ES2713383T3 - Lectinas recombinantes de fijación a las células cancerosas con actividad antitumoral y método de preparación - Google Patents

Abstract

Una proteína lectina incluye una secuencia de aminoácidos de ID de la SEC. 2 o 3, que tiene mejores propiedades de solubilidad y estabilidad en comparación con una proteína lectina de ID de la SEC. 1.

Description

DESCRIPCION

Lectinas recombinantes de fijacion a las celulas cancerosas con actividad antitumoral y metodo de preparacion

AMBITO DE LA INVENCION

La invencion se relaciona con el campo de las protefnas de fijacion a carbohidratos y, mas concretamente, con una protefna que se fija especfficamente a oligosacaridos concretos asociados con una especial importancia medica. La invencion se relaciona especfficamente con las lectinas, mas en concreto con las lectinas fungicas recombinantes que tienen la capacidad de reconocer a los polisacaridos de importancia clfnica y su efecto antiproliferativo en las celulas cancerosas, con aplicaciones en el diagnostico, tratamiento e investigacion del cancer.

CONTEXTO DE LA INVENCION

Las lectinas son protefnas o glucoprotefnas que aglutinan los eritrocitos de algunos o todos los grupos sangufneos in vitro. Constituyen un importante grupo de protefnas bioactivas que se encuentran en la mayor parte de organismos. Las lectinas se utilizan como herramientas para fines de diagnostico y terapeutico en areas sanitarias. Las lectinas tambien se utilizan en la purificacion de las glucoprotefnas, en el analisis de los oligosacaridos y en los procesos de seleccion celular. Las lectinas se pueden fijar reversiblemente a los monosacaridos o al grupo azucar de las glucoprotefnas, glucolfpidos o polisacaridos.

Los cambios en las estructuras de los carbohidratos sobre las superficies celulares constituyen un rasgo caracterfstico durante el cancer. Dichos cambios generan la exposicion de estructuras de carbohidratos asociadas a tumores. Entre ellos, se encuentra una mayor aparicion del antfgeno Thomsen-Friedenreich, un disacarido Galp1^3GalNac-0-Ser/Thr. En las celulas normales, este antfgeno se enmascara debido a determinados azucares, acidos sialicos o sulfatos. Algunas de las lectinas tienen la capacidad de reconocer y fijarse especfficamente a estas estructuras alteradas y ejercen diversos efectos fisiologicos como apoptosis, citotoxicidad, actividad proliferativa/antiproliferativa, metastasis, inhibicion de la adherencia celular, etc. Por tanto, actualmente dichas se esta considerando el uso de las lectinas como agentes de diagnostico y terapeuticos del cancer y tambien para la actividad antitumoral.

Se han aislado y caracterizado diversas lectinas procedentes de varias fuentes. Sin embargo, difieren en sus propiedades fisicoqufmicas, como el tamano molecular y las especificidades de los azucares. Tambien existe la caracterizacion de unas cuantas protefnas recombinantes. La lectina recombinante de hongo procedente de Marasmius oreades tiene un tamano molecular de 33 kDa y muestra una elevada afinidad por Galal, 3Gal y Galal, 3Gaipi, 4GlcNAc. (R.P. Kruger et al., J.Biol.Chem., 277, 15002-15005, 2002; H.C. Winter et al. J.Biol.Chem, 277, 14996-15001, 2002, I.J. Goldstein, et al. Patente de EE. UU.: 6958321)

Se ha clonado la lectina de cacahuete que muestra afinidad por el antfgeno Thomsen-Friedenreich (V. Sharma y A. Surolia, Gene [Amst], 148, 299-304, 1994) y, posteriormente, algunas mutaciones de esta protefna con una masa molecular subunitaria de ~28 kDa tambien se han expresado en E. coli (V. Sharma, M. Vijayan y A. Surolia, J.Biol.Chem., 271, 21200-21213, 1996) con algunas diferencias en su preferencia por la especificidad de los azucares. Una lectina mucho mas pequena de masa molecular de 11,73 kDa con una elevada afinidad de fijacion a la L-fucosa procedente de Pseudomonas aeruginosa tambien se ha expresado en E. coli como una fusion protefnalectina amarilla fluorescente (BioTechniques, 41, 327-332, 2006).

Jonathan M. Rhodes observo que una lectina de hongo (ABL) procedente de Agaricus bisporus tiene actividad antiproliferativa en las celulas cancerosas del colon humano y efecto curativo en la psoriasis; n.° de patente de EE. UU. 5607679.

La lectina de Sclerotium rolfsii (SRL) purificada a partir de cuerpos escleroticos del hongo fitopatogeno Sclerotium rolfsii presenta una especificidad de carbohidratos complejos y una especificidad hacia el antfgeno TF. El antfgeno TF es un oncofetal, un disacarido Galpl, 3GaNAc a ser/thr y se sabe que se expresa en las superficies celulares de distintos canceres. SRL, ademas de fijarse al antfgeno TF, tambien se fija a los disacaridos sialilados y sulfatados. Se ha determinado la estructura cristalina de esta lectina y su secuencia completa de aminoacidos (Demetres 2007 y Satisha 2008). Los estudios de fijacion indicaron que SRL se fija a distintos tejidos cancerosos humanos y tambien a celulas cultivadas. La fijacion adicional de SRL a celulas de colon y a celulas leucemicas humanas cultivadas provoca su antiproliferacion y en las celulas de colon el efecto ha demostrado estar mediado por la induccion de la apoptosis. Sin embargo, la lectina natural purificada tiene problemas de solubilidad para su uso en diversas aplicaciones, por tanto existe la necesidad de obtener formas de esta lectina con una estabilidad mejorada para aplicaciones practicas.

Asf, la lectina tiene un enorme potencial en el area de los ensayos medicos. La aplicacion inmediata pretende proporcionar determinadas lectinas con caracterfsticas novedosas, para que sean utiles en el campo medico y tengan propiedades mejoradas.

RESUMEN DE LA INVENCION

La presente invencion revela que las lectinas recombinantes presentan una especificidad hacia determinadas cadenas de azucares que se encuentran exclusivamente en determinadas celulas cancerosas. La presente invencion proporciona ademas un metodo de preparacion de dos lectinas recombinantes (designadas como UC-SS/CSR-1803 y UC-SS/CSR-1805 o simplemente Rec-2 y Rec-3, respectivamente) expresadas en E. coli. El metodo comprende la sfntesis de genes de lectina cuyas secuencias se derivan mediante modificaciones deliberadas realizadas en la secuencia original de aminoacidos de una lectina de Sclerotium rolfsii (Sathisha et al., Amino Acids; 2008, 35, 309-320), un hongo fitopatogeno del suelo y su clonacion en E. coli. Las lectinas recombinantes se expresan como protefnas solubles y se purifican mediante tecnicas cromatograficas de filtracion en gel e intercambio ionico.

La presente invencion proporciona especfficamente dos lectinas recombinantes (Rec--2 y Rec-3) con masas de la subunidad aproximadas (M^r 16,1 kDa), que son especfficas hacia determinados polisacaridos ligados mediante enlaces O-glucosfdicos que se producen en las glucoprotefnas y en las superficies celulares, pero que no muestran especificidad hacia los polisacaridos ligados al nitrogeno. La propiedad de reconocer a los O-glucanos pero no a los N-glucanos y no mostrar ninguna especificidad hacia los grupos sangufneos humanos las diferencia de otras lectinas recombinantes reveladas en la solicitud de patente tambien pendiente 30/MUM/2008. Tambien se ha descubierto que las lectinas recombinantes Rec-2 y Rec-3 no se ligan a la fetufna, aunque si muestran una afinidad muy fuerte por la asialofetufna, lo que las diferencia de la lectina recombinante mencionada (solicitud de patente 30/MUM/2008) y tambien de la lectina natural. Por medio de esta propiedad de reconocimiento se fijan a determinadas moleculas de la superficie celular manifestadas durante una neoplasia maligna (Fig. 1) y, por tanto, se fijan a los tejidos de cancer de mama, cancer de colon y cancer de ovarios en humanos (Fig. 2) y tambien a celulas cultivadas y estirpes celulares leucemicas (Tabla l). Ademas de fijarse a celulas de cancer humanas cultivadas, las lectinas recombinantes manifiestan in vitro una actividad antiproliferativa en las celulas (Tabla 2), lo que pone de manifiesto sus propiedades diagnosticas y terapeuticas.

La invencion revela las secuencias de ADN de la codificacion de Rec-2 y Rec-3 para lectinas de 141 aminoacidos de longitud en cada caso, similares a la lectina natural (lectina S. rolfsii), pero con unas cuantas modificaciones deliberadas sintetizadas qufmicamente y clonadas en E. coli (ID de la SEC 1.1 y ID de la SEC 2.1). Las lectinas clonadas se expresaron despues de la induccion con el IPTG inductor. La protefna expresada se presento soluble y en forma activa en cada caso. Las lectinas recombinantes se purificaron a homogeneidad esencial recurriendo al intercambio de aniones y la cromatograffa de tamiz molecular. La estimacion de los pesos moleculares de la espectrometrfa de masas y la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sodico (SDS PAGE) indican un valor de aproximadamente 16,1 kDa. El experimento con enfoque isoelectrico muestra un valor de PI de 6,614 mientras que la lectina natural tiene 6,219; la propiedad ayudo de forma notable a mejorar la solubilidad y estabilidad de las protefnasrecombinantes. La mejora de la solubilidad, estabilidad y fijacion al antfgeno ^t F desialilado de las lectinas recombinantes tiene mayores implicaciones que sus aplicaciones en diversos campos como reactivos, ademas de su facilidad de produccion.

Ademas, en el presente se pone de manifiesto un metodo para preparar la lectina recombinante expresada en una celula anfitriona como E. coli u hongo levaduriforme. Este metodo se compone de la sfntesis del gen de la lectina tomando como base la secuencia de aminoacidos derivada del MALDI MS/MS de la lectina de Sclerotium rolfsii (ID de la SEC. l), un hongo fitopatogeno del suelo y su clonacion en la celula anfitriona.

Para obtener las propiedades deseadas, se modifico deliberadamente la secuencia de aminoacidos de la lectina natural y se obtuvieron lectinas recombinantes que se expresan en E. coli. La presente invencion descubre dos lectinas recombinantes con secuencias de aminoacidos modificadas pero con estrechas semejanzas a la lectina natural con respecto a sus propiedades de fijacion a los tejidos cancerosos y en celulas cultivadas in vitro y su actividad apoptotica en celulas cultivadas. Sin embargo, estas dos lectinas tienen una mejor solubilidad y estabilidad y mejores propiedades de especificidad de los azucares deseadas para aplicaciones, en comparacion con la lectina natural.

La lectina recombinante se expresa como una protefna soluble y se purifica mediante tecnicas cromatograficas de filtracion en gel e intercambio ionico.

La secuencia de aminoacidos ID de las SEC. 2 y 3 representa a dicha lectina con todas las caracterfsticas anteriores. La molecula de acidos nucleicos que codifica el aminoacido en la protefna de las caracterfsticas anteriores tambien esta dentro del ambito de aplicacion. La secuencia de ADN de ID de la SEC. 1.1 y 2.1 representa dichos acidos nucleicos que codifican la lectina que tiene las caracterfsticas anteriores. Las secuencias tambien contemplan cualquier cambio en las secuencias de nucleotidos o aminoacidos, lo que incluye, a modo de ejemplo, cualquier sustitucion, eliminacion, adicion o modificacion como acetilacion, nitracion, glucacion, sulfonacion, etc., en cualquiera de las posiciones de la secuencia completa y tambien incluye truncamientos en el extremo 5' o 3' de las secuenciasque no alteran las propiedades reveladas en la solicitud instantanea.

En un aspecto, esta lectina recombinante en una formulacion biotinilada o modificada con un cromoforo fluorogeno se puede utilizar para la deteccion de celulas cancerosas o cancer asociado a antfgenos especfficos.

El efecto modulador de la proliferacion de la lectina recombinante puede tener una posible aplicacion en el tratamiento antineoplasico como agente antitumoral.

En otro aspecto, la lectina recombinante puede utilizarse en el tratamiento y la investigacion del cancer. La solicitud revela, en concreto, una secuencia de ADN (ID de las SEC. 1.1 y 2.1) de codificacion para lectinas de 141 aminoacidos de longitud, similares a la lectina (S. rolfsii), pero con unas cuantas modificaciones, que se sintetizaron qufmicamente y se clonaron en E. coli.

Tambien se ha revelado el metodo de produccion de dicha lectina recombinante. La lectina clonada se expresa despues de la induccion con el IPTG inductor.

Especfficamente, la presente invencion proporciona una protefna lectina que consta de una secuencia de aminoacidos de ID de la SEC. 2 o 3. La protefna lectina de la invencion tiene mejores propiedades de solubilidad y estabilidad, en comparacion con la lectina de ID de la SEC. 1.

La presente invencion tambien proporciona la protefna lectina de la presente invencion para uso en el tratamiento del cancer y el uso de la protefna lectina de la presente invencion en la deteccion in vitro de las celulas cancerosas.

La presente invencion tambien proporciona la protefna lectina de la presente invencion para uso en el tratamiento del cancer y el uso de la protefna lectina de la presente invencion en la deteccion in vitro de las celulas cancerosas.

La presente invencion proporciona tambien una molecula de acidos nucleicos que codifica una protefna lectina de la presente invencion, siendo dicha molecula de acidos nucleicos ADN o ARN, y preferiblemente ID de la SEC. 1.1 o 2.1.

La presente invencion tambien proporciona un vector recombinante que comprende, ligados operativamente en direccion 5' a 3': un promotor que funciona en una celula anfitriona; una secuencia de acidos nucleicos estructurales de la presente invencion en la que dicha secuencia de acidos nucleicos codifica una protefna lectina; y una senal de terminacion.

Ademas, la presente invencion proporciona una celula anfitriona transformada que contiene el vector de la presente invencion.

Es mas, la presente invencion proporciona un proceso para producir una protefna lectina Sclerotium rolfsii recombinante que consiste en: cultivar una celula anfitriona que contenga el vector recombinante de la codificacion de la presente invencion de la protefna lectina; expresar la protefna lectina recombinante; y aislar dicha protefna lectina del cultivo.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1: Perfiles comparativos de los receptores de la SRL natural aislados de las membranas de celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) normales humanas en reposo (1), PBMC activadas por la fitohemaglutinina (PHA) (2), Molt-4 (3) y celulas Jurkat (4). Las protefnas de membrana (40 pg) se resolvieron mediante SDS-PAGE (gel al 10 %) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las protefnas de interaccion con SRL se investigaron con lectina biotinilada y se compararon con marcadores de protefnas de peso molecular estandar (M) despues de la visualizacion con una reaccion de estreptavidina-peroxidasa de rabano (HRP).

Figura 2:

Patron de fijacion de Rec 2 y Rec 3 y de la lectina natural a tejidos cancerosos humanos de mama y ovario en comparacion con la tincion hematoxilina-eosina (H & E). Las lectinas biotiniladas se utilizaron para inmunohistoqufmica.

Figura 3:

La secuencia de aminoacidos de la protefna lectina aislada de S. rolfsii (ID de la SEC. 1);

Secuencia de protefnas de la lectina recombinante Rec 2 de la solicitud instantanea. El numero de aminoacidos codificantes de esta lectina es 141 y se representan mediante ID de la SEC. 2. Las posiciones alteradas/modificadas se han resaltado en la secuencia.

Secuencia de protefnas de la lectina recombinante Rec 3 de la solicitud instantanea. El numero de aminoacidos codificantes de esta lectina es 141 y se representan mediante ID de la SEC. 3. Las posiciones alteradas/modificadas se han resaltado en la secuencia.

Alineacion de secuencia multiple de ID de la SEC. 1-3.

Figura 4: Una secuencia de ADN codificante de la lectina de la solicitud instantanea, ID de las SEC. 1.1 y 2.1. La longitud de la secuencia optimizada es — nucleotidos, que incluye los sitios de restriccion del extremo 5' Nde I (CATATG) y el extremo 3' BamHI (GGATCC). ID de la SEC.: 1.1; NOMBRE DEL GEN; UC-SS/CSR—1803 (Rec-2); ID de la SEC.: 2.1; NOMBRE DEL GEN: UC-SS/CSR-1805 (Rec-3)

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion revela genes clonados de dos nuevas variantes, designadas aquf como Rec-2 y Rec-3, en E. coli que estan mas proximos a la lectina S. rolfsii natural en la secuencia de aminoacidos, pero se diferencian en las cargas superficiales. Las cargas superficiales se alteraron deliberadamente para potenciar la mejor solubilidad y estabilidad de las protefnas en comparacion con la lectina natural. Dos genes de lectina codificantes de la lectina S. rolfsii con pocas alteraciones se sintetizan y expresan qufmicamente en E. coli. Las lectinas recombinantes se purifican mediante metodos cromatograficos convencionales y sedemuestra que tienen una masa molecular aproximada de 16000 Da. Las dos lectinas recombinantes descritas aquf son diferentes en la especificidad del grupo sangufneo, reconocen todos los grupos sangufneos humanos y tienen la capacidad exclusiva de reconocer el antfgeno TF y sus formas crfpticas. Las dos lectinas recombinantes no especfficas de grupos sangufneos se parecen mas a la lectina natural de S. rolfsii en la fijacion a los azucares, en la fijacion a las celulas y en aportar propiedades apoptoticas. Sin embargo, las lectinas recombinantes tienen unas mejores propiedades de estabilidad y solubilidad en comparacion con la lectina nativa, lo que las convierte en ideales para diversas aplicaciones.

Las diversas aplicaciones para el uso de las lectinas recombinantes pueden ser las siguientes:

Considerando la propiedad de las celulas cancerosas de fijacion a R1 y R2, se pueden utilizar como agentes de administracion de farmacos para el tratamiento del cancer y tambien pueden encontrar aplicacion como herramientas de diagnostico en la deteccion de patogenos microbianos/virales.

Estas lectinas recombinantes pueden utilizarse para la deteccion de determinadas glucoprotefnas y glucoconjugados presentes en los lfquidos biologicos.

Las lectinas presentan especificidad de sustrato hacia carbohidratos de la superficie celular asociados al cancer como el antfgeno TF desialilado y pueden tener aplicacion como matrices de afinidad para la purificacion de glucoprotefnas y glucoconjugados de significacion fisiologica y bioqufmica que se fijan a estas lectinas recombinantes.

Las lectinas recombinantes se pueden utilizar como socios de fusion para la purificacion de las lectinas recombinantes.

La invencion se revelarfa ahora por medio de la metodologfa y representaciones preferidas:

Construccion y clonacion del gen de lectina:

La secuencia de aminoacidos deriva del MALDI MS/MS y los datos de la cristalograffa de rayos X de la lectina purificada del hongo del suelo Sclerotium rolfsii formo la base de la construccion del gen. El gen correspondiente a esta secuencia ID de la SEC. 1 se sintetizo qufmicamente siguiendo los protocolos estandar. El gen ensamblado se introdujo primero en un vector pUC57. El inserto se libero mediante la digestion del plasmido con Ndel y BamHI y, a continuacion, se volvio a clonar en pET20b previamente digerido con Ndel y BamHI. Despues de que se utilizase la union del plasmido para transformar la cepa anfitriona E. coli DE3 (ORO) para la expresion. Los clones recombinantes se analizaron para la liberacion del inserto tras la digestion con Nde I y Bam HI. El analisis por SDS-PAGE de E. coli recombinante tras la induccion con IPTG mostro la protefna de ~16 kDa prevista.

Proliferacion celular

Una colonia individual de E. coli recombinante se inoculo en 5 ml de LB-Amp y se le permitio proliferar a 37 °C hasta el dfa siguiente, con agitacion. El cultivo de proliferacion hasta el dfa siguiente se inoculo en el medio de fermentacion y prolifero a 37 °C hasta que se alcanzo una DO de ~2,0; los cultivos se indujeron luego con 250 pM de IPTG (concentracion final) y proliferaron hasta el dfa siguiente a 20 °C.

Preparacion de extracto celular

Los cultivos proliferados hasta el dfa siguiente se centrifugaron a 8000 rpm durante 10 min y las celulas sedimentadas (4 gms) se suspendieron en 40 ml de 50 mM de Tris-HCl con pH 8,0 que contenfa 1 mM, PMSF e 1 mM EDTA. La suspension celular se homogeneizo con ultrasonidos durante 20 min utilizando el homogeneizador ultrasonico. Las celulas se centrifugaron a 12000 rpm, 10 min a 4 °C. El sobrenadante se utilizo para una purificacion adicional.

Purificacion de la protefna

Cromatograffa de dietilaminoetil (DEAE)-celulosa:

El sobrenadante (400 mg de protefna) en 50 mM de amortiguador Tris-HCl con pH 8,0 se cargo en la columna de 25 ml de dietilaminoetilo (DEAE) (BIORAD) equilibrada en 50 mM de amortiguador Tris-HCl con pH 8,0. La columna se lavo con 2 volumenes de columna de amortiguador seguidos por la elucion gradual de la columna con amortiguador b que contenfa 75 mM de NaCl y 200 mM de NaCl. Se realizo la elucion de la lectina con amortiguador que contenfa 300 mM de NaCl. Esta fraccion contenfa 216 mg de protefna.

Cromatograffa de polietilenimina (PEI):

La elucion de DEAE (216 mg) se cargo en la columna NUCLEOSIL 4000-7-PEI (250 * 10 mm), equilibrada con 50 mM de amortiguador Tris-acetato con pH 8,0. La protefna ligada se eluyo aplicando un gradiente lineal de NaCl del 0-100 % en 15 min a un caudal de 2 ml/min utilizando el sistema de cromatograffa lfquida rapida de protefnas (FPLC) y la protefna eluida al 98 % B (60 mg). La protefna eluida se dializo frente al agua y se repurifico en la misma columna de PEI utilizando amortiguador de bicarbonato de amonio.

La columna de PEI se equilibro con 20 mM de amortiguador de bicarbonato de amonio con pH 8,0 y la protefna se cargo en la columna. La protefna ligada se eluyo utilizando un gradiente amortiguador de 20-500 mM de amortiguador de bicarbonato de amonio. La protefna eluida (30 mg) se dializo frente al agua, se liofilizo y se almaceno a -20 °C.

Cromatograffa de filtracion en gel: La purificacion final de la protefna recombinante se logro mediante cromatograffa de filtracion en gel en Superdex G-75 equilibrado con 25 mM de solucion salina amortiguada con tris (TBS), pH 7,2 en el sistema de purificacion AKTA Prime plus.

La expresion de la protefna y la purificacion de la protefna se comprobaron en SDS PAGE al 15 % y los resultados se ofrecen aquf. Habfa una banda de protefna tenible azul de Coomassie importante correspondiente a un tamano molecular de 16 kDa.

EJEMPLOS

Estudios de solubilidad:

Las lectinas recombinantes purificadas se dializaron ampliamente frente al agua y se liofilizaron. Las muestras liofilizadas se suspendieron en amortiguadores de distinto pH, el contenido de protefna y la actividad de hemaglutinacion se determinaron en el sobrenadante transparente despues de la centrifugacion. Las actividades de solubilidad y hemaglutinacion se compararon con la lectina natural.

Estudios histoqufmicos:

La fijacion de las lectinas a secciones de tejido de casos confirmados de cancer epitelial de colon humano se realizo utilizando lectinas biotiniladas y la fijacion se observo mediante un microscopio de luz. Secciones de tejido se tineron de forma rutinaria utilizando hematoxilina y eosina y se llevaron a cabo estudios histoqufmicos de la lectina mediante protocolos estandar utilizando secciones de tejido de 5 pm de tejidos cancerosos. Se obtuvieron secciones de tejidos de cancer de colon de un grosor de 5 pm cada una, que se utilizaron para estudios histoqufmicos, por medio de un microtomo giratorio semiautomatico (Leica RM 2145) y se desparafinaron calentandolas en un calentador de portaobjetos a 60 °C durante 1 h. Las secciones de tejido se rehidrataron manteniendolas en dos cambios de xileno durante cinco minutos en cada caso, y luego se transfirieron a alcohol puro y a alcohol al 95 % durante tres minutos en cada caso. Como procedimiento de rutina para confirmar el estado de los tejidos en condicion normal o cancerosa, las secciones de tejido se tineron con tinciones de hematoxilina y eosina (H y E). Las secciones de tejido, despues de la rehidratacion, se trataron con una tincion de hematoxilina basofila durante 20-25 min, seguida por una inmersion en acido-alcohol de 1 % de HCl y las secciones de tejido se lavaron suavemente bajo agua corriente del grifo. A continuacion, se realizo la contratincion de las secciones con eosina durante 2 minutos, se lavaron con agua, se secaron y se sumergieron en xileno y se montaron en DPX (Distrene 80, dibutilftalato xileno), un medio de montaje permanente no acuoso, y se observaron utilizando un microscopio de luz (Carl Zeiss Jenalumar) y se fotografiaron.

Se llevo a cabo una tincion histoqufmica, utilizando lectinas biotiniladas, tal comodescribieron Danguy y Gabius, en Gabius and Gabius (1993). Todos los reactivos se equilibraron a temperatura ambiente antes de la tincion. En ningun momento se permitio que las secciones de tejido se secasen durante el procedimiento de tincion. El estudio tambien incluyo portaobjetos de control preparados mediante la exclusion de la lectina biotinilada. Para bloquear la actividad de la peroxidasa endogena, despues de la rehidratacion, las secciones de tejido se incubaron con metanol que contenfa un 0,3 % de peroxido de hidrogeno durante 30 minutos a temperatura ambiente. Luego, las secciones se enjuagaron con agua durante 5 minutos y, a continuacion, con TBST (pH 7,2) durante 5 minutos. Despues de que las secciones de tejido se enjuagaran con amortiguador fosfato salino (PBS) con pH 7,2, las secciones se incubaron con un 1 % de albumina serica bovina (BSA) tratada con peryodato en 0,1 M de solucion de PBS durante 15 min para bloquear los sitios de fijacion inespecfficos mediante la BSA. Las secciones se enjuagaron a continuacion con TBST durante 5 min. Las lectinas biotiniladas (20 pg/ml en PBS) se aplicaron cuidadosamente para cubrir por completo las secciones y se incubaron durante 1 h, de forma que se facilitase la fijacion completa. Las secciones se enjuagaron despues con TBST, durante 5 minutos. Estas secciones de tejido se incubaron a continuacion con estreptavidina-HRP (dilucion 1^1000) en PBS, con pH 7,2, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones se enjuagaron luego con dos cambios de TBST, con pH 7,2, durante 5 minutos. Despues de la conjugacion estreptavidina-HRP, las secciones de tejido se desarrollaron en cromogeno DAB (diaminobenzidina)/sustrato de H2O2 en solucion amortiguada (pH 7,5), que se preparo de acuerdo con las directrices de los fabricantes. Las secciones de tejido se incubaron durante 10 minutos y, a continuacion, se enjuagaron suavemente con agua durante 5 minutos. Se permitio que los portaobjetos se secasen y se sumergieron en xileno y se montaron en DPX. Las secciones se examinaron luego bajo un microscopio de luz (Carl Zeiss Jenalumar) para observar y estudiar los patrones de intensidad de la tincion en los tejidos normales y cancerosos y se fotografiaron.

Identificacion de antfgenos de la superficie celular:

Identificacion de los neoglicanos expresados en linfocitos activados y transformadosen comparacion con los linfocitos normales mediante la lectina recombinante;

Para identificar las neoglucoprotefnas expresadas en los linfocitos tras la activacion mediante la PHA y celulas transformadas, se llevaron a cabo estudios de interaccion con las respectivas protefnas de la membrana celular con lectina biotinilada.

Aislamiento de las protefnas de la membrana celular:

Los linfocitos perifericos humanos se prepararon a partir de la sangre extrafda a un donante sano. La muestra de sangre (20 ml) recogida en un tubo de vidrio de centrifugadora con contenido de EDTA (concentracion final de 12,5 mM) y los linfocitos normales se separaron mediante centrifugacion con un gradiente de Ficoll-Hypaque (Pharmacia). Una parte de los linfocitos normales se activo mediante incubacion con PHA (2,5 pg/ml de PHA) en medio RPMI-1640 suplementado con un 10 % de suero fetal de ternero (FCS) durante 72 horas en una estufa de incubacion de CO². Las celulas activadas se obtuvieron mediante centrifugacion y la activacion se confirmo comprobando la expresion de los receptores CD25.

Linfocitos normales, linfocitos activados y estirpes celulares leucemicas; Molt-4 y Jurkat se mantuvieron finalmente en un medio de cultivo RPMI 1640, suplementado con glutamina (2 mM), FCS inactivado con calor (10 %), penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 pg/ml). Los cultivos se mantuvieron a 37 °C en una atmosfera humidificada (95 % aire y 5 % CO²). Las protefnas de la membrana de estas celulas cultivadas se aislaron utilizando el metodo del “Kit de extraccion de protefnas de membrana Pierce” (Mem-PER, n.° prod. 89826) y los contenidos de protefna se estimaron utilizando el Kit de estimacion de protefnas DC de Bio-Rad. Las protefnas de membrana aisladas se concentraron finalmente mediante precipitacion de cloroformo-metanol y las protefnas precipitadas se secaron al aire y se almacenaron a 4 °C hasta su uso posterior.

Electroforesis e inmunoelectrotransferencia (western blotting):

La electroforesis en gel de poliacrilamida se realizo en presencia de SDS utilizando un sistema de minigel (Hoefer Scientific Instruments, EE. UU.) en gel al 10 % durante 60 min a 120 voltios. Las protefnas se transfirieron de geles de poliacrilamida a membranas de nitrocelulosa en un equipo de transferencia semiseca utilizando un amortiguador de transferencia (240 mM de glicina, 25 mM de tris, 0,1 % SDS) que contiene un 20 % de metanol a 75 mA durante 3 h a 4 °C. Las membranas se saturaron despues de la transferencia con solucion de bloqueo (3 % p-BSA) y se lavaron con TBST. La fijacion de la lectina se llevo a cabo a temperatura ambiente durante 4 horas con lectina acoplada a biotina a la concentracion final de 20 pg/ml (preparada en TBST). Despues de un lavado a fondo, la transferencia se incuba con estreptavidina-HRP (1:1000 en TBST) a temperatura ambiente durante 1 h y el exceso de estreptavidina-HRP se lavo con TBST. Por ultimo, las bandas de lectina-glucoprotefnas se visualizaron mediante desarrollo con un sistema cromogenico DAB.

Los resultados de estos hallazgos indican que la presente lectina recombinante tiene la capacidad de fijarse a algunos de los neoglucanos expresados exclusivamente en las celulas leucemicas y tambien en linfocitos activados.

SDS PAGE y transferencia de lectina

Las protefnas de muestras de lfquido de quistes ovaricos se separaron mediante SDS PAGE en geles al 10 % tal como describen Laemmli et al. utilizando Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, EE. UU. La electroforesis se realizo durante 70 min. utilizando 110 voltios. Inmediatamente despues de la electroforesis, bandas de protefnas fraccionadas se resolvieron transfiriendolas a una membrana de nitrocelulosa utilizando una unidad de transferencia semiseca. La membrana transferida se lavo con agua destilada y se realizo su tincion con reactivo Ponceau para confirmar la eficiencia de la transferencia y marcar la ubicacion de las protefnas estandares. Por ultimo, la transferencia se lavo con TBS con un contenido de 0,1 % de Tween-20 (TBST) y se trato con un 3 % de P-BSA en TBST hasta el dfa siguiente para evitar una fijacion inespecffica. Despues del lavado con TBST, la transferencia se incubo con lectinas biotiniladas (20 pg/ml en TBST) a 37 °C durante 4-6 horas. El exceso de lectina y la lectina no ligada se eliminaron lavando la membrana con TBST y, a continuacion, las membranas se incubaron con estreptavidina-HRP (1 pg/ml en TBST) durante una hora. La estreptavidina-HRP sin ligar se eliminomediante un lavado con TBST. Las glucoprotefnas de fijacion a la lectina se visualizaron mediante la tincion de la actividad de la peroxidasa utilizando el sistema DAB.

Actividad proliferativa y antiproliferativa de PBMC y celulas leucemicas y de cancer de colon cultivadas La actividad proliferativa/antiproliferativa de la SRL en las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC) humana se determino mediante un ensayo de incorporacion de timidina tritiada, usando PBMC humanas recien aisladas, tal como describen Wang et al., [1992] con algunas modificaciones. Las PBMC se aislaron de muestras de sangre recien extrafdas de donantes sanos y las celulas se mantuvieron en un medio completo RPMI 1640, tal como se describio previamente. Las celulas se diluyeron con un medio RPMI con un contenido de 10 % de FCS y, a continuacion, se sembraron (1 * 105 celulas/50 |jl/pocillo) en microplacas de 96 pocillos (NUNC Dinamarca). Diversas concentraciones (10, 5, 2,5, 1,25 y 0,625 jg/ml) de SRL en un medio RPMI 1640 se anadieron a cada pocillo en un volumen final de 100 j l y se incubaron a 37 °C en una atmosfera de CO2 al 5 % humidificada durante 72 h. Dieciocho horas antes del perfodo de incubacion total, se anadio 1 jC i de timidina tritiada a cada pocillo en un volumen final de 10 j l y la incubacion continuo durante otras 18 h. Por ultimo, las celulas se obtuvieron en un papel de filtro de vidrio (Amersham Biosciences) utilizando un recolectador celular (NUNC, Dinamarca), se lavaron a fondo con agua destilada y se secaron en un microhorno. Los discos de filtro se transfirieron a viales de centelleo (Tarsons, India) con contenido de 600 j l de mezcla de centelleo a base de tolueno. Por ultimo, la timidina tritiada incorporada se midio mediante un contador de centelleo p (Packard Bioscience Ltd.) como recuentos por minuto (CPM). Para confirmar la actividad proliferativa mediada por los receptores de lectinas, los ensayos se realizaron utilizando una SRL preincubada con mucina. La SRL (10 jg/ml) se preincubo con mucina (12,5 jg en 100 jl) durante 1 h a 37 °C y se utilizo para un ensayo de proliferacion celular. Se incluyeron controles adecuados con contenido de celulas sin lectina y celulas solo con mucina. Los resultados son representativos de los tres experimentos independientes realizados por triplicado.

El efecto proliferativo/antiproliferativo de SRL en la estirpe celular leucemica Molt-4 se determino mediante un ensayo de incorporacion de timidina tritiada, tal como se describio anteriormente. El efecto proliferativo/antiproliferativo de SRL en la estirpe celular leucemica Molt-4 se determino mediante un ensayo de incorporacion de timidina tritiada, tal como se describio anteriormente. Se sembraron celulas (1 * 105/pocillo) en una placa de cultivo tisular de 96 pocillos y se permitio su aclimatacion durante 3 h antes del tratamiento con lectina. Se anadieron concentraciones en serie de SRL de 6,25 jg/ml a 100 jg/ml en 50 j l de medio RPMI a cada pocillo y se incubaron durante 72 h. Todos los demas pasos del ensayo se mantuvieron igual, tal como se describio anteriormente. Para el ensayo de bloqueo de la lectina, la SRL (100 jg/ml) se preincubo con 12,5 jg de mucina en un volumen total de 100 j l durante 1 h a 37 °C y se utilizo para el ensayo.

Secuencias recombinantes

Las secuencias de genes y las protefnas tienen la siguiente actividad biologica: reconocer todo los grupos sangufneos humanos y tener la capacidad exclusiva de reconocer el antfgeno TF y sus formas crfpticas, parecerse a la lectina natural de S. rolfsii en la fijacion a los azucares, en la fijacion celular y en aportar propiedades apoptoticas, tener mejores propiedades de estabilidad y solubilidad en comparacion con la lectina natural esta dentro del ambito de la aplicacion. Las moleculas de nucleotidos que codifican las moleculas recombinantes pueden ser ADN o ARN. Las protefnas de las caracterfsticas mencionadas anteriormente, obtenidas mediante mutaciones deliberadas o aleatorias, estan cubiertas dentro del concepto de la solicitud instantanea.

La fijacion de las lectinas recombinantes a diferentes celulas cultivadas se presenta en la tabla 1.

Tabla 1. Fijacion de las lectinas recombinantes a celulas leucemicas (Molt 4 y Jurkat), ovaricas (PA 1) y de colon (COLO 205) cultivadas y la inhibicion de la fijacion por la mucina

En cada caso, la fijacion de R2 y R3 con Molt 4, Jurkat (celulas leucemicas), PA-1 (celulas ovaricas) y COLO 205 (celulas de colon) es superior al 90 % y la fijacion se puede abolir mediante la mucina.

Como otra manifestacion, se revela el efecto inmunomodulador sobre estas celulas cultivadas. Tanto R2 como R3 ejercen una actividad antiproliferativa sobre las celulas cultivadas, maximo efecto (60 %) sobre las celulas leucemicas en comparacion con las celulas ovaricas (50 %) y las celulas de colon (40 %). Su efecto modulador de la proliferacion puede tener una posible aplicacion en el tratamiento del cancer (tabla 2).

Tabla 2. Actividad antiproliferativa de las lectinas recombinantes en las celulas cultivadas mediante el ensayo MTT

En una de las manifestaciones preferidas, la protefna lectina expresada (ID de las SEC. 2 y 3) difiere de la protefna lectina natural en terminos de, al menos, una modificacion/sustitucion de aminoacidos en las posiciones. De estas, los cambios de posiciones se indican en la Tabla 3

Tabla 3. Posiciones de aminoacidos cambiadas para Rec 2 y Rec 3 en comparacion con la secuencia de la lectina natural

Las secuencias de lectina recombinantes se pueden biotinilar o se les puede adherir un cromoforo fluorogenico utilizando los metodos conocidos habitualmente para usarse en la deteccion de las celulas cancerosas o antfgenos especfficos asociados al cancer. El efecto modulador de la proliferacion de la lectina recombinante encuentra su aplicacion en el tratamiento antineoplasico. Ademas, el uso de la lectina recombinante como agente de administracion de farmacos para el tratamiento del cancer se contempla en la presente solicitud.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una protefna lectina incluye una secuencia de aminoacidos de ID de la SEC. 2 o 3, que tiene mejores propiedades de solubilidad y estabilidad en comparacion con una protefna lectina de ID de la SEC. 1.

2. La protefna lectina de la aseveracion 1, tiene un peso molecular de aproximadamente 16,1 kDa y un valor de PI de 6,614.

3. La protefna lectina de las aseveraciones 1 o 2 esta pensada para usarse en el tratamiento antineoplasico.

4. Utilizacion de una protefna lectina de las aseveraciones 1 o 2 en la deteccion in vitro de las celulas cancerosas.

5. Una molecula de acidos nucleicos que codifica una protefna lectina definida en las aseveraciones 1 o 2 es ADN o ARN.

6. Una molecula de acidos nucleicos, tal como se define en la aseveracion 5, es ADN de la ID de la SEC. 1.1 o 2.1.

7. Un vector recombinante que incluye, ligados operativamente en direccion 5' a 3': un promotor que funciona en una celula anfitriona; una secuencia de acidos nucleicos estructurales, tal como se define en las aseveraciones 5 o 6, en la que dicha secuencia de acidos nucleicos codifica una protefna lectina; y una senal de terminacion.

8. Un vector recombinante de la aseveracion 7 es capaz de replicarse, transcribirse, transferirse y expresarse en un organismo unicelular.

9. Un celula anfitriona transformada contiene el vector, tal como se afirma en la aseveracion 7 u 8.

10. La celula anfitriona transformada de la aseveracion 9 es una celula de bacteria Escherichia coli o una celula de hongo levaduriforme

11. El proceso para producir una protefna lectina de Sclerotium rolfsii recombinante incluye:

• cultivo de una celula anfitriona que contiene el vector recombinante, tal como se define en las aseveraciones 7 o 8 codificando la protefna lectina;

• expresion de la protefna lectina recombinante; y

• aislamiento de dicha protefna lectina procedente del cultivo.