológica tiene una RLIT de un valor particular.In the present context, the proportion of intratumoral lymphocytes to cancer cells (RLIT) is the proportion in the pathological section, in a tumor, in a tumor biopsy, in a tumor section or in a tumor image, tumor section or pathological section The term RLIT can also be attributed to a patient. A patient who has a RLIT of a particular value refers to a patient of whom a pathological section has a RLIT of a particular value.

Los términos "infiltración linfocitaria" e "infiltración inmunitaria" se usan indistintamente en el presente documento. The terms "lymphocyte infiltration" and "immune infiltration" are used interchangeably herein.

En el presente contexto, "automatizado" se refiere a procesos que operan independientemente del control o entrada externa (humana). En el presente contexto, un proceso automatizado puede ser un proceso implementado por ordenador. Los procedimientos de la presente invención son procedimientos implementados por ordenador. Los procedimientos de la presente invención pueden ser procedimientos completamente automatizados, es decir, pueden operar independientemente del control humano o de la entrada en su totalidad. Los procedimientos de la presente invención pueden comprender una etapa de identificación de linfocitos y células cancerosas mediante análisis automatizado de imágenes. Los procedimientos de la presente invención pueden realizarse en una imagen de tumor en la que los linfocitos y las células cancerosas se han identificado mediante análisis de imagen automatizado. In the present context, "automated" refers to processes that operate independently of the external (human) control or input. In the present context, an automated process can be a computer-implemented process. The procedures of the present invention are procedures implemented by computer. The methods of the present invention can be fully automated procedures, that is, they can operate independently of human control or of the input in its entirety. The methods of the present invention may comprise a step of identifying lymphocytes and cancer cells by automated image analysis. The methods of the present invention can be performed on a tumor image in which lymphocytes and cancer cells have been identified by automated image analysis.

Los procedimientos de la presente invención se realizan en secciones patológicas, tales como secciones de tumores. Los procedimientos de la presente invención son, por lo tanto, procedimientos ex vivo, es decir, los procedimientos de la presente invención no se practican en el cuerpo humano.The procedures of the present invention are performed in pathological sections, such as tumor sections. The methods of the present invention are, therefore, ex vivo procedures , that is, the procedures of the present invention are not practiced in the human body.

Un paciente con cáncer en el contexto de la presente invención es un individuo que tiene cáncer o que ha sido diagnosticado con cáncer. La referencia al cáncer puede ser una referencia a un tipo o subtipo particular de cáncer. El paciente de cáncer puede haber sido sometido a quimioterapia basada en antraciclina, inmunoterapia o una terapia de combinación que comprende quimioterapia basada en antraciclina e inmunoterapia. El paciente con cáncer puede tener cáncer de mama, cáncer colorrectal, melanoma o cáncer de pulmón no microcítico. El paciente con cáncer puede tener el subtipo de cáncer de mama conocido como cáncer de mama triple negativo. El cáncer de mama triple negativo se puede definir como un cáncer de mama que es negativo para los receptores de estrógeno (ER) y HER2. (TNBC a veces se define como cáncer de mama que es negativo para los receptores de estrógeno (ER), HER2 y receptores de progesterona (PR), pero dado que los cánceres que son negativos para ER son normalmente también negativos para PR, en el presente contexto, TNBC se define como el cáncer de mama que es negativo para ER y HER2.A cancer patient in the context of the present invention is an individual who has cancer or who has been diagnosed with cancer. The reference to cancer may be a reference to a particular type or subtype of cancer. The cancer patient may have undergone anthracycline-based chemotherapy, immunotherapy or a combination therapy comprising anthracycline-based chemotherapy and immunotherapy. The cancer patient may have breast cancer, colorectal cancer, melanoma or non-small cell lung cancer. The cancer patient may have the subtype of breast cancer known as triple negative breast cancer. Triple negative breast cancer can be defined as a breast cancer that is negative for estrogen (ER) and HER2 receptors. (TNBC is sometimes defined as breast cancer that is negative for estrogen receptors (ER), HER2 and progesterone receptors (PR), but since cancers that are negative for ER are usually also negative for PR, in the In this context, TNBC is defined as breast cancer that is negative for ER and HER2.

En el contexto de la presente invención, la referencia al tratamiento de un paciente con cáncer se refiere al tratamiento del cáncer en un paciente.In the context of the present invention, the reference to the treatment of a cancer patient refers to the treatment of cancer in a patient.

El paciente con cáncer puede tener, o el tipo o subtipo de cáncer puede seleccionarse de, cáncer de mama (incluyendo carcinoma de mama ductal de mama y carcinoma lobular de mama), cáncer del sistema nervioso central (incluyendo glioblastoma multiforme y glioma de grado inferior), cáncer endocrino (incluyendo carcinoma adrenocortical, carcinoma tiroideo papilar, paraganglioma y feocromocitoma), cáncer gastrointestinal (incluido colangiocarcinoma, adenocarcinoma colorrectal, carcinoma hepatocelular del hígado, adenocarcinoma ductal pancreático, cáncer de estómago-esófago), cáncer ginecológico (incluyendo cáncer cervical, cistoadenocarcinoma seroso ovárico, carcinosarcoma uterino, carcinoma endometrial del cuerpo uterino), cáncer de cabeza y cuello (incluido carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, melanoma uveal), cáncer hematológico (incluida leucemia mieloide aguda y leucemia mieloide aguda), cáncer de piel (incluido melanoma cutáneo), cáncer de tejidos blandos (incluido sarcoma), cáncer torácico (incluido adenocarcinoma de pulmón, carcinoma de células escamosas de pulmón, mesotelioma) y cáncer urológico (incluido carcinoma renal de células cromófobas, carcinoma renal de células claras, carcinoma renal papilar, adenocarcinoma de próstata, cáncer de células germinales de testículo, carcinoma de vejiga urotelial). Cada uno de estos cánceres es objeto de estudio como parte del proyecto Atlas del genoma del cáncer.The cancer patient may have, or the type or subtype of cancer may be selected from, breast cancer (including ductal breast carcinoma and lobular carcinoma of the breast), central nervous system cancer (including glioblastoma multiforme and lower grade glioma ), endocrine cancer (including adrenocortical carcinoma, papillary thyroid carcinoma, paraganglioma and pheochromocytoma), gastrointestinal cancer (including cholangiocarcinoma, colorectal adenocarcinoma, hepatocellular carcinoma of the liver, ductal pancreatic adenocarcinoma, stomach-esophageal cancer (including cervical cancer) ovarian serous cystadenocarcinoma, uterine carcinosarcoma, endometrial carcinoma of the uterine body), head and neck cancer (including squamous cell carcinoma of the head and neck, uveal melanoma), hematologic cancer (including acute myeloid leukemia and acute myeloid leukemia), skin cancer (including cutaneous melanoma), tissue cancer soft (including sarcoma), thoracic cancer (including lung adenocarcinoma, squamous cell carcinoma of the lung, mesothelioma) and urological cancer (including chromophobic renal cell carcinoma, clear cell renal carcinoma, papillary renal carcinoma, prostate adenocarcinoma, germ cells of testis, urothelial bladder carcinoma). Each of these cancers is being studied as part of the Atlas project of the cancer genome.

En el presente contexto, el término "firmas inmunitarias" se utiliza para abarcar todos los biomarcadores relacionados con las respuestas inmunitarias e incluye las firmas de expresión génica estudiadas en el presente documento, así como otros biomarcadores que incluyen el biomarcador "Lym" (Yuan et al. 2012) y la RLIT.In the present context, the term "immune signatures" is used to encompass all biomarkers related to immune responses and includes gene expression signatures studied herein, as well as other biomarkers that include the biomarker "Lym" (Yuan et al. 2012) and the RLIT.

Todas y cada una de las combinaciones compatibles de las realizaciones descritas anteriormente se describen explícitamente en el presente documento, como si todas y cada una de las combinaciones fueran citadas individual y explícitamente. Each and every one of the compatible combinations of the embodiments described above are explicitly described herein, as if each and every combination was cited individually and explicitly.

Varios aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación.Various aspects and further embodiments of the present invention will be apparent to those skilled in the art in view of the present disclosure.

"y/o" cuando se usa en el presente documento debe tomarse como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin la otra. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como una descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B e (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera individualmente en el presente documento."and / or" when used herein should be taken as a specific description of each of the two characteristics or components specified with or without the other. For example, "A and / or B" should be taken as a specific description of each of (i) A, (ii) B e (iii) A and B, as if each of them were presented individually in this document .

A menos que el contexto indique otra cosa, las descripciones y definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ningún aspecto o realización particular de la invención, y se aplican igualmente a todos los aspectos y realizaciones que se describen.Unless the context indicates otherwise, the descriptions and definitions of the features set forth above are not limited to any particular aspect or embodiment of the invention, and apply equally to all aspects and embodiments described.

Sección experimentalExperimental section

ProcedimientosProcedures

Estudios de cáncer de mamaBreast cancer studies

Muestras clínicasClinical samples

El conjunto completo de muestras de METABRIC (Curtis et al.) contiene 1.980 tumores primarios de mama congelados de cinco hospitales contribuyentes. Entre estos, 1.026 de los 1.047 tumores de tres hospitales tienen secciones de H y E sin artefactos graves, mientras que todas las muestras de H y E de los otros dos hospitales están altamente fragmentadas debido al almacenamiento congelado a largo plazo. Por lo tanto, solo se consideraron los 1.026 tumores para este estudio (mediana de seguimiento a largo plazo de 68,3 meses). En promedio, se obtuvieron tres secciones de tumores en diferentes ubicaciones de cada tumor primario y se colocaron en el mismo portaobjetos (Yuan et al., 2012). Los materiales tumorales intercalados entre estas secciones se seccionaron, se mezclaron y se usaron para realizar el perfil molecular, maximizando así la relevancia biológica de los múltiples tipos de datos que se generan. Más detalles sobre el procedimiento experimental, los protocolos de tinción y perfilado molecular se pueden encontrar en Yuan et al 2012. Los datos de expresión génica para el mismo conjunto de tumores se perfilaron utilizando la plataforma Illumina HT-12. El estado de ER se determinó en función de la distribución bimodal de los datos de micromatrices de expresión de ESR1 y el estado de amplificación de Her2 en función de los datos de micromatrices SNP6 de los mismos tumores. En total, hubo 181 ER-negativos, Las muestras Her2-negativas y estas se definieron como triple negativo / TNBC. Las muestras de dos de los tres hospitales se fusionaron para formar la cohorte 1 (89 muestras) y las muestras del otro hospital se fusionaron para formar la cohorte 2 (92 muestras) con el fin de obtener un tamaño de población similar en cada cohorte. La infiltración inmunitaria se puntuó para 112 de las 181 muestras por los anatomopatólogos del consorcio METABRIC en tres categorías: ausente, leve y severa. Ausente si no había linfocitos, leve si hubo una ligera dispersión de linfocitos, y grave si hubo un infiltrado linfocitario prominente. Las puntuaciones patológicas de la infiltración inmunitaria no se correlacionaron significativamente con el pronóstico (Figura 13).The complete set of METABRIC samples (Curtis et al.) Contains 1,980 primary frozen breast tumors from five contributing hospitals. Among these, 1,026 of the 1,047 tumors in three hospitals have sections of H and E without serious artifacts, while all samples of H and E from the other two hospitals are highly fragmented due to long-term frozen storage. Therefore, only 1,026 tumors were considered for this study (median long-term follow-up of 68.3 months). On average, three sections of tumors were obtained in different locations of each primary tumor and placed on the same slide (Yuan et al., 2012). The tumor materials interspersed between these sections were sectioned, mixed and used to perform the molecular profile, thus maximizing the biological relevance of the multiple types of data generated. More details on the experimental procedure, molecular staining and profiling protocols can be found in Yuan et al 2012. Gene expression data for the same set of tumors were profiled using the Illumina HT-12 platform. The ER status was determined based on the bimodal distribution of the ESR1 expression microarray data and the Her2 amplification state based on the SNP6 microarray data of the same tumors. In total, there were 181 ER-negative, Her2-negative samples and these were defined as triple negative / TNBC. Samples from two of the three hospitals were merged to form cohort 1 (89 samples) and samples from the other hospital merged to form cohort 2 (92 samples) in order to obtain a similar population size in each cohort. Immune infiltration was scored for 112 of the 181 samples by the pathologists of the METABRIC consortium in three categories: absent, mild and severe. Absent if there were no lymphocytes, mild if there was a slight lymphocyte dispersion, and severe if there was a prominent lymphocyte infiltrate. The pathological scores of immune infiltration did not correlate significantly with the prognosis (Figure 13).

Análisis de imágenes de H y EH and E image analysis

La precisión de la herramienta automatizada de análisis de imágenes para las imágenes de la sección de congelación de tumores mamarios de H&E se había validado previamente según las puntuaciones de los tumores patológicos y la evaluación célula por célula (Yuan et al., Natrajan et al.). Para muestras de METABRIC, esta herramienta logró una precisión de validación cruzada del 90 % para la clasificación celular y una alta correlación con las puntuaciones patológicas de las proporciones celulares (cor = 0,98) (Yuan et al.). Esta herramienta se usó para clasificar todos los núcleos celulares en 181 secciones de tumor completo TNBC, resultando en un promedio de 81.810 (desviación estándar 80.330) células cancerosas, 15.500 (25.133) linfocitos y 14.090 (14.180) células estromales para cada imagen. Los linfocitos tienen una morfología típica de pequeños núcleos basófilos redondos y homogéneos, de este modo, se pueden diferenciar de forma fiable de otros tipos de células en el cáncer. Dado que este análisis se basa en la morfología nuclear solo en la H y E, es probable que los linfocitos identificados sean una mezcla de tipos de células inmunitarias, incluidos los linfocitos T y B.The accuracy of the automated image analysis tool for the images of the freezing section of H&E breast tumors had been previously validated based on pathological tumor scores and cell-by-cell evaluation (Yuan et al., Natrajan et al. ). For METABRIC samples, this tool achieved a cross-validation accuracy of 90% for cell classification and a high correlation with the pathological scores of cell proportions (cor = 0.98) (Yuan et al.). This tool was used to classify all cell nuclei into 181 sections of complete TNBC tumor, resulting in an average of 81,810 (standard deviation 80,330) cancer cells, 15,500 (25,133) lymphocytes and 14,090 (14,180) stromal cells for each image. Lymphocytes have a typical morphology of small round and homogeneous basophilic nuclei, thus, they can be reliably differentiated from other types of cells in cancer. Since this analysis is based on nuclear morphology only on H and E, the identified lymphocytes are likely to be a mixture of types of immune cells, including T and B lymphocytes.

Modelando la heterogeneidad espacial de la interacción inmune del cáncerModeling the spatial heterogeneity of cancer's immune interaction

Sea x = x¹x²... , sea Xn las localizaciones espaciales de n células cancerosas y = y¹y²..., sea ym las ubicaciones espaciales de m células inmunes en una imagen de tumor (por ejemplo, una imagen de sección de tumor de H y E). Usando una función de kernel quártico K se puede establecerLet x = x ¹ x ² ..., be Xn the spatial locations of n cancer cells y = y ¹ and ² ..., be ym the spatial locations of m immune cells in a tumor image (for example, an image of tumor section of H and E). Using a K- kernel kernel function K can be set

una estimación de la densidad del núcleo sobre la imagen del tumor completo: / ( x ) =an estimate of core density over the entire tumor image: / (x) =

h ' donde h es el parámetro de ancho de banda para K. h 'where h is the bandwidth parameter for K.

h se optimizó utilizando los criterios de Error de mínimos cuadrados (Berman et al.) en 10 imágenes muestreadas al azar. Por lo tanto, la proximidad espacial al cáncer para una célula inmune i es si = f (y). Entonces podemos identificar las clases de linfocitos basados en s, s = s¹s²... , sm, usando agrupación de mezclas gaussianas sin supervisión (McLachlan, 2000). Este procedimiento tiene como objetivo identificar múltiples componentes / agrupaciones dentro de los datos con probabilidades que cuantifican la incertidumbre de las observaciones que pertenecen a las agrupaciones. h was optimized using the least squares error criteria (Berman et al.) in 10 randomly sampled images. Therefore, the spatial proximity to cancer for an immune cell i is si = f ( y). Then we can identify the lymphocyte classes based on s, s = s ¹ s ² ..., sm, using cluster of Gaussian mixtures without supervision (McLachlan, 2000). This procedure aims to identify multiple components / clusters within the data with probabilities that quantify the uncertainty of the observations belonging to the clusters.

KK

^V 00 = Y WkGCsIfZfc.ffk), ^V 00 = Y WkGCsIfZfc.ffk),

k= 1 k = 1

donde K es el número de grupos, j k y ak son la media y la varianza que definen la función de densidad probabilística G para el componente kth, y wk es el peso de un componente k. Estos parámetros se estimaron mediante Expectativa-Maximización (Dempster, 1977). La selección de modelos con diferentes números de conglomerados se puede hacer usando criterios estadísticos, siendo uno de los más comunes el Criterio de Información Bayesiano (Schwartz, 1978). Se puede utilizar junto con la agrupación de modelos de mezcla para seleccionar el mejor número de agrupaciones K:where K is the number of groups, jk and ak are the mean and the variance that define the probability density function G for the component kth, and wk is the weight of a component k. These parameters were estimated by Expectation-Maximization (Dempster, 1977). The selection of models with different numbers of clusters can be done using statistical criteria, one of the most common being the Bayesian Information Criteria (Schwartz, 1978). It can be used together with the grouping of mix models to select the best number of K pools:

BIC = 2L (p (s)) dlog (m) BIC = 2L ( p ( s)) dlog ( m)

donde L () es la función de máxima probabilidad de registro y d es el número de parámetros libres que se deben estimar. Eficazmente, el criterio BIC tiene como objetivo evaluar el error de modelado así como la complejidad del modelo. Cuanto mayor sea el valor de BIC y mejor se considera que es la solución. Para realizar la agrupación, se muestrean aleatoriamente 100.000 células inmunitarias. Su proximidad espacial a los datos del cáncer se utilizó para agrupar con un rango de K diferente, K=1-5. Esto se repitió 200 veces el 97 % de cuya solución con tres grupos se consideró óptima por BIC. El jk medio de los grupos es consistente (mediana: 0,011, 0,06, 0,13; desviación estándar / SD: 0,002, 0,0047, 0,0045). Posteriormente, se clasificó a todos los linfocitos en todas las muestras de tumores en función de estos grupos. Se usó la proporción de la cantidad de linfocitos intratumorales y la cantidad de células cancerosas como medida final de la infiltración inmunitaria intratumoral:where L ( ) is the function of maximum probability of registration and d is the number of free parameters to be estimated. Effectively, the BIC criterion aims to evaluate the modeling error as well as the complexity of the model. The higher the BIC value and the better the solution is considered. To perform the grouping, 100,000 immune cells are randomly sampled. Its spatial proximity to cancer data was used to group with a different K range, K = 1-5. This was repeated 200 times 97% of whose solution with three groups was considered optimal by BIC. The average jk of the groups is consistent (median: 0.011, 0.06, 0.13; standard deviation / SD: 0.002, 0.0047, 0.0045). Subsequently, all lymphocytes were classified in all tumor samples according to these groups. The proportion of the amount of intratumoral lymphocytes and the amount of cancer cells was used as the final measure of intratumoral immune infiltration:

^_ ^In tro-lin focito de tumor

^_ ^ In tro-lin tumor focyte

Análisis de imágenes y modelado de la heterogeneidad espacial, con más detalleImage analysis and spatial heterogeneity modeling, in more detail

Datos de imagenImage data

CRImage procesa un portaobjetos de H y E dividiéndola primero en subimágenes de 2.000 píxeles por 2.000 píxeles e identificando las células en estas subimágenes. Por lo tanto, las ubicaciones de células para estas subimágenes deben combinarse. Se proporcionan identificaciones de células y ubicaciones espaciales combinadas para todas las secciones H y E de la sección completa de TNC de 181 como archivos de datos R en una carpeta 'CellPosAndMask'. Estos archivos se nombran por su ID de imagen. Cada archivo contiene la x, y las columnas de clase que almacenan las coordenadas x y, así como la clase de cada célula en el portaobjetos grande de H y E. También hay una matriz binaria "máscara" para denotar el área del tejido. La resolución de esta imagen es de 5 pm por píxel.CRImage processes a slide of H and E by first dividing it into sub-images of 2,000 pixels by 2,000 pixels and identifying the cells in these sub-images. Therefore, cell locations for these subpictures must be combined. Combined cell identifications and spatial locations are provided for all sections H and E of the entire TNC section of 181 as R data files in a 'CellPosAndMask' folder. These files are named by their image ID. Each file contains the x, and the class columns that store the x and y coordinates, as well as the class of each cell on the large slide of H and E. There is also a binary matrix "mask" to denote the tissue area. The resolution of this image is 5 pm per pixel.

Identificar el parámetro de ancho de banda óptimo para calcular la densidad del kernelIdentify the optimal bandwidth parameter to calculate kernel density

Al muestrear 10 muestras aleatorias, el error cuadrático medio se calcula en un rango de diferentes anchos de banda h para calcular la densidad del cáncer.When sampling 10 random samples, the mean square error is calculated in a range of different bandwidths h to calculate the cancer density.

biblioteca (splancs) library ( splancs)

MSE <- NULLMSE <- NULL

set.seed (10) set.seed ( 10)

ffs <- sample(dir('./data/CellPosAndMask/’), 10) ffs <- sample (dir ( './data/CellPosAndMask/'), 10)

for (ff in ffs){ for ( ff in ffs) {

res <- try(load(paste('./data/CellPosAndMask/', ff, sep="))) res <- try ( load ( paste ( './data/CellPosAndMask/', ff, sep = ")))

CellPos[,1] <- as.character)CellPos[, 1]) CellPos [, 1] <- as.character) CellPos [, 1])

CellPos[,2] <- as.numeric(CellPos[,2]) CellPos [, 2] <- as.numeric ( CellPos [, 2])

CellPos [, 3] <- as.numeric(CellPos[,3]) CellPos [, 3] <- as.numeric ( CellPos [, 3])

CellPos <- CellPos[rowSums(is.na(CellPos))==0, ] CellPos <- CellPos [rowSums ( is.na ( CellPos)) == 0,]

CellPos[,3] <- ncol(Mask) - CellPos[ 3] 1 CellPos [, 3] <- ncol ( Mask) - CellPos [3] 1

CellPos[,3][ CellPos[3] > ncol(Mask)] <- ncol(Mask) CellPos [, 3] [CellPos [3]> ncol ( Mask)] <- ncol ( Mask)

CellPos <- CellPos[CellPos[,1]!='a',]CellPos <- CellPos [CellPos [, 1]! = 'A',]

cell.c <- data.frame(x=as.numeric(CellPos[CellPos[,1]-='c',2]), cell.c <- data.frame ( x = as.numeric ( CellPos [CellPos [, 1] - = 'c', 2]),

y=as.numeric(CellPos[CellPos[,1]=-c',3])) y = as.numeric ( CellPos [CellPos [, 1] = - c ', 3]))

cv<- mse2d(as.points(cell.c), poly=cbind(c(0, 0, nrow(Mask), nrow(Mask)), c(0, ncol(Mask), cv <- mse2d ( as.points ( cell.c), poly = cbind ( c ( 0, 0, nrow ( Mask), nrow ( Mask)), c ( 0, ncol ( Mask),

ncol(Mask), 0)), nsmse = 40, range=10) ncol ( Mask), 0)), nsmse = 40, range = 10)

MSE <- rbind(MSE, cv$mse) MSE <- rbind ( MSE, cv $ mse)

}}

save(cv, MSE, file='./data/BandwidthSelection.rdata) save ( cv, MSE, file = '. / data / BandwidthSelection.rdata)

Se eligió h=5 como el ancho de banda óptimo para una variabilidad más baja del error cuadrático medio.H = 5 was chosen as the optimal bandwidth for a lower variability of the mean square error.

Generar proximidad espacial al cáncer para cada linfocitoGenerate spatial proximity to cancer for each lymphocyte

Ahora, las puntuaciones espaciales se pueden generar dados los datos de posición de la célula usando la siguiente función getLIT. La función getLIT usa los archivos de posición de la célula para inferir un mapa de densidad de cáncer usando el ancho de banda seleccionado anteriormente.Now, spatial scores can be generated given cell position data using the following getLIT function. The getLIT function uses cell position files to infer a cancer density map using the previously selected bandwidth.

getLIT <- función (ff,...) {getLIT <- function (ff, ...) {

require(EBImage) require ( EBImage)

require(splancs) require ( splancs)

res <- try(load(paste('./data/CellPosAndMask/', ff, ’.rdata', sep="))) res <- try ( load ( paste ( './data/CellPosAndMask/', ff, '.rdata', sep = ")))

i f (class(res)!= 'try-error){ if ( class ( res)! = 'try-error) {

CellPos[,1] <- as.character(CellPos[,1]) CellPos [, 1] <- as.character ( CellPos [, 1])

CellPos[,3] <- as.numeric(CeilPos[,3]) CellPos [, 3] <- as.numeric ( CeilPos [, 3])

CellPos[,3] <- ncol(Mask) - CeliPos[,3] 1 CellPos [, 3] <- ncol ( Mask) - CeliPos [, 3] 1

CellPos[,3][ CellPos[,3] > ncol(Mask)] <- ncol(Mask) CellPos [, 3] [CellPos [, 3]> ncol ( Mask)] <- ncol ( Mask)

cell.c <- data.frame(x=as.numeric(CellPos[CellPos[,1]=-c',2]), cell.c <- data.frame ( x = as.numeric ( CellPos [CellPos [, 1] = - c ', 2]),

y=as.numeric(CellPos[CeilPos[1]=-c',3])) y = as.numeric ( CellPos [CeilPos [1] = - c ', 3]))

res <- kernel2d(as.points(celI.c), poly=cbind(c(0, 0, nrow(Mask), nrow(Mask)), c(0, res <- kernel2d ( as.points ( celI.c), poly = cbind ( c ( 0, 0, nrow ( Mask), nrow ( Mask)), c ( 0,

ncol(Mask), ncoI(Mask), 0)), h0=h, nx=dim(Mask)[1], ny=dim(Mask)[2]) ncol ( Mask), ncoI ( Mask), 0)), h0 = h, nx = dim ( Mask) [1], ny = dim ( Mask) [2])

cell.l <- data.frame(x=as.numeric(CellPos[CellPos[,1]=='I',2]), cell.l <- data.frame ( x = as.numeric ( CellPos [CellPos [, 1] == 'I', 2]),

y=as.numeric(CellPos[CellPos[,1]=='I',3])) y = as.numeric ( CellPos [CellPos [, 1] == 'I', 3]))

z.i <- unlist(sapply(1:length(cell.l$x), function(x) res$z[cell.l$x[x], celi.l$y[x]])) zi <- unlist ( sapply ( 1: length ( cell.l $ x), function ( x) res $ z [cell.l $ x [x], celi.l $ y [x]]))

}}

z.lz.l

}}

Utilizando esta función, se pueden generar mediciones para cada linfocito para cada tumor.Using this function, measurements can be generated for each lymphocyte for each tumor.

itl <- list() itl <- list ( )

files <- trait$file files <- trait $ file

for (ff in files) for ( ff in files)

itl <- c(itl, list(try(getlTL(ff, h=5, w=3, cex=. 5, ifPlot=F)))) itl <- c ( itl, list ( try ( getlTL ( ff, h = 5, w = 3, cex =. 5, ifPlot = F))))

names(itl) <- files names ( itl) <- files

save(itl, file='./data/ITL.rdata') save ( itl, file = '. / data / ITL.rdata')

Por defecto, la función getLIT usa los valores de corte (valores de umbral) de 0,10507473 y 0,03662728 para determinar los linfocitos intratumorales (ITL), adyacentes al tumor (LTA) y distales al tumor (LTD). Ahora describiremos cómo se seleccionaron estos puntos de corte.By default, the getLIT function uses the cut-off values (threshold values) of 0.10507473 and 0.03662728 to determine intratumoral lymphocytes (ITL), adjacent to the tumor (LTA) and distal to the tumor (LTD). We will now describe how these cut points were selected.

Identificar subpoblaciones de linfocitos por aprendizaje no supervisadoIdentify lymphocyte subpopulations by unsupervised learning

El agrupamiento de la mezcla de Gauss y el BIC implementado en el paquete R mclust se utilizaron para el descubrimiento de subpoblaciones de linfocitos. Se tomaron muestras aleatorias de 100.000 linfocitos del objeto itl y después se agruparon.The Gaussian mixture cluster and the BIC implemented in the R mclust package were used for the discovery of lymphocyte subpopulations. Random samples of 100,000 lymphocytes were taken from the itl object and then pooled.

library(mclust) library ( mclust)

load (file-./data/ITL. rdata') load ( file-./data/ITL. rdata ')

set.seed (11) set.seed ( 11)

x <- sample(as.numeric(unlist(itl)), 100000) x <- sample ( as.numeric ( unlist ( itl)), 100,000)

res <- Mclust(x, G=1:5) res <- Mclust ( x, G = 1: 5)

El proceso de muestreo se repitió para generar agrupaciones 200 veces y se evaluó el resultado de Mclust y mclustBIC. Se obtienen valores BIC para estas 200 rondas. La solución de tres grupos k = 3 permanece óptima en el 97 % del tiempo, y k = 5 se eligió el 3 % de las veces. La mediana de las medias de agrupación cuando hay tres agrupamientos son 0,0114, 0,0603 y 0,1322 con una desviación estándar de 0,002 y 0,0047 y 0,0045, respectivamente.The sampling process was repeated to generate clusters 200 times and the result of Mclust and mclustBIC was evaluated. BIC values are obtained for these 200 rounds. The solution of three groups k = 3 remains optimal in 97% of the time, and k = 5 was chosen 3% of the time. The median of the grouping means when there are three groupings are 0.0114, 0.0603 and 0.1332 with a standard deviation of 0.002 and 0.0047 and 0.0045, respectively.

Por lo tanto, el resultado de la agrupación de linfocitos a partir de datos muestreados aleatoriamente es estable. Dado que el agrupamiento es estable, los valores de corte se tomaron al valor máximo de la primera y segunda agrupaciones de una de las pruebas de muestreo como nuestros valores de corte para determinar la clasificación de linfocitos para las muestras restantes.Therefore, the result of lymphocyte clustering from randomly sampled data is stable. Since the grouping is stable, the cut-off values were taken at the maximum value of the first and second groupings of one of the sampling tests as our cut-off values to determine the lymphocyte classification for the remaining samples.

Generación de RLIT, RLAT y RLTDRLIT, RLAT and RLTD generation

Posteriormente, los cortes se pueden usar para clasificar cada linfocito en función de sus datos almacenados en el objeto R itl. mat.I es una matriz con columnas de 'Distal', 'Adyacente', "Intra" que indica la cantidad de linfocitos en cada clase para un tumor.Subsequently, the cuts can be used to classify each lymphocyte based on its data stored in the object R itl. mat.I is a matrix with columns of 'Distal', 'Adjacent', "Intra" that indicates the amount of lymphocytes in each class for a tumor.

th=c(0.03662728, 0.10507473) th = c ( 0.03662728, 0.10507473)

mat.I <- NULLmat.I <- NULL

for (i in 1:length(itl)){ for ( i in 1: length ( itl)) {

z.l <- itl[[i]] zl <- itl [[i]]

cl <- rep(1,length(z.l)) cl <- rep ( 1, length ( zl))

cl[z.I>th[1] & z.l<th[2]] <- 2cl [z.I> th [1] & z.l <th [2]] <- 2

cl[z.l>=th[2]] <- 3 cl [zl> = th [2]] <- 3

mat.I <- rbind(mat.l, c(sum(cl==1), sum(cl==2), sum(cl--3))) mat.I <- rbind ( mat.l, c ( sum ( cl == 1), sum ( cl == 2), sum ( cl - 3)))

}}

colnames(mat.l) <- c('Distal', 'Adjacent', 'Intra') colnames ( mat.l) <- c ( 'Distal', 'Adjacent', 'Intra')

rownames(mat.l) <- names(itl) rownames (mat.l) <- names (itl)

La columna Intra de mat.I es el número de linfocitos intratumorales. Esto dividido por el número de células cancerosas (trait $ nTumour) es la medida de RLITThe Intra column of mat.I is the number of intratumoral lymphocytes. This divided by the number of cancer cells (trait $ nTumour) is the measure of RLIT

Medición de distancias celulares y disposición espacialMeasurement of cellular distances and spatial arrangement

Para identificar propiedades físicas de los LIT, LTA y LTD que los diferencian, en 10.000 linfocitos muestreados aleatoriamente de 20 tumores, identificamos las 5 células cancerosas más cercanas y el centroide de la región del casco convexo que forman estas células cancerosas. Para cada linfocito, se calculó la distancia desde el linfocito hasta la célula cancerosa más cercana (d^{m in}) y se calculó la distancia hasta el centroide del casco convexo del cáncer (dcentroid). El centroide de una región del casco convexo se calculó como las posiciones medias del subconjunto de puntos que definen el casco convexo. Las diferencias entre las clases de linfocitos en términos de d^centroid y d^centroid se evaluaron con la prueba t de Student.To identify the physical properties of the LIT, LTA and LTD that differentiate them, in 10,000 lymphocytes randomly sampled from 20 tumors, we identify the 5 closest cancer cells and the centroid of the convex hull region that form these cancer cells. For each lymphocyte, the distance from the lymphocyte to the nearest cancer cell ( d ^{m in} ) was calculated and the distance to the centroid of the convex cancer helmet (dcentroid) was calculated. The centroid of a region of the convex hull was calculated as the mean positions of the subset of points that define the convex hull. Differences between lymphocyte classes in terms of d ^centroid and d ^centroid were evaluated with the Student's t-test.

Otras firmas inmunitarias en comparaciónOther immune firms in comparison

La abundancia de linfocitos basada en el resultado del análisis de la imagen se calculó como:Lymphocyte abundance based on the result of the image analysis was calculated as:

^{.. e . N lin fo c ito} linfocito = ^{— ^ ------------}* *cáncer ^{.. e. N lin fo c ito} lymphocyte = ^{- ^ ------------} * * cancer

Las firmas de expresión génica se calcularon como se describe en los documentos referidos.Gene expression signatures were calculated as described in the referred documents.

Módulos génicos de RLITRLIT gene modules

La agrupación jerárquica se utilizó para identificar módulos genéticos altamente correlacionados agrupando la matriz de correlación de todos los genes asociados a LIT en 100 agrupaciones. Los módulos se seleccionaron a partir de estos grupos en función de la correlación absoluta de Pearson media superior a 0,75 y el tamaño del grupo superior a cinco.Hierarchical clustering was used to identify highly correlated genetic modules by grouping the correlation matrix of all genes associated with LIT into 100 clusters. The modules were selected from these groups based on the average Pearson absolute correlation greater than 0.75 and the group size greater than five.

Comparación de los genes de RLIT y asociados a RLITComparison of RLIT and RLIT associated genes

Para probar si la RLIT tiene un valor adicional para los genes asociados a la RLIT, se realizó un análisis multivariado de regresión de Cox con RLIT emparejado con el perfil de expresión de un gen RLIT. Esto se realizó para todos los primeros 100 genes asociados a RLIT clasificados por correlación. La RLIT se dicotomizó utilizando el umbral informado en el documento, y la expresión génica fue dicotomizada en dos grupos de igual tamaño o tres grupos (25 percentiles inferiores, 50 centrales y 25 superiores). Se produjeron tablas con la relación de riesgos, el valor p del rango log y el intervalo del 95 %. En ambos análisis con dos y tres grupos de pacientes según los datos de expresión génica, los valores p de la RLIT fueron consistentemente más altos que los valores p de los perfiles de expresión génica, además de ser más altos que el nivel de significación de 0,05 (-log (p) 2,99).To test whether the RLIT has an additional value for the genes associated with the RLIT, a multivariate Cox regression analysis was performed with RLIT paired with the expression profile of an RLIT gene. This was done for all the first 100 RLIT associated genes classified by correlation. The RLIT was dichotomized using the threshold reported in the document, and gene expression was dichotomized into two groups of equal size or three groups (25 percentiles lower, 50 central and 25 higher). Tables with the risk ratio, the p value of the log range and the 95% interval were produced. In both analyzes with two and three groups of patients according to gene expression data, the p-values of the RLIT were consistently higher than the p-values of the gene expression profiles, in addition to being higher than the significance level of 0 , 05 (-log (p) 2.99).

Otros procedimientos estadísticosOther statistical procedures

La tendencia monótona entre la RLIT y los parámetros clínicos se probó utilizando la prueba de tendencia Jonckheere-Terpstra (Jonckheere). El análisis de supervivencia se realizó con datos de supervivencia a 10 años específicos del cáncer de mama. El estimador de Kaplan-Meier se utilizó para la estratificación del paciente y la prueba del rango logarítmico para las diferencias de los grupos. El modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox se ajustó a los datos de supervivencia y los índices de riesgo y se calcularon los intervalos de confianza del 95 % para determinar la correlación con la supervivencia específica de la enfermedad, en el que la prueba del rango logarítmico con p <0,05 se consideró significativa. La correlación entre la RLIT y la expresión génica se calculó con la correlación de Pearson y los valores q se calcularon utilizando la corrección de la tasa de descubrimiento falso (FDR) utilizando el 25 % de los datos para ajustar el modelo nulo. Los valores de corte para dicotomizar las firmas inmunitarias se optimizaron por etapas de 20 a 80 percentiles en un intervalo de 1,5. Se seleccionaron los valores de corte que mostraron el mayor significado pronóstico con la prueba del rango logarítmico. Para la prueba de consistencia en la Fig. 5F, cada firma se centró en 0 y se ajustó a la desviación estándar 1. Los cortes óptimos también se asignaron a los nuevos datos antes de la comparación. El conjunto de genes MSigDB versión 4.0 (Subramanian et al.) se usó junto con una prueba hipergeométrica para el análisis de enriquecimiento.The monotonous tendency between the RLIT and the clinical parameters was tested using the Jonckheere-Terpstra trend test (Jonckheere). Survival analysis was performed with specific 10-year survival data from the breast cancer The Kaplan-Meier estimator was used for the stratification of the patient and the logarithmic range test for the differences of the groups. The Cox proportional hazards regression model was adjusted to survival data and risk indices and 95% confidence intervals were calculated to determine the correlation with disease-specific survival, in which the range test Logarithmic with p <0.05 was considered significant. The correlation between the RLIT and gene expression was calculated with the Pearson correlation and the q values were calculated using the correction of the false discovery rate (FDR) using 25% of the data to fit the null model. The cut-off values to dichotomize immune signatures were optimized in stages of 20 to 80 percentiles in a range of 1.5. The cut-off values that showed the greatest prognostic significance were selected with the logarithmic range test. For the consistency test in Fig. 5F, each signature was centered at 0 and adjusted to the standard deviation 1. Optimal cuts were also assigned to the new data before comparison. The MSigDB version 4.0 gene set (Subramanian et al.) Was used together with a hypergeometric test for enrichment analysis.

Estudios de cáncer de ovariosOvarian Cancer Studies

Se obtuvieron muestras de un estudio colaborativo entre el Reino Unido y China que tenía como objetivo estudiar las implicaciones clínicas de la infiltración inmunitaria en un conjunto de 91 pacientes con cáncer de ovario con enfermedad metastásica. Se obtuvieron portaobjetos teñidos con H y E para los tumores primarios, se cribaron y se sometieron a análisis de imagen utilizando CRImage. Las células en estas imágenes se clasificaron en las categorías de células cancerosas, linfocitos y células estromales. Una vez que las ubicaciones espaciales de estas células se obtuvieron a partir del análisis de imágenes, se computó la densidad kernel del cáncer para cada imagen y se obtuvieron mediciones de linfocitos a cáncer para cada linfocito. Las medidas se sometieron a agrupamiento y se encontraron dos grupos, es decir, linfocitos intratumorales y no intratumorales. Se calculó la RLIT como la relación de linfocitos intratumorales a células cancerosas para cada paciente. El 29 % de los pacientes con RLIT más baja que un valor de corte de 0,06085726 tiene una supervivencia global significativamente peor que los pacientes con RLIT más alta que el valor de corte (prueba del rango logarítmico de la SG a 10 años p = 0,024, HR = 0,51, IC = 0,28-0,92; SG a 5 años p = 0,045, HR = 0,54, IC = 0,29-0,99; cifras en ovarios). La supervivencia global se definió utilizando la muerte como un evento independientemente de la causa, ya que esta información no estaba disponible.Samples were obtained from a collaborative study between the United Kingdom and China that aimed to study the clinical implications of immune infiltration in a set of 91 ovarian cancer patients with metastatic disease. Slides stained with H and E were obtained for the primary tumors, screened and subjected to image analysis using CRImage. The cells in these images were classified into the categories of cancer cells, lymphocytes and stromal cells. Once the spatial locations of these cells were obtained from the image analysis, the kernel density of the cancer was computed for each image and measurements of cancer lymphocytes were obtained for each lymphocyte. The measures were grouped and two groups were found, that is, intratumoral and non-intratumoral lymphocytes. RLIT was calculated as the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells for each patient. 29% of patients with RLIT lower than a cut-off value of 0.06085726 have a significantly worse overall survival than patients with RLIT higher than the cut-off value (10-year OS logarithmic range test p = 0.024, HR = 0.51, CI = 0.28-0.92; 5-year OS p = 0.045, HR = 0.54, CI = 0.29-0.99; figures in ovaries). Overall survival was defined using death as an event regardless of the cause, since this information was not available.

Los tumores se clasificaron según el sistema de estadificación FIGO de 1988 (Prat 2013). La infiltración linfocitaria se evaluó en cinco campos de alta potencia, cada campo se puntúa como ausente, leve o severa: Ausente si no había linfocitos, leve si hubo una ligera dispersión de linfocitos, y grave si hubo un infiltrado linfocitario prominente. La mediana de las puntuaciones basadas en el campo se tomó como la puntuación de un tumor.Tumors were classified according to the 1988 FIGO staging system (Prat 2013). Lymphocytic infiltration was evaluated in five high-power fields, each field is scored as absent, mild or severe: Absent if there were no lymphocytes, mild if there was a slight lymphocyte dispersion, and severe if there was a prominent lymphocyte infiltrate. The median field-based scores were taken as the score of a tumor.

ResultadosResults

Modelado estadístico de la heterogeneidad espacial de la infiltración inmunitaria - determinación de RLIT Statistical modeling of spatial heterogeneity of immune infiltration - RLIT determination

Una herramienta automatizada de análisis de imágenes identificó las células cancerosas, linfocitos y las células estromales que abarcan los fibroblastos y las células endoteliales se basan en sus morfologías nucleares en los portaobjetos de la sección de tumores completos de H y E (Yuan et al. 2012). El componente principal de esta herramienta es un clasificador entrenado por anatomopatólogos en regiones tumorales seleccionadas al azar y validadas en 564 tumores de mama con 90 % de precisión (Yuan et al. 2012). Como resultado del análisis de imágenes, los tipos y las ubicaciones espaciales de un promedio de 110.000 células se registraron en cada sección de tumor de mama. Por lo tanto, esta herramienta totalmente automatizada permitió el mapeo de las distribuciones espaciales de todas las células cancerosas y linfocitos dentro de una sección de tumor, que puede visualizarse posteriormente como un paisaje 3D (Fig. 1A). Las relaciones espaciales de las células inmunitarias y cancerosas se analizan después con una cartera estadística ilustrada en la Fig. 1B. En primer lugar, para perfilar globalmente la distribución espacial de las células cancerosas, la densidad de las células cancerosas se cuantificó utilizando una estimación de kernel (apartado Procedimientos). De manera intuitiva, esto construye un "paisaje de cáncer" donde las colinas indican regiones tumorales densamente pobladas con células cancerosas. Por tanto, la altura de una colina se correlaciona con la densidad del cáncer en una ubicación específica en el tumor (Fig. 1B). En segundo lugar, por cada linfocito, su proximidad espacial al cáncer se puede cuantificar directamente con el paisaje de densidad del cáncer en su ubicación específica. Por lo tanto, se puede obtener de manera eficiente una medición cuantitativa de la proximidad espacial a las células tumorales para cada linfocito (Fig. 1B).An automated image analysis tool identified cancer cells, lymphocytes and stromal cells that encompass fibroblasts and endothelial cells are based on their nuclear morphologies on the slides of the complete tumors section of H and E (Yuan et al. 2012 ). The main component of this tool is a classifier trained by pathologists in randomly selected tumor regions and validated in 564 breast tumors with 90% accuracy (Yuan et al. 2012). As a result of the image analysis, the types and spatial locations of an average of 110,000 cells were recorded in each breast tumor section. Therefore, this fully automated tool allowed mapping the spatial distributions of all cancer cells and lymphocytes within a tumor section, which can be subsequently visualized as a 3D landscape (Fig. 1A). The spatial relationships of the immune and cancer cells are then analyzed with a statistical portfolio illustrated in Fig. 1B. First, to globally profile the spatial distribution of cancer cells, the density of cancer cells was quantified using a kernel estimate (Procedures section). Intuitively, this builds a "cancer landscape" where the hills indicate densely populated tumor regions with cancer cells. Therefore, the height of a hill correlates with cancer density at a specific location in the tumor (Fig. 1B). Second, for each lymphocyte, its spatial proximity to cancer can be quantified directly with the cancer density landscape at its specific location. Therefore, a quantitative measurement of spatial proximity to tumor cells for each lymphocyte can be obtained efficiently (Fig. 1B).

Usando esta estrategia, los inventores cuantificaron la proximidad espacial al cáncer para cada linfocito en 181 muestras de TNBC en el estudio METABRIC (apartado Procedimientos, Fig.2A). En principio, los linfocitos que difieren en su posicionamiento espacial al cáncer se pueden diferenciar basándose en estas mediciones espaciales cuantitativas. El inventor investigó si los procedimientos de agrupamiento basados en datos según la distribución normal pueden usarse para diferenciar diferentes clases de linfocitos, dado que la distribución espacial celular es un patrón emergido naturalmente. Se empleó la agrupación de modelos de mezcla gaussiana no supervisada Fraley, 2003) para identificar agrupamientos de linfocitos en función de su proximidad espacial al cáncer utilizando un conjunto de entrenamiento de 100.000 linfocitos muestreados al azar (Fig. 2B, Procedimientos). Posteriormente, una solución de tres grupos que identifica tres clases de linfocitos se consideró óptima por el Criterio de Información Bayesiano (Schwartz,. 1978) (Fig. 2B). Esta solución de tres clases es consistentemente el 97 % óptimo del tiempo en 200 muéstreos repetidos, mientras que la solución de cinco clases se consideró óptima el 3 % del tiempo (procedimientos, Fig. 2C). Además, la estructura de agolpamiento de las soluciones de tres clases fue estable (mediana de la media del agolpamiento: 0,011, 0,06, 0,13; desviación estándar / SD: 0,002, 0,0047, 0,0045); Fig. 2C), lo que indica que se identificaron los mismos grupos en cada muestreo aleatorio. Las tres clases de linfocitos se denominaron Linfocitos intratumorales (LIT), Linfocitos de tumor adyacente (LTA) y Linfocitos de tumor distal (LTD). Posteriormente, se entrenó un clasificador según las clases de linfocitos para predecir los tipos de linfocitos en todas las muestras de TNBC (Procedimientos).Using this strategy, the inventors quantified the spatial proximity to cancer for each lymphocyte in 181 TNBC samples in the METABRIC study (Procedures section, Fig. 2A). In principle, lymphocytes that differ in their spatial positioning to cancer can be differentiated based on these quantitative spatial measurements. The inventor investigated whether data-based grouping procedures according to the normal distribution can be used to differentiate different kinds of lymphocytes, since the cellular spatial distribution is a naturally emerged pattern. The cluster of non-supervised Gaussian mixture models Fraley, 2003) was used to identify lymphocyte clusters based on their spatial proximity to cancer using a training set of 100,000 randomly sampled lymphocytes (Fig. 2B, Procedures). Subsequently, a three-group solution that identifies three classes of lymphocytes was considered optimal by the Bayesian Information Criterion (Schwartz, 1978) (Fig. 2B). This three-class solution is consistently the optimal 97% of the time in 200 show them repeatedly, while the five-class solution was considered optimal 3 % of the time (procedures, Fig. 2C). In addition, the clustering structure of the three-class solutions was stable (median of the mean of the crush: 0.011, 0.06, 0.13; standard deviation / SD: 0.002, 0.0047, 0.0045); Fig. 2C), which indicates that the same groups were identified in each random sampling. The three classes of lymphocytes were called intratumoral lymphocytes (LIT), adjacent tumor lymphocytes (LTA) and distal tumor lymphocytes (LTD). Subsequently, a classifier was trained according to lymphocyte classes to predict the types of lymphocytes in all TNBC samples (Procedures).

Para entender las diferencias de las nuevas clases de linfocitos propuestas, se derivaron medidas adicionales que se basan en distancias físicas directas. En primer lugar, para cada linfocito se puede cuantificar su distancia a la célula cancerosa más cercana (d^{m in}, Procedimientos, Fig. 2D). Se demostró que los LIT tenían una mediana de la distancia de 7 |jm (rango intercuartílico 5-10) a la célula cancerosa más cercana, mientras que es de 10 jm (7-11) para los LTA y de 20 jm (14-26) para los LTD (Fig. 2E). La superposición en la distancia a la célula cancerosa más cercana entre los LIT y los LTA sugiere que esta medida no es la diferencia fundamental entre las dos clases. Dado que la medida de densidad kernel según la cual se derivaron las clases de linfocitos es esencialmente un suavizado espacial, el inventor planteó la hipótesis de que la disposición espacial de las células cancerosas que rodean a los linfocitos difiere entre los LTA y los LIT. Para medir la disposición espacial, el inventor examinó la región del casco convexo formada por 5 células cancerosas más cercanas, que es la región más pequeña que cubre estas células (Fig. 2D, Procedimientos). Si un linfocito está rodeado de células cancerosas, debe caer en la región del casco convexo que forman las células cancerosas cercanas y tiene una pequeña distancia al centroide de esta región (Fig. 2D, izquierda). Por el contrario, si las células cancerosas cercanas están a un lado de un linfocito, la distancia entre el linfocito y el centroide de la región del casco convexo del cáncer es probable que sea grande (Fig. 2D, derecha). Por lo tanto, el inventor utilizó la distancia entre un linfocito y el centroide de la región del casco convexo del cáncer como medida cuantitativa de la disposición espacial de las células cancerosas que rodean un linfocito (d^centroid). Tres clases de linfocitos mostraron diferencias significativas en dcentroid con la mediana de dcentroid 3,6 jm (2,2-5,1), 7,2 jm (4,5-10,6), 17,7 jm (11,0-26,6) para los LIT, LTA y LTD, respectivamente (Figura 2E). Por lo tanto, d^mind y d^centroid juntos definen mejor y ayudan a la interpretación de las clases de linfocitos (Fig. 2F). Tomados en conjunto, estos datos demostraron que la medida propuesta de la proximidad espacial al cáncer basada en el núcleo puede explicar efectivamente la proximidad espacial y el entorno, y también que las tres clases de linfocitos difieren no solo en la distancia a la célula cancerosa más cercana sino también en las formas en que las células cancerosas cercanas se disponen. Se ilustra un caso representativo que muestra la distribución espacial de los linfocitos en estas tres clases (Fig. 3A-B). Por ejemplo, se puede observar que los LIT se ubican en regiones densamente pobladas con células cancerosas (Fig. 3C).In order to understand the differences in the proposed new lymphocyte classes, additional measures based on direct physical distances were derived. First, for each lymphocyte its distance to the nearest cancer cell can be quantified ( d ^{m in} , Procedures, Fig. 2D). The LITs were shown to have a median distance of 7 | jm (interquartile range 5-10) to the nearest cancer cell, while it is 10 jm (7-11) for the LTA and 20 jm (14- 26) for LTD (Fig. 2E). The overlap in the distance to the nearest cancer cell between the LIT and the LTA suggests that this measure is not the fundamental difference between the two classes. Since the measure of kernel density according to which lymphocyte classes were derived is essentially a spatial smoothing, the inventor hypothesized that the spatial arrangement of cancer cells surrounding lymphocytes differs between LTAs and LITs. To measure the spatial arrangement, the inventor examined the region of the convex hull formed by 5 closest cancer cells, which is the smallest region that covers these cells (Fig. 2D, Procedures). If a lymphocyte is surrounded by cancer cells, it must fall into the region of the convex hull that forms nearby cancer cells and has a small distance to the centroid of this region (Fig. 2D, left). On the contrary, if nearby cancer cells are on one side of a lymphocyte, the distance between the lymphocyte and the centroid of the convex hull region of the cancer is likely to be large (Fig. 2D, right). Therefore, the inventor used the distance between a lymphocyte and the centroid of the region of the convex hull of cancer as a quantitative measure of the spatial arrangement of cancer cells surrounding a lymphocyte ( d ^centroid ). Three classes of lymphocytes showed significant differences in dcentroid with the median dcentroid 3.6 jm (2.2-5.1), 7.2 jm (4.5-10.6), 17.7 jm (11.0 -26.6) for the LIT, LTA and LTD, respectively (Figure 2E). Therefore, d ^mind and d ^centroid together better define and help the interpretation of lymphocyte classes (Fig. 2F). Taken together, these data demonstrated that the proposed measure of spatial proximity to cancer based on the nucleus can effectively explain spatial proximity and the environment, and also that the three classes of lymphocytes differ not only in the distance to the cancer cell more nearby but also in the ways in which nearby cancer cells are arranged. A representative case is shown that shows the spatial distribution of lymphocytes in these three classes (Fig. 3A-B). For example, it can be seen that LITs are located in densely populated regions with cancer cells (Fig. 3C).

En las 181 muestras de TNBC, en general, hay más LTA que los otros dos tipos de linfocitos (en promedio 47 % de LTA, 32 % de LIT y 21 % de LTD, Fig. 4A). Los cambios en la abundancia de estas tres clases en 181 muestras se pueden observar en una gráfica de triángulos (Fig. 4B). Cuando la proporción de LIT es baja (0-20 %), en general, hay más LTD (40-60 %) que LTA (30-50 %). A medida que aumenta la cantidad de LIT (20-50 %), los LTA también aumentan (40-60 %) mientras que los LTD disminuyen (10-40 %). Cuando hay una gran cantidad de LIT (> 50%), todavía hay cierta cantidad de LTA (20-40 %) con muy pocos LTD (<10 %). Para resumir el grado de infiltración linfocitaria para un tumor dado, se calculó primero la relación entre el número de LIT y el número de células cancerosas (RLIT; véase el apartado de Procedimientos anteriormente). En las 181 muestras de TNBC, se observó una asociación significativa entre la RLIT y la evaluación patológica de la infiltración linfocitaria de los tumores en categorías de ausentes, leve y grave (p = 2x10'33, Fig. 4C). En cuanto a otros parámetros clínicos, no hubo correlación entre la RLIT y el tamaño del tumor, el estado ganglionar y el estado de mutación TP53 (Fig. 4D). El grado tumoral no se consideró porque el 87 % de las muestras de TNBC son tumores de grado 3. Estos datos respaldan la validez de la RLIT como una medida de la infiltración linfocitaria y su valor potencial, además de los parámetros clínicos conocidos para el TNBC.In the 181 TNBC samples, in general, there is more LTA than the other two types of lymphocytes (on average 47% of LTA, 32% of LIT and 21% of LTD, Fig. 4A). Changes in the abundance of these three classes in 181 samples can be observed in a triangle graph (Fig. 4B). When the proportion of LIT is low (0-20%), in general, there is more LTD (40-60%) than LTA (30-50%). As the amount of LIT increases (20-50%), LTAs also increase (40-60%) while LTDs decrease (10-40%). When there is a large amount of LIT (> 50%), there is still a certain amount of LTA (20-40%) with very few LTD (<10%). To summarize the degree of lymphocyte infiltration for a given tumor, the relationship between the number of LIT and the number of cancer cells (RLIT; see the Procedures section above) was first calculated. In the 181 TNBC samples, a significant association was observed between the RLIT and the pathological evaluation of lymphocyte infiltration of tumors in categories of absent, mild and severe (p = 2x10'33, Fig. 4C). As for other clinical parameters, there was no correlation between RLIT and tumor size, lymph node status and TP53 mutation status (Fig. 4D). Tumor grade was not considered because 87% of TNBC samples are grade 3 tumors. These data support the validity of RLIT as a measure of lymphocyte infiltration and its potential value, in addition to the known clinical parameters for TNBC. .

La RLIT es una medida estadística de la infiltración linfocitaria y un predictor independiente de la supervivencia específica de la enfermedad en dos cohortes de TNBC.RLIT is a statistical measure of lymphocyte infiltration and an independent predictor of disease-specific survival in two TNBC cohorts.

Para investigar la importancia clínica de la medida de los LIT inmunitarios propuesta, el inventor analizó la supervivencia específica de la enfermedad en función de los LIT. Las muestras de TNBC se pueden dividir en dos cohortes independientes basadas en hospitales contribuyentes (Procedimientos, n = 89 y n = 92, distribución de RLIT, Fig. 3E). Para dicotomizar la RLIT continua, el valor de corte óptimo se seleccionó para tener el mejor valor pronóstico en la cohorte 1 como la cohorte de descubrimiento (Procedimientos). El mejor valor de corte se seleccionó de modo que fuera 0,011 y el 20 % de los pacientes tenían una RLIT más baja que este valor de corte. Estos pacientes tienen una supervivencia específica de la enfermedad significativamente peor en comparación con los pacientes con una RLIT más alta en la cohorte 1 (prueba del rango logarítmico p = 0,0063, Razón de riesgos HR = 0,36, intervalo de confianza IC del 95 %= 0,17-0,77; la Tabla 1; Fig. 4F). Esta observación fue verificada en la cohorte de validación, Cohorte 2 (p = 0,0037, HR = 0,25, IC = 0,09-0,69; Fig. 4F). Se observó una estratificación significativa después del análisis repetido con la cohorte 2 como cohorte de descubrimiento y la cohorte 1 como cohorte de validación (Fig. 3G). Las mismas pruebas se realizaron para la proporción de LTA y LTD a células cancerosas (RLAT y RLTD), pero ninguno mostró una correlación significativa con la supervivencia específica de la enfermedad (cohorte de descubrimiento y validación: RLAT p = 0,064 y 0,75; RLTD p = 0,43 y 0,25; Fig. 7-8). Posteriormente, los inventores se centraron en la RLIT. Los pacientes con TNBC con RLIT alta tienen una probabilidad de supervivencia del 80 % a los cinco años desde el diagnóstico en comparación con el 49 % para los pacientes con RLIT baja (estimaciones de supervivencia de Kaplan-Meier, dos cohortes combinadas). La RLIT se comparó con otras ocho firmas inmunitarias. Estos incluyen la firma basada en imagen previamente publicada, abundancia de linfocitos (Lym), definida como la relación entre el número de linfocitos y el número de células cancerosas (Procedimientos) (Yuan et al., 2012). Una diferencia importante entre la RLIT y Lym es que Lym no tiene en cuenta las diferentes clases de linfocitos, mientras que la RLIT considera linfocitos infiltrantes. El resto de las firmas son firmas basadas en la expresión génica publicadas por Calabro et al. (Calabro et al.) que es predictivo del pronóstico de cáncer de mama negativo para ER, una firma de 5 genes de Ascierto et al. (Ascierto et al. '12) que predice la supervivencia sin recurrencia entre los subtipos de cáncer de mama y los linfocitos B, la IL8 y las firmas combinadas para predecir el pronóstico de TNBC (Rody et al.). También se incluyó la expresión de CXCR3 y CXCL13, ya que se ha demostrado que se correlacionan con el pronóstico del cáncer de mama (Ma et al., Gu-Trantien et al.).To investigate the clinical importance of the proposed immune LIT measure, the inventor analyzed the specific survival of the disease based on the LITs. TNBC samples can be divided into two independent cohorts based on contributing hospitals (Procedures, n = 89 and n = 92, RLIT distribution, Fig. 3E). To dichotomize the continuous RLIT, the optimal cut-off value was selected to have the best prognostic value in cohort 1 as the discovery cohort (Procedures). The best cut-off value was selected so that it was 0.011 and 20% of the patients had a lower RLIT than this cut-off value. These patients have a significantly worse disease-specific survival compared to patients with a higher RLIT in cohort 1 (logarithmic range test p = 0.0063, HR risk ratio = 0.36, confidence interval CI of the 95% = 0.17-0.77; Table 1; Fig. 4F). This observation was verified in the validation cohort, Cohort 2 (p = 0.0037, HR = 0.25, CI = 0.09-0.69; Fig. 4F). Significant stratification was observed after repeated analysis with cohort 2 as a discovery cohort and cohort 1 as a validation cohort (Fig. 3G). The same tests were performed for the proportion of LTA and LTD to cancer cells (RLAT and RLTD), but none showed a significant correlation with disease-specific survival (discovery and validation cohort: RLAT p = 0.064 and 0.75; RLTD p = 0.43 and 0.25; Fig. 7-8). Subsequently, the inventors focused on the RLIT Patients with TNBC with high RLIT have an 80 % chance of survival five years after diagnosis compared to 49% for patients with low RLIT (Kaplan-Meier survival estimates, two cohorts combined). The RLIT was compared with eight other immune signatures. These include the signature based on previously published image, lymphocyte abundance (Lym), defined as the relationship between the number of lymphocytes and the number of cancer cells (Procedures) (Yuan et al., 2012). An important difference between RLIT and Lym is that Lym does not take into account different kinds of lymphocytes, while RLIT considers infiltrating lymphocytes. The rest of the signatures are signatures based on gene expression published by Calabro et al. (Calabro et al.) Which is predictive of the prognosis of breast cancer negative for ER, a 5-gene firm of Ascierto et al. (Ascierto et al. '12) that predicts survival without recurrence between breast cancer subtypes and B lymphocytes, IL8 and combined signatures to predict the prognosis of TNBC (Rody et al.). The expression of CXCR3 and CXCL13 was also included , as it has been shown to correlate with the prognosis of breast cancer (Ma et al., Gu-Trantien et al.).

El mismo enfoque de selección del valor de corte se aplicó para probar la asociación entre estas firmas y la supervivencia específica de la enfermedad (Tabla 2). Las firmas que mostraron los mejores valores de pronóstico se muestran en la Fig. 5A-E (todas se proporcionan en la Figura 9) y en la Tabla 1. Ninguna de estas firmas se correlacionó con el pronóstico en ambas cohortes. Este análisis se repitió utilizando la cohorte 2 como la cohorte de descubrimiento para seleccionar los valores de corte óptimos y la cohorte 1 para validación (Figura 10, Tabla 3). En ambos experimentos, solo la RLIT estratificó de forma consistente a los pacientes en dos grupos de resultados diferentes entre las nueve firmas (Figuras 7 y 8). Además, se compararon los mejores valores de corte de RLIT seleccionados en dos cohortes para las nueve firmas (procedimientos, Figura 5F). La RLIT estaba entre las firmas más consistentes en términos de cortes óptimos en dos cohortes, apoyando la consistencia y el uso potencial de RLIT como una medida objetiva para identificar pacientes con baja infiltración linfocitaria.The same approach to selecting the cut-off value was applied to prove the association between these signatures and the specific survival of the disease (Table 2). The signatures that showed the best prognostic values are shown in Fig. 5A-E (all are provided in Figure 9) and in Table 1. None of these signatures correlated with the prognosis in both cohorts. This analysis was repeated using cohort 2 as the discovery cohort to select the optimal cutoff values and cohort 1 for validation (Figure 10, Table 3). In both experiments, only the RLIT consistently stratified patients into two different outcome groups between the nine signatures (Figures 7 and 8). In addition, the best RLIT cut-off values selected in two cohorts for the nine signatures (procedures, Figure 5F) were compared. The RLIT was among the most consistent firms in terms of optimal cuts in two cohorts, supporting the consistency and potential use of RLIT as an objective measure to identify patients with low lymphocyte infiltration.

En comparación con las firmas inmunitarias publicadas, la RLIT fue también la única firma que mostró una correlación significativa con la supervivencia específica de la enfermedad en el modelo multivariado de riesgos proporcionales de Cox junto con los parámetros clínicos estándar del estado ganglionar y el tamaño del tumor en ambas cohortes, se usó cualquier cohorte como la cohorte de descubrimiento (tablas 1 a 3). Usando muestras de ambas cohortes, RLIT tiene un valor p del rango logarítmico de 2,1x10-4 y un HR 0,32 (0,17-0,58). Para probar la robustez del modelo de Cox en la determinación del valor pronóstico de RLIT, los inventores utilizaron el análisis bootstrap en datos perturbados aleatoriamente y repitieron el análisis de regresión univariable y multivariable 1.000 veces. El 95,6 % y el 94,7 % del tiempo, la RLIT se mantuvo significativamente asociado al pronóstico en los análisis univariados y multivariados, respectivamente. Tomados en conjunto, estos resultados muestran la estabilidad y la robustez de la RLIT como biomarcador de pronóstico independiente en el TNBC.Compared to the published immune signatures, the RLIT was also the only firm that showed a significant correlation with the specific survival of the disease in the multivariate Cox proportional hazards model along with the standard clinical parameters of lymph node status and tumor size. In both cohorts, any cohort was used as the discovery cohort (Tables 1 to 3). Using samples from both cohorts, RLIT has a p-value of the logarithmic range of 2.1x10-4 and an HR 0.32 (0.17-0.58). To test the robustness of the Cox model in determining the prognostic value of RLIT, the inventors used bootstrap analysis in randomly disturbed data and repeated the univariable and multivariable regression analysis 1,000 times. 95.6% and 94.7% of the time, the RLIT remained significantly associated with the prognosis in the univariate and multivariate analyzes, respectively. Taken together, these results show the stability and robustness of the RLIT as an independent prognostic biomarker in TNBC.

La heterogeneidad de la RLIT se refleja a nivel transcripcional por la expresión de CTLA4 y APOBEC3G The heterogeneity of the RLIT is reflected at the transcriptional level by the expression of CTLA4 and APOBEC3G

Para identificar asociaciones moleculares de infiltración inmunitaria y analizar la relevancia biológica de la RLIT, el inventor integró la RLIT basada en imágenes con los datos de expresión génica en micromatriz perfilados para el mismo conjunto de 181 tumores de TNBC. El análisis identificó 307 genes correlacionados positivamente y 105 genes correlacionados negativamente con la RLIT (Corrección de prueba múltiple de tasa de descubrimiento falso, valor q <0,05; Procedimientos). Los genes con las correlaciones más significativas con nuestra firma inmunológica de RLIT incluyen quinasas (SH3KBP1, LCK, MAP4K1) y los receptores (FCRL3, GPR18, TNFRSF13B, SEMA4D, CXCR3, IL2RG), así como la inmunoterapia conocida como CTLA4 diana (Tabla 4). Por lo tanto, correlaciones significativas entre la RLIT y los genes relacionados con el sistema inmunitario demuestran la relevancia biológica de la firma RLIT.To identify molecular associations of immune infiltration and analyze the biological relevance of RLIT, the inventor integrated image-based RLIT with profiled microarray gene expression data for the same set of 181 TNBC tumors. The analysis identified 307 positively correlated genes and 105 negatively correlated genes with the RLIT (Multiple test correction of false discovery rate, value q <0.05; Procedures). The genes with the most significant correlations with our RLIT immunological signature include kinases ( SH3KBP1, LCK, MAP4K1) and receptors ( FCRL3, GPR18, TNFRSF13B, SEMA4D, CXCR3, IL2RG), as well as immunotherapy known as CTLA4 target (Table 4 ). Therefore, significant correlations between the RLIT and genes related to the immune system demonstrate the biological relevance of the RLIT signature.

Tabla 4. Los 20 genes principales se correlacionaron positivamente con la RLIT y los 10 genes principales se rr l i n r n n iv m n n l RLIT r .Table 4. The 20 main genes were positively correlated with the RLIT and the 10 main genes were RL l n r n n iv m n n l RLIT r.

continuacióncontinuation

Posteriormente, el análisis de enriquecimiento se realizó en los genes correlacionados positiva y negativamente, respectivamente, contra las categorías de conjuntos de genes MSigDB (Subramanian, 2005), incluidas las vías KEGG (Kanehisa, 2000), las vías canónicas curadas por expertos en dominios y firmas inmunológicas (Procedimientos, figura 11). Los genes correlacionados positivamente con RLIT están enriquecidos con citotoxicidad mediada por células asesinas naturales, receptor de linfocitos T, Procesamiento de antígenos y presentación de las rutas de KEGg , células CD8T, células CD4T y firmas inmunogénicas reguladas por aumento, así como las rutas canónicas de IL12 y CD8 TCR. Por el contrario, los genes correlacionados negativamente con RLIT se enriquecieron con la interacción del receptor ECM y las rutas de KEGG de adhesión focal, los linfocitos T reguladores y las firmas inmunológicas relacionadas con el TGFp, así como las rutas relacionadas con la integrina. El análisis molecular en el nivel de la ruta sugiere que la RLIT se asocia positivamente a actividades inmunes antitumorales en el TNBC.Subsequently, enrichment analysis was performed on positively and negatively correlated genes, respectively, against the categories of MSigDB gene sets (Subramanian, 2005), including KEGG pathways (Kanehisa, 2000), canonical pathways cured by domain experts and immunological signatures (Procedures, figure 11). The genes positively correlated with RLIT are enriched with cytotoxicity mediated by natural killer cells, T lymphocyte receptor, antigen processing and presentation of KEGg pathways, CD8T cells, CD4T cells and immunogenic signatures regulated by augmentation, as well as canonical pathways of IL12 and CD8 TCR. In contrast, genes negatively correlated with RLIT were enriched with the interaction of the ECM receptor and the focal adhesion KEGG pathways, regulatory T lymphocytes and immunological signatures related to TGFp, as well as integrin-related pathways. Molecular analysis at the route level suggests that RLIT is positively associated with antitumor immune activities in TNBC.

Para analizar mejor sus relaciones interconectadas y descubrir módulos moleculares de novo, se identificaron módulos de genes estrechamente conectados dentro de los genes asociados a RLIT (Figura 11; Procedimientos). Como tales, se identificaron siete módulos de genes correlacionados positivamente (P1-7) y dos módulos de genes correlacionados negativamente con RLIT (N1 y N2). Los genes relacionados con el sistema inmunitario conocidos en los módulos incluyen IFNG (P1), RLPTR (P3), GPR18 (P4), CXCR3 (P5), MAP4K1 (P6), CTLA4 (P7), ANXA2 (N1) y FAP (N2). De forma destacable, dos de los módulos contienen APOBEC3G (P2) y CTLA4 (P7), lo que puede sugerir una corregulación entre APOBEC3G, NKG7 e interleucinas, incluidas IL21R e IL18RAP, así como altas correlaciones entre CTLA4, quimioatrayente para linfocitos B CXCL13 (Denkert) e inmunorreceptor de células TIGITT con dominios Ig e ITIM. Además, los perfiles de expresión de estos genes se asociaron significativamente a la supervivencia específica de la enfermedad en TNBC, incluyendo APOBEC3G, así como GPR18 (P4) y MAP4K1 (P6) clasificados como los genes principales asociados a RLIT (Figura 6B, Figura 12). La expresión de CTLA4 fue capaz de estratificar a los pacientes en grupos con un pronóstico significativamente diferente, y podría estratificar aún más el grupo alto de RLIT en dos subgrupos con resultados significativamente diferentes (p = 0,046, Figura 6C, figura 12). Comparando la RLIT con genes asociados a la RLIT en términos de valor pronóstico, el análisis multivariado mostró que la estratificación de RLIT tiene un valor adicional y en muchos casos superior al de los genes asociados a RLIT (Figura 13, Procedimientos).To better analyze their interconnected relationships and discover de novo molecular modules, closely connected gene modules were identified within the RLIT-associated genes (Figure 11; Procedures). As such, seven positively correlated gene modules (P1-7) and two gene modules negatively correlated with RLIT (N1 and N2) were identified. The immune system related genes known in the modules include IFNG (P1), RLPTR (P3), GPR18 (P4), CXCR3 (P5), MAP4K1 (P6), CTLA4 (P7), ANXA2 (N1) and FAP (N2) ). Notably, two of the modules contain APOBEC3G (P2) and CTLA4 (P7), which may suggest a corregulation between APOBEC3G, NKG7 and interleukins, including IL21R and IL18RAP, as well as high correlations between CTLA4, chemoattractant for B CXCL13 lymphocytes ( Denkert) and TIGITT cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains. In addition, the expression profiles of these genes were significantly associated with disease-specific survival in TNBC, including APOBEC3G, as well as GPR18 (P4) and MAP4K1 (P6) classified as the main genes associated with RLIT (Figure 6B, Figure 12 ). The expression of CTLA4 was able to stratify patients in groups with a significantly different prognosis, and could stratify even more the high RLIT group into two subgroups with significantly different results (p = 0.046, Figure 6C, Figure 12). Comparing the RLIT with genes associated with the RLIT in terms of prognostic value, the multivariate analysis showed that the stratification of RLIT has an additional value and in many cases superior to that of the genes associated with RLIT (Figure 13, Procedures).

ReferenciasReferences

En el presente documento se cita una serie de publicaciones con el fin de describir y divulgar más completamente la invención y la situación actual de la técnica a la que pertenece la invención. Las citas completas para estas referencias se proporcionan a continuación.A series of publications are cited herein in order to more fully describe and disclose the invention and the current state of the art to which the invention pertains. Full citations for these references are provided below.

Alexiou GA, Vartholomatos E, Voulgaris S. Prognostic value of neutrophil-to-lymphocyte ratio in patients with glioblastoma. Journal of neuro-oncology. 2013;115:521-2.Alexiou GA, Vartholomatos E, Voulgaris S. Prognostic value of neutrophil-to-lymphocyte ratio in patients with glioblastoma. Journal of neuro-oncology. 2013; 115: 521-2.

Ancuta E, Ancuta C, Zugun-Eloae F, Iordache C, Chirieac R, Carasevici E. Predictive value of cellular immune response in cervical cáncer. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie. 2009;50:651-5.Ancuta E, Ancuta C, Zugun-Eloae F, Iordache C, Chirieac R, Carasevici E. Predictive value of cellular immune cervical cancer response. Romanian journal of morphology and embryology = Revue roumaine de morphologie et embryologie. 2009; 50: 651-5.

Andre, F., M. V. Dieci, P. Dubsky, C. Sotiriou, G. Curigliano, C. Denkert and S. Loi (2013). Molecular pathways: involvement of immune pathways in the therapeutic response and outcome in breast cancer." Clin Cancer Res 19(1): 28-33.Andre, F., M. V. Dieci, P. Dubsky, C. Sotiriou, G. Curigliano, C. Denkert and S. Loi (2013). Molecular pathways: involvement of immune pathways in the therapeutic response and outcome in breast cancer. "Clin Cancer Res 19 (1): 28-33.

Ascierto, M. L., M. Kmieciak, M. O. Idowu, R. Manjili, Y. Zhao, M. Grimes, C. Dumur, E. Wang, V. Ramakrishnan, Ascierto, M. L., M. Kmieciak, M. O. Idowu, R. Manjili, Y. Zhao, M. Grimes, C. Dumur, E. Wang, V. Ramakrishnan,

X. Y. Wang, H. D. Bear, F. M. Marincola and M. H. Manjili (2012). "A signature of immune function genes associated with recurrence-free survival in breast cancer patients." Breast Cancer Res Treat 131(3): 871-880, X. Y. Wang, H. D. Bear, F. M. Marincola and M. H. Manjili (2012). "A signature of immune function genes associated with recurrence-free survival in breast cancer patients." Breast Cancer Res Treat 131 (3): 871-880,

Bambury RM, Teo MY, Power DG, Yusuf A, Murray S, Battley JE, et al. The association of pretreatment neutrophil to lymphocyte ratio with overall survival in patients with glioblastoma multiforme. Journal of neuro-oncology, 2013;114:149-54Bambury RM, Teo MY, Power DG, Yusuf A, Murray S, Battley JE, et al. The association of pretreatment neutrophil to lymphocyte ratio with overall survival in patients with glioblastoma multiforme. Journal of neuro-oncology, 2013; 114: 149-54

Basavanhally, A. N., S. Ganesan, S. Agner, J. P. Monaco, M. D. Feldman, J. E. Tomaszewski, G. Bhanot and A. Madabhushi (2010). "Computerized image-based detection and grading of lymphocytic infiltration in HER2+ breast cancer histopathology." IEEE Trans Biomed Eng 57(3): 642-653.Basavanhally, A. N., S. Ganesan, S. Agner, J. P. Monaco, M. D. Feldman, J. E. Tomaszewski, G. Bhanot and A. Madabhushi (2010). "Computerized image-based detection and grading of lymphocytic infiltration in HER2 + breast cancer histopathology." IEEE Trans Biomed Eng 57 (3): 642-653.

Berman, M. and P. Diggle (1989). "Estimating Weighted Integrals of the 2nd-Order Intensity of a Spatial Point Process." Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological 51(1 ):81-92.Berman, M. and P. Diggle (1989). "Estimating Weighted Integrals of the 2nd-Order Intensity of a Spatial Point Process." Journal of the Royal Statistical Society Series B-Methodological 51 (1): 81-92.

Jonckheere, A. R. (1954). "A test of significance for the relation between m rankings and k ranked categories." British Journal of Statistical Psychology 7: 93--100,Jonckheere, A. R. (1954). "A test of significance for the relation between m rankings and k ranked categories." British Journal of Statistical Psychology 7: 93--100,

Bystryn JC, Oratz R, Roses D, Harris M., Henn M, Lew R. Relationship between immune response to melanoma vaccine immunization and clinical outcome in stage II malignant melanoma. Cancer. 1992;69:1157-64.Bystryn JC, Oratz R, Roses D, Harris M., Henn M, Lew R. Relationship between immune response to melanoma vaccine immunization and clinical outcome in stage II malignant melanoma. Cancer. 1992; 69: 1157-64.

Calabró, A., T. Beissbarth, R. Kuner, M. Stojanov, A Benner, M. Asslaber, F. Ploner, K. Zatloukal, H. Samonigg, A. Poustka and H. Sültmann (2009). "Effects of infiltrating lymphocytes and estrogen receptor on gene expression and prognosis in breast cancer." Breast Cancer Res Treat 116(1): 69-77.Calabró, A., T. Beissbarth, R. Kuner, M. Stojanov, A Benner, M. Asslaber, F. Ploner, K. Zatloukal, H. Samonigg, A. Poustka and H. Sültmann (2009). "Effects of infiltrating lymphocytes and estrogen receptor on gene expression and prognosis in breast cancer." Breast Cancer Res Treat 116 (1): 69-77.

Cheng, Yizong (August 1995). "Mean Shift, Mode Seeking, and Clustering". IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence (IEEE) 17 (8): 790-799.Cheng, Yizong (August 1995). "Mean Shift, Mode Seeking, and Clustering." IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence (IEEE) 17 (8): 790-799.

Clarke B, Tinker AV, Lee CH, Subramanian S, van de Rijn M, Turbin D, et al. Intraepithelial T cells and prognosis in ovarian carcinoma: novel associations with stage, tumor type, and BRCA1 loss. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2009;22:393-402.Clarke B, Tinker AV, Lee CH, Subramanian S, van de Rijn M, Turbin D, et al. Intraepithelial T cells and prognosis in ovarian carcinoma: novel associations with stage, tumor type, and BRCA1 loss. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2009; 22: 393-402.

Contardi, E., G. L. Palmisano, P. L. Tazzari, A. M. Martelli, F. Fala, M. Fabbi, T. Kato, E. Lucarelli, D. Donati, L. Polito, A. Bolognesi, F. Ricci, S. Salvi, V. Gargaglione, S. Mantero, M. Alberghini, G. B. Ferrara and M. P. Pistillo (2005). "CTLA-4 is constitutively expressed on tumor cells and can trigger apoptosis upon ligand interaction." Int J Cancer 117(4): 538-550,Contardi, E., GL Palmisano, PL Tazzari, AM Martelli, F. Fala, M. Fabbi, T. Kato, E. Lucarelli, D. Donati, L. Polito, A. Bolognesi, F. Ricci, S. Salvi, V. Gargaglione, S. Mantero, M. Alberghini, GB Ferrara and MP Pistillo (2005). "CTLA-4 is constitutively expressed on tumor cells and can trigger apoptosis upon ligand interaction." Int J Cancer 117 (4): 538-550,

Curtis, C., S. P. Shah, S. F. Chin, G. Turashvili, O. M. Rueda, M. J. Dunning, D. Speed, A. G. Lynch, S. Samarajiwa, Curtis, C., S. P. Shah, S. F. Chin, G. Turashvili, O. M. Rueda, M. J. Dunning, D. Speed, A. G. Lynch, S. Samarajiwa,

Y. Yuan, S. Graf, G. Ha, G. Haffari, A. Bashashati, R. Russell, S. McKinney, A. Langerod, A. Green, E. Provenzano, G. Wishart, S. Pinder, P. Watson, F. Markowetz, L. Murphy, I. Ellis, A. Purushotham, A. L. Borresen-Dale, J. D. Y. Yuan, S. Graf, G. Ha, G. Haffari, A. Bashashati, R. Russell, S. McKinney, A. Langerod, A. Green, E. Provenzano, G. Wishart, S. Pinder, P. Watson, F. Markowetz, L. Murphy, I. Ellis, A. Purushotham, AL Borresen-Dale, JD

Brenton, S. Tavare, C. Caldas and S. Aparicio (2012). "The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups." Nature 486(7403): 346-352.Brenton, S. Tavare, C. Caldas and S. Aparicio (2012). "The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumors reveals novel subgroups." Nature 486 (7403): 346-352.

Crane CA, Austgen K, Haberthur K, Hofmann C, Moyes KW, Immune evasion mediated by tumor-derived lactate dehydrogenase induction of NKG2D ligands on myeloid cells in glioblastoma patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014;111:12823-8.Crane CA, Austgen K, Haberthur K, Hofmann C, Moyes KW, Immune evasion mediated by tumor-derived lactate dehydrogenase induction of NKG2D ligands on myeloid cells in glioblastoma patients. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2014; 111: 12823-8.

Dave SS, Wright G, Tan B, Rosenwald A, Gascoyne RD, Chan WC, et al. Prediction of Survival in Follicular Lymphoma Based on Molecular Features of Tumor-Infiltrating Immune Cells. New England Journal of Medicine, 2004;351:2159-69.Dave SS, Wright G, Tan B, Rosenwald A, Gascoyne RD, Chan WC, et al. Prediction of Survival in Follicular Lymphoma Based on Molecular Features of Tumor-Infiltrating Immune Cells. New England Journal of Medicine, 2004; 351: 2159-69.

Davidsson S, Ohlson AL, Andersson SO, Fall K, Meisner A, Fiorentino M, et al. CD4 helper T cells, CD8 cytotoxic T cells, and FOXP3(+) regulatory T cells with respect to lethal prostate cancer. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2013;26:448-55.Davidsson S, Ohlson AL, Andersson SO, Fall K, Meisner A, Fiorentino M, et al. CD4 helper T cells, CD8 cytotoxic T cells, and FOXP3 (+) regulatory T cells with respect to lethal prostate cancer. Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 2013; 26: 448-55.

DeNardo, D. G., D. J. Brennan, E. Rexhepaj, B. Ruffell, S. L. Shiao, S. F. Madden, W. M. Gallagher, N. Wadhwani, S. D. Keil, S. A. Junaid, H. S. Rugo, E. S. Hwang, K. Jirstrom, B. L. West and L. M. Coussens (2011). "Leukocyte complexity predicts breast cáncer survival and functionally regulates response to chemotherapy." Cáncer Discov 1(1):54-67.DeNardo, DG, DJ Brennan, E. Rexhepaj, B. Ruffell, SL Shiao, SF Madden, WM Gallagher, N. Wadhwani, SD Keil, SA Junaid, HS Rugo, ES Hwang, K. Jirstrom, BL West and LM Coussens ( 2011). "Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy. "Cancer Discov 1 (1): 54-67.

Denkert, C., S. Loibl, A. Noske, M. Roller, B. M. Muller, M. Komor, J. Budczies, S. Darb-Esfahani, R. Kronenwett, C. Hanusch, C. von Torne, W. Weichert, K. Engels, C. Solbach, I. Schrader, M. Dietel and G. von Minckwitz (2010). "Tumor-associated lymphocytes as an independent predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer." J Clin Oncol 28(1): 105-113.Denkert, C., S. Loibl, A. Noske, M. Roller, BM Muller, M. Komor, J. Budczies, S. Darb-Esfahani, R. Kronenwett, C. Hanusch, C. von Torne, W. Weichert , K. Engels, C. Solbach, I. Schrader, M. Dietel and G. von Minckwitz (2010). "Tumor-associated lymphocytes as an independent predictor of response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer." J Clin Oncol 28 (1): 105-113.

Dieci, M. V., C. Criscitiello, A. Goubar, G. Viale, P. Conte, V. Guarneri, G. Ficarra, M. C. Mathieu, S. Delaloge, G. Curigliano and F. Andre (2014). "Prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes on residual disease after primary chemotherapy for triple-negative breast cancer: a retrospective multicenter study." Ann Oncol 25(3): 611-618. Dieci, M. V., C. Criscitiello, A. Goubar, G. Viale, P. Conte, V. Guarneri, G. Ficarra, M. C. Mathieu, S. Delaloge, G. Curigliano and F. Andre (2014). "Prognostic value of tumor-infiltrating lymphocytes on residual disease after primary chemotherapy for triple-negative breast cancer: a retrospective multicenter study." Ann Oncol 25 (3): 611-618.

Dieu-Nosjean MC, Antoine M Fau - Danel C, Danel C Fau - Heudes D, Heudes D Fau - Wislez M, Wislez M Fau -Poulot V, Poulot V Fau - Rabbe N, et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures.Dieu-Nosjean MC, Antoine M Fau - Danel C, Danel C Fau - Heudes D, Heudes D Fau - Wislez M, Wislez M Fau-Poulot V, Poulot V Fau - Rabbe N, et al. Long-term survival for patients with non-small-cell lung cancer with intratumoral lymphoid structures.

Erdag G, Schaefer JT, Smolkin ME, Deacon DH, Shea SM, Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Research.Erdag G, Schaefer JT, Smolkin ME, Deacon DH, Shea SM, Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Research

2012;72:1070-802012; 72: 1070-80

Failmezger H, Yuan Y, Rueda O and Markowetz F (2012). CRImage: CRImage a package to classify cells and calculate tumour cellularity. R package version 1.14.0,Failmezger H, Yuan Y, Rueda O and Markowetz F (2012). CRImage: CRImage a package to classify cells and calculate tumor cellularity. R package version 1.14.0,

Fiorelli V, Gendelman R, Caterina Sirianni M, Chang H-K, Colombini S, Markham PD, et al. Y-Interferon Produced by CD8+ T Cells Infiltrating Kaposi's Sarcoma Induces Spindle Cells With Angiogenic Phenotype and Synergy With Human Immunodeficiency Virus-1 Tat Protein: An Immune Response to Human Herpesvirus-8 Infection? Blood. 1998;91:956-67.Fiorelli V, Gendelman R, Caterina Sirianni M, Chang H-K, Colombini S, Markham PD, et al. Y-Interferon Produced by CD8 + T Cells Infiltrating Kaposi ' s Sarcoma Induces Spindle Cells With Angiogenic Phenotype and Synergy With Human Immunodeficiency Virus-1 Tat Protein: An Immune Response to Human Herpesvirus-8 Infection? Blood. 1998; 91: 956-67.

Fraley, C. and A. E. Raftery (2003). "Enhanced model-based clustering, density estimation, and discriminant analysis software: MCLUST." Journal of Classification 20(2): 263-286.Fraley, C. and A. E. Raftery (2003). "Enhanced model-based clustering, density estimation, and discriminant analysis software: MCLUST." Journal of Classification 20 (2): 263-286.

Fridman, W. H., F. Pages, C. Sautes-Fridman and J. Galon (2012). "The immune contexture in human tumours: impact on clinical outcome." Nat Rev Cancer 12(4): 298-306.Fridman, W. H., F. Pages, C. Sautes-Fridman and J. Galon (2012). "The immune contexture in human tumors: impact on clinical outcome." Nat Rev Cancer 12 (4): 298-306.

Gannon PO, Poisson AO, Delvoye N, Lapointe R, Mes-Masson AM, Saad F. Characterization of the intra-prostatic immune cell infiltration in androgen-deprived prostate cancer patients. Journal of immunological methods.Gannon PO, Poisson AO, Delvoye N, Lapointe R, Mes-Masson AM, Saad F. Characterization of the intra-prostatic immune cell infiltration in androgen-deprived prostate cancer patients. Journal of immunological methods.

2009;348:9-17.2009; 348: 9-17.

Galon, J., A. Costes, F. Sanchez-Cabo, A. Kirilovsky, B. Mlecnik, C. Lagorce-Pages, M. Tosolini, M. Camus, A. Berger, P. Wind, F. Zinzindohoue, P. Bruneval, P. H. Cugnenc, Z. Trajanoski, W. H. Fridman and F. Pages (2006). "Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome." Science 313(5795): 1960-1964.Galon, J., A. Costes, F. Sanchez-Cabo, A. Kirilovsky, B. Mlecnik, C. Lagorce-Pages, M. Tosolini, M. Camus, A. Berger, P. Wind, F. Zinzindohoue, P Bruneval, PH Cugnenc, Z. Trajanoski, WH Fridman and F. Pages (2006). "Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome." Science 313 (5795): 1960-1964.

Galon, J., B. Mlecnik, G. Bindea, H. K. Angell, A. Berger, C. Lagorce, A. Lugli, I. Zlobec, A. Hartmann, C. Bifulco, I. D. Nagtegaal, R. Palmqvist, G. V. Masucci, G. Botti, F. Tatangelo, P. Delrio, M. Maio, L. Laghi, F. Grizzi, M. Asslaber, C. D'Arrigo, F. Vidal-Vanaclocha, E. Zavadova, L. Chouchane, P. S. Ohashi, S. Hafezi-Bakhtiari, B. G. Wouters, M. Roehrl, L. Nguyen, Y. Kawakami, S. Hazama, K. Okuno, S. Ogino, P. Gibbs, P. Waring, N. Sato, T. Torigoe, K. Itoh, P. S. Patel, S. N. Shukla, Y. Wang, S. Kopetz, F. A. Sinicrope, V. Scripcariu, P. A. Ascierto, F. M. Marincola, B. A. Fox and F. Pages (2014). "Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumours." J Pathol 232(2): 199-209.Galon, J., B. Mlecnik, G. Bindea, HK Angell, A. Berger, C. Lagorce, A. Lugli, I. Zlobec, A. Hartmann, C. Bifulco, ID Nagtegaal, R. Palmqvist, GV Masucci, G. Botti, F. Tatangelo, P. Delrio, M. Maio, L. Laghi, F. Grizzi, M. Asslaber, C. D'Arrigo, F. Vidal-Vanaclocha, E. Zavadova, L. Chouchane, PS Ohashi , S. Hafezi-Bakhtiari, BG Wouters, M. Roehrl, L. Nguyen, Y. Kawakami, S. Hazama, K. Okuno, S. Ogino, P. Gibbs, P. Waring, N. Sato, T. Torigoe, K. Itoh, PS Patel, SN Shukla, Y. Wang, S. Kopetz, FA Sinicrope, V. Scripcariu, PA Ascierto, FM Marincola, BA Fox and F. Pages (2014). "Towards the introduction of the 'Immunoscore' in the classification of malignant tumors." J Pathol 232 (2): 199-209.

Gao Q, Qiu Sj Fau - Fan J, Fan J Fau - Zhou J, Zhou J Fau - Wang X-Y, Wang Xy Fau - Xiao Y-S, Xiao Ys Fau -Xu Y, et al. Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection.Gao Q, Qiu Sj Fau - Fan J, Fan J Fau - Zhou J, Zhou J Fau - Wang X-Y, Wang Xy Fau - Xiao Y-S, Xiao Ys Fau -Xu Y, et al. Intratumoral balance of regulatory and cytotoxic T cells is associated with prognosis of hepatocellular carcinoma after resection.

Gu-Trantien, C., S. Loi, S. Garaud, C. Equeter, M. Libin, A. de Wind, M. Ravoet, H. Le Buanec, C. Sibille, G. Manfouo- Foutsop, I. Veys, B. Haibe-Kains, S. K. Singhal, S. Michiels, F. Rothe, R. Salgado, H. Duvillier, M. Ignatiadis, C. Desmedt, D. Bron, D. Larsimont, M. Piccart, C. Sotiriou and K. Willard-Gallo (2013). "CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival." J Clin Invest 123(7): 2873-2892.Gu-Trantien, C., S. Loi, S. Garaud, C. Equeter, M. Libin, A. de Wind, M. Ravoet, H. Le Buanec, C. Sibille, G. Manfouo-Foutsop, I. Veys , B. Haibe-Kains, SK Singhal, S. Michiels, F. Rothe, R. Salgado, H. Duvillier, M. Ignatiadis, C. Desmedt, D. Bron, D. Larsimont, M. Piccart, C. Sotiriou and K. Willard-Gallo (2013). "CD4 (+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival." J Clin Invest 123 (7): 2873-2892.

Halliday G, Patel A, Hunt M, Tefany F, Barnetson RC. Spontaneous regression of human melanoma/nonmelanoma skin cancer: Association with infiltrating CD4+ T cells. World J Surg. 1995;19:352-8.Halliday G, Patel A, Hunt M, Tefany F, Barnetson RC. Spontaneous regression of human melanoma / nonmelanoma skin cancer: Association with infiltrating CD4 + T cells. World J Surg. 1995; 19: 352-8.

Hastie R, Hastie, R. Tibshirani, J. Friedman, The Elements of Statistical Learning (Springer, Nueva York, 2001). Hastie R, Hastie, R. Tibshirani, J. Friedman, The Elements of Statistical Learning (Springer, New York, 2001).

Hegmans JP, Hemmes A, Hammad H, Boon L, Hoogsteden HC, Lambrecht BN. Mesothelioma environment comprises cytokines and T-regulatory cells that suppress immune responses. The European respiratory journal.Hegmans JP, Hemmes A, Hammad H, Boon L, Hoogsteden HC, Lambrecht BN. Mesothelioma environment comprises cytokines and T-regulatory cells that suppress immune responses. The European respiratory journal.

2006;27:1086-95.2006; 27: 1086-95.

Hiraoka N, Onozato K Fau - Kosuge T, Kosuge T Fau - Hirohashi S, Hirohashi S. Prevalence of FOXP3+ regulatory T cells increases during the progression of pancreatic ductal adenocarcinoma and its premalignant lesions.Hiraoka N, Onozato K Fau - Kosuge T, Kosuge T Fau - Hirohashi S, Hirohashi S. Prevalence of FOXP3 + regulatory T cells increases during the progression of pancreatic ductal adenocarcinoma and its premalignant lesions.

Huang CT, Oyang YJ, Huang HC, Juan HF. MicroRNA-mediated networks underlie immune response regulation in papillary thyroid carcinoma.Huang CT, Oyang YJ, Huang HC, Juan HF. MicroRNA-mediated networks underlie immune response regulation in papillary thyroid carcinoma.

Issa-Nummer, Y., S. Darb-Esfahani, S. Loibl, G. Kunz, V. Nekljudova, I. Schrader, B. V. Sinn, H. U. Ulmer, R. Kronenwett, M. Just, T. Kuhn, K. Diebold, M. Untch, F. Holms, J. U. Blohmer, J. O. Habeck, M. Dietel, F. Overkamp, P. Krabisch, G. von Minckwitz and C. Denkert (2013). "Prospective validation of immunological infiltrate for prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in HER2-negative breast cancer--a substudy of the neoadjuvant Gepar- Quinto trial." PLoS One 8(12): e79775.Issa-Nummer, Y., S. Darb-Esfahani, S. Loibl, G. Kunz, V. Nekljudova, I. Schrader, BV Sinn, HU Ulmer, R. Kronenwett, M. Just, T. Kuhn, K. Diebold , M. Untch, F. Holms, JU Blohmer, JO Habeck, M. Dietel, F. Overkamp, P. Krabisch, G. von Minckwitz and C. Denkert (2013). "Prospective validation of immunological infiltrate for prediction of response to neoadjuvant chemotherapy in HER2-negative breast cancer - a substudy of the neoadjuvant Gepar- Quinto trial." PLoS One 8 (12): e79775.

Janowczyk A, S. C, Madabhushi A. Quantifying local heterogeneity via morphologic scale: Distinguishing tumoral from stromal regions. Journal of pathology informatics. 2013(4 Supl):Janowczyk A, S. C, Madabhushi A. Quantifying local heterogeneity via morphologic scale: Tumor distinguishing from stromal regions. Journal of pathology informatics. 2013 (4 Suppl):

Kanehisa, M. and S. Goto (2000). "KEGG: kyoto encyclopedia of genes and genomes." Nucleic Acids Research 28(1): 27-30.Kanehisa, M. and S. Goto (2000). "KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes." Nucleic Acids Research 28 (1): 27-30.

Kmiecik J, Poli A, Brons NH, Waha A, Eide GE, Elevated CD3+ and CD8+ tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. Journal of neuroimmunology. 2013;264:71-83.Kmiecik J, Poly A, Brons NH, Waha A, Eide GE, Elevated CD3 + and CD8 + tumor-infiltrating immune cells correlate with prolonged survival in glioblastoma patients despite integrated immunosuppressive mechanisms in the tumor microenvironment and at the systemic level. Journal of neuroimmunology. 2013; 264: 71-83.

Kruger, J. M., C. Wemmert, L. Sternberger, C. Bonnas, G. Dietmann, P. Gancarski and F. Feuerhake (2013). "Combat or surveillance? Evaluation of the heterogeneous inflammatory breast cancer microenvironment." J Pathol 229(4): 569-578.Kruger, J. M., C. Wemmert, L. Sternberger, C. Bonnas, G. Dietmann, P. Gancarski and F. Feuerhake (2013). "Combat or surveillance? Evaluation of the heterogeneous inflammatory breast cancer microenvironment." J Pathol 229 (4): 569-578.

Kuong, K. J. and L. A. Loeb (2013). "APOBEC3B mutagenesis in cancer." Nat Genet 45(9): 964-965.Kuong, K. J. and L. A. Loeb (2013). "APOBEC3B mutagenesis in cancer." Nat Genet 45 (9): 964-965.

Monajemi, M., C. F. Woodworth, J. Benkaroun, M. Grant and M. Larijani (2012). "Emerging complexities of APOBEC3G action on immunity and viral fitness during HIV infection and treatment." Retrovirology 9: 35.Monajemi, M., C. F. Woodworth, J. Benkaroun, M. Grant and M. Larijani (2012). "Emerging complexities of APOBEC3G action on immunity and viral fitness during HIV infection and treatment." Retrovirology 9: 35.

Kono K, Kawaida H, Takahashi A, Sugai H, Mimura K, Miyagawa N, et al. CD4(+)CD25high regulatory T cells increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunol Immunother.Kono K, Kawaida H, Takahashi A, Sugai H, Mimura K, Miyagawa N, et al. CD4 (+) CD25high regulatory T cells increase with tumor stage in patients with gastric and esophageal cancers. Cancer Immunol Immunother.

2006;55:1064-71.2006; 55: 1064-71.

Lee, H. J., J. Y. Seo, J. H. Ahn, S. H. Ahn and G. Gong (2013). "Tumor-associated lymphocytes predict response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients." J Breast Cancer 16(1): 32-39.Lee, H. J., J. Y. Seo, J. H. Ahn, S. H. Ahn and G. Gong (2013). "Tumor-associated lymphocytes predict response to neoadjuvant chemotherapy in breast cancer patients." J Breast Cancer 16 (1): 32-39.

Liu, S., J. Lachapelle, S. Leung, D. Gao, W. D. Foulkes and T. O. Nielsen (2012). "CD8+ lymphocyte infiltration is an independent favorable prognostic indicator in basal-like breast cancer." Breast Cancer Res 14(2): R48.Liu, S., J. Lachapelle, S. Leung, D. Gao, W. D. Foulkes and T. O. Nielsen (2012). "CD8 + lymphocyte infiltration is an independent favorable prognostic indicator in basal-like breast cancer." Breast Cancer Res 14 (2): R48.

Loi, S., N. Sirtaine, F. Piette, R. Salgado, G. Viale, F. Van Eenoo, G. Rouas, P. Francis, J. P. Crown, E. Hitre, E. de Azambuja, E. Quinaux, A. Di Leo, S. Michiels, M. J. Piccart and C. Sotiriou (2013). "Prognostic and predictive value of tumor-infiltrating lymphocytes in a phase III randomized adjuvant breast cancer trial in node-positive breast cancer comparing the addition of docetaxel to doxorubicin with doxorubicin-based chemotherapy: BIG 02-98." J Clin Oncol 31(7): 860-867.Loi, S., N. Sirtaine, F. Piette, R. Salgado, G. Viale, F. Van Eenoo, G. Rouas, P. Francis, JP Crown, E. Hitre, E. de Azambuja, E. Quinaux, A. Di Leo, S. Michiels, MJ Piccart and C. Sotiriou (2013). "Prognostic and predictive value of tumor-infiltrating lymphocytes in a phase III randomized adjuvant breast cancer trial in node-positive breast cancer comparing the addition of docetaxel to doxorubicin with doxorubicin-based chemotherapy: BIG 02-98." J Clin Oncol 31 (7): 860-867.

McNamara MG, Lwin Z, Jiang H, Templeton AJ, Zadeh G, Bernstein M, et al. Factors impacting survival following second surgery in patients with glioblastoma in the temozolomide treatment era, incorporating neutrophil/lymphocyte ratio and time to first progression. Journal of neuro-oncology. 2014;117:147-52.McNamara MG, Lwin Z, Jiang H, Templeton AJ, Zadeh G, Bernstein M, et al. Factors impacting survival following second surgery in patients with glioblastoma in the temozolomide treatment era, incorporating neutrophil / lymphocyte ratio and time to first progression. Journal of neuro-oncology. 2014; 117: 147-52.

Ma, X., K. Norsworthy, N. Kundu, W. H. Rodgers, P. A. Gimotty, O. Goloubeva, M. Lipsky, Y. Li, D. Holt and A. Fulton (2009). "CXCR3 expression is associated with poor survival in breast cancer and promotes metastasis in a murine model." Mol Cancer Ther 8(3): 490-498.Ma, X., K. Norsworthy, N. Kundu, W. H. Rodgers, P. A. Gimotty, O. Goloubeva, M. Lipsky, Y. Li, D. Holt and A. Fulton (2009). "CXCR3 expression is associated with poor survival in breast cancer and promotes metastasis in a murine model." Mol Cancer Ther 8 (3): 490-498.

Mahmoud, S. M. A., E. C. Paish, D. G. Powe, R. D. Macmillan, M. J. Grainge, A. H. S. Lee, I. O. Ellis and A. R. Green (2011). "Tumor-infiltrating CD8+ lymphocytes predict clinical outcome in breast cancer." J Clin Oncol 29(15): 1949-1955.Mahmoud, S. M. A., E. C. Paish, D. G. Powe, R. D. Macmillan, M. J. Grainge, A. H. S. Lee, I. O. Ellis and A. R. Green (2011). "Tumor-infiltrating CD8 + lymphocytes predict clinical outcome in breast cancer." J Clin Oncol 29 (15): 1949-1955.

Mangeat, B., P. Turelli, G. Caron, M. Friedli, L. Perrin and D. Trono (2003). "Broad antiretroviral defence by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts." Nature 424(6944): 99-103.Mangeat, B., P. Turelli, G. Caron, M. Friedli, L. Perrin and D. Trono (2003). "Broad antiretroviral defense by human APOBEC3G through lethal editing of nascent reverse transcripts." Nature 424 (6944): 99-103.

Mao, H., L. Zhang, Y. Yang, W. Zuo, Y. Bi, W. Gao, B. Deng, J. Sun, Q. Shao and X. Qu (2010). "New insights of CTLA-4 into its biological function in breast cancer." Curr Cancer Drug Targets 10(7): 728-736. Mao, H., L. Zhang, Y. Yang, W. Zuo, Y. Bi, W. Gao, B. Deng, J. Sun, Q. Shao and X. Qu (2010). "New insights of CTLA-4 into its biological function in breast cancer." Curr Cancer Drug Targets 10 (7): 728-736.

Milne K, Kobel M, Kalloger SE, Barnes RO, Gao D, Gilks CB, et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high- grade serous ovarían cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. PloS one.Milne K, Kobel M, Kalloger SE, Barnes RO, Gao D, Gilks CB, et al. Systematic analysis of immune infiltrates in high-grade serous ovarian cancer reveals CD20, FoxP3 and TIA-1 as positive prognostic factors. PloS one.

2009;4:e6412.2009; 4: e6412.

Mittendorf et al (2014) "PD-L1 Expression in Triple Negative Breast Cancer" Cancer Immunol Res 2; 361.Mittendorf et al (2014) "PD-L1 Expression in Triple Negative Breast Cancer" Cancer Immunol Res 2; 361.

Mukherji B Fau - Guha A, Guha A Fau - Loomis R, Loomis R Fau - Ergin MT, Ergin MT. Cell-mediated amplification and down regulation of cytotoxic immune response against autologous human cancer.Mukherji B Fau - Guha A, Guha A Fau - Loomis R, Loomis R Fau - Ergin MT, Ergin MT. Cell-mediated amplification and down regulation of cytotoxic immune response against autologous human cancer.

Natrajan, R., F. M. Mardakheh, H. Sailem, C. Bakal and Y. Yuan (In preparation). "The Ecosystem Diversity Landscape of Breast Cancer."Natrajan, R., F. M. Mardakheh, H. Sailem, C. Bakal and Y. Yuan (In preparation). "The Ecosystem Diversity Landscape of Breast Cancer."

Ohno S, Ohno Y, Suzuki N, Kamei T, Koike K, Inagawa H, et al. Correlation of histological localization of tumorassociated macrophages with clinicopathological features in endometrial cancer. Anticancer Research.Ohno S, Ohno Y, Suzuki N, Kamei T, Koike K, Inagawa H, et al. Correlation of histological localization of tumorassociated macrophages with clinicopathological features in endometrial cancer. Anticancer Research

2004;24:3335-422004; 24: 3335-42

Papewalis C, Kouatchoua C Fau - Ehlers M, Ehlers M Fau - Jacobs B, Jacobs B Fau - Porwol D, Porwol D Fau -Schinner S, Schinner S Fau - Willenberg HS, et al. Chromogranin A as potential target for immunotherapy of malignant pheochromocytoma.Papewalis C, Kouatchoua C Fau - Ehlers M, Ehlers M Fau - Jacobs B, Jacobs B Fau - Porwol D, Porwol D Fau-Schinner S, Schinner S Fau - Willenberg HS, et al. Chromogranin A as potential target for immunotherapy of malignant pheochromocytoma.

Perou C, Sorlie T, Eisen M, van de Rijn M, Jeffrey S, Rees C, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406:747-52.Perou C, Sorlie T, Eisen M, van de Rijn M, Jeffrey S, Rees C, et al. Molecular portraits of human breast tumors. Nature 2000; 406: 747-52.

Prat, J., "Staging classification for cancer of the ovary, fallopian tube and peritoneum." International Journal of Gynecology and Obstetrics. 2013. (http://www.ncin.org.uk/view?rid=2515).Prat, J., "Staging classification for cancer of the ovary, fallopian tube and peritoneum." International Journal of Gynecology and Obstetrics. 2013. (http://www.ncin.org.uk/view?rid=2515).

Pretscher D, Distel LV, Grabenbauer GG, Wittlinger M, Buettner M, Niedobitek G. Distribution of immune cells in head and neck cancer: CD8+ T-cells and CD20+ B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favourable outcome in patients with oro- and hypopharyngeal carcinoma. BMC cancer. 2009;9:292.Pretscher D, Distel LV, Grabenbauer GG, Wittlinger M, Buettner M, Niedobitek G. Distribution of immune cells in head and neck cancer: CD8 + T-cells and CD20 + B-cells in metastatic lymph nodes are associated with favorable outcome in patients with gold - and hypopharyngeal carcinoma. BMC cancer. 2009; 9: 292.

Robert C., L. Thomas, I. Bondarenko, S. O'Day, D. J. M, C. Garbe, C. Lebbe, J. F. Baurain, A. Testori, J. J. Grob, N. Davidson, J. Richards, M. Maio, A. Hauschild, W. H. Miller, Jr., P. Gascon, M. Lotem, K. Harmankaya, R. Ibrahim, Robert C., L. Thomas, I. Bondarenko, S. O'Day, DJ M, C. Garbe, C. Lebbe, JF Baurain, A. Testori, JJ Grob, N. Davidson, J. Richards, M. Maio , A. Hauschild, WH Miller, Jr., P. Gascon, M. Lotem, K. Harmankaya, R. Ibrahim,

S. Francis, T. T. Chen, R. Humphrey, A. Hoos and J. D. Wolchok (2011). "Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma." N Engl J Med 364(26): 2517-2526.S. Francis, T. T. Chen, R. Humphrey, A. Hoos and J. D. Wolchok (2011). "Ipilimumab plus dacarbazine for previously untreated metastatic melanoma." N Engl J Med 364 (26): 2517-2526.

Rody, A., U. Holtrich, L. Pusztai, C. Liedtke, R. Gaetje, E. Ruckhaeberle, C. Solbach, L. Hanker, A. Ahr, D. Metzler, K. Engels, T. Karn and M. Kaufmann (2009). "T-cell metagene predicts a favorable prognosis in estrogen receptornegative and HER2-positive breast cancers." Breast Cancer Res 11(2): R15.Rody, A., U. Holtrich, L. Pusztai, C. Liedtke, R. Gaetje, E. Ruckhaeberle, C. Solbach, L. Hanker, A. Ahr, D. Metzler, K. Engels, T. Karn and M Kaufmann (2009). "T-cell metagene predicts a favorable prognosis in estrogen receptor negative and HER2-positive breast cancers." Breast Cancer Res 11 (2): R15.

Rody A, Karn T, Liedtke C, Pusztai L, Ruckhaeberle E, Hanker L, et al. A clinically relevant gene signature in triple negative and basal-like breast cancer. Breast cancer research: BCR. 2011;13:R97Rody A, Karn T, Liedtke C, Pusztai L, Ruckhaeberle E, Hanker L, et al. A clinically relevant gene signature in triple negative and basal-like breast cancer. Breast cancer research: BCR. 2011; 13: R97

Salgardo, R. et al., (2014) "Harmonization of the evaluation of tumour infiltration lymphocytes (TILs) in breast cancer: recommendations by an international TILs-Working Group 2014. Annals of OncologySalgardo, R. et al., (2014) "Harmonization of the evaluation of tumor infiltration lymphocytes (TILs) in breast cancer: recommendations by an international TILs-Working Group 2014. Annals of Oncology

Salvi, S., V. Fontana, S. Boccardo, D. F. Merlo, E. Margallo, S. Laurent, A. Morabito, E. Rijavec, M. G. Dal Bello, M. Mora, G. B. Ratto, F. Grossi, M. Truini and M. P. Pistillo (2012). "Evaluation of CTLA-4 expression and relevance as a novel prognostic factor in patients with non-small cell lung cancer." Cancer Immunol Immunother61(9): 1463 1472.Salvi, S., V. Fontana, S. Boccardo, DF Merlo, E. Margallo, S. Laurent, A. Morabito, E. Rijavec, MG Dal Bello, M. Mora, GB Ratto, F. Grossi, M. Truini and MP Pistillo (2012). "Evaluation of CTLA-4 expression and relevance as a novel prognostic factor in patients with non-small cell lung cancer." Cancer Immunol Immunother61 (9): 1463 1472.

Schalper, K. A., V. Velcheti, D. Carvajal, H. Wimberly, J. Brown, L. Pusztai and D. L. Rimm (2014). "In Situ Tumor PD-L1 mRNA Expression Is Associated with Increased TILs and Better Outcome in Breast Carcinomas." Clin Cancer Res.Schalper, K. A., V. Velcheti, D. Carvajal, H. Wimberly, J. Brown, L. Pusztai and D. L. Rimm (2014). "In Situ Tumor PD-L1 mRNA Expression Is Associated with Increased TILs and Better Outcome in Breast Carcinomas." Clin Cancer Res.

Spanos WC, Nowicki P, Lee DW, Hoover A, Hostager B, Gupta A, et al. Immune response during therapy with cisplatin or radiation for human papillomavirus-related head and neck cancer. Archives of otolaryngology--head & neck surgery. 2009; 135:1137-46.Spanos WC, Nowicki P, Lee DW, Hoover A, Hostager B, Gupta A, et al. Immune response during therapy with cisplatin or radiation for human papillomavirus-related head and neck cancer. Archives of otolaryngology - head & neck surgery. 2009; 135: 1137-46.

Sjodahl G, Lovgren K, Lauss M, Chebil G, Patschan O, Infiltration of CD3+ and CD68+ cells in bladder cancer is subtype specific and affects the outcome of patients with muscle-invasive tumors. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2014;32:791-7.Sjodahl G, Lovgren K, Lauss M, Chebil G, Patschan O, Infiltration of CD3 + and CD68 + cells in bladder cancer is subtype specific and affects the outcome of patients with muscle-invasive tumors. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations. 2014; 32: 791-7.

Sorbye SW, Kilvaer T, Valkov A, Donnem T, Smeland E, Al-Shibli K, et al. Prognostic impact of lymphocytes in soft tissue sarcomas. PloS one. 2011;6:e14611. Sorbye SW, Kilvaer T, Valkov A, Donnem T, Smeland E, Al-Shibli K, et al. Prognostic impact of lymphocytes in soft tissue sarcomas. PloS one. 2011; 6: e14611.

Stagg, J. and B. Allard (2013). "Immunotherapeutic approaches in triple-negative breast cáncer: latest research and clinical prospects." Ther Adv Med Oncol 5(3): 169-181.Stagg, J. and B. Allard (2013). "Immunotherapeutic approaches in triple-negative breast cancer: latest research and clinical prospects." Ther Adv Med Oncol 5 (3): 169-181.

Subramanian, A., P. Tamayo, V. K. Mootha, S. Mukherjee, B. L. Ebert, M. A. Gillette, A. Paulovich, S. L. Pomeroy, Subramanian, A., P. Tamayo, V. K. Mootha, S. Mukherjee, B. L. Ebert, M. A. Gillette, A. Paulovich, S. L. Pomeroy,

T. R. Golub, E. S. Lander and J. P. Mesirov (2005). "Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles." Proc Natl Acad Sci U S A 102(43): 15545-15550.T. R. Golub, E. S. Lander and J. P. Mesirov (2005). "Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles." Proc Natl Acad Sci U S A 102 (43): 15545-15550.

Suzuki K, Kadota K, Sima CS, Nitadori J, Rusch VW, Travis WD, et al. Clinical impact of immune microenvironment in stage I lung adenocarcinoma: tumor interleukin-12 receptor beta2 (IL-12Rbeta2), IL-7R, and stromal FoxP3/CD3 ratio are independent predictors of recurrence. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2013;31:490-8.Suzuki K, Kadota K, Sima CS, Nitadori J, Rusch VW, Travis WD, et al. Clinical impact of immune microenvironment in stage I lung adenocarcinoma: interleukin-12 tumor beta2 receptor (IL-12Rbeta2), IL-7R, and stromal FoxP3 / CD3 ratio are independent predictors of recurrence. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2013; 31: 490-8.

The Cancer Genome Atlas Network (2012). "Comprehensive molecular portraits of human breast tumours." Nature 490(7418): 61-70.The Cancer Genome Atlas Network (2012). "Comprehensive molecular portraits of human breast tumors." Nature 490 (7418): 61-70.

Tjin EP, Krebbers G, Meijlink KJ, van de Kasteele W, Rosenberg EH, Sanders J, et al. Immune-escape markers in relation to clinical outcome of advanced melanoma patients following immunotherapy. Cancer immunology research. 2014;2:538-46.Tjin EP, Krebbers G, Meijlink KJ, van de Kasteele W, Rosenberg EH, Sanders J, et al. Immune-escape markers in relation to clinical outcome of advanced melanoma patients following immunotherapy. Cancer immunology research. 2014; 2: 538-46.

Thompson RH, Dong H, Lohse CM, Leibovich BC, Blute ML, PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells and is associated with poor outcome for patients with renal cell carcinoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2007;13:1757-61.Thompson RH, Dong H, Lohse CM, Leibovich BC, Blute ML, PD-1 is expressed by tumor-infiltrating immune cells and is associated with poor outcome for patients with renal cell carcinoma. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2007; 13: 1757-61.

Townsend KN, Spowart JE, Huwait H, Eshragh S, West NR, Markers of T cell infiltration and function associate with favorable outcome in vascularized high-grade serous ovarian carcinoma. PloS one. 2013;8:e82406.Townsend KN, Spowart JE, Huwait H, Eshragh S, West NR, Markers of T cell infiltration and function associate with favorable outcome in vascularized high-grade serous ovarian carcinoma. PloS one. 2013; 8: e82406.

Ueno T, Toi M, Saji H, Muta M, Bando H, Kuroi K, et al. Significance of macrophage chemoattractant protein-1 in macrophage recruitment, angiogenesis, and survival in human breast cancer. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2000;6:3282-9.Ueno T, Toi M, Saji H, Muta M, Bando H, Kuroi K, et al. Significance of macrophage chemoattractant protein-1 in macrophage recruitment, angiogenesis, and survival in human breast cancer. Clinical cancer research: an official journal of the American Association for Cancer Research. 2000; 6: 3282-9.

Vauleon E, Tony A, Hamlat A, Etcheverry A, Chiforeanu DC, Menei P, et al. Immune genes are associated with human glioblastoma pathology and patient survival. BMC medical genomics. 2012;5:41.Vauleon E, Tony A, Hamlat A, Etcheverry A, Chiforeanu DC, Menei P, et al. Immune genes are associated with human glioblastoma pathology and patient survival. BMC medical genomics. 2012; 5: 41.

Villegas FR, Coca S, Villarrubia VG, Jimenez R, Chillon MJ, Prognostic significance of tumor infiltrating natural killer cells subset CD57 in patients with squamous cell lung cancer. Lung cancer (Amsterdam, Netherlands). 2002;35:23-8.Villegas FR, Coca S, Villarrubia VG, Jimenez R, Chillon MJ, Prognostic significance of tumor infiltrating natural killer cells subset CD57 in patients with squamous cell lung cancer. Lung cancer (Amsterdam, Netherlands). 2002; 35: 23-8.

Webster WS, Lohse CM, Thompson RH, Dong H, Frigola X, Dicks DL, et al. Mononuclear cell infiltration in clearcell renal cell carcinoma independently predicts patient survival. Cancer. 2006;107:46-53.Webster WS, Lohse CM, Thompson RH, Dong H, Frigola X, Dicks DL, et al. Mononuclear cell infiltration in clearcell renal cell carcinoma independently predicts patient survival. Cancer. 2006; 107: 46-53.

Welsh TJ, Green RH, Richardson D, Waller DA, O'Byrne KJ, Bradding P. Macrophage and mast-cell invasion of tumor cell islets confers a marked survival advantage in non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2005;23:8959-67.Welsh TJ, Green RH, Richardson D, Waller DA, O'Byrne KJ, Bradding P. Macrophage and mast-cell invasion of tumor cell islets confers a marked survival advantage in non-small-cell lung cancer. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology. 2005; 23: 8959-67.

Witkin, A. P. "Scale-space filtering", Proc. 8th Int. Joint Conf. Art. Intell., Karlsruhe, Germany,1019-1022, 1983. Witkin, A. P. "Scale-space filtering", Proc. 8th Int. Joint Conf. Art. Intell., Karlsruhe, Germany, 1019-1022, 1983.

Wu G, Han BI Fau - Pei X-t, Pei XT. Immune response of dendritic cells acquiring antigens from apoptotic cholangiocarcinoma cells induced by mitomycin.Wu G, Han BI Fau - Pei X-t, Pei XT. Immune response of dendritic cells acquiring antigens from apoptotic cholangiocarcinoma cells induced by mitomycin.

Yang I, Tihan T, Han SJ, Wrensch MR, Wiencke J, Sughrue ME, et al. CD8+ T-cell infiltrate in newly diagnosed glioblastoma is associated with long-term survival. Journal of clinical neuroscience: official journal of the Neurosurgical Society of Australasia. 2010;17:1381-5.Yang I, Tihan T, Han SJ, Wrensch MR, Wiencke J, Sughrue ME, et al. CD8 + T-cell infiltrate in newly diagnosed glioblastoma is associated with long-term survival. Journal of clinical neuroscience: official journal of the Neurosurgical Society of Australasia. 2010; 17: 1381-5.

Yong AS, Stephens N, Weber G, Li Y, Savani BN, Improved outcome following allogeneic stem cell transplantation in chronic myeloid leukemia is associated with higher expression of BMI-1 and immune responses to BMI-1 protein. Leukemia. 2011;25:629-37.Yong AS, Stephens N, Weber G, Li Y, Savani BN, Improved outcome following allogeneic stem cell transplantation in chronic myeloid leukemia is associated with higher expression of BMI-1 and immune responses to BMI-1 protein. Leukemia 2011; 25: 629-37.

Yuan, Y., H. Failmezger, O. M. Rueda, H. R. Ali, S. Graf, S.-F. Chin, R. F. Schwarz, C. Curtis, M. J. Dunning, H. Bardwell, N. Johnson, S. Doyle, G. Turashvili, E. Provenzano, S. Aparicio, C. Caldas and F. Markowetz (2012). "Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling." Science Translational Medicine 4(157): 157ra143.Yuan, Y., H. Failmezger, O. M. Rueda, H. R. Ali, S. Graf, S.-F. Chin, R. F. Schwarz, C. Curtis, M. J. Dunning, H. Bardwell, N. Johnson, S. Doyle, G. Turashvili, E. Provenzano, S. Aparicio, C. Caldas and F. Markowetz (2012). "Quantitative Image Analysis of Cellular Heterogeneity in Breast Tumors Complements Genomic Profiling." Science Translational Medicine 4 (157): 157ra143.

Zhang Y., Wang L, Liu Y, Wang S, Shang P, Preoperative neutrophil-lymphocyte ratio before platelet- lymphocyte ratio predicts clinical outcome in patients with cervical cancer treated with initial radical surgery. International journal of gynecological cancer: official journal of the International Gynecological Cancer Society. 2014;24:1319-25. Zhang Y., Wang L, Liu Y, Wang S, Shang P, Preoperative neutrophil-lymphocyte ratio before platelet-lymphocyte ratio predicts clinical outcome in patients with cervical cancer treated with initial radical surgery. International journal of gynecological cancer: official journal of the International Gynecological Cancer Society. 2014; 24: 1319-25.

Claims

1. A procedure implemented by ex vivo computer to measure immune infiltration in a tumor, the procedure comprising:

provide an image of the tumor in which lymphocytes and cancer cells have been identified;

obtaining a measurement of lymphocytes with respect to cancer for each lymphocyte, which comprises applying a density estimate to obtain a model of cancer cell density; and determine the proximity of each lymphocyte to the density of cancer cells;

classify a subset of lymphocytes as intratumoral lymphocytes according to their measurement of cancer lymphocytes, where a lymphocyte is classified as intratumoral lymphocyte if its measurement of cancer lymphocytes is above a threshold value;

quantify intratumoral lymphocytes and cancer cells in the tumor image; and

calculate the ratio of intratumoral lymphocytes (RLIT) as the ratio of intratumoral lymphocytes to cancer cells,

where RLIT is a measure of immune infiltration in the tumor.

2. A procedure for determining a cut-off value of RLIT for a type or subtype of cancer, for use in providing a prognosis in a cancer patient who has that type or subtype of cancer, the procedure comprising:

measuring immune infiltration in a tumor of each member of a cohort of cancer patients having the type or subtype of cancer, according to the method of claim 1, thereby calculating the RLIT for each tumor; relate the RLIT for each tumor to the clinical outcome of each cancer patient in the cohort of cancer patients; and

selecting a cut-off value for RLIT, where an RLIT equal to or less than the cut-off value is associated with a significantly worse clinical outcome in the cohort of cancer patients than an RLIT above the cut-off value.

3. A method for providing a prognosis in a cancer patient, the method comprising measuring immune infiltration in a tumor of the cancer patient according to the method of claim 1, thereby calculating the RLIT for the tumor,

in which an RLIT below a predetermined cut-off value of RLIT indicates a poor prognosis.

4. The method according to any one of the preceding claims, further comprising a step of identifying lymphocytes and cancer cells in an image of the tumor by automated image analysis to provide an image of the tumor in which lymphocytes have been identified and cancer cells

5. The method according to any one of the preceding claims, wherein the cancer patient has breast cancer, ovarian cancer, colorectal cancer, melanoma or non-small cell lung cancer.

6. The method according to claim 5, wherein the cancer patient has breast cancer that is triple negative breast cancer.

7. The method of providing a prognosis in a cancer patient according to any one of claims 3 to 6, wherein the cut-off value of the predetermined RLIT is 0.005 to 0.070;

8. The method of providing a prognosis in a cancer patient according to any one of claims 3 to 6, the method further comprising determining a cut-off value of the ITLR for the type or subtype of the patient's cancer by the method according to claim 2, wherein the cut-off value of RLIT is the predetermined cut-off value of RLIT to provide a prognosis for the cancer patient.

9. A method for predicting whether a cancer patient will respond to a therapeutic regimen, the method comprising analyzing a tumor image of the cancer patient according to the procedure of claim 1, wherein an RLIT above a cut-off value of RLIT indicates that the patient is likely to respond to the therapeutic regimen.

10. The method of providing a prognosis in a cancer patient according to any one of claims 3 to 6 or the method of predicting whether a cancer patient will respond to a therapeutic regimen according to claim 9,

wherein the procedure further comprises measuring immune filtration in a surgically resected tumor obtained from the cancer patient.

11. A CTLA4 antagonist, for use in a cancer treatment procedure,

where the cancer patient has triple negative breast cancer,

wherein, in the procedure, the therapeutic regimen comprises the administration of a CTLA4 antagonist, and wherein the cancer patient is treated according to the therapeutic regimen if the RLIT determined according to with claim 1 it is above a predetermined cut-off value.

12. The method according to any one of the preceding claims, wherein the image of a tumor is an image of a tumor section stained with hematoxylin and eosin.