ES2711814T3 - Método para el diagnóstico de carcinoma endometrial - Google Patents

Abstract

Un método asistido por computadora para el diagnóstico de carcinoma endometrial basado en el análisis metabolómico de la sangre, dicho método que comprende las siguientes fases: (I) una fase de capacitación que comprende: - análisis de GCMS o GCxGCMS de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y controles sanos; - integración de los resultados obtenidos por un análisis multivariante mediante el uso de al menos un modelo de análisis discriminante o un modelo de aprendizaje por computadora para capacitar al menos un modelo de clasificación; (II) una fase de asignación que comprende el análisis de GCMS o GCxGCMS de una muestra de sangre desconocida y su asignación a una clase de pertinencia sobre la base del modelo de clasificación formulado en la fase de capacitación (I).

Description

DESCRIPCION

Metodo para el diagnostico de carcinoma endometrial

La presente invencion se refiere a un metodo para el diagnostico de carcinoma endometrial basado en el analisis metabolomico de la sangre y la manipulacion bioinformatica de los perfiles metabolicos a traves de modelos de clasificacion.

El carcinoma endometrial es el cancer invasivo mas comun del tracto genital femenino y es el responsable del 7 % de todos los tumores invasivos en las mujeres (excluyendo los tumores cutaneos).

El carcinoma endometrial es raro en mujeres que tienen menos de 40 anos. El pico de incidencia es entre 55 y 65 anos. Los estudios clmico-patologicos y el analisis molecular apoyan la clasificacion del carcinoma endometrial en dos amplias categonas: Tipo I y Tipo II.

El tipo I es el mas frecuente, con un porcentaje de casos superior al 80 %, este invade las glandulas endometriales proliferativas y se define con el termino carcinoma endometrioide. En general, surge en un marco de hiperplasia endometrial y, como este, se asocia con obesidad, diabetes, hipertension, infertilidad y estimulacion estrogenica sin oposicion. Estudios recientes proporcionan evidencia adicional que apoya la tesis de que la hiperplasia endometrial es un precursor del carcinoma endometrial (Muller GL y otros. Allelotype mapping of unstable microsatellites establishes direct lineage continuity between endometrial precancers and cancers. Cancers Res 56:4483, 1996). El carcinoma endometrial tipo II generalmente afecta a las mujeres diez anos mas tarde que el carcinoma endometrial tipo I (65-75 anos) y, a diferencia del tipo I, se desarrolla principalmente en un marco de atrofia endometrial. El tipo II representa menos del 15 % de los casos de carcinoma endometrial y se diferencia escasamente (G3). El subtipo mas comun es el seroso, que se define asf debido a la superposicion biologica y morfologica con el carcinoma de ovario. Los subtipos histologicos menos comunes tambien pertenecen a esta categona: el carcinoma de celulas claras y el tumor Mulleriano mixto maligno.

Por el momento, no es factible realizar una deteccion masiva en una poblacion asintomatica en edad perimenopausica y postmenopausica para el diagnostico precoz del carcinoma endometrial, tal como se realiza para el carcinoma cervical a traves de la prueba de Papanicolaou.

Los estudios realizados en una muestra exocervical demuestran una frecuencia de falsos negativos de aproximadamente 40-50 % desde que las celulas exfoliadas endometriales, que han sufrido la accion del entorno vaginal, presentan alteraciones y, por lo tanto, pierden las caractensticas que permiten la diferenciacion de la celula tumoral a partir de la celula normal. Ademas, el pronostico se relaciona estrictamente con el diagnostico temprano, de hecho, la supervivencia despues de 5 anos disminuye drasticamente del 78-98 % en caso de diagnostico en la etapa I hasta el 3-10 % en caso de diagnostico en la etapa IV.

Hasta la fecha, se han identificado varios miles de metabolitos del suero humano y la aplicacion de la metabolomica ha permitido el desarrollo de biomarcadores para muchas enfermedades como la esquizofrenia (Kaddurah-Daouk R., Metabolic profiling of patients with schizophrenia, PLOS Med 2006; 8:e363), la meningitis (Subramanian A. y otros, Proton MR/CSF analysis and a new software as predictors for the differentiation of meningitis in children, NMR Biomed 2005; 18:213-25) y el cancer de colon (Denkert C. y otros, Metabolite profiling of human colon carcinoma - deregulation of TCA cycle and amino acid turnover, Mol. Cancer 2008; 7:1-15). Sin embargo, el uso de la metabolomica en el campo ginecologico se ha limitado hasta ahora a estudios relacionados al carcinoma de ovario (Fan L. y otros. Identification of metabolic biomarkers to diagnose epithelial ovarian cancer using a UPLC/QTOF/MS platform Acta Oncologica, 2012; 51:473-479). Hasta la fecha, no hay estudios publicados en la literatura realizados en cromatograffa de gases acoplada a espectrometna de masas y con tecnicas quimiometricas para el diagnostico del carcinoma endometrial.

Por lo tanto, es muy necesario un sistema de diagnostico no invasivo que permita realizar una deteccion en la poblacion con riesgo de edad o de factores de riesgo conocidos, para identificar de manera temprana esta temible neoplasia femenina.

Ventajosamente, la presente invencion resuelve los problemas mencionados anteriormente mediante un metodo no invasivo para el diagnostico del carcinoma endometrial. Hasta hoy, no hay otros metodos de diagnostico no invasivos que permitan una distincion histologica de este tipo de tumor.

El objeto de la invencion se explicara de aqrn en adelante en detalle.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra el resultado del analisis OPLS-DA basado en datos del perfil metabolomico de los pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos.

Las graficas de puntuacion discriminan entre las dos clases sin superposiciones. Los triangulos representan a los pacientes afectados por carcinoma endometrial, mientras que los anillos pequenos a los pacientes sanos. Los principales componentes PC1 y PC2 reportados en los ejes respectivamente describen el 16,5 % y el 14,9 % de la varianza global.

La Figura 2 muestra, de acuerdo con la invencion, la clasificacion histologica (carcinoma de tipo I versus carcinoma de tipo II) obtenida con el modelo PLS-DA. Las manchas representan los perfiles metabolomicos de mujeres con carcinoma endometrial de tipo I, mientras que los triangulos a los de los pacientes con carcinoma endometrial de tipo II. El modelo coloca solo una de estas muestras en un area que no es atribuible umvocamente al area correcta.

Definiciones

El termino "metabolomica", se refiere al analisis de los procesos celulares mediante el estudio del perfil metabolomico de moleculas pequenas de un organismo.

Con el termino "analisis metabolomico", los inventores se refieren a la realizacion de un proceso dirigido a la identificacion y la determinacion de la concentracion del mayor numero posible de metabolitos en una muestra biologica.

El termino "metabolitos" se refiere a las pequenas moleculas derivadas de los procesos biologicos de tipo anabolico o catabolico de una celula o de un conjunto de celulas. Con el termino "metabolitos", los inventores se refieren a todas las moleculas que tienen un peso molecular inferior a 1000 Dalton, que son potencialmente identificables y medibles dentro de una muestra biologica.

El termino "perfil metabolomico" se refiere el patron espedfico que los metabolitos tienen en la sangre del paciente en dependencia de sus proporciones relativas.

El PLS-DA (Analisis Discriminante de Mmimos Cuadrados Parciales) es un metodo supervisado que usa tecnicas de regresion multivariante para extraer a traves de combinaciones lineales de las variables originales (X), la informacion que puede predecir la pertinencia de una determinada clase (Y). Para evaluar la efectividad en la discriminacion de las clases, se realiza una prueba de permutacion. En cada permutacion, se construye un modelo PLS-DA a partir de los datos (X) y las etiquetas de clase conmutadas (Y) mediante el uso de los numeros optimos de los componentes determinados por validacion cruzada para el modelo basado en la asignacion de las clases originales. Se realizan dos tipos de pruebas estadfsticas para medir el poder de discriminacion entre las clases. La primera se basa en la precision de la prediccion en la fase de capacitacion del modelo. La segunda se basa en la distancia de separacion de acuerdo con la relacion entre la suma de las distancias cuadraticas dentro de las clases y entre las clases (relacion B/W).

El OPLS-DA (Analisis Discriminante de Mmimos Cuadrados Parciales Ortogonales) es un desarrollo importante de la tecnica PLS-DA que se ha propuesto para administrar de forma ortogonal la variacion de las clases en la matriz de datos.

OPLS-DA aumenta el desempeno de clasificacion de los modelos PLS-DA. Los desempenos de clasificacion se estiman sobre la base de la "validacion cruzada de k-iteraciones" al dividir la matriz de datos en subconjuntos k aleatorios. Para cada ciclo de calculo, uno de los subconjuntos de F se mantiene aparte como un conjunto de prueba y los subconjuntos k-1 restantes actuan como capacitadores. Cada uno de los subconjuntos K se usan una vez como un conjunto de prueba, generando Kvalores de precision. La precision de la clasificacion se calcula como el promedio de lastasas de precision en subconjuntos k. El modelo se somete a una validacion cruzada con el metodo "validacion cruzada dejando uno fuera" (LOOCV) para validarse. La matriz de datos se escala segun la media y la varianza unitaria, antes de enviarse a la division en subconjuntos k. En otras palabras, el promedio y la desviacion estandar de los datos de capacitacion se usan para indicar el centro y para escalar los datos de prueba. Una vez capacitado, el modelo se usa para verificar si los datos han generado un "sobreajuste". Para hacer esto, se genera un conjunto de validacion con etiquetas de clase conocidas y, por lo tanto, se verifica si proporciona una tasa de precision comparable a la de los datos de capacitacion. Otro metodo es una validacion de la lmea R2/Q2 lo que ayuda a evaluar el riesgo de que el modelo actual sea falso, es decir, el modelo se ajusta bien solo a los conjuntos de subconjuntos, pero no predice Y tan bien para las nuevas observaciones. El valor de R2 es la variacion porcentual del conjunto de capacitacion que puede explicarse por el modelo.

El valor de Q2 es una medida de la validacion cruzada de R2. Esta validacion compara la bondad del ajuste del modelo original con la bondad del ajuste de diferentes modelos en funcion de los datos en los que el orden de observaciones Y se permuta aleatoriamente, mientras que la matriz se mantiene intacta. Los criterios para la validez del modelo son los siguientes:

1. Todos los valores Q2 en el conjunto de datos permutados deben ser inferiores al valor Q2, estimado en el conjunto de datos actual. Si esto no esta verificado, significa que el modelo esta sobre ajustado.

2. La lmea de regresion (la lmea que une el punto real Q2 al centroide del grupo de Q2 valores permutados) tiene un valor negativo de la interseccion del eje y.

Las Maquinas de Vectores de Soporte (SVM) son tecnicas supervisadas de aprendizaje automatico relativamente nuevas para usos de clasificacion. Las SVM fueron propuestas por primera vez en 1982 por Vapnik (Vapnik, V. Estimation of Dependences Based on Empirical Data; Springer Verlag: New York, 1982). El principio basico de las SVM, que son esencialmente clasificadores binarios, es el siguiente: dado un conjunto de datos con dos clases, se construye un clasificador lineal en forma de un hiperplano, que tiene el margen maximo en la minimization simultanea del error de clasificacion empmco y la maximization del margen geometrico. En el caso de conjuntos de datos que no son separables linealmente, los datos originales se asignan a un espacio de caracteristicas de mayor dimension y se construye un clasificador lineal en este nuevo espacio (esto se conoce como "kernel"). Considerando un conjunto de datos de capacitacion

donde cada uno de xi cae en una de las dos categorias yiG{1,1}, SVM determina el hiperplano cuyos parametros se dan por (w, b) segun lo obtenido por la solution del siguiente problema de optimization convexa:

sujeto a las siguientes condiciones:

en donde c es el parametro de regularization, que es un compromiso entre la precision del aprendizaje y el termino prediction, y £ es una medida del numero de errores de clasificacion. La inclusion del termino regularizacion reduce el problema de sobreajuste.

Arboles de decision.

Los arboles de decision construyen modelos de clasificacion basados en la division recursiva de los datos. Tipicamente, un algoritmo del arbol de decision comienza con el conjunto completo de datos, los datos se dividen en dos o mas subgrupos en funcion de los valores de uno o mas atributos, y despues cada subconjunto se divide repetidamente en subconjuntos mas pequenos hasta que el tamano de cada subconjunto alcanza un nivel apropiado. Todo el proceso de modelado puede representarse en una estructura de arbol, y el modelo generado puede resumirse como un conjunto de reglas "si-entonces". Los arboles de decision son faciles de interpretar, poco exigentes desde el punto de vista computacional y capaces de hacerfrente a datos ruidosos. La mayoria de los arboles de decision abordan los problemas de clasificacion, como por ejemplo el objeto de esta invention. En este contexto, la tecnica tambien se conoce como arbol de clasificacion. En la representation con la estructura de arbol, un nudo representa un conjunto de datos, y todo el conjunto de datos se representa como un nudo en la raiz.

El documento JP2007057309 describe un metodo asistido porcomputadora para el diagnostico de carcinoma endometrial basado en un analisis proteomico de la sangre.

KARKKAINEN J Y OTROS, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER AND CLINICAL ONCOLOGY, vol. 26, num. 9, 1990, paginas 975-977describe un analisis de GC-MS de medicamentos administrados (por ejemplo, MPA) en la sangre de pacientes con carcinoma endometrial para el monitoreo del tratamiento.

El documento WO 2011/161186 describe el diagnostico de sepsis y menciona una variedad de tipos espetificos de analisis multivariante o metodos de algoritmo de clasificacion.

CAO Q JACKIE Y OTROS, International Journal of Gynecological Pathology 23(4), paginas 321-329 describe los perfiles de expresion genica por microarreglo de ADNc en carcinomas endometrioides y serosos del endometrio.

El documento JP 2007 147459 describe el ribitol como un estandar interno.

PETER PODOLEC Y OTROS, JOURNAL OF CHROMATOGRAPHY B: BIOMEDICAL SCIENCES & APPLICATIONS., vol. 967, 2014, paginas 134-138, describe el analisis GC-MS/MS de los metabolitos de Trypanosoma brucei.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a un metodo asistido por computadora para el diagnostico del carcinoma endometrial, basado en el analisis metabolomico de la sangre y en una integracion de los resultados obtenidos atraves de un analisis multivariante mediante el uso de modelos de analisis discrim inate que se seleccionan en el grupo que consiste en PLS-DA y OPLS-DA, o modelos de aprendizaje por computadora que se seleccionan en el grupo que consiste en SVM y arbol de decision.

El objeto de la presente invencion es un metodo para el diagnostico del carcinoma endometrial basado en el analisis metabolomico de la sangre, dicho metodo comprende las siguientes fases:

(I) una fase de capacitacion que comprende:

- analisis de GCMS o GCxGCMS de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y controles sanos;

- integracion de los resultados obtenidos por analisis multivariante mediante el uso de al menos un modelo de analisis discriminante o un modelo de aprendizaje por computadora para capacitar al menos un modelo de clasificacion;

(II) una fase de asignacion que comprende el analisis de GCMS o GCxGCMS de una muestra de sangre desconocida y su asignacion a una clase sobre la base del modelo de clasificacion formulado en la fase de capacitacion (I).

El analisis multivariante, que se realiza en los cromatogramas recolectados mediante el uso de:

- al menos un modelo de analisis discriminante que se selecciona del grupo que consiste en: PLS-DA y OPLS-DA, o - dicho modelo de aprendizaje por computadora que se selecciona del grupo que consiste en: SVM y arbol de decision; permite ventajosamente la clasificacion dicotomica satisfactoria ("Paciente sano" versus "Paciente afectado por carcinoma endometrial") de muestras desconocidas. El modelo de clasificacion obtenido con un analisis multivariante PLS-DA incluso ha permitido la discriminacion histologica del carcinoma (carcinoma de tipo I versus carcinoma de tipo II). Hasta la fecha, no hay otros metodos de diagnostico no invasivos que puedan permitir una discriminacion histologica de este tipo de tumor.

En dicha fase de capacitacion (I) se analizan las muestras derivadas de pacientes afectados por carcinoma endometrial y de mujeres sanas con caractensticas ffsicas (IMC, edad, comorbilidad) y sociales (nivel de educacion, condicion socio­ economica) similares, y de esta manera se capacitan los modelos de clasificacion. Esta fase de capacitacion tiene como objetivo crear y delimitar las caractensticas del perfil metabolico presente en la sangre de los dos grupos. Para tener una buena prediccion del modelo de clasificacion, es necesario someter a un analisis multivariante un numero de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos igual a al menos el 80 % del numero de las variables identificadas de los perfiles metabolicos, tales muestras que pertenezcan al menos a 2 clases diferentes. En tal fase de asignacion (II), las muestras desconocidas se someten a analisis de GCMS, y los cromatogramas resultantes se clasifican de acuerdo con los modelos previamente capacitados, estimando la clase de pertinencia mas probable.

El metodo de diagnostico del carcinoma endometrial de la presente invencion no se basa en la medicion de la concentracion de cada metabolito, sino que todo el grupo de metabolitos se considera como biomarcador (perfil metabolico), que, por estar presente de acuerdo con diferentes proporciones en los 2 grupos, permiten la insercion en dos clases diferentes de pertinencia.

Preferentemente, dicha fase de capacitacion (I) comprende ademas las siguientes subfases:

- extraccion y derivatizacion de metabolitos de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos;

- analisis de GCMS o GCxGCMS de los metabolitos extrafdos y derivatizados para obtener un cromatograma para cada muestra, cada cromatograma es un perfil metabolico;

- creacion de la matriz de datos de los perfiles metabolicos de pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos; - estructuracion de al menos un modelo de clasificacion como un resultado del analisis multivariante de la matriz de datos; en donde dicho analisis multivariante se realiza mediante el uso de al menos un modelo de analisis discriminante o un modelo de aprendizaje por computadora para capacitar al menos un modelo de clasificacion.

Se pueden usar diferentes modelos de clasificacion de acuerdo con la presente invencion; preferentemente dichos modelos de clasificacion se seleccionan del grupo que consiste en: PLS-DA, OPLS-DA, SVM y Arbol de decision.

Preferentemente, dicha fase de asignacion (II) comprende ademas las siguientes subfases:

- extraccion y derivatizacion de metabolites de al menos una muestra de sangre desconocida;

- analisis de GCMS o GCxGCMS de los metabolites extrafdos y derivatizados para obtener al menos un cromatograma para la muestra de sangre desconocida;

- creacion del perfil metabolico a partir de dicho cromatograma de la muestra de sangre desconocida;

- asignacion del perfil metabolico a una clase sobre la base del modelo de clasificacion capacitado en la fase (I).

Preferentemente, el metodo de la presente invencion contempla un modelo de clasificacion capacitado para una clasificacion dicotomica "Paciente sano" o "Paciente afectado por carcinoma endometrial". Incluso mas preferentemente, dicho modelo de clasificacion tambien se capacita para una clasificacion histologica del cancer "tipo I" o "tipo II".

Preferentemente, dicha extraccion se realiza mediante el uso de una mezcla de extraccion que consiste en una mezcla acuosa de un alcohol y de un disolvente polar aprotico, preferentemente CH3OH/H2O/CHCl3, incluso mas preferentemente con una relacion de volumen 2-3/0,5-0,5/0,5-1.

En una modalidad preferida, dicha subfase de extraccion y derivatizacion comprende:

i) agitacion de la muestra obtenida de la adicion de una mezcla de extraccion;

ii) centrifugacion de la muestra obtenida en i);

iii) derivatizacion del sobrenadante obtenido de ii) por tratamiento con clorhidrato de metoxiamina en piridina;

iv) silanizacion del sobrenadante de la muestra obtenida en iii) con un agente de silanizacion que se selecciona del grupo que consiste en: N,O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida (MSTFA), hexametil disilazano (HMDS), 1 -(trimetilsilil) imidazol (TMSI), N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (m Tb STFA), 1 -(terc-butildimetilsilil) imidazol (TBDMSIM) en presencia opcional de trimeticlorosilano (TMCS).

Preferentemente, dicha extraccion de metabolitos se realiza despues de anadir a la muestra una alteuota conocida de un compuesto de referencia; preferentemente dicho compuesto de referencia es ribitol.

Para obtener la separacion de metabolitos utiles para los fines de la presente invencion, es posible trabajar tanto con cromatograffa de gases monodimensional como con cromatograffa de gases bidimensional; se prefiere la cromatograffa de gases bidimensional, ya que el mejor poder de resolucion de la tecnica ofrece una mejor precision de clasificacion. De todos modos, como se muestra en los EJEMPLOS, tambien es posible trabajar con la cromatograffa de gases monodimensional mas comun.

Los cromatogramas de gases obtenidos, preferentemente en modo SCAN, se integran para identificar todos los picos que tienen un area mayor que 10 veces el ruido de fondo de la senal del cromatograma.

Mediante el uso del pico del compuesto de referencia (preferentemente ribitol) como una referencia, tanto para el analisis cuantitativo como para centrar los tiempos de retencion, cada pico se identifica sobre la base de una senal m/z de cuantificacion y al menos 2 senales m/z de calificacion. Despues de la integracion se realiza la cuantificacion con el metodo de areas de porcentajes normalizados. Los resultados obtenidos de esta cuantificacion (areas de porcentajes normalizados) se transfieren a una matriz en donde cada muestra representa una lmea y las columnas se representan por varios metabolitos identificados umvocamente por medio de su tiempo de retencion cromatografico, en comparacion con el tiempo de retencion del compuesto de referencia. La primera columna de la matriz se usa para definir la clase de pertinencia de la muestra. En el caso mas sencillo, solo pueden considerarse dos clases "Paciente sano" y "Paciente afectado por carcinoma endometrial", mas adelante se presentan evidencias del funcionamiento de la invencion sobre la base de esta clasificacion dicotomica.

Tambien es objeto de la presente invencion un metodo como se describe anteriormente que comprende ademas las siguientes fases:

- integracion de cromatogramas, en donde dicha integracion proporciona la identificacion de todos los picos que tienen un area mayor que 10 veces el ruido de fondo de la senal del cromatograma; mediante el uso del pico del compuesto de referencia como referencia tanto para el analisis cuantitativo como para centrar los tiempos de retencion,

donde cada pico se identifica sobre la base de:

- una senal m/z de cuantificacion; y

- al menos dos senales m/z de calificacion;

- cuantificacion con el metodo de areas de porcentajes normalizados;

- transferencia de los datos obtenidos de dicha cuantificacion a una matriz en la que cada muestra representa una lmea y las columnas se representan por varios metabolites identificados unvocamente por medio de su tiempo de retencion cromatografico.

El analisis estad^stico multivariante de los datos (PLS-DA y OPLS-DA) y el aprendizaje automatico (SVM y arbol de decision) se realizan en cromatogramas normalizados y corregidos (basado en el area del pico de ribitol) mediante el uso de SIMPCA-P 13,0 (Umetrics), RapidMiner 5,3 (Rapid-I) y R (Foundation for Statistical Computing, Viena). Los valores se centran en el promedio y se normaliza la varianza. Para el perfil metabolico, el modelo OPLS-DA ha mostrado capacidad satisfactoria de modelado y prediccion mediante el uso de un componente predictivo y tres componentes ortogonales (R²Y^cum=0,995, Q^2cum=0,985). La Figura 1 muestra la separacion entre las clases obtenidas con el modelo OPLS-DA.

Ademas, se construyo una clasificacion basada en la histologfa del carcinoma a traves de un modelo PLS-DA. Como se muestra en la Figura 2, solo una muestra se coloca en un area incierta del espacio de definicion de las clases.

La presente invencion se puede entender mejor a la luz de los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLOS

La metodologfa de diagnostico, objeto de la presente invencion, se desarrollo a partir del analisis metabolomico, realizado en muestras de sangre de pacientes con cierto diagnostico de carcinoma endometrial, antes de la intervencion de histerectoiTHa y de un grupo de mujeres de control que tienen caractensticas ffsicas y socio-economicas similares pero con un utero sano. La informacion sobre el isotipo y la etapa de la neoplasia se recopilaron despues de la histerectom â sobre la base de las evidencias anatomopatologicas obtenidas mediante el analisis del organo explantado.

Recoleccion de muestras

Las muestras se tomaron de 88 mujeres con carcinoma endometrial y 80 mujeres sanas, que voluntariamente dieron muestras de sangre. El estudio fue aprobado por el comite de etica de la universidad Magna Grecia de Catanzaro y los pacientes y los voluntarios sanos firmaron el consentimiento informado sobre los propositos del estudio. Las muestras de sangre se tomaron justo antes de la intervencion de histerectom^a mediante el uso de viales BD Vacutainer®, el suero se congelo a -80 °C hasta el momento del analisis. La sospecha diagnostica de carcinoma endometrial despues de la prueba histerectoscopica con biopsia de la lesion endometrial se confirmo por la prueba anatomopatologica del utero despues de la intervencion de histerectom^a. Tambien se organizo un grupo de control que tomaba muestras de sangre de mujeres que no teman signos de carcinoma endometrial y con caractensticas ffsicas y socioeconomicas similares (peso, talla, IMC, edad, estado civil, nivel de educacion, etc.).

Las caractensticas demograficas y clmicas de los casos y de los controles se informan en la Tabla 1, mientras que en la Tabla 2 se enumeran las caractensticas anatomopatologicas de los tumores investigados.

Tabla 1: caractensticas de la poblacion del estudio

Parametro Carcinoma endometrial Controles Valor P

Numeros de casos 88 80 --Edad (anos) 63,3±14,8 63,1±8,3 NS

IMC 27,6±6,7 26,2±4,5 NS

Tabla 2: caractensticas anatomopatologicas de los tumores investigados

Numeros de casos Porcentaje de casos

Tipo I 67 76,1 %

Histotipo

Tipo II 21 23,9 %

G1 2 2,3 %

Etapa G2 53 60,2 %

G3 33 37,5 %

Extraccion y derivatizacion de metabolitos

Se transfirieron cincuenta microlitros de suero a viales Eppendorf de 2 ml y 20 |jl de una solucion de 1 g/l de ribitol y se anadieron 200 j l de una mezcla que consiste en 2,5 partes de metanol, 1 parte de agua y 1 parte de cloroformo (CH3OH:H2O:CHcl3, 2,5:1:1). La solucion se mezclo en vortice durante 30 segundos.

Las muestras se centrifugaron a 16000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Se colecto una alfcuota de 200 j l de sobrenadante y se transfirio a nuevos viales Eppendorf de 2 ml y se anadio con 200 jL de H2O y se mezclo en vortice durante 30 segundos y se centrifugo nuevamente a 16000 rpm durante 5 minutos a 4 °C.

Se colecto nuevamente una alfcuota de 350 j l del sobrenadante y se transfirio a ampollas de vidrio de 1,5 y se liofilizo. La muestra liofilizada se trato con 50 j l de 20 mg/ml de clorhidrato de metoxiamina en piridina. La reaccion se realizo a 37 °C con agitacion (350 rpm) durante 90 minutos. Al final, se anadieron 50 j l de di N,O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) con 1 % de trimetilclorosilano a cada ampolla y la reaccion de silanizacion se realizo a 37 °C durante 60 minutos bajo agitacion (350 rpm).

Analisis de MDGCMS

Para la cromatograffa de gases bidimensional se uso una columna primaria (colocada en el primer horno), del tipo SLB-5ms 30,0 m x 0,25 mm ID con 1 jm de grosor de pelfcula [polfmero de silfenileno, practicamente con polaridad equivalente a poli(5 % difenilo/95 % metilsiloxano)] (J&W Agilent) que se unio a la posicion 1 de la interfaz con 7 puertas (SGE). Un BPX-505,0 m x 0,50 mm ID con 0,25 jm de grosor de la pelfcula se unio a la posicion 7 de la interfaz. Se establecio un BPX-501,5 m x 0,25 mm ID, 0,25 jm a la posicion 6 y se conecto a un detector de ionizacion de llama (FID) configurado a 320 °C, mientras que la columna analttica de 5,0 m (qmmicamente identica a la conectada a FID) se conecto al sistema qMS.

La columna conectada a FID se uso para reducir el flujo en la segunda dimension y para verificar que el compuesto apenas representativo no se debio a una fluctuacion aleatoria de la cromatograffa.

Se uso un vaso capilar externo de 40 j l (20 cm x 0,71 mm ODx 0,51 mm ID en acero inoxidable) para conectar las puertas 3 y 4 de la interfaz SGE.

El programa termico igual para los dos hornos fue: 80 °C durante 1 minuto, despues se calienta hasta 320 °C a 3 °C/minuto y se mantiene durante 4 minutos.

La presion inicial de helio (velocidad lineal constante) se establecio en 129,6 kPa. La presion inicial auxiliar de helio del APC (control avanzado de presion), que tambien funciona en condiciones de velocidad lineal constante, se establecio en 90,4 kPa.

El volumen de inyeccion de 1 j l con una relacion de separacion de: 1:5. El penodo de modulacion se establecio en 4,1 s (penodo de acumulacion 4,0 segundos, penodo de inyeccion 0,1 segundos). Las condiciones del espectrometro de masas cuadrupolo fueron: modo de ionizacion: impacto electronico (70 eV), intervalo de masa: 40-600 m/z, velocidad de escaneo: 10 000 amu/segundo.

Analisis de GCMS

Para la cromatograffa de gases monodimensional se uso una columna del tipo CP-Sil 8 CB GC Column, 30 m, 0,25 mm, 1,00 jm , (Agilent J&W).

El programa termico del GC concibio una temperatura inicial de 100 °C por 1 minuto, despues se calento hasta 320 °C a 4 °C/minuto y 4 minutos de tiempo de espera para un tiempo total de funcionamiento de 60 minutos.

La presion inicial de helio (velocidad lineal constante de 39 cm/s) se establecio en 83,7 kPa. El volumen de inyeccion a 2 j l con una relacion de separacion: 1:5. Las condiciones del espectrometro de masas cuadrupolo fueron: modo de ionizacion: impacto electronico (70 eV), intervalo de masa: 35-600 m/z, velocidad de escaneo: 3,333 amu/segundo con un tiempo de corte de solvente de 4,5 minutos.

Creacion de la matriz de datos

En un cromatograma de TIC usualmente se detectan mas de 250 senales, algunos de estos picos no se investigaron mas, ya que no hubo correspondencias en otras muestras, porque estaban en una concentracion demasiado baja o porque teman una calidad espectral deficiente para ser confirmados como metabolitos.

Se detectaron un total de 198 metabolitos endogenos como aminoacidos, acidos organicos, carbohidratos, acidos grasos y esteroides. Para la identificacion del pico, se uso el mdice de retencion lineal (LRI) como tolerancia maxima, una diferencia entre el mdice de Kovats tabulado y el mdice experimental de 10, mientras que el mmimo de compatibilidad para la busqueda en las bibliotecas se establecio en 85 %. Se usaron 2 bibliotecas: el NIST11 y una biblioteca desarrollada intencionadamente por derivatizacion de mas de 500 metabolitos en las mismas condiciones de las muestras analizadas. Las areas de los picos se normalizaron y se corrigieron con referencia a la senal de ribitol. Los resultados se resumieron en un archivo separado por comas (CSV) y se cargaron en un software adecuado para el procesamiento estadfstico. Los cromatogramas de gases obtenidos en modo SCAN se integraron para identificartodos los picos que tienen un area superior a 10 veces el ruido de fondo de la senal del cromatograma de gases. Cada pico se identifico sobre la base de la senal m/z de cuantificacion y al menos dos senales m/z de calificacion. Despues de la integracion, se realizo la cuantificacion con el metodo de las areas de porcentajes normalizados, se uso el pico de ribitol como referencia tanto para el analisis cuantitativo como para centrar los tiempos de retencion.

Los resultados obtenidos de esta cuantificacion (areas de porcentajes normalizados) se transfirieron a una matriz en donde cada muestra representa una lmea y las columnas se representan por varios metabolitos identificados umvocamente por medio de su tiempo de retencion cromatografica. La primera columna de la matriz se usa para definir la clase de pertinencia de la muestra. En el caso mas sencillo, solo pueden considerarse dos clases "Paciente sano" y "Paciente afectado por carcinoma endometrial", mas adelante se presentan evidencias del funcionamiento de la invencion sobre la base de esta clasificacion dicotomica. Se obtuvieron evidencias adicionales sobre la posibilidad de probar diferentes modelos de clasificacion para predecir el histotipo de la neoplasia y la clasificacion.

Analisis estadfstico

El analisis estadfstico multivariante de los datos (PLS-DA y OPLS-DA) y el aprendizaje automatico (SVM y el arbol de decision) se llevaron a cabo en los cromatogramas normalizados y corregidos (basado en el area del pico de ribitol) mediante el uso de SIMPCA-P 13,0 (Umetrics), RapidMiner 5,3 (Rapid-I) y R (Foundation for Statistial Computing, Vienna).

Los valores se centraron en el promedio y se normalizo la varianza.

Resultados

Para un perfil metabolico, el modelo OPLS-DA ha mostrado capacidad satisfactoria de modelado y prediccion mediante el uso de un componente predictivo y tres componentes ortogonales (R2Ycum= 0,995, Q2cum= 0,985). Los otros modelos de clasificacion han mostrado buenas habilidades de clasificacion (incluso si son mas bajas que OPLS-DA). Son posibles diferentes enfoques para la asignacion final de la clase de pertinencia de la muestra desconocida. Puede usarse la respuesta de un modelo unico o pueden integrarse las respuestas de los distintos modelos en un algoritmo de decision mas complejo.

La Tabla 3 informa algunos indices de la evaluacion del desempeno diagnostico que se uso para evaluar los modelos investigados. La sensibilidad se calculo como TP/(TP+FN), en donde TP representa el numero de verdaderos positivos, es decir, espedficamente las muestras correctamente diagnosticadas como afectadas por el carcinoma endometrial por el modelo propuesto, y FN es el numero de falsos negativos, es decir, espedficamente las muestras erroneamente identificadas como negativos. La especificidad se calculo como TN/(TN+FP), en donde TN representa el numero de verdaderos negativos, es decir, espedficamente muestras correctamente diagnosticadas como sanas y FP representa los falsos positivos, es decir, espedficamente el numero de personas erroneamente diagnosticadas como sanas. La relacion de probabilidad positiva (PLR) se calculo como Sensibilidad/(1-Especificidad), mientras que la negativa (NLR) como (1-Sensibilidad)/Especificidad.

El valor predictivo (NPV) se calculo como TN/(TN+FN), mientras que el valor positivo (VPP) como TP/(TP+FP). La precision representa el porcentaje de todas las asignaciones correctas y se calculo como (TP+TN)/(TP+FP+TN+FN) mientras que la repetibilidad como los numeros de reasignaciones correctas en 10 repeticiones del analisis de una muestra.

Tabla 3 - Desempeno diagnostico de los modelos investigados

Parametro OPLS-DA PLS-DA SVM Arbol de decision Sensibilidad 0,989 0,966 0,977

Especific idad 0,988 0,974 0,963

PLR 79,1 37,7 26,1

No hay error de clasificacion

NLR 0,012 0,035 0,024

N P V 0,988 0,962 0,975

P P V 0,989 0,977 0,966

E xactitud 0,988 0,970 0,970

No hay error de clasificacion

R epetibilidad >99 % >99 % >99 %

Para identificar los metabolitos que contribuyeron mucho mas a la separacion de las clases, se calculo la puntuacion de las variables importantes en la proyeccion (VIP) para cada componente. Las puntuaciones VIP representan la suma ponderada de los cuadrados de carga de los pls, considerando la cantidad de y-varianza en cualquier dimension. Dos picos muestran una puntuacion VIP mayor que 2 tanto en los modelos PLS-DA como en OPLS-DA (tanto en la clasificacion de carcinoma endometrial versus control y en la clasificacion de tipo I versus tipo II). Estos se identificaron como nudos importantes tambien en el arbol de decision; estas observaciones sugieren una gran importancia de estas variables en los procesos de clasificacion (datos no informados). El primer metabolito (puntuacion VIP=2,3; similitud espectrometrica =91 %; 5LRI = 11) resulto ser una senal atribuible al aminoacido glutamina, mientras que el segundo (puntuacion VIP=2,1; similitud espectrometrica=89 % 5LRI = 16) resulto ser atribuible a glucono 8-lactona.

Claims (10)

Reivindicaciones

1. Un metodo asistido por computadora para el diagnostico de carcinoma endometrial basado en el analisis metabolomico de la sangre, dicho metodo que comprende las siguientes fases:

(I) una fase de capacitacion que comprende:

- analisis de GCMS o GCxGCMS de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y controles sanos;

- integracion de los resultados obtenidos por un analisis multivariante mediante el uso de al menos un modelo de analisis discriminante o un modelo de aprendizaje por computadora para capacitar al menos un modelo de clasificacion;

(II) una fase de asignacion que comprende el analisis de GCMS o GCxGCMS de una muestra de sangre desconocida y su asignacion a una clase de pertinencia sobre la base del modelo de clasificacion formulado en la fase de capacitacion (I).

2. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde

- al menos un modelo de analisis discriminante se selecciona del grupo que consiste en: PLS-DA y OPLS-DA, o - dicho modelo de aprendizaje por computadora se selecciona del grupo que consiste en: SVM y arbol de decision.

3. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde la fase de capacitacion (I) comprende las siguientes subfases:

- extraccion y derivatizacion de metabolitos de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma y de controles sanos;

- analisis de GCMS o GCxGCMS de metabolitos extrafdos y derivatizados para obtener un cromatograma para cada muestra;

- creacion de la matriz de datos de los perfiles metabolicos de los pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos;

- estructuracion de al menos un modelo de clasificacion como un resultado del analisis multivariante de la matriz de datos; en donde dicho analisis multivariante se lleva a cabo mediante el uso de al menos un modelo de analisis discriminante o un modelo de aprendizaje por computadora para capacitar al menos un modelo de clasificacion.

4. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones precedentes, en donde dicha fase (II) comprende ademas las siguientes subfases:

- extraccion y derivatizacion de metabolitos de al menos una muestra de sangre desconocida;

- analisis de GCMS o GCxGCMS de los metabolitos extrafdos y derivatizados para obtener al menos un cromatograma para la muestra de sangre desconocida;

- creacion del perfil metabolico a partir de dicho cromatograma de la muestra de sangre desconocida;

- asignacion del perfil metabolico a una clase sobre la base del modelo de clasificacion capacitado en la fase (I).

5. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde el numero de muestras de sangre derivadas de pacientes con carcinoma endometrial y de controles sanos es igual a al menos el 80 % del numero de variables identificadas de perfiles metabolicos.

6. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho modelo de clasificacion se capacita para una clasificacion dicotomica "Paciente sano" o "Paciente afectado por carcinoma endometrial".

7. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho modelo de clasificacion se capacita ademas para una clasificacion histologica de cancer "tipo I" o "tipo II".

8. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha extraccion y derivatizacion comprenden:

i) agitacion de la muestra obtenida de la adicion de una mezcla de extraccion;

ii) centrifugacion de la muestra obtenida en i);

iii) derivatizacion del sobrenadante obtenido en ii) por tratamiento con clorhidrato de metoxiamina en piridina; iv) silanizacion del sobrenadante de la muestra obtenida en iii) con un agente de silanizacion que se selecciona del grupo que consiste en: N,O-bis(trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA), N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida (MSTFA), hexametil disilazano (HMDS), 1 -(trimetilsilil) imidazol (TMSI), N-terc-butildimetilsilil-N-metiltrifluoroacetamida (MTBSTFA), 1 -(terc-butildimetilsilil) imidazol (TBDMSIM);

en donde dicha mezcla de extraccion consiste en una mezcla acuosa de un alcohol y un disolvente polar aprotico.

9. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha extraccion de metabolitos se realiza anadiendo una alfcuota de un compuesto de referencia, preferentemente ribitol.

10. El metodo de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas las siguientes fases:

- integracion de los cromatogramas obtenidos de acuerdo con una o mas de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha integracion proporciona la identificacion de todos los picos que tienen un area mayor que 10 veces el ruido de fondo de la senal del cromatograma; mediante el uso del pico del compuesto de referencia como referencia tanto para el analisis cuantitativo como para centrar los tiempos de retencion,

donde cada pico se identifica sobre la base de:

- una senal m/z de cuantificacion; y

- al menos dos senales m/z de calificacion;

- cuantificacion con el metodo de areas de porcentajes normalizados;

- transferencia de los datos obtenidos de dicha cuantificacion a una matriz en la que cada muestra representa una lmea y las columnas se representan por varios metabolitos identificados umvocamente por medio de su tiempo de retencion cromatografica.