ES2710321A1 - Adn polimerasas independientes de cebador y su uso para la sintesis de adn - Google Patents

Abstract

ADN polimerasas independientes de cebador y su uso para la síntesis de ADN. La presente invención proporciona un péptido aislado de SEQ ID NO: 1, necesario para la actividad primasa, así como nuevas enzimas ADN polimerasas replicativas, preferiblemente la de SEQ ID NO: 2, que comprenden dicho péptido. Por tanto, estas ADN polimerasas están dotadas de actividad primasa y no requieren cebadores proporcionados externamente para iniciar y realizar la amplificación de ADN. Estas polimerasas son capaces de llevar a cabo una síntesis de ADN de novo fiable y procesiva de moldes de ADN en ausencia de cebadores pre-sintetizados. Por lo tanto, estas enzimas actúan como primasas y ADN polimerasas. Asimismo, muestran capacidad de síntesis de translesión, pudiendo ser útiles no solo para la amplificación del genoma completo sino también para la amplificación de ADN dañados. La invención se refiere además a métodos para amplificar ADN moldes que usan estas enzimas.

Description

DESCRIPCION

ADN POLIMERASAS INDEPENDIENTES DE CEBADOR Y SU USO PARA LA

SINTESIS DE ADN

La presente invention se encuentra dentro de los campos de la biologla molecular, biotecnologla y metodos de amplification o replication de ADN. Particularmente, esta invencion se refiere a un nuevo grupo de enzimas ADN polimerasa con actividad primasa de ADN, las cuales pueden usarse para la amplificacion in vitro de moldes de ADN sin la presencia de cebadores anadidos externamente.

TECNICA ANTERIOR

Las ADN polimerasas (ADNPs) son enzimas clave, esenciales para la replicacion, recombination y reparation del genoma en todas las formas de vida celular y sus virus. Las ADNPs pueden dividirse en siete familias (A, B, C, D, X, Y y RTs). Las ADNPs de la familia B (PolBs) comprenden enzimas implicadas en la replicacion del genoma en eucariotas y arqueas, aunque tambien en virus de los tres dominios de vida. Para iniciar la slntesis de ADN, todas las PolBs caracterizadas hasta ahora dependen de la presencia de un cebador externo, de un grupo hidroxilo presentado por un acido nucleico (ARN o ADN) o por la denominada protelna terminal (PT). Por tanto, basandose en el requisito de utilizar cebadores para iniciar la replicacion del genoma, as! como en la agrupacion filogenetica, estas enzimas se pueden dividir en general en dos grupos principales: las PolBs cebadas con ARN (rPolBs) y las PolBs cebadas con protelna (pPolBs). Se desconoce la relation evolutiva entre los dos grupos y, por lo tanto, no esta claro si una supuesta PolB ancestral habrla empleado como cebador una protelna o un oligonucleotido de ARN. El grupo de las rPolBs contiene principalmente replicasas dedicadas a la copia precisa y eficiente de grandes genomas celulares y vlricos. Por el contrario, las pPolBs son exclusivas de virus y de elementos moviles egolstas con genomas lineales de tamano moderado (<50 kb). La caracterlstica de las pPolBs es la presencia de subdominios especlficos, denominados TPR1 y TPR2, que se describieron originalmente en la ADN polimerasa 029 (ADNP029). Para la interaction de la ADNP con la PT se requiere TPR1, mientras que TPR2 dota a la pPolB de capacidad de procesamiento y desplazamiento de cadena, garantizando las dos propiedades la superioridad de la ADNP029 en diversas aplicaciones de biologia molecular, tal como la amplification de ADN de molecula unica de desplazamiento multiple.

El cebado con protema se ha descrito en diversos virus de bacterias y eucariotas, asi como en plasmidos lineales encontrados en levaduras, hongos filamentosos y plantas. Mas recientemente, tambien se identificaron genes codificantes de pPolB en dos superfamilias de elementos geneticos moviles (EGM) integrados en varios genomas celulares (Krupovic y Koonin, 2016, Curr Opin Microbiol, 31, 25-33). La primera superfamilia comprende elementos transponibles similares a virus de eucariotas, denominados polintones (tambien conocidos como Maveriks), que ademas de pPolB, codifican integrasas similares a retrovirus y un conjunto de protemas que se predice que estan implicadas en la formation de partmulas vmcas (Krupovic, et al., 2014a, Biol Direct, 9, 6). El segundo supergrupo de elementos que codifican pPolB, denominado casposones, esta presente en una amplia variedad de arqueas y algunas bacterias (Krupovic, et al., 2014b, BMC Biology, 12, 36). Para la integration en el genoma celular, estos elementos emplean endonucleasas homologas a la enzima Cas1, una protema caractehstica de los sistemas CRISPR-Cas responsables del proceso de inmunizacion. Se ha postulado que las pPolBs participan en la replication de los genomas del casposon y polinton (Kapitonov, V.V., y Jurka, J., 2006, Proc Natl Acad Sci USA, 103, 4540-4545); por consiguiente, estos EGMs reciben el nombre de elementos autosintetizadores o autorreplicantes. La genomica comparativa y los analisis filogeneticos sugirieron que los polintones y los casposones han desempenado papeles clave en la evolution de muchos grupos de virus de ADNbc (bicatenario) de eucariotas y sistemas CRISPR-Cas, respectivamente. Sin embargo, no hay pruebas experimentales de la replicacion y, en particular, de la initiation de la replicacion de estos elementos integrados autorreplicantes.

En cuanto a las primasas, se ha demostrado que las ADN primasas que contienen el dominio PrimPol, que pertenecen a la gran superfamilia de primasas arqueoeucariotas (PAE), poseen multiples actividades enzimaticas in vitro, incluida la actividad de la ADN polimerasa dependiente de cebador e independiente de cebador, actividades nucleotidiltransferasa, smtesis de translesion e incluso transcriptasa inversa (Gill, et al., 2014, Nucleic Acids Res, 42, 3707-3719; Martmez-Jimenez, et al., 2015, DNA Repair (Amst), 29, 127-138). Aunque en determinados virus o protemas codificadas por plasmidos, el dominio de las PAE se fusiona con diversas helicasas y puede sintetizar productos de ADN de gran tamano, como ocurre en el caso de la recientemente descubierta primasa-polimerasa codificada por el fago NrS-1 (Zhu, et al., 2017, Proc Natl Acad Sci USA, 114, E2310-E2318), estas enzimas carecen del dominio exonucleasa, y su polimerizacion de ADN en moldes mas largos parece ser principalmente distributiva. Por tanto, en general, se considera que el papel de las protelnas PAE in vivo esta ampliamente restringido a la slntesis de cebadores cortos, que se extienden mediante las ADNPs replicativas celulares (Beck, et al., 2010, Nucleic Acids Res, 38, 6707-6718).

Hasta ahora ninguna ADN polimerasa conocida puede comenzar una nueva cadena de ADN (de novo) sino que solo puede anadir un nucleotido a un grupo 3'-OH preexistente, y por lo tanto necesita un cebador al que pueda anadirse el primer nucleotido. Otra enzima denominada primasa es la que sintetiza los cebadores. No se han descrito PolBs que al mismo tiempo muestren actividad tanto primasa como ADN polimerasa. Por tanto, para realizar la replication del ADN in vivo, se necesitan al menos dos enzimas diferentes, una primasa capaz de proporcionar un cebador y una ADN polimerasa para elongarlo. Para la replicacion o amplification in vitro de un ADN molde, los cebadores deben anadirse externamente a la mezcla de reaction para que a traves de la ADN polimerasa puedan elongarse.

Para la amplificacion del genoma completo a partir de celulas individuales, recientemente se ha propuesto un nuevo metodo denominado Trueprime, que usa una combination de una primasa PAE, TthPrimPol y ADNP029 (Picher, et al., 2016, Nature communications, 7, 13296).

Sin embargo, en este marco, existe una necesidad en la tecnica de tener ADN polimerasas replicativas mejoradas que no requieran cebadores anadidos externamente para iniciar y realizar la replicacion del ADN. Estas polimerasas mejoradas presentarlan una actividad independiente de cebador o actividad primasa, permitiendo de este modo el uso de mezclas de reaccion de amplificacion simplificadas. Estas enzimas podrlan usarse incluso como soluciones de una sola enzima para la amplificacion procesiva y fiel de genomas completos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La presente invention proporciona nuevas enzimas ADN polimerasas con actividad primasa que no requieren cebadores provistos externamente para la replication del ADN. Estas polimerasas son capaces de iniciar y realizar una slntesis de ADN de novo fiable y procesiva de moldes circulares y lineales en ausencia de cebadores preexistentes o factores proteicos adicionales. Por lo tanto, estas enzimas de la invencion actuan como primasas y ADN polimerasas. Asimismo, muestran capacidad de slntesis de translesion de modo que pueden ser utiles para la amplification de ADN moldes danados.

Estas enzimas ADN polimerasas son un nuevo grupo dentro de las ADN polimerasas de la familia B, representando as! el tercer grupo principal de las PolBs, junto con las rPolBs y pPolBs. Estas enzimas de la invencion, que tambien se denominaran "piPolBs" de "polimerasas de la familia B independientes de cebador" (pi por las siglas del ingles primer-independent), son ADN polimerasas eficientes y fiables.

Las piPolBs de la invencion tienen la capacidad de realizar una slntesis de ADN de novo dependiente de molde intrlnseco, de manera que para la slntesis de ADN no necesitan un cebador presintetizado. Asimismo, son ADN polimerasas replicativas completas, dotadas de capacidad de correction de errores y desplazamiento de cadena. Por tanto, esta invencion desafla un dogma existente en el campo desde hace mucho tiempo, que establece que las ADN polimerasas replicativas son incapaces de sintetizar ADN de novo, sin un cebador preexistente que proporcione un grupo hidroxilo para anclar el nucleotido entrante.

Este nuevo grupo principal de PolBs, las piPolBs de la invencion, esta codificado por un nuevo tipo de elementos geneticos moviles (EGM) autorreplicantes, denominados pipolinas, integrados en el genoma de bacterias de diversos filos, entre los que se incluyen Actinobacteria, Firmicutes y Proteobacteria, y tambien estan presentes como plasmidos circulares en las mitocondrias. La mayorla de las pipolinas se encuentran integradas en genomas bacterianos, aunque algunas persisten como plasmidos extracromosomicos. La caracterizacion bioqulmica de una piPolB representativa de Escherichia coli (mostrada en la SEQ ID NO: 2) mostro que la protelna presentaba una actividad de polimerizacion de ADN eficaz y versatil, con capacidad de replicar moldes de ADN danados y no danados, dotada ademas de capacidades de correccion de errores y desplazamiento de cadena, similar a las pPolB tlpicas, como la codificada por el bacteriofago phi29. De manera destacable, la protelna tambien tiene la capacidad de realizar una slntesis de ADN de novo dependiente de molde intrlnseco, es decir, actividad primasa de ADN, inesperada y nunca antes vista entre las siete familias de ADN polimerasas (A, B, C, D, X, Y y RTs). Por tanto, las piPolB por si solas son suficientes para la replication de moldes de ADN, como las moleculas EGM circulares, en ausencia de factores de initiation de la replicacion adicionales, rompiendo as! el dogma existente en el campo desde hace mucho tiempo que establece que las ADN polimerasas replicativas requieren un cebador preexistente para iniciar la slntesis de ADN. Las piPolBs de la invention podrlan usarse para desarrollar nuevas aplicaciones para la amplification del genoma completo sin la necesidad de cebadores externos que puedan causar un sesgo de amplificacion.

Ademas, la supervivencia mejorada de las celulas de E. coli que expresan piPolB tras el bloqueo de la replicacion por agentes que danan el ADN (veanse los ejemplos a continuation) sugiere un papel adicional de estas piPolBs de la invencion en la tolerancia al dano del ADN.

Resumiendo, las principales ventajas de las piPolBs descritas en la presente invencion son:

- No requieren la adicion de un cebador externo (presintetizado) a la mezcla de reaction para la amplificacion del ADN, dado que presentan actividad primasa. Por tanto, estas enzimas pueden sintetizar ADN de novo exclusivamente dependiente de un molde intrlnseco, en ausencia de cebadores preexistentes o factores proteicos adicionales que inicien la replicacion.

- Asimismo, su capacidad primasa no depende de una secuencia molde especlfica. Como no presentan un requisito de secuencia molde rlgido para iniciar la replicacion, se pueden seleccionar multiples orlgenes de replicacion de una manera aleatoria, una propiedad util para la amplificacion eficaz del genoma completo independiente de cebadores.

- Pueden iniciar y realizar la replicacion de ADN de moldes circulares y lineales, preferiblemente monocatenarios.

- Estas enzimas mantienen las propiedades deseables de las ADN polimerasas B, como la ADN polimerasa del fago phi29. Estas propiedades son una extension de cebador de ADN eficaz y actividad de polimerizacion de ADN, asl como capacidades de correction de errores y desplazamiento de cadena.

- Presentan una capacidad de slntesis de translesion (STL) procesiva intrlnseca eficaz, elongando el cebador de manera procesiva sin introducir mutaciones con desplazamiento del marco de lectura. Esto significa que las piPolBs de la invention tienen alta tolerancia al dano y capacidad de reparation del ADN. Estas piPolBs pueden usar moldes de ADN danados y no danados, ya que, como se muestra en los ejemplos que se proporcionan a continuation (vease, por ejemplo, la Fig. 2A), pueden replicar moldes danados. Esta capacidad puede usarse, por ejemplo, para la amplification de moldes de ADN danados o antiguos.

Las piPolBs de la invencion podrlan usarse como soluciones de una sola enzima para la amplificacion del genoma completo a partir de celulas individuales. Esto representa una ventaja sobre la tecnica anterior donde las soluciones para la replication del genoma completo consisten en una combination mas compleja de diferentes enzimas, tales como, por ejemplo, una primasa, una Prim-Pol y la ADNP del fago phi29.

Adicionalmente, los inventores de la presente invencion han identificado el motivo de aminoacidos conservado comun necesario para la actividad primasa en las piPolBs descritas en este documento. Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 1. Esta SEQ ID NO: 1 es el domino conservado comun dentro de las piPolBs descritas en esta invencion, necesario para la actividad primasa y consiste en KX2-X3-10-KTRG, donde X2 es un aminoacido seleccionado de la lista que consiste en A, H, K, T, D, Y, G o R, preferiblemente A o H, mas preferiblemente H; y X3-10 es una secuencia de 8 aminoacidos de longitud donde dichos aminoacidos pueden ser cualquier aminoacido identicos o diferentes entre ellos. Incluso mas preferiblemente, X3-10 es la secuencia de aminoacidos EVSQLIAM (SEQ ID NO: 5). En una realization particular, X2 es H y X3-10 es la SEQ ID NO: 5. La secuencia SEQ ID NO: 1 en la que X2 es H y X3-10 es la SEQ ID NO: 5 es la SEQ ID NO: 85. Esta SEQ ID NO: 85 es la mas preferida.

La SEQ ID NO: 1, preferiblemente la SEQ ID NO: 85, corresponde a las posiciones 613 a 626 de la SEQ ID NO: 2, donde la SEQ ID NO: 2 es una de las piPolB de E. coli descritas y ensayadas en esta invencion y la piPolB mas preferida de la invencion.

Este motivo de SEQ ID NO: 1 puede introducirse de manera recombinante en otras ADN polimerasas conocidas, preferiblemente en las PolB, mas preferiblemente en las pPolB, para dotarlas de actividad primasa.

Por tanto, otro aspecto de la invencion se refiere a una enzima ADN polimerasa (ADNP) recombinante o mutante que comprende una secuencia de aminoacidos de una ADN polimerasa parental de la familia B (ADN PolB) donde el motivo KxY se ha sustituido por el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1, preferiblemente por el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 85, donde dicha enzima ADN polimerasa recombinante tiene actividad ADN polimerasa y actividad primasa. En el presente documento, esta enzima ADN polimerasa recombinante tambien se denominara "ADNP recombinante de la invencion".

El termino "recombinante" o "mutante", tal como se usa en el presente documento, se refiere a una enzima ADN polimerasa que procede de una ADN PolB parental por medio de una o mas sustituciones de uno o mas aminoacidos en el (los) punto(s) descrito(s) en este documento dentro de su secuencia de aminoacidos y, por lo tanto, tiene una secuencia diferente a la de la enzima parental natural o de tipo silvestre. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "ADNP recombinante" significa un polipeptido que tiene actividad ADN polimerasa y actividad primasa, producido por slntesis qulmica o de manera recombinante por un organismo que expresa una secuencia de nucleotidos que codifica la ADN PolB parental modificada en el sentido descrito en este documento. Dicha secuencia de nucleotidos modificada se obtiene por intervention humana modificando la secuencia de nucleotidos que codifica la ADN PolB parental. El termino "modification" significa cualquier modificacion qulmica de la secuencia de aminoacidos o acido nucleico de la ADN PolB parental. Por lo tanto, la ADNP recombinante de la invencion se puede obtener mediante cualquier tecnica de ingenierla genetica conocida en la materia para la produccion de polipeptidos recombinantes.

Las sustituciones de aminoacidos descritas en este documento introducidas en la ADN PolB parental pueden obtenerse utilizando tecnicas de ingenierla genetica o de ADN recombinante, tales como, por ejemplo, mutando la secuencia codificante de la ADN PolB parental mediante mutagenesis dirigida o pueden obtenerse mediante slntesis qulmica de la secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de la ADNP recombinante de la invention que lleva dichas sustituciones de aminoacidos.

Por lo tanto, la ADNP recombinante de la invencion puede sintetizarse, por ejemplo, pero sin limitation, in vitro. Por ejemplo, mediante la slntesis de peptidos en fase solida o estrategias de ADN recombinante. La ADNP recombinante de la invencion puede producirse de manera recombinante, incluyendo su production como un polipeptido maduro o como una pre-protelna que incluye un peptido senal.

La ADNP recombinante de la invencion no es la enzima de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NOs: 9 a 42 (las piPolBs descritas en la presente description).

Una "ADN polimerasa parental de la familia B" es una ADN polimerasa de la familia B de tipo silvestre, bien sea rPolB o pPolB, preferiblemente pPolB, pero no piPolB, de las conocidas en la tecnica. Las pPolB comprenden, en sentido N-terminal a C-terminal, un dominio exonucleasa, al menos dos dominios Palm separados por un dominio TPR1, dominios “fingers” y un dominio TPR2 y un dominio “thumb”.

El motivo de SEQ ID NO: 1 puede introducirse en la PolB parental, preferiblemente pPolB, en sustitucion de su dominio conservado que comprende el motivo KxY. El experto en la materia sabe donde se localiza este motivo KxY dentro de las PolBs, sin embargo, como ejemplo, este motivo KxY corresponde a las posiciones 498 a 500, ambas incluidas, de la SEQ ID NO: 6, donde la SEQ ID NO: 6 es la pPolB del fago phi29. Por tanto, en una realization preferida de este aspecto de la invencion, las posiciones 498 a 500 de la PolB phi29 parental (SEQ ID NO: 6) se sustituyen por la SEQ ID NO: 1, preferiblemente por la SEQ ID NO: 85. Por otra parte, este motivo KxY corresponde a las posiciones 535 a 537, ambas incluidas, de la SEQ ID NO: 7, donde la SEQ ID NO: 7 es la pPolB del fago Bam35. Por tanto, en otra realizacion preferida de este aspecto de la invencion, las posiciones 535 a 537 de la PolB Bam35 parental (SEQ ID NO: 7) se sustituyen por la SEQ ID NO: 1, preferiblemente por la SEQ ID NO: Preferiblemente, la ADNP recombinante de la invention muestra actividades cebadora o primasa, exonucleasa y ADN polimerasa asi como capacidades de correction de errores y de desplazamiento de cadena.

La “actividad ADN polimerasa” es la actividad que consiste en la smtesis de moleculas o secuencias de ADN a partir de desoxirribonucleotidos. Por lo tanto, las ADN polimerasas son capaces de replicar ADN a partir de un molde de ADN anadiendo nucleotidos libres al extremo 3' de la cadena de ADN que se esta formando. Esto resulta en la elongation de la cadena que se esta formando en direction 5'-3'.

La "actividad cebadora o primasa" es la actividad que consiste en la smtesis de cebadores. La actividad primasa cataliza la smtesis de segmentos cortos de ARN o ADN, denominados cebadores, complementarios a un molde de ADNmc (monocatenario).

Las actividades ADN polimerasa y primasa pueden evaluarse, por ejemplo pero sin limitation, poniendo en contacto un ADN molde y la enzima ADN polimerasa a ensayar en condiciones que permitan la amplification de ADN, en presencia de al menos dNTPs (desoxirribonucleotidos trifosfato), un tampon e iones de magnesio o manganeso como cofactores y en ausencia de cebadores anadidos externamente. Despues de esta incubation, el producto de la reaction de amplificacion se puede visualizar, por ejemplo, en un gel de electroforesis. Si los productos de amplificacion se visualizan en el gel, entonces la ADN polimerasa utilizada en la reaccion presenta ambas actividades, ADN polimerasa, replicativa y primasa.

En otra realization preferida de este aspecto de la invencion, la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa Bam35, la ADN polimerasa PRD1, la ADN polimerasa Cp-1, la ADN polimerasa His1, la ADN polimerasa His2 o la ADN polimerasa phi29, o polipeptidos al menos 80 %, mas preferiblemente al menos 85 %, 86 %, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98 % o 99 %, identicos a cualquiera de ellas que tengan actividad ADN polimerasa (replicativa). En una realizacion mas preferida, la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa phi29 o la ADN polimerasa Bam35 o polipeptidos al menos 80 % identicos a cualquiera de ellas que tengan actividad ADN polimerasa (replicativa). En una realization incluso mas preferida, la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa phi29 o la ADN polimerasa Bam35. En una realization particular, la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa phi29.

El termino "identidad", tal como se usa en el presente documento, en el contexto de describir dos o mas secuencias polipeptldicas, se refiere a un porcentaje especificado de coincidencias de residuos de aminoacidos en las posiciones de un alineamiento de dos secuencias de aminoacidos. En la tecnica son bien conocidos los metodos de alineamiento de secuencias para establecer comparaciones. Por tanto, el grado de identidad puede determinarse utilizando, por ejemplo, el metodo de Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153), el metodo de Wilbur-Lipman (Wilbur y Lipman, 1983, Proceedings of the National Academy of Science USA 80: 726-730), el programa GAG, incluyendo GAP (Devereux et al. 1984, Nucleic Acids Research 12: 287 Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, 25 (WI)); BLAST o BLASTN, EMBOSS Needle y FASTA (Altschul et al. 1999, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Adicionalmente, para determinar el grado de identidad entre dos secuencias tambien puede utilizarse el algoritmo de Smith-Waterman.

La ADN polimerasa Bam35 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 7. La ADN polimerasa phi29 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 6. La ADN polimerasa PRD1 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 75. La ADN polimerasa Cp-1 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 76. La ADN polimerasa His1 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 77. La ADN polimerasa His2 es, preferiblemente, la enzima que comprende la SEQ ID NO: 78.

En una realization particular de la ADNP recombinante de la invention, esta comprende la secuencia de aminoacidos de la SEQ ID NO: 3 o la SEQ ID NO: 4, preferiblemente SEQ ID NO: 3. La SEQ ID NO: 3 corresponde a la ADN pPolB de phi29 parental (SEQ ID NO: 6) que comprende su motivo KxY sustituido por la SEQ ID NO: 1. La SEQ ID NO: 4 corresponde a la ADN pPolB de Bam35 parental (SEQ ID NO: 7) que comprende su motivo KxY sustituido por la SEQ ID NO: 1.

Otro aspecto de la presente invention se refiere a una secuencia de acido nucleico aislada, en lo sucesivo en el presente documento la “secuencia de acido nucleico de la invention”, que codifica la enzima ADNP recombinante de la invention. Preferiblemente, esta secuencia de acido nucleico es ADNc.

Debido a la degeneration del codigo genetico, varias secuencias de nucleotidos pueden codificar la misma secuencia de aminoacidos. Una "molecula de acido nucleico aislada", "secuencia nucleotldica", “secuencia de acido nucleico” o “polinucleotido” es una molecula de acido nucleico (polinucleotido) que se ha eliminado de su medio natural (es decir, se ha sometido a manipulation humana) y puede incluir ADN, ARN o derivados de ADN o de ARN, incluyendo ADNc. La secuencia de nucleotidos de la presente invencion puede o no estar modificada qulmica o bioqulmicamente y puede obtenerse artificialmente por medio de metodos de clonacion y seleccion o por medio de secuenciacion.

La secuencia de acido nucleico de la invencion puede codificar el polipeptido maduro o una preprotelna que consiste en un peptido senal unido a la enzima madura que debe procesarse posteriormente.

La secuencia de nucleotidos de la presente invencion tambien puede comprender otros elementos, tales como intrones, secuencias no codificantes en los extremos 3’ y/o 5’, sitios de union a ribosomas, etc. Esta secuencia de nucleotidos tambien puede incluir secuencias que codifiquen aminoacidos adicionales que sean utiles para la purification o estabilidad del polipeptido codificado.

La secuencia de acido nucleico de la invencion se puede incluir en una construction genetica, preferiblemente en un vector de expresion. Dicha construction genetica tambien puede comprender una o mas secuencias reguladoras de la expresion genica, tales como promotores, terminadores, potenciadores, etc.

Por tanto, otro aspecto de la invencion se refiere a una construccion genetica, en lo sucesivo en el presente documento "la construccion genetica de la invencion", que comprende la secuencia de acido nucleico de la invencion. En una realization preferida, esta construccion genetica es un vector de expresion.

La expresion “construccion genica”, “construccion genetica” o “construccion de acido nucleico” se refiere a una unidad funcional necesaria para transferir y/o expresar un gen de interes, en este documento la secuencia de nucleotidos de la invention como se describe, y secuencias reguladoras que incluyen, por ejemplo, un promotor, unidas operativamente a la secuencia que codifica la protelna. Se refiere a una molecula de acido nucleico, mono o bicatenario, que esta aislado de un gen natural o que esta modificado para que contenga segmentos de acido nucleico de tal manera que de otro modo no existirla en la naturaleza. La expresion "construction de acido nucleico" es sinonima de la expresion "casete de expresion" cuando la construccion de acido nucleico contiene las secuencias control necesarias para la expresion de la secuencia codificante.

El termino “vector de expresion” se refiere a una molecula de ADN, lineal o circular, que comprende la secuencia de acido nucleico de la invencion unida operativamente a segmentos adicionales que proporcionan la transcription del peptido codificado. En general, para introducir un gen especlfico en una celula diana se usa un plasmido. Una vez que el vector de expresion esta en el interior de la celula, la protelna codificada por el gen se produce por medio de los complejos ribosomicos de la maquinaria de transcripcion y traduction celular. Con frecuencia el plasmido se modifica por ingenierla genetica para que contenga secuencias reguladoras que actuan como regiones potenciadoras y promotoras que conducen a una transcripcion eficaz del gen transportado en el vector de expresion. El objetivo de un vector de expresion bien disenado es la production de grandes cantidades de ARN mensajero estable y, por lo tanto, de protelnas. Los vectores de expresion son herramientas basicas para la biotecnologla y para la produccion de protelnas, tales como enzimas. El vector de expresion de la invencion se introduce en una celula hospedadora de modo que el vector permanezca como un constituyente cromosomico o como un vector autorreplicante extracromosomico.

El termino "expresion" se refiere al proceso mediante el cual un polipeptido se sintetiza a partir de un polinucleotido. El termino incluye la transcripcion del polinucleotido en un ARN mensajero (ARNm) y la traduccion de dicho ARNm en una protelna o polipeptido.

Son ejemplos de vectores de expresion los fagos, cosmidos, fagemidos, los cromosomas artificiales de levaduras (YAC, por las siglas del ingles yeast artificial chromosomes), los cromosomas artificiales de bacterias (BAC, por las siglas del ingles bacterial artificial chromosomes), los cromosomas artificiales humanos (HAC, por las siglas del ingles human artificial chromosomes), o los vectores virales tales como adenovirus, retrovirus o lentivirus.

Los vectores de expresion apropiados para la insertion del polinucleotido de la invention son, preferiblemente, plasmidos utilizados para la expresion de protelnas en procariotas tales como, por ejemplo: los plasmidos pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados, mp18, mp19, pBR322, pMB9, Co1E1, pCR1, RP4 y pET, fagos y vectores "lanzadera", tales como pSA3 y pAT28; vectores de expresion en levaduras tales como el plasmido de 2 micrometros de Saccharomyces cerevisiae, plasmidos de integration, vectores YEP, plasmidos centromericos y similares; vectores de expresion en celulas de insecto tales como los vectores de las series pAC y pVL; vectores de expresion en celulas vegetales tales como las series piBi, pEarleyGate, PAVA, pCAMBIA, PGSA, PGWB, PM DC, PMY, pore y similares, y otros plasmidos de expresion de protelnas utilizados en celulas eucariotas, incluyendo baculovirus adecuados para la transfection celular. En una realization mas preferida, el vector de expresion es un plasmido pET23a.

Otro aspecto de la invencion se refiere a una celula hospedadora, en lo sucesivo en el presente documento "la celula hospedadora de la invencion", que comprende la secuencia de acido nucleico o la construction genetica de la invencion.

La expresion "celula hospedadora", como se usa en esta description, se refiere a cualquier celula procariota o eucariota que pueda ser receptora de un vector de expresion, vector de donation o cualquier otra molecula de ADN exogeno. Por lo tanto, la expresion incluye cualquier celula cultivable que pueda modificarse a traves de la introduction de ADN que no este contenido en ella de manera natural. Preferiblemente, una celula hospedadora es aquella en la que puede expresarse el polinucleotido de la invencion, dando lugar a un polipeptido estable, modificado postraduccionalmente y localizado en el compartimiento subcelular apropiado. La election de una celula hospedadora apropiada tambien puede verse influenciada por la eleccion de la senal de detection. Por ejemplo, el uso de construcciones con genes reporteros (por ejemplo, lacZ, luciferasa, timidina quinasa o protelna verde fluorescente "GFP”) puede proporcionar una senal seleccionable mediante la activation o inhibition de la transcription del gen de interes en respuesta a una protelna que regula la transcripcion. Para lograr una selection o cribado optimos, debe tenerse en cuenta el fenotipo de la celula hospedadora.

En una realization preferida de la celula hospedadora de la invention, esta es una celula de E. coli.

Otro aspecto de la invencion se refiere al uso de la celula hospedadora de la invencion para la production (expresion) de la enzima ADNP recombinante de la invencion.

La celula hospedadora de la invencion se puede cultivar para dicha finalidad. Un "cultivo de celulas hospedadoras" se refiere al proceso de mantenimiento y crecimiento in vitro de las celulas hospedadoras. Los cultivos celulares necesitan condiciones controladas de temperatura, pH, porcentajes de gases (oxlgeno y dioxido de carbono), ademas de la presencia de los nutrientes adecuados para permitir la viabilidad y la division celular. Los cultivos celulares pueden llevarse a cabo en sustratos solidos, tales como agar o en un medio llquido, lo que permite el cultivo de grandes cantidades de celulas en suspension. Las condiciones de cultivo in vitro dependeran del tipo de celula hospedadora seleccionada y sus requisitos. Los expertos en la materia sabran que condiciones y requisitos de cultivo especlficos deberlan aplicarse en cada caso.

Una vez que se ha cultivado la celula hospedadora de la invencion y se ha expresado la enzima ADNP recombinante de la invencion, esta puede purificarse. El termino "purificar", como se usa en la description, se refiere al aislamiento de la enzima ADNP recombinante de la invencion y su concentration, a partir de los otros polipeptidos presentes en el medio de cultivo de la celula hospedadora de la invencion. El aislamiento de la enzima puede llevarse a cabo utilizando tecnicas de solubilidad diferencial, cromatografla, electroforesis o isoelectroenfoque. Las tecnicas de cromatografla pueden basarse en el peso molecular, la carga ionica (basada en el estado de ionization de los aminoacidos en condiciones de trabajo), la afinidad de la protelna por determinadas matrices o columnas cromatograficas, o mediante etiquetas de purification, y puede llevarse a cabo en una columna, un papel o una placa. El aislamiento de la protelna puede llevarse a cabo, por ejemplo, mediante precipitation con sulfato de amonio, cromatografla llquida rapida de protelnas (FPLC, por las siglas del ingles, fast protein liquid chromatography) o cromatografla ilquida de alta resolution (HPLC, high performance liquid chromatography), utilizando sistemas automatizados que reducen significativamente el tiempo de purification y aumentan la eficacia de la purificacion.

Otro aspecto de la invention se refiere a un kit para amplificar o replicar un ADN molde, en lo sucesivo en el presente documento "el kit de la invencion", que comprende los siguientes elementos:

a. la ADNP recombinante de la invencion,

b. al menos un tampon,

c. dNTPs y

d. iones de magnesio o manganeso, preferiblemente iones de manganeso.

Preferiblemente, este kit de la invencion no comprende oligonucleotidos o cebadores.

El "tampon", al que se hace referencia en la presente description y en las reivindicaciones, puede seleccionarse, por ejemplo y sin limitation, de la lista que consiste en: clorhidrato de tris (Tris-HCL), tris-acetico, HEPES, BSA, Tween20, glicerol, EDTA, DTT, beta-mercaptoetanol, o cualquier combination de los mismos.

La expresion “dNTPs” se refiere a desoxinucleosidos trifosfato, tales como, por ejemplo, pero sin limitacion, dATP, dCTP, dITP, dUTP, dGTP, dTTP o derivados de los mismos. Preferiblemente, los desoxinucleosidos trifosfato utilizados en la presente invencion son dATP, dTTP, dGTP y dCTP. Incluso mas preferiblemente, estos cuatro dNTPs estan en condiciones equimolares en el kit de la invencion y en los metodos de la invencion descritos mas adelante.

En general, el kit de la invencion comprende todos los reactivos necesarios para llevar a cabo los metodos de la invencion descritos mas adelante. El kit tambien puede incluir, sin ningun tipo de limitacion, otros tampones, por ejemplo para controlar el pH, enzimas, tales como, por ejemplo, pero sin limitacion, otras polimerasas, helicasas, topoisomerasas y enzimas similares, cofactores para obtener una actividad optima de las mismas, reactivos para prevenir la contamination, etc. Asimismo, el kit puede incluir todos los soportes, dispositivos y receptaculos necesarios para su implementation y optimization. El kit tambien puede contener otras moleculas, genes, protelnas o sondas de interes, que pueden servir como controles positivos y/o negativos. Preferiblemente, el kit tambien comprende las instrucciones para llevar a cabo los metodos de la invention descritos mas adelante.

Otro aspecto de la invention se refiere al uso de la enzima ADNP recombinante de la invention o del kit de la invention para la amplification o replication in vitro de un ADN molde.

El termino "amplification”, como se usa en la presente description y en las reivindicaciones, se refiere a aumentar el numero de copias de un ADN molde.

El termino “replication”, como se usa en la presente description y en las reivindicaciones, se refiere a la slntesis de ADN complementario a partir de un ADN molde.

En una realization preferida de este aspecto de la invention, la amplification o replication del ADN molde se realiza en ausencia de oligonucleotidos (cebadores) anadidos externamente.

Otro aspecto de la invention se refiere al uso de una enzima ADN polimerasa que comprende el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1, o de un kit que comprende dicha enzima ADN polimerasa y los elementos (b) a (d) del kit de la invention que se han mencionado anteriormente, para la amplification o replication in vitro de un ADN molde en ausencia de oligonucleotidos (cebadores) anadidos externamente.

Las expresiones "en ausencia de oligonucleotidos (cebadores) anadidos externamente" y "actividad independiente de cebadores", como se usan en la presente invention, significan que la reaction de amplification o replication no esta provista externamente con cebadores presintetizados.

Las "enzimas ADN polimerasas que comprenden el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1", comprenden dicha secuencia de aminoacidos al final del ultimo dominio palm y ademas comprenden preferiblemente un motivo PolC que es TTD, lo que supone una diferencia con las pPolB, ya que las pPolB tienen un motivo PolC que es DxD donde "x" es cualquier aminoacido.

Ejemplos de ADN polimerasas que comprenden el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 son, pero sin limitation, las SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 8 o cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 9 a 42. Las ADN polimerasas que comprenden el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 y que tienen al menos un 70 %, mas preferiblemente al menos un 80 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96%, 97%, 98 % o 99 %, de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 8 o con cualquiera de las secuencias mostradas en las SEQ ID NOs: 9 a 42, tambien estan comprendidas dentro de este aspecto de la invention. Ejemplos de ADN polimerasas que comprenden el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 y que tienen al menos un 70 % de identidad de secuencia con estas secuencias son las SEQ ID NO: 43 y 44.

En una realization preferida, la enzima ADN polimerasa que comprende el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 comprende la secuencia de aminoacidos que consiste en la SEQ ID NO: 2. Mas preferiblemente, esta SEQ ID NO: 2 esta codificada por la secuencia de acido nucleico con codones optimizados de SEQ ID NO: 45.

La expresion “ADN molde” se refiere a una molecula de ADN que se va a copiar, replicar o amplificar en un metodo de amplification a traves de la slntesis de una cadena de ADN complementaria; es decir, se refiere a una molecula de ADN que se replicara o amplificara. El ADN molde puede ser, pero sin limitacion, ADN plasmldico o ADN genomico, mas preferiblemente ADN genomico. En otra realizacion preferida, el ADN molde de la presente invencion es el genoma completo comprendido en una celula.

En otra realizacion preferida de la presente invencion, el ADN molde al que se hace referencia a lo largo de la description y las reivindicaciones es lineal o circular, donde dicho ADN lineal o circular puede ser bicatenario (cadena doble) o monocatenario (cadena sencilla). Mas preferiblemente, el ADN molde al que se hace referencia en la presente invencion es monocatenario; incluso mas preferiblemente ADN monocatenario circular.

El ADN molde al que se hace referenda a lo largo de la presente invention puede ser ADN danado o no danado. Preferiblemente, es ADN danado. El "ADN danado" es un ADN que comprende danos en su secuencia, donde dichos danos preferiblemente bloquean la slntesis de ADN por ADNPs replicativas. Preferiblemente, este dano es causado, por ejemplo, por la presencia de uno o mas sitios abasicos, bases oxidadas tales como timinglicol (Tg), o desaflos genotoxicos relacionados con agentes que danan el ADN tales como la exposition a mitomicina C (MMC) o la irradiation con luz ultravioleta. Mas preferiblemente, el ADN danado comprende danos no voluminosos en bases.

En la tecnica se conoce una gran cantidad de metodos que permiten la amplification del ADN. Algunos metodos requieren un proceso de termociclado, tal como, por ejemplo, pero sin limitation, la reaction en cadena de la polimerasa (PCR, del ingles polymerase chain reaction). Otros metodos no requieren un proceso de termociclado, sino que se llevan a cabo a una temperatura esencialmente constante, tales como, por ejemplo, pero sin limitacion, amplificacion por clrculo rodante (RCA, rolling circle amplification), amplificacion de desplazamiento multiple (MDA, multiple displacement amplification), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA, strand displacement amplification) o amplificacion mediada por bucle (LAMP, loop mediated amplification), entre otros.

En otra realization preferida de la presente invencion, la amplificacion del ADN molde a la que se hace referencia a lo largo de la description y las reivindicaciones, se realiza mediante una tecnica seleccionada de la lista que consiste en: reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica de desplazamiento multiple (MDA), amplificacion por clrculo rodante (RCA), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA, nucleic acid sequence based amplification), reaccion en cadena de la ligasa (LCR, ligase chain reaction), amplificacion dependiente de helicasa (HDA, helicase dependent amplification), metodo de amplificacion por ramification (RAM, ramification amplification method) o amplificacion mediada por bucle (LAMP). Mas preferiblemente, la amplificacion se realiza por RCA.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro, en lo sucesivo en el presente documento "el primer metodo de la invencion", para amplificar o replicar un ADN molde que comprende:

a. poner en contacto un ADN molde con una mezcla de reaccion que comprende:

- la enzima ADNP recombinante de la invention,

- un tampon,

- iones de magnesio o manganeso, preferiblemente iones de manganeso, y - dNTPs, y

b. incubar el ADN molde con la mezcla de reaccion en condiciones que permitan la amplification del ADN.

En una realization preferida de este primer metodo de la invencion, la mezcla de reaccion no comprende oligonucleotidos (cebadores).

El termino "cebador" u "oligonucleotido" se refiere a oligonucleotidos de ADN o ARN cortos, por ejemplo de 18-22 bases, que son complementarios a la secuencia de un determinado acido nucleico molde, y que actuan como punto de partida para la adicion de nucleotidos en el proceso de copia de una cadena complementaria a la secuencia de dicho acido nucleico molde, por ejemplo, pero sin limitation, en una PCR. El termino "cebador" se refiere por lo tanto a un oligonucleotido capaz de actuar como punto de partida de la slntesis de ADN cuando esta en condiciones de extension del cebador.

Otro aspecto de la invencion se refiere a un metodo in vitro, en lo sucesivo en el presente documento "el segundo metodo de la invencion", para amplificar o replicar un ADN molde que comprende:

a. poner en contacto un ADN molde con una mezcla de reaccion que comprende:

- una enzima ADN polimerasa que comprende el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 o un kit que comprende dicha enzima ADN polimerasa, - un tampon,

- iones de magnesio o manganeso, preferiblemente iones de manganeso, y - dNTPs, y

b. incubar el ADN molde con la mezcla de reaccion en condiciones que permitan la amplificacion del ADN,

donde la mezcla de reaccion de la etapa (a) no comprende oligonucleotidos (cebadores).

En una realization preferida del segundo metodo de la invention, la enzima ADN polimerasa que comprende el peptido que consiste en la SEQ ID NO: 1 comprende la secuencia de aminoacidos que consiste en la SEQ ID NO: 2. Mas preferiblemente, esta SEQ ID NO: 2 esta codificada por la secuencia de acido nucleico optimizada de SEQ ID NO: 45.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, el ADN molde es lineal o circular, donde dicho ADN lineal o circular puede ser bicatenario o monocatenario. Mas preferiblemente, el ADN molde es monocatenario; incluso mas preferiblemente ADN monocatenario circular.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, si el ADN molde es bicatenario, estos metodos comprenden ademas una etapa adicional, antes de la etapa (a), de desnaturalizacion del ADN molde. Esta desnaturalizacion puede consistir, por ejemplo, y sin limitation, en el uso de enzimas capaces de desenrollar el ADN de una estructura bicatenaria a una estructura monocatenaria para facilitar la replication de cada cadena, dichas enzimas pueden ser, por ejemplo, helicasa y/o topoisomerasa II.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, la amplification del ADN molde se realiza mediante una tecnica seleccionada de la lista que consiste en: reaction en cadena de la polimerasa (PCR), amplification isotermica de desplazamiento multiple (MDA), amplification por clrculo rodante (RCA), amplification por desplazamiento de cadena (SDA), amplification basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), reaction en cadena de la ligasa (LCR), amplification dependiente de helicasa (HDA), metodo de amplification por ramification (RAM) o amplification mediada por bucle (LAMP). Mas preferiblemente, la amplificacion se realiza por RCA.

Se entiende que "poner en contacto" es que el ADN molde y la mezcla de reaction se incuban en condiciones de extension del ADN. La expresion "condiciones de extension del ADN" o "condiciones que permiten la amplification del ADN" hace referencia a las condiciones en las cuales puede tener lugar la slntesis dependiente de ADN molde.

La expresion "condiciones que permiten la amplification del ADN" se refiere a las condiciones en las cuales puede tener lugar la incorporation de los nucleotidos a un ADN naciente por medio de la complementariedad de bases con un acido nucleico molde. En general, las condiciones en las cuales se realiza la amplification de ADN incluyen: (a) poner en contacto el acido nucleico molde con la ADN polimerasa en una mezcla que tambien comprenda un cation divalente, por ejemplo, magnesio o manganeso, y nucleotidos, y (b) someter dicha mezcla a una temperatura y tiempo suficientes para que la ADN polimerasa inicie la incorporacion de los nucleotidos al ADN naciente por medio de la complementariedad de bases con el acido nucleico molde y de lugar a una poblacion de moleculas de ADN complementarias de diferentes tamanos.

En algunas realizaciones preferidas de los metodos de replication o amplification de la invention, al menos un dNTP se marca mediante tecnicas bien conocidas en la materia. Las etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isotopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimaticas.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, la concentration de la enzima ADN polimerasa es de entre 50 nM y 100 pM, mas preferiblemente 500 nM.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, la concentration de los dNTPs es de entre 100 nM y 1 mM, mas preferiblemente entre 100 nM y 500 pM, incluso mas preferiblemente entre 10 pM y 100 pM.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, el tampon tiene un pH de entre 7,0 y 8,5.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, la concentration de los iones de magnesio y manganeso es de entre 0,1 y 20 mM.

En otra realization preferida del primer y segundo metodo de la invention, la incubation de la etapa (b) tiene lugar a una temperatura constante de entre 20 y 40 °C y durante entre 5 min y 24 h.

A menos que se definan de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comunmente un experto familiarizado con la tecnica a la cual pertenece la presente invention. En la practica de la presente invention pueden utilizarse metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento. A lo largo de la description y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variaciones no pretenden excluir otras caracterlsticas tecnicas, aditivos, componentes, o etapas. Objetos adicionales, ventajas y caracterlsticas de la invencion resultaran obvias para los expertos en la tecnica tras examinar la descripcion o pueden aprenderse mediante la practica de la invencion. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustracion y no pretenden ser limitativos de la presente invencion.

DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

FIG. 1. La piPolB recombinante de la pipolina de E. coli 3-373-03_S1_C2, es una ADNP activa y fiable con actividad de correction de errores intrinseca.

(A) Ensayos de extension de cebador con un sustrato duplex molde de oligonucleotido/cebador (1 nM) como se representa sobre el gel (SEQ ID NO: 79). Las reacciones se incubaron durante 10 minutos a 30 °C en presencia de 10 nM de una variante de piPolB deficiente en polimerasa D368A o de tipo silvestre (TS), la cantidad indicada de dNTPs y desencadenado con MgCl210 mM. Cuando se indica, como control se utilizo la ADN polimerasa de 029 (029). A la derecha se indican las posiciones del sustrato 15-mer y los productos de degradation y polimerizacion. (B) Preferencia de insertion de nucleotidos por la variante de piPolB deficiente en exonucleasa D59A/E61A en presencia de cantidades crecientes de cada dNTP como se indica. Molde sobre el gel (SEQ ID NO: 80).

FIG. 2. Caracterizacion de la capacidad de STL eficaz de piPolB. (A) Experimento de extension de cebador frente a un molde que contiene el sitio abasico. El ensayo se llevo a cabo como se indica en la Figura 1A, pero con un sustrato molde/cebador que contenla un analogo del sitio abasico de THF (F) como se representa encima del gel (SEQ ID NO: 81). (B) Seguimiento paso a paso de la replication de piPolB del molde que contiene THF por adicion secuencial de los dNTP (0,1 pM), como se indica. El sustrato se representa encima del gel (SEQ ID NO: 82) y se indica el tamano esperado. Las posiciones del sustrato 15-mer, as! como los marcadores 19, 22 y 33-mer (carril M), tambien se indican a la derecha. (C) Efecto de cofactores metalicos divalentes sobre la capacidad de polimerizacion de piPolB en moldes danados y no danados (SEQ ID NO: 83). Las reacciones se desencadenaron con MnCl21 mM o MgCl210 mM, como se indica. (D) Capacidad de STL de piPolB en moldes danados de ADN alternativos, que contienen timinglicol (Tg) o dlmeros de timina ciclobutano (T:T) (SEQ ID NO: 83) desencadenados por la presencia de iones de manganeso o magnesio.

FIG. 3. Sintesis de ADN independiente de cebador por piPolB de pipolinas. Electroforesis de agarosa alcalina (A) y TAE no desnaturalizante (B) de productos de replicacion de ADN M13. Los ensayos (20 pl) se llevaron a cabo en presencia de 20 nmoles de ADNmc de M13 cebado (carriles 1, 3-8) o no cebado (carriles 9-15), dNTPs 100 pM y [a32P]dATP 1 pCi. Las variantes de tipo silvestre, D368A y D59A/E61A de piPolB se ensayaron a 500 nM o, cuando se indica, a concentraciones decrecientes de piPolB de tipo silvestre (500, 250, 100 y 50 nM, carriles 3-6 y 10-13). Por referencia, como control se utilizo ADN polimerasa de 029 100 nM (carriles 1 y 9). Como controles negativos (carriles 16-19) tambien se realizaron ensayos de control sin molde de ADN de entrada. Las reacciones se incubaron durante 20 min a 30 °C y, despues de la adicion de solucion de parada (EDTA 50 mM, SDS al 0,5 %), se dividieron para cargar las mismas muestras en ambos geles. Para mas detalles veanse los metodos de STAR. Los marcadores de ADN A (carriles 2 y 20) y la unidad de la longitud de ADNmc de M13 (flecha) se indican a la derecha. (C) Electroforesis de agarosa TAE no desnaturalizante de los productos de replicacion M13 en presencia de dNTPs 100 pM (carriles 1-3 y 7-9) o NTPs (carriles 4-6 y 10-12), como se indica. Los ensayos de replicacion se realizaron con variantes de piPolB de tipo silvestre o D59A/E61A y se desencadeno con MgCl210 mM (carriles 1-6) o MnCl21 mM (carriles 7-12). (D) Sintesis de cebador y replicacion de molde de ADN poli-dT homopolimerico (1 pM) mediante piPolB (500 nM). Las reacciones se desencadenaron con MnCl21 mM y se resolvieron mediante PAGE al 20 % - urea 8M a alta resolucion. Los cebadores P4, P10, P15 y 33A (vease la Tabla 2) marcados con 32P en el extremo 5', se cargaron como marcadores de tamano (carril M), y el tamano de los productos mas cortos detectados se indica a la derecha.

FIG. 4. Sintesis de ADN de novo por piPolB. (A) Sintesis de cebador por piPolB. Se incubo ADN de M13 con dNTPs o NTPs (100 pM) y piPolB de tipo silvestre (WT, wild type) o las variantes deficientes en polimerasa (D368A) o exonucleasa (D59A/E61A) (500 nM). Los productos detectados se marcaron con [y32P]ATP (1 pCi) que solo podia incorporarse en la position 5' de los cebadores recien sintetizados. (B) Preferencia de insertion para las primeras etapas de la slntesis de ADN cebador mediante la piPolB deficiente en exonucleasa. El ensayo se realizo como en el panel A pero con cada dNTP (100 pM) proporcionado independientemente o en las combinaciones indicadas. Las reacciones se desencadenaron con MgCl210 mM o MnCl21 mM y se resolvieron mediante PAGE al 20 % - urea 8M a alta resolution.

FIG. 5. El residuo K613 invariable de las piPolB desempena un papel en la STL y en la sintesis de cebador de novo. (A) Ensayos de extension de cebador de las piPolB de tipo silvestre, K613A y H614A, con etiqueta de His. Los ensayos se realizaron durante 10 minutos a 30 °C en presencia de duplex cebador/molde 1 nM, dNTPs 10 pM y la concentration indicada de variantes de piPolB. (B) Slntesis de cebador por las piPolB de tipo silvestre, K613A y H614A, con etiqueta de His. (C) Comparacion de la capacidad de extension de cebador de las piPolB de tipo silvestre y K613A con etiqueta de His, frente a moldes no danados (X = T) o danados (X = THF) (SEQ ID NO: 83). Las reacciones se desencadenaron con MnCl2 1 mM y se resolvieron mediante PAGE al 20 % - urea 8M.

FIG. 6. Supervivencia de celulas de E. coli (DE3) que expresan variantes de piPolB de tipo silvestre o D368A inactiva despues de exposiciones a danos en el ADN. Los graficos muestran la supervivencia relativa (media y error estandar de cuatro experimentos independientes) de celulas que sobreexpresan variantes de piPolB deficientes en polimerizacion de ADN o de tipo silvestre despues de la exposition genotoxica con MMC (A) o irradiation con luz UV (B).

FIG. 7. Efecto del contexto de secuencia y concentracion de la enzima sobre la capacidad de STL por piPolB. (A) Analisis en PAGE desnaturalizante de productos de extension de cebador por la ADN polimerasa de 029 (029) y piPolB. Como se indica, las variantes de piPolB de tipo silvestre, D368A (deficiente en polimerasa) y D59A/E61A (deficiente en exonucleasa) se ensayaron utilizando dos contextos de secuencia diferentes (carriles 1-10, SEQ ID NO: 83, frente a 11-20, SEQ ID NO: 84), en ausencia (carriles 1-5 y 11-15) o en presencia (carriles 6-10 y 16-20) de un analogo de sitio abasico de THF. Las representaciones esquematicas de cada sustrato molde/cebador se representan arriba. (B) Replication procesiva de sustratos cebador/molde disminuyendo las concentraciones de piPolB de tipo silvestre. Las reacciones se realizaron en presencia de dNTPs 1 pM (carriles 1-9) o 100 pM (carriles 10-18) para moldes no danados (SEQ ID NO:79) o danados (SEQ ID NO: 81), respectivamente.

FIG. 8. Capacidad de desplazamiento de cadena de piPolB. Analisis con PAGE desnaturalizante de replication de un duplex cebador/molde con hueco (SEQ ID NO: 79) (carriles 1-7) o con un hueco de 5 nucleotidos (carriles 8-14) obtenido con un oligonucleotido aguas abajo (P20-33, Tabla 2) que debe desplazarse para reanudar la replication mediante piPolB (carriles 6-7 y 13-14). Como controles positivos y negativos, se usaron variantes de tipo silvestre y ATPR2 de la ADN polimerasa de 029, respectivamente.

FIG. 9. Efecto de los cationes divalentes sobre la replicacion de novo del sustrato de ADNmc homopolimerico mediante piPolB. Sfntesis de cebador y replicacion de molde de ADN poli-dT homopolimerico (1 pM) mediante variantes de piPolB de tipo silvestre (WT) o deficiente en exonucleasa (D59A/E61A) (500 nM). Las reacciones se desencadenaron con MgCl210 mM o MnCl21 mM y se resolvieron mediante PAGE al 20 % - urea 8M a alta resolution. Los cebadores P4, P10, P15 y 33A (vease la Tabla 2) marcados con 32P en el extremo 5', se cargaron como marcadores de tamano (carril M), y el tamano de los productos mas cortos detectados se indica a la izquierda y a la derecha, respectivamente.

FIG. 10. Pequeno efecto de modificaciones individuales de la secuencia molde en la replicacion de novo del sustrato de ADNmc homopolimerico mediante piPolB. Los moldes de ADNmc alternativos se representan encima del gel (SEQ ID NO: 69 a 73).

FIG. 11. Capacidades polimerasa y primasa de las variantes de piPolB en los residuos analogos del motivo KxY de PolB. Capacidad de extension de cebador (A) y de sfntesis de cebador (B) de las piPolB de tipo silvestre, K623A y R625A con etiqueta de His. Los ensayos se realizaron como se describe en la Figura 4. Por referencia, en el panel B tambien se incluyeron variantes de piPolB de tipo silvestre y deficientes en exonucleasa y polimerasa sin etiqueta de His.

EJEMPLOS

Para ilustrar la invencion se proporcionan los siguientes ejemplos, que no pretenden limitar el alcance de la misma. Dichos ejemplos se basan en ensayos llevados a cabo por los inventores y muestran la actividad de replication eficaz, independiente de cebador, de la piPolB de SEQ ID NO: 2, asl como su capacidad de slntesis de translesion.

Ejemplo 1. Un nuevo grupo principal de ADN polimerasas de la familia B.

Las busquedas con PSI-BLAST frente a la base de datos del genoma bacteriano RefSeq en NCBI sembrado con la secuencia de la pPolB experimental mente caracterizada del bacteriofago Bam35 (NP_943751), recuperaron numerosos resultados con similitud a las PolBs. Estas pudieron categorizarse en dos grupos: (i) resultados muy significativos (38-99% de identidad de secuencia) para las pPolBs codificadas dentro de los contigos genomicos relacionados con los bacteriofagos Bam35 (familia Tectiviridae) y 029 (subfamilia Picovirinae, familia Podoviridae); (ii) resultados para homologos de pPolB muy divergentes codificados en cromosomas y diversos plasmidos de bacterias muy diversas, tales como Firmicutes, Actinobacteria y Proteobacteria. Las ultimas protelnas mostraron una identidad de secuencia de ~ 16-20 % con la pPolB de Bam35. No obstante, el analisis de multiples alineamientos de secuencia de estas supuestas ADNPs divergentes mostro que todas ellas contienen los subdominios TPR1 y TPR2, un sello distintivo de las pPolBs, y los residuos del sitio activo de los dominios de exonucleasa y ADN polimerasa de las PolBs estan conservados, aunque con notables variaciones dentro de los motivos KxY y PolC. El motivo PolC (DTD) esta casi universalmente conservado en las PolBs y contiene dos residuos de acido aspartico catalltico necesarios para la actividad de la protelna. En la presente invencion, se observo que en todos los miembros del nuevo grupo piPolB, el primero de los dos aspartatos dentro del motivo PolC esta sustituido por un resto de treonina (TTD). De manera destacable, algunas pPolBs de arqueas tambien muestran variation dentro de este motivo, pero ninguna de estas protelnas se ha caracterizado experimentalmente.

Busquedas adicionales sembradas con secuencias representativas del nuevo grupo PolB de proteobacterias, tales como bacterias de Escherichia coli (KDU42669) o Rhodobacterales Y4I (WP_008555115), produjeron resultados significativos con respecto a varios homologos codificados por plasmidos mitocondriales circulares similares a pCRY1. De manera destacable, los ultimos plasmidos son distintos de los plasmidos mitocondriales lineales tan estudiados que codifican las pPolBs (vease a continuation). El analisis de secuencia de las protelnas mitocondriales confirmo su estrecha similitud con el grupo divergente de PolBs bacterianas.

Para comprender mejor la relation entre el grupo recientemente descubierto de ADNPs y las pPolBs, se realizo un analisis filogenetico de maxima probabilidad de secuencias representativas de todos los clados de pPolBs conocidos, incluidos virus de bacterias, arqueas y eucariotas, casposones, polintones, asl como plasmidos lineales eucariotas citoplasmaticos y mitocondriales. En el arbol filogenetico enraizado con secuencias de rPolB, todas las pPolBs previamente caracterizadas formaron un clado monofiletico bien confirmado, con un patron de ramification coherente con analisis filogeneticos previos. Las nuevas ADNPs formaron un clado distinto, bien confirmado, que en la presente invention se denomino "piPolB" (vease a continuacion), separado de las pPolBs restantes, sugiriendo que ha divergido al principio de la evolution de las PolBs. Por tanto, las piPolB representan el tercer grupo principal de las PolBs, junto con las rPolBs y pPolBs.

Dentro del clado piPolB, hay dos grupos principales, que son mas o menos congruentes con la taxonomla bacteriana. El primero incluye predominantemente secuencias de Actinobacteria y diversos ordenes de Firmicutes, en concreto, Bacillales, Lactobacillales y Clostridiales. El segundo grupo contiene secuencias de diferentes clases de Proteobacteria, en concreto Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria y Deltaproteobacteria. De manera destacable, el ultimo grupo tambien incluye las piPolBs de plasmidos mitocondriales circulares que se agrupan con secuencias de alfaproteobacteria. Aunque el ultimo grupo no esta muy confirmado en este analisis, esta observation es mas coherente con la posibilidad de que las piPolBs se importaran en eucariotas junto con el simbionte alfaproteobacteriano en el origen de las mitocondrias. Por tanto, las piPolBs parecen haber coevolucionado con sus hospedadores durante un perlodo de tiempo prolongado, a pesar de varios casos posibles de transferencia horizontal de genes.

Ejemplo 2. Las piPolBs estan codificadas dentro de un nuevo grupo de elementos autorreplicantes.

El analisis de contexto genomico proporciono pruebas convincentes de que la mayoria de las piPolBs estan codificadas dentro de los EGM (elementos geneticos moviles) integrados en los cromosomas bacterianos. A diferencia de los casposones y polintones, que se integran en el genoma utilizando endonucleasas similares a Cas1 e integrasas de la familia similar a retrovirus, respectivamente, la inmensa mayoria de los EGM que llevan piPolB codifican integrasas de la superfamilia de tirosina recombinasas (integrasas Y). Algunos de los elementos llevan copias adicionales de integrasas Y o integrasas/invertasas de la superfamilia de las serina recombinasas. No obstante, diversos homologos piPolB bacterianos y todos los mitocondriales estan codificados por plasmidos extracromosomicos, en lugar de integrados, y, por consiguiente, carecen de los genes integrasa, lo que sugiere que la integration en el cromosoma es opcional para estos elementos. Por tanto, en la presente invention, todos estos nuevos elementos bacterianos y mitocondriales se denominaron pipolinas (por elementos geneticos moviles codificantes de piPolB).

La integracion de los EGM deja una marca molecular en el cromosoma celular que se manifiesta en forma de repeticiones directas, correspondiente a los sitios de insertion izquierdo y derecho (attL y attR, del ingles left attachment y right attachment), que flanquean el elemento integrado. Las integrasas Y tlpicamente catalizan la recombinacion entre sitios homologos presentes en el genoma celular y las moleculas de ADNbc circular de los EGM. Un analisis exhaustivo de las regiones genomicas que abarcan las piPolB, permitio definir los sitios de integracion exactos de muchas pipolinas de diversos taxones bacterianos. La inmensa mayoria de las integraciones ocurrieron dentro de los genes de ARNt, como es habitual para los EGM de bacterias y arqueas que emplean integrasas Y. Algunas bacterias llevan mas de una pipolina. Por ejemplo, el genoma de Vibrio vulnificus contiene dos elementos relacionados que codifican piPolB insertados en diferentes genes de ARNt.

El analisis genomico comparativo de las pipolinas mostro que forman grupos que generalmente son coherentes con la filogenia de las piPolBs. La similitud entre elementos de hospedadores distantemente relacionados se limita a los genes de piPolB y, en menor medida, de integrasa Y. Ademas de piPolB e integrasas, a menudo las pipolinas codifican excisionasas, que ayudan en la escision de los EGM integrados; componentes de sistemas de modification de restriction de tipo I y tipo II; y varios componentes de la maquinaria de movilizacion de plasmidos. Ademas, los genes menos conservados que se encuentran en las pipolinas codifican diferentes protelnas de union al ADN con motivos cinta-helice-helice, dedo de zinc o helice-giro-helice, aunque tambien protelnas de cromatina H-NS similares a histona, varias nucleasas y sistemas toxina-antitoxina. Ninguno de los elementos codifica protelnas especlficas de virus. Por el contrario, el pangenoma de las pipolinas consiste en varios genes tlpicos de plasmidos. De hecho, el analisis BLASTP muestra que la mayorla de los genes pipolina estan conservados en varios plasmidos no relacionados. De acuerdo con esta afirmacion, cuatro de las piPolBs bacterianas y cinco mitocondriales estan codificadas por plasmidos circulares. De manera destacable, los plasmidos mitocondriales no llevan otros genes que los que codifican piPolB, lo que sugiere que despues de la introduction de un ancestro mitocondrial en un hospedador protoeucariota, los EGM experimentaron evolution reduccionista, perdiendo todos los genes excepto los de piPolB.

Aunque la piPolB es la unica protelna asociada a la replication del ADN conservada en todas las pipolinas, algunos elementos codifican supuestas helicasas de las superfamilias 1 y 2; exonucleasas 3'-5'; uracil-ADN glicosilasas; ribonucleasas H; y una ATPasa AAA+ similar a Orc1/Cdc6. A diferencia de los plasmidos y virus que codifican pPolB que, como regla, tienen genomas lineales, las pipolinas representan moleculas de ADNbc circular y, por lo tanto, es poco probable que el mecanismo de cebado por protelna sea aplicable. La abrumadora mayorla (94%) de los virus de ADNbc que codifican las ADNP cebadas por ARN, tambien codifican sus propias primasas. Por el contrario, ninguna de las pipolinas posee genes para primasas reconocibles, lo que plantea preguntas sobre el mecanismo de cebado.

En conjunto, los resultados de los analisis genomicos filogeneticos y comparativos subrayan la singularidad de las piPolBs y pipolinas, que se pueden considerar como la tercera gran superfamilia de EGM autorreplicantes, junto con los polintones y casposones.

Ejemplo 3. La ADN polimerasa pipolina es una replicasa competente.

Para verificar si las piPolBs eran verdaderamente ADNPs activas, se eligio una enzima representativa de la pipolina de E. coli 3-373-03-S1_C2 (SEQ ID NO: 2) y se purifico su forma recombinante. Primero se analizaron las actividades sinteticas y degradativas de esta protema en un ensayo de extension de cebador, en presencia de concentraciones crecientes de dNTPs (Figura 1A, carriles 4-9). Como se esperaba, en ausencia de dNTPs, solo pudieron detectarse productos de degradation. Sin embargo, la adicion de los dNTPs dio como resultado un cambio de actividad de exonucleolisis a polimerizacion, indicando que ambas actividades estan coordinadas. Las variantes de protemas con actividades deficientes de polimerizacion (D368A, Figura 1A, carriles 10­ 11 y Figura 7A) o exonucleasa (D59A/E61A, Figura 7A), confirmaron que las capacidades 5'-3' sinteticas y 3'-5' degradativas son intrinsecas para la piPolB purificada recombinante. La presencia de actividad de polimerizacion de ADN competente en piPolB confirma que para la coordination con los cofactores metalicos, solo se requiere el segundo grupo carboxilato en el motivo PolC, en consonancia con las sugerencias anteriores de que el primer resto de aspartato conservado en el motivo PolC en los grupos pPolB y rPolB, tiene un papel estructural en lugar de catalrtico.

Para caracterizar adicionalmente la actividad de polimerizacion de ADN de piPolB, se analizo la preferencia de insertion para los pares de bases de Watson y Crick utilizando la variante de piPolB deficiente en exonucleasa, D59A/E61A. Tal como se muestra en la Figura 1B, la insercion del nucleotido correcto podria detectarse a una concentration de dNTP aproximadamente 1000 veces menor en comparacion con la del dNTP incorrecto, lo que indica una preferencia muy fuerte por la insercion del nucleotido complementario. Estos resultados confirman que la piPolB de las pipolinas es una ADN polimerasa eficaz y fiable, como se esperaria de una ADNP replicativa de la familia B.

Ejemplo 4. La piPolB esta dotada de sintesis de translesion intrinseca a traves del ADN que contiene analogos de nucleotidos no voluminosos.

Los sitios abasicos (AP) constituyen la lesion de ADN mas habitual que puede surgir de la despurinacion espontanea, pero tambien se presenta como productos intermedios en la reparation de la escision de bases. Un modelo predominante es que las ADNP replicativas de alta fidelidad no pueden replicar a traves de dichas lesiones en el ADN, lo que conduce a detener la replication y al desencadenamiento posterior de los mecanismos de tolerancia al dano del ADN, lo que implica ADNPs especializadas que pueden evitar el dano del ADN por sintesis de translesion (STL).

Adicionalmente, trabajos recientes comunicaron ejemplos de STL por replicasas celulares y vmcas de las familias A, B o C durante la replication procesiva del genoma. Por tanto, para determinar si piPolB era capaz de replicar moldes danados, primero se analizo la extension del cebador frente a un dominio de tetrahidrofurano (THF), un analogo estable de un sitio abasico, en la primera position nucleotidica del molde. Tal como se muestra en la Figura 2A, piPolB es capaz de insertar el primer nucleotido y extender el cebador mas alla del THF (lmeas 4-9), mientras que, tal como se esperaba, la ADNP029 solo dio lugar a una replicacion insignificante (lmeas 2-3). La capacidad de evitar el error a menudo depende del contexto de la secuencia y esta contrarrestada por la actividad de correccion de errores. Sin embargo, la capacidad de STL de piPolB no parece verse afectada por el contexto de la secuencia molde (Figura 7A). En el sitio de la lesion pudo detectarse una banda minoritaria (16-mer) de producto parcial, lo que sugiere que, como se mostro previamente para la ADNP de Bam35, la elongation del cebador mas alla del sitio abasico es una etapa limitante en la STL mediante piPolB, a pesar de que la replicacion de ambos moldes de oligonucleotidos no danados y danados puede ser procesiva (Figura 7B).

Despues, se analizo la preferencia de incorporation frente al sitio de THF. Utilizando la variante D59A/E61A deficiente en exonucleasa, se descubrio que piPolB inserta preferiblemente purinas sobre pirimidinas (Figura 2B, carriles 3-6), en el orden de preferencia A> G> T> C, en consonancia con la denominada "regla A" descrita anteriormente para muchas ADNPs. La STL por las ADNPs podna producirse a traves de un mecanismo de desalineacion, que da como resultado una delecion de uno o dos nucleotidos y, por consiguiente, un producto de ADN mas corto. Las Figuras 2A y 7A muestran que el producto final sintetizado por piPolB alcanzo la longitud total del producto utilizando sustratos danados y no danados, lo que sugiere que, en lugar de un mecanismo de desalineacion, la piPolB puede insertar y alargar adicionalmente un nucleotido frente al sitio abasico. Para verificar este mecanismo, se hizo un seguimiento paso a paso de la polimerizacion en un ensayo de extension de cebador en presencia de diferentes combinaciones de dNTPs (Figura 2B, carriles 7-11). En particular, se proporciono dATP en combination con otro dNTP unico (dTTP, dCTP y dGTP, carriles 7-9, respectivamente). Mientras que la insertion frente al THF se detecto en todos los casos, solo la combinacion dATP y dTTP (AT, carril 7) permitio la extension del cebador mas alla del sitio abasico, dando lugar a un producto que se corresponde con el marcador de 19-mer (Figura 2B, carril M), lo que indica la replication exacta del molde hasta esta position (vease el esquema del sustrato encima del gel). Consecuentemente, la presencia de dATP, dTTP y dGTP (ATG, carril 10) permitio la copia del molde hasta el producto de 22-mer de longitud, y solo cuando se proporcionaron los cuatro dNTPs, pudo detectarse el producto de replication de longitud completa (carril 11). En conjunto, estos resultados indican que la capacidad de STL de piPolB inserta preferiblemente una A frente a los sitios abasicos y posteriormente alarga el cebador de manera procesiva sin introducir mutaciones con desplazamiento del marco de lectura.

Para comprender mejor la replication de ADN mediada por piPolB y del rendimiento de STL, se analizo la evitacion del sitio abasico con diferentes cofactores metalicos y danos en el ADN que bloquean la replication. Como se muestra en la Figura 2C, la STL de sitio abasico en presencia de iones de manganeso fue mas eficaz a concentraciones mas bajas de dNTPs (carriles 19-22 frente a 8-11), en consonancia con informes previos sobre otras PolBs. Se observo que la replication del molde no danado requerla una mayor concentration de dNTPs en presencia de iones manganeso (carriles 14-17) en comparacion con las reacciones desencadenadas por magnesio (carriles 3-6). A continuation, se exploro la especificidad por el molde de la capacidad de STL de piPolB con sustratos que contienen la base oxidada de timinglicol (Tg) y dlmeros de ciclobutano timina (T:T). El Tg es el producto oxidativo mas habitual de la timina y presenta un fuerte bloqueo para la slntesis de ADN por la mayorla de las ADNPs replicativas. Por otra parte, T:T surge tras la exposition a la radiation de luz ultravioleta y constituye un obstaculo particularmente pronunciado para la mayorla de las ADNPs porque el enlace covalente de dos nucleobases adyacentes evita un retorcimiento en la cadena principal del ADN que normalmente hace accesible una base del molde al sitio activo de la polimerasa. Los resultados indican que piPolB pudo copiar la base oxidada de timinglicol (Tg) en presencia de iones de magnesio (Figura 2D, carriles 5-8). Sin embargo, curiosamente, la extension del cebador mas alla del dano fue menos eficaz, porque el intervalo de 16-mer es mas fuerte que en el caso del molde que contiene THF (carriles 8-11 en el panel C frente a carriles 5-7 en el panel D). En llnea con la alteration en la extension del cebador procesiva mas alla del dano, los iones de manganeso aparentemente no estimularon la STL. Por el contrario, la evitacion de Tg se redujo en presencia de este cofactor metalico (carriles 9-10). En el caso de T:T, la insertion de solo 1 o 2 nucleotidos frente al dano podrla detectarse ya sea con iones de magnesio o manganeso (carriles 12-14 y 15-17, respectivamente). En conclusion, piPolB tiene una capacidad de STL eficaz que le permite evitar sitios abasicos y modificaciones oxidativas de bases pero no puede superar modificaciones mas voluminosas tales como T:T, probablemente porque este dano induce cambios estructurales importantes en la helice de ADN que obstaculizan contundentemente la replication del ADN.

Ejemplo 5. Replicacion de ADN independiente de cebador.

Para obtener information sobre la procesividad de la replicacion de ADN por piPolB, se realizaron ensayos de replicacion por clrculo rodante de ADNmc cebado individualmente, utilizando como molde ADN de M13 y los productos se resolvieron mediante electroforesis desnaturalizante alcalina. Debido a su alta procesividad, junto con la capacidad de desplazamiento de cadena, la ADNP de 029 fue capaz de sintetizar fragmentos de ADNmc muy grandes en estas condiciones (Figura 3A, carril 1). Por el contrario, piPolB dio lugar a una senal borrosa de productos de replicacion que abarca de 0,5 a 10 kb, con un pico aparente de aproximadamente 3 kb (Figura 3A, carriles 3-6), lo que indica que la piPolB no es tan procesiva como la ADNP029 y, por lo tanto, genera fragmentos de ADN mas cortos. Sin embargo, la longitud maxima del producto obtenida con piPolB se mantuvo similar incluso a una concentration enzimatica 20 veces mas baja, lo que sugiere que es una replicasa de ADN procesiva. Una parte considerable de los productos de replicacion era mas grande que la del ADN M13, lo que sugiere que la replicacion del ADN por piPolB esta acoplada con el desplazamiento de cadena. La ultima actividad se confirmo posteriormente utilizando un sustrato de molde/cebador de oligonucleotidos con un hueco de 5 nt (Figura 8).

Increlblemente, se detecto un patron de replicacion muy similar independientemente de si el M13 estaba cebado o no (Figura 3A, carriles 10-13). Por el contrario, tal como se esperaba, la ADNP029 no pudo sintetizar ningun producto en ausencia de cebador (carril 9). Cuando se cargaron las mismas muestras en un gel de agarosa no desnaturalizante (Figura 3B), el producto de replicacion aparecio como una sola banda que correspondla a la longitud esperada de la unidad M13, sugiriendo que los productos de ADN monocatenarios detectados en el gel de electroforesis desnaturalizante alcalino son productos de replicacion M13. Consecuentemente, no se pudo detectar ningun producto en ausencia de molde de ADN entrante (carriles 16-19), descartando la replicacion de posibles trazas contaminantes de ADN en cualquiera de las variantes de la polimerasa. De la misma manera, cuando las reacciones se realizaron con la variante D368A deficiente para la actividad de polimerizacion (carriles 8 y 15) no se obtuvo ningun producto. De manera destacable, los fragmentos detectados con la enzima mutante D59A/E61A fueron ligeramente mas pequenos (en <0,5 kb) que con la enzima de tipo silvestre (Figura 3A carriles 7 y 14), presumiblemente porque la deficiencia de exonucleasa da lugar a la acumulacion de errores de replication que puede dar como resultado la alteration de la capacidad de desplazamiento de cadena o de procesamiento. Estos resultados confirman ademas que la replicacion del ADN M13, con o sin cebador anadido, es intrlnseca para piPolB. La slntesis de ADN de novo en ADN M13 no cebado podrla detectarse utilizando como cofactores iones tanto de magnesio como de manganeso (Figura 3C, carriles 2-3 y 8­ 9), aunque con una intensidad algo mayor del producto de replicacion total con iones de manganeso. Sin embargo, la replicacion no se detecto cuando los desoxirribonucleotidos se sustituyeron por ribonucleotidos (carriles 5-6 y 11-12), como se esperaba para una ADNP de la familia B que contiene la ventana esterica de tirosina conservada. Se detectaron fragmentos de ADN mas pequenos con la polimerasa de tipo silvestre que podrlan ser productos de la degradation exonucleolltica (carril 8).

Para investigar un posible requisito de secuencia para el inicio de novo de la replicacion del ADN, se realizaron ensayos que utilizaron, como molde, un poli-dT homopolimerico monocatenario de 33-mer. Como se muestra en la Figura 3D, la piPolB pudo replicar este molde, lo que sugiere que puede no haber un requisito para una secuencia de molde especlfica en las condiciones utilizadas. La replicacion del ADN en presencia del dATP complementario dio lugar a productos de ADN grandes y a un patron en escalera que indicaba que la replicacion comenzaba de novo, con la slntesis de cebadores cortos. Este patron en escalera podrla corresponder a una replicacion distributiva o a posiciones iniciadoras alternativas en todo el molde. Los productos de replicacion obtenidos utilizando la piPolB deficiente en exonucleasa fueron en general mas cortos, lo que sugiere una alteracion en la capacidad de procesamiento, como se descubrio en el caso de la replicacion de M13 (Figura 9, carriles 8-10 frente a 11-13). Usando este sustrato homopolimerico corto, la slntesis de cebadores de ADN fue insignificante con iones magnesio (Figura 9, carriles 2-7 frente a 8-13), lo que destaca la mayor eficacia del manganeso como cofactor para el cebado de ADN, en consonancia con los resultados previos con ADN M13 (Figura 3C).

Curiosamente, cuando se anadieron todos los dNTPs, la generation de productos de ADN grandes se redujo algo (Figura 3D, carril 6) y, si el dATP se redujo al nucleotido marcado (16 nM en comparacion con 100 pM del no marcado, carril 7), los productos de replication fueron insignificantes, lo que sugiere que para iniciar la replication se requiere la formation de pares de bases correctos de Watson y Crick.

En conjunto, estos resultados indican que la piPolB de la pipolina de E. coli 3-373-03_S1_C2 es capaz de iniciar y llevar a cabo la replication del ADN de moldes circulares y lineales en ausencia de cebadores preexistentes o factores proteicos adicionales. Asimismo, la replication de sustratos de ADN homopolimerico sugiere que, contrariamente a las ADN primasas canonicas de la superfamilia de primasas arqueoeucariotas (PAE), la capacidad cebadora de ADN de las piPolB no depende de una secuencia molde especlfica.

Ejemplo 6. Slntesis de novo de cebadores de ADN.

Para confirmar adicionalmente que piPolB es capaz de sintetizar ADN de novo, se realizo una replication de ADNmc M13 utilizando como nucleotido marcado y32P-ATP. Por tanto, solo los fragmentos de ADN recien sintetizados incorporarlan el marcador radiactivo. Tal como se muestra en la Figura 4A, se generaron pequenos fragmentos de ADN (de hasta 4-5 nucleotidos de longitud) de manera distributiva con las piPolBs de tipo silvestre y deficiente en exonucleasa, pero no con la variante D368A. De nuevo, esta reaction fue considerablemente mas eficaz en presencia de iones manganeso que con los de magnesio (carriles 1-8 frente a 9-16). Asimismo, los productos solo se detectaron en presencia de dNTPs pero no con NTPs (no se muestra). En lugar de los grandes fragmentos de ADN detectados en los ensayos descritos anteriormente (Figura 3A), solo se observaron cebadores di-y trinucleotldicos que pueden ser productos iniciadores abortivos resultantes de la incorporation de un ribonucleotido (en lugar de dNTP) como un nucleotido 5' terminal.

El uso de PAGE de alta resolution permitio identificar cebadores di y trinucleotldicos alternativos con intensidad similar, lo que sugiere que el inicio de la slntesis de ADN por piPolB no requiere una secuencia molde especlfica. En llnea con esto, cuando cada dNTP se proporciono por separado (Figura 4B), la reaction fue claramente estimulada por dGTP, en presencia de iones de magnesio o manganeso (carriles 4 y 14) y, en un menor grado, por dCTP y dTTP, en solitario o en combination con otros desoxirribonucleotidos. El hecho de que el dinucleotido A-dG sea el producto iniciador sintetizado de manera mas eficaz, esta en consonancia con la observation de que las pirimidinas son los sustratos molde preferentes para la reaction de cebado por la mayorla de las ADN primasas. En llnea con estos resultados, los cambios de un solo nucleotido en el sustrato homopolimerico poli-dT no cambiaron sustancialmente la eficacia de la slntesis de ADN de novo (Figura 10), aunque se pudieron detectar di- y tri-nucleotidos cortos cuando se incluyeron una o dos Cs en la secuencia molde, incluso en el extremo 5' de la molecula molde (carriles 7 y 12). En conjunto, estos resultados demuestran que piPolB es capaz de iniciar la slntesis de novo de cebadores de ADN sin un fuerte requerimiento de secuencia molde especlfica.

Ejemplo 7. Una lisina invariable juega un papel en las actividades de STL y slntesis de cebadores.

Las PolBs contienen un motivo KxY conservado dentro de una cadena p en el dominio palm implicado en la estabilizacion del extremo del cebador. Se formulo la hipotesis de que se requerirlan adaptaciones estructurales de este motivo o de residuos cercanos para la union estable de un nucleosido trifosfato en el lado 5' del cebador naciente para permitir la formation de dinucleotidos. De hecho, el analisis de la alineacion de secuencia multiple mostro que las piPolBs carecen del motivo KxY canonico y en su lugar contienen una secuencia conservada alternativa KTRG (SEQ ID NO: 46). Un patron KX2 adicional dentro de una extension N-terminal de la misma cadena p tambien esta altamente conservado en homologos de piPolB, definiendo un motivo KX2-X3-10-KTRG extendido (SEQ ID NO: 1). En la enzima representativa de SEQ ID NO: 2 ensayada en el presente documento, X2 es H y X3-10 es la SEQ ID NO: 5, es decir, la SEQ ID NO: 1 es la SEQ ID NO: 85, y este motivo KX2-X3-10-KTRG corresponde a las posiciones 613 a 626 de esta secuencia. Por tanto, se generaron variantes de alanina de estos residuos K613, H614, K623 y R625. En consonancia con un supuesto papel en la estabilizacion del extremo del cebador, las variantes K623A y R625A tenlan una capacidad de extension de cebador alterada (Figura 11A) y slntesis de cebador mas alla de la formacion de dinucleotidos (Figura 11B). Por otra parte, las protelnas K613A y H614A tenlan capacidad de extension de cebador normal en las condiciones ensayadas (Figura 5A). Sin embargo, mientras que H614A fue capaz de sintetizar nuevos cebadores con un patron similar al de piPolB de tipo silvestre (Figura 5B, carriles 6-7), la capacidad primasa de K613A se redujo fuertemente (carriles 4-5), lo que sugerla un papel especlfico de este resto durante la slntesis de ADN de novo.

Despues, se analizo la capacidad de STL de la variante K613A mediante un ensayo de extension de cebador en el molde que contenla THF. La Figura 5C muestra que la actividad de la protelna K613A se vio fuertemente alterada en comparacion con la piPolB de tipo silvestre (carriles 3-4 frente a 7-8). Por tanto, aunque la slntesis del cebador de ADN y la extension del cebador frente a los sustratos danados y no danados parecen depender de los mismos residuos catallticos conservados, como se muestra para la variante D368A (vease anteriormente), se pudieron desacoplar parcialmente estas actividades. Este resultado confirma adicionalmente las capacidades exclusivas intrlnsecas de STL y ADN primasa de piPolB y tambien revela el papel del motivo de estabilizacion de cebadores extendido del grupo piPolB que se requerirla para estas actividades.

Ejemplo 8. Papel biologico de piPolB en la slntesis de ADN de novo.

Teniendo en cuenta la capacidad primasa de ADN de piPolB, que no tiene precedentes en las enzimas de la familia PolB, se decidio investigar su funcion biologica in vivo. Para este fin, bacterias que expresaban piPolB se expusieron a Mitomicina C (MMC) y a irradiacion con luz ultravioleta (UV), los dos agentes que danan el ADN que se sabe que bloquean la replicacion del ADN al introducir modificaciones de base voluminosas y entrecruzamientos intercatenarios (EIC). Dado que piPolB no fue capaz de replicar un molde que contenla T:T (Figura 2D), es poco probable que su capacidad de STL pueda permitir evitar el dano en el ADN inducido por tratamiento con MMC o irradiacion UV. Sin embargo, dado que el bloqueo de la replication en la cadena principal se puede evitar mediante acontecimientos de recebado aguas abajo de las lesiones generadas por UV, se formulo la hipotesis de que la slntesis de ADN de novo por piPolB podrla contribuir a aliviar el estres genotoxico generado por agentes que danan el ADN. Los resultados sugieren que, de hecho, este es el caso, porque la expresion de la piPolB de tipo silvestre en cultivos de E. coli Bl21(DE3) aumento significativamente la supervivencia celular tanto con el tratamiento con MMC como con la irradiacion UV, en comparacion con las bacterias que expresan la variante inactiva de piPolB, D368A (Figura 6). Estos resultados indican un posible papel de las piPolB en la reparacion o tolerancia al dano del ADN en el contexto de celulas de E. coli.

Por tanto, la presente invencion comunica el descubrimiento y la caracterizacion bioqulmica de un nuevo grupo principal, previamente pasado por alto, de PolBs replicativas, que en el presente documento se denominaron "piPolBs" debido a su capacidad exclusiva de realizar la slntesis de ADN molde independiente de cebador. Dentro de la filogenia de PolB global, piPolB forma un clado antiguo, distinto, conjuntamente con los dos grupos descritos anteriormente, rPolB y pPolB. Los genes que codifican las piPolB se encuentran en los EGM, denominadas pipolinas, la mayorla de las cuales estan integradas en genomas de bacterias de tres filos diferentes (Firmicutes, Actinobacteria y Proteobacteria), aunque tambien se replican como plasmidos circulares en las mitocondrias. La distribution de las pipolinas es bastante irregular, lo que es tlpico de los EGM integrados. En gran medida, las pipolinas parecen haber coevolucionado con sus hospedadores, porque la filogenia basada en las piPolB es congruente con la taxonomla bacteriana general (por ejemplo, grupo de proteobacterias juntas y se dividen ademas en clados correspondientes a diferentes clases de proteobacterias). De manera destacable, el analisis filogenetico mostro que las piPolBs de los plasmidos mitocondriales se agrupan con homologos proteobacterianos, en particular con los de alfaproteobacterias. Dado que con toda probabilidad las mitocondrias han evolucionado a partir de un antecesor alfaproteobacteriano en el inicio de la eucariogenesis, es tentador especular que las piPolBs se introdujeron en eucariotas junto con el endosimbionte alfaproteobacteriano de las protomitocondrias. De acuerdo con estimaciones conservadoras basadas en el registro de microfosiles, los eucariotas surgieron hace ~ 2 billones de anos. Por tanto, el clado de piPolB deberla ser al menos tan antiguo si no mas, especialmente si la aparicion de las pipolinas es anterior a la divergencia del filo bacteriano principal. Sin embargo, no se puede excluir la posibilidad de que las pipolinas se hayan introducido horizontalmente en las mitocondrias de proteobacterias en un pasado mas reciente.

Las piPolBs comparten el sitio activo conservado con otras PolBs y tambien contienen los subdominios TPR1 y TPR2, un sello distintivo de las pPolBs. Consecuentemente, en el presente documento se mostro que piPolB presenta actividades eficaces de polimerizacion de ADN y de desplazamiento de cadena. Una caracterizacion bioqulmica mas detallada de piPolB tambien mostro la capacidad de STL intrlnseca en danos no voluminosos de bases (Figura 2), que, aunque conduce a la acumulacion de mutaciones, en ultima instancia favorecera el mantenimiento del genoma danado. Increlblemente, a diferencia de todas las demas PolBs, la piPolB no requiere un cebador anadido externamente para la replication del ADN. Por el contrario, en el presente documento se encontro que piPolB es capaz de iniciar la slntesis de ADN de novo, una capacidad hasta ahora exclusiva de las ADN primasas. En el caso de la ADNP029, se ha demostrado que el motivo TPR1 establece contactos con la cadena molde y juega un papel clave en la interaction con la PT (protelna terminal) durante las primeras etapas de la replicacion cebada con protelna. Dado que con toda probabilidad las piPolBs no interaccionan con una PT, la funcion de la region TPR1 puede estar limitada a la interaccion con el ADN. Una posibilidad adicional podrla ser que este subdominio tambien interaccione con determinados cofactores celulares, lo que modularla la actividad de la piPolB in vivo. Tambien se observo que determinados componentes de la maquinaria de replicacion celular (por ejemplo, ADN ligasa) podrlan estar implicados en el ciclo de replicacion de las pipolinas.

El uso de manganeso como cofactor divalente en lugar de magnesio aumento la STL a traves de sitios abasicos (Figura 2C), as! como la slntesis de ADN de novo (Figuras 3C, 9 y 4).

La enzima ensayada en estos ejemplos actua como una primasa y como una ADN polimerasa. En el presente documento, se ha demostrado que las piPolBs tienen un motivo KTRG exclusivo (SEQ ID NO: 46), alternativo al motivo KxY conservado de las PolBs, que interacciona con el extremo del cebador. Ademas, una lisina invariable cercana al motivo KTRG desempena un papel clave tanto en la STL como en la slntesis de cebador de novo (Figura 5). Dada la carga positiva de este resto y de residuos cercanos en el grupo de piPolB, es probable que el motivo KX2-X3-10-KTRG extendido (SEQ ID NO: 1) pueda inducir un mecanismo de union con el extremo del cebador altamente estable que pueda favorecer la union del nucleotido entrante y la posterior estabilizacion del complejo ternario, lo que darla como resultado una capacidad de polimerizacion mejorada. Estos resultados establecen una relation estructural entre las capacidades de STL y primasa de piPolB.

Como se ha mencionado anteriormente, todas las ADN primasas carecen de capacidad de correction de errores. Esto parece ventajoso para la slntesis eficaz de fragmentos de Okazaki de vida corta. Por el contrario, la actividad de correccion de errores de la exonucleasa 3'-5', que es necesaria para la replication fiable del ADN por una ADN polimerasa, podrla obstaculizar la capacidad primasa. Por tanto, las actividades sinteticas y degradantes de piPolB deben estar muy coordinadas para permitir la slntesis eficaz de cebadores y la replicacion fiable del ADN. Asimismo, la actividad exonucleasa de piPolB tambien es compatible con la slntesis de translesion de danos no voluminosos de bases que, como se reporto previamente para la pPolB del bacteriofago Bam35, no requiere la desalineacion de la cadena molde sino que tolera emparejamientos erroneos que contienen danos durante la slntesis de ADN procesiva. Estudios previos han demostrado que la replicacion de pipolinas similares a pCRYI desde mitocondrias fungicas puede iniciarse desde orlgenes multiples en lugar de desde un origen fijo. Sin embargo, esta observation no se ha explicado. Estos plasmidos no codifican una supuesta PT; de hecho, solo contienen el gen piPolB. Por lo tanto, a la luz de los resultados presentados en este documento, dicho patron de replicacion es coherente con la posibilidad de que las pipolinas similares a pCRYI se repliquen mediante sus piPolBs afines de una manera independiente de cebador. De manera analoga, la forma episomal circular de las pipolinas bacterianas podrla replicarse mediante las piPolBs desde orlgenes multiples.

La replicacion a traves de lesiones de ADN mas voluminosas que no podrlan ser evitadas por piPolB podrla beneficiarse de un posible recebado aguas abajo. Por consiguiente, en el presente documento se ha demostrado que la expresion de piPolB de tipo silvestre promueve la supervivencia de celulas de E. coli expuestas a agentes que danan el ADN bloqueando la replicacion (Figura 6). Por tanto, se formulo la hipotesis de que las piPolB podrlan haber evolucionado para conservar el ADN de las pipolinas proporcionando una replicacion de ADN de novo fiable y procesiva, as! como tolerancia al dano del ADN, lo que tambien puede aumentar la conveniencia de las bacterias hospedadoras.

Es importante destacar que las piPolB suponen una gran promesa para desarrollar nuevas aplicaciones biotecnologicas. Por ejemplo, las actividades in vitro de piPolB, en concreto desplazamiento de cadena y polimerizacion de ADN fiable y procesiva, pueden aprovecharse para una amplification eficaz del genoma completo independiente de cebador, mientras que la slntesis de translesion puede ser util para la amplification de moldes de ADN danados o antiguos. Dado que las piPolBs no muestran un requisito de secuencia fuerte para iniciar la replication, se pueden seleccionar orlgenes de replication de una manera aleatoria, una propiedad util para la amplification del genoma completo. La piPolB podrla convertirse en una solution de una sola enzima para conseguir el objetivo de la amplification del genoma completo en aplicaciones de genomica unicelular.

Ejemplo 9. Procedimientos experimentales.

9.1. Analisis Bioinformaticos.

Analisis filogeneticos. Utilizando el programa PSI-BLAST se investigaron las bases de datos no redundantes de secuencias de protelnas en el NCBI. Para los analisis filogeneticos las secuencias de protelnas se alinearon con Promals3D. Las posiciones mal alineadas (contenido de information bajo) se eliminaron utilizando la funcion Gappyout de Trimal. Previamente se recogio el conjunto de datos de secuencias de pADNP de virus, plasmidos y polintones (Krupovic, M., y Koonin, E.V., 2015, Nat Rev Microbiol, 13, 105-115). Se construyo un arbol filogenetico de maxima probabilidad utilizando el programa PhyML, cuya ultima version incluye la selection automatica del modelo de sustitucion mas adecuado para una alineacion determinada. El mejor modelo identificado por PhyML fue LG G6 I F (LG, matriz Le-Gascuel; G6, parametro de forma gamma: fijo, numero de categorlas: 6; I, proportion de sitios invariables: fijo; F, frecuencias de equilibrio: emplricas).

Identificacion y anotacion de un EGM integrado. Las pipolinas se identificaron mediante un analisis de vecino genomico mas proximo (genomic neighborhoods) de los genes codificantes de piPolB. Los llmites de integration exactos se definieron basandose en la presencia de repeticiones directas correspondientes a sitios de union. Las repeticiones se investigaron utilizando Unipro UGENE. Los genes pipolina se anotaron en funcion de las busquedas con PSI-BLAST frente a la base de datos no redundante de protelnas en las busquedas de NCBI y HHpred. Las pipolinas se compararon entre si y se visualizaron utilizando EasyFig.

9.2. Expresion y purification de protelnas.

La ADN polimerasa independiente de cebador (piPolB) de la pipolina de E. coli 3-373-03_S1_C2 (NCBI GI: 693097161, SEQ ID NO: 2) se obtuvo de GeneScript, en los sitios Ndel-XhoI de pET23a. Se incluyo un codon de parada para obtener la protelna recombinante no etiquetada (SEQ ID NO: 45). Las protelnas deficientes en polimerasa (D368A) y exonucleasa (D59A/E61A), asl como las variantes de tipo silvestre, K613A, H614A, K623A y R625A con etiqueta de his, se obtuvieron por mutagenesis dirigida (Tabla 1):

Tabla 1. Informacion de secuencias genicas y cebadores de mutagenesis.

Todas las variantes de piPolB se expresaron en celulas Bl21(DE3) de E. coli, utilizando medio de autoinduccion ZYM-5052 en presencia de ampicilina 100 mg/l. Los cultivos crecieron durante 20 horas a 28 °C. Para la purification de variantes de piPolB no etiquetadas, las celulas se rompieron mediante molienda con alumina y se suspendieron en tampon A (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, p-mercaptoetanol 7mM, glicerol al 5 % (v/v)) que contenla NaCl 1 M. Los desechos de alumina y celulas se eliminaron por centrifugation, y se ajusto la absorbancia a 260 nm a 120 unidades/ml antes de la precipitation del ADN con polietilenimina al 0,3 % (p/v). Despues de centrifugacion a 20.000 x g durante 20 min, al sobrenadante se anadio sulfato de amonio hasta un 69 % de saturation y se centrifugo a 20.000 x g durante 30 min. El sedimento que contenla piPolB (tipo silvestre y mutantes) se resuspendio en tampon A y se aplico en serie a columnas de flujo rapido Q Sepharose® (GE Healthcare) y fosfocelulosa (P11, Whatman), a una fuerza ionica de aproximadamente 0,2 M de NaCl. Despues de un lavado abundante con concentraciones crecientes de NaCl en tampon A, la ADN polimerasa purificada se eluyo con NaCl 0,35 M y se aplico a una columna Heparin-Sepharose® CL-6B (GE Healthcare), donde, despues de lavar con NaCl 0,35, 0,4 y 0,45 M, se eluyeron con NaCl 1 M en tampon A.

Las variantes con etiqueta de histidina se purificaron con un metodo estandar. Brevemente, las celulas se resuspendieron en tampon C (tampon fosfato 50 mM, a pH 8, p-mercaptoetanol 7mM, glicerol al 5 % (v/v), NaCl 1 M, imidazol 5 mM) y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente con lisozima 1 mg/ml (Sigma) y 1 unidad de benzonasa (Sigma), antes de la ruptura celular por sonicacion. Despues de centrifugacion a 20.000 x g durante 30 min, la fraction soluble se aplico a una columna Ni-NTA (Qiagen). Despues de un lavado abundante con imidazol 5, 10, 25 y 50 mM, la protelna se eluyo con imidazol 200 mM y posteriormente se aplico a la columna Heparin-Sepharose® CL-6B (GE Healthcare), donde, despues de lavar con NaCl 0,35, 0,4 y 0,45 M, se eluyo con NaCl 1 M en tampon A.

En todos los casos, las fracciones agrupadas que contenlan variantes puras de piPolB, se dializaron durante la noche frente a 500 volumenes de tampon B (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, p-mercaptoetanol 7mM, NaCl 0,25 M y glicerol al 50 % (v/v)) y se mantuvieron a -20 °C, o a -70 °C para una conservation prolongada. Se calculo que la pureza final de las protelnas era > 90 % por SDS-PAGE seguido de tincion con azul de Coomassie.

9.3. Ensayos de extension de cebador.

Los oligonucleotidos (Tabla 2) se adquirieron en Sigma en un grado de purification PAGE. Para formar un sustrato de cebador/molde, como se indica en la parte superior de cada figura, el oligonucleotido P15 (Tabla 2) se marco en 5' con [y-32P]ATP utilizando polinucleotido quinasa T4 y se hibrido a un exceso molar de 1,2 veces de oligonucleotidos molde no marcados complementarios (T33GTA, T33GTT o T33GFA, Tabla 2) en presencia de NaCl 50 mM y Tris-HCl 50 mM, pH 7,5.

Tabla 2. Secuencias de oligonucleotidos utilizadas en los ejemplos. F representa el analogo del sitio abasico THF. * / invT / significa un ultimo nucleotido dTMP unido por un enlace 3'-3 'invertido.

Los ensayos se realizaron en un volumen final de 20 pl que contenlan Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, glicerol al 4 % (v/v), BSA 0,1 mg/ml, Tween 20 al 0,05 % (v/v) y, a menos que se indique lo contrario, 1 nM del duplex cebador/molde marcado en 5' indicado, ADN polimerasa 10 nM y la concentration de dNTPs indicada. Las reacciones se desencadenaron con la adicion de MgCl210 mM o MnCl21 mM, como se indica y, despues de incubar durante los tiempos indicados a 30 °C, las reacciones de detuvieron anadiendo 10 pl de tampon de carga de formamida (formamida al 98%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,5 % (p/v) y xileno cianol al 0,5 % (p/v)). Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 20 % - urea 8 M (20x30x0,5 mm) en tampon TBE 1X. Las bandas del gel se detectaron mediante autorradiografla o con lectores de imagenes de fosforo (Typhoon FLA 7000) y se procesaron con el programa informatico ImageJ.

9.4. Replication de ADN monocatenario.

ADN genomico, circular, monocatenario del fago M13mp18 (reserva de laboratorio) se diluyo hasta 50 ng/pl en un tampon que contenla NaCl 0,2 M y Tris-HCl 60 mM, pH 7,5 con o sin cebador M13 UP (Tabla 2), se calento durante 5 min a 65 °C y se enfrio lentamente durante la noche para permitir la hibridacion del cebador. Los sustratos M13 cebados y no cebados se conservaron a -20 °C en allcuotas pequenas para minimizar el corte de ADN debido a ciclos repetitivos de congelaciondescongelacion.

La mezcla de reaction contenla, en un volumen final de 25 pl, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, glicerol al 4 % (v/v), BSA 0,1 mg/ml, Tween 20 al 0,05 % (p/v), sulfato de amonio 20 mM, dNTPs 100 pM, [a-32P]dATP 0,5 pCi, 3,2 nM de ADNmc del fago M13mp18 cebado o no cebado, y las concentraciones indicadas de cada ADN polimerasa. Las reacciones se desencadenaron con la adicion de MgCl210 mM o MnCl21 mM y se incubaron durante 20 min. a 30 °C. Despues, las reacciones se desactivaron anadiendo 5 pl de EDTA 250 mM, SDS al 5 % (p/v) y se cargaron directamente en electroforesis de agarosa no desnaturalizante TAE1x. Para la electroforesis de agarosa alcalina, una allcuota (15 pl) se sometio a filtration en gel a traves de columnas de centrifugado Sephadex G-15 que contenlan SDS al 0,1 % (p / v). La escalera de ADN lambda utilizada como marcador de tamano se marco rellenando con fragmento de Klenow (New England Biolabs) en presencia de fa 32P]dATP.

La replication del molde monocatenario homopolimerico se realizo en conditiones similares, utilizando los oligonucleotidos de 33-mer (IDT) con las secuencias indicadas (Tabla 2), que contienen un enlace invertido 3'-3' invertido 3'-3' terminal para impedir la extension del cebador y la degradation exonucleolltica. Los ensayos de replication de oligonucleotidos se realizaron en un volumen final de 20 pl que contenla Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, glicerol al 4 % (v/v), BSA 0,1 mg/ml, Tween 20 al 0,05 % (v/v), molde oligonucleotldico 1 pM, dNTPs 100 pM, 500 nM de la variante de piPolB indicada y [a-32P]dATP 0,5 pCi. Despues de incubar durante los tiempos indicados a 30 °C, las reacciones de detuvieron anadiendo 10 pl de tampon de carga de formamida (formamida al 98%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,5 % (p/v) y xileno cianol al 0,5 % (p/v)). Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 20 % - urea 8 M (20x30x0,5 mm) en tampon TBE 1X. Las bandas del gel se detectaron mediante autorradiografla o con lectores de imagenes de fosforo (Typhoon FLA 7000) y se procesaron con el programa informatico ImageJ.

9.5. Detection de la sintesis de cebador de novo.

Para detectar la sintesis de cebador de novo se utilizo [y-32P]ATP como nucleotido marcado. Como molde se utilizo ADNmc de M13 (3,2 nM). La mezcla de reaction contenla, en un volumen final de 25 pl, Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, DTT 1 mM, glicerol al 4 % (v/v), BSA 0,1 mg/ml, Tween 20 al 0,05 % (v/v), dNTPs 10 pM, [y-32P]ATP 0,5 pCi, el molde indicado y ADN polimerasa (500 nM). Las reacciones se desencadenaron con la adicion de MgCl210 mM o MnCl21 mM y se incubaron a 30 °C durante los tiempos indicados. A continuation, las reacciones de detuvieron anadiendo 10 pl de tampon de carga de formamida (formamida al 98%, EDTA 20 mM, azul de bromofenol al 0,5 % (p/v) y xileno cianol al 0,5 % (p/v)). Las muestras se analizaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 20 % - urea 8 M (20x30x0,5 mm) en tampon TBE 1X. Cuando se indica, se utilizaron geles de alta resolution (40 cm de longitud). Las bandas del gel se detectaron con lectores de imagenes de fosforo (Typhoon FLA 7000) y se procesaron con el programa informatico ImageJ. La escalera de ADN [y32P]ATP-(dGMP)n utilizada como marcador de tamano, generada por la PrimPol humana, fue un obsequio del Dr. Luis Blanco (CBMSO, Madrid).

9.6. Supervivencia de bacterias que expresan piPolB despues de exposicion a agentes que danan el ADN.

Se inocularon cultivos iniciadores de E. coli Bl21(DE3) que llevaban los plasmidos pET23a::piPolB o pET23a::piPolB(D368A) en medio LB en presencia de ampicilina (150 pg/ml) y glucosa (40 mM) y se cultivaron durante la noche a una temperatura de 37 °C y con agitacion. Los cultivos saturados se diluyeron (1: 100) en medio LB fresco con ampicilina y se cultivaron durante 1-2 horas a 28 °C hasta alcanzar una DO600nm = 0,4. La expresion de la protelna recombinante se indujo despues mediante IPTG 0,5 mM durante una hora antes de la exposicion genotoxica. En este punto, para verificar la expresion de la protelna recombinante mediante SDS-PAGE, (no se muestra) se extrajo una allcuota. Para el tratamiento con MMC, la concentration de farmaco indicada se anadio directamente a los cultivos que se cultivaron durante una hora mas y despues se diluyeron en serie en LB fresco y se colocaron en placas de LB con agar (sin antibiotico). En el caso de exposicion a UV, los cultivos inducidos se diluyeron en serie en PBS esteril y se sembraron en placas de LB con agar antes de la irradiation con la intensidad de luz UV indicada en un Spectrolinker™ XL-1000 (Spectronics Corporation).

El analisis y la representation de los datos se realizo utilizando R y R-Studio (Studio, Inc., Boston, MA), utilizando los paquetes de los programas Dplyr, Stats y Ggplot2, disponibles en CRAN (la extensa red de archivos R). Basandose en los ensayos de normalidad de Shapiro-Wilk, se analizaron los resultados de las exposiciones a MMC y luz ultravioleta mediante la prueba de la T para datos emparejados y la prueba de rango con signo de Wilcoxon que compara 2 grupos, respectivamente. Los P valores se indican en la Figura 6 como * p<0,1, ** p<0,05 y *** p<0,01.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Un peptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 1.

2. Una enzima ADN polimerasa recombinante que comprende una secuencia de aminoacidos de una ADN polimerasa parental de la familia B, donde el motivo KxY se ha sustituido por el peptido de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicha enzima ADN polimerasa recombinante tiene actividad ADN polimerasa y actividad primasa.

3. La enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con la reivindicacion 2, donde la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa de Bam35 o la ADN polimerasa de phi29, o polipeptidos al menos 80 % identicos a cualquiera de ellas que tengan actividad ADN polimerasa.

4. La enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con la reivindicacion 3, donde la ADN polimerasa parental de la familia B es la ADN polimerasa de phi29.

5. La enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende la secuencia de aminoacidos SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, preferiblemente SEQ ID NO: 3.

6. Una secuencia de acido nucleico que codifica la enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

7. Una construccion genetica que comprende la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 6.

8. La construccion genetica de acuerdo con la reivindicacion 7 que es un vector de expresion.

9. Una celula hospedadora que comprende la secuencia de acido nucleico de acuerdo con la reivindicacion 6 o la construccion genetica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Un kit para amplificar un ADN molde que comprende los siguientes elementos: a. la enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5,

b. al menos un tampon,

c. dNTPs, y

d. iones de magnesio o manganeso.

11. Uso de la celula hospedadora de acuerdo con la reivindicacion 9 para la production de la enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5.

12. Uso de la enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 o del kit de acuerdo con la reivindicacion 10 para la amplification de un ADN molde.

13. Uso de acuerdo con la reivindicacion 12, donde la amplificacion del ADN molde se realiza en ausencia de oligonucleotidos anadidos externamente.

14. Uso de una enzima ADN polimerasa que comprende el peptido de acuerdo con la reivindicacion 1 para la amplificacion de un ADN molde en ausencia de oligonucleotidos anadidos externamente.

15. Uso de acuerdo con la reivindicacion 14, donde la enzima ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoacidos que consiste en la SEQ ID NO: 2.

16. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde el ADN molde es lineal o circular y bicatenario o monocatenario.

17. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, donde la amplificacion del ADN molde se realiza mediante una tecnica seleccionada de la lista que consiste en: reaction en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica de desplazamiento multiple (MDA), amplificacion por clrculo rodante (RCA), amplificacion de desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion dependiente de helicasa (HDA), metodo de amplificacion por ramification (RAM) o amplificacion mediada por bucle (LAMP).

18. Un metodo para amplificar un ADN molde que comprende:

a. poner en contacto un ADN molde con una mezcla de reaccion que comprende:

- la enzima ADN polimerasa recombinante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5,

- un tampon,

- iones de magnesio o manganeso, y

- dNTPs, y

b. incubar el ADN molde con la mezcla de reaccion en condiciones que permitan la amplification del ADN.

19. El metodo de acuerdo con la revindication 18, donde el ADN molde es lineal o circular y bicatenario o monocatenario.

20. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19 donde, si el ADN molde es bicatenario, comprende ademas una etapa adicional, antes de la etapa (a), de desnaturalizacion del ADN molde.

21. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, donde la amplificacion del ADN molde se realiza mediante una tecnica seleccionada de la lista que consiste en: reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica de desplazamiento multiple (MDA), amplificacion por clrculo rodante (RCA), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion dependiente de helicasa (HDA), metodo de amplificacion por ramification (RAM) o amplificacion mediada por bucle (LAMP).

22. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde la mezcla de reaccion no comprende oligonucleotidos.

23. Un metodo para amplificar un ADN molde que comprende:

a. poner en contacto un ADN molde con una mezcla de reaccion que comprende:

- una enzima ADN polimerasa que comprende el peptido de acuerdo con la reivindicacion 1,

- un tampon,

- iones de magnesio o manganeso, y

- dNTPs, y

b. incubar el ADN molde con la mezcla de reaccion en condiciones que permitan la amplification del ADN,

donde la mezcla de reaccion de la etapa (a) no comprende oligonucleotidos.

24. El metodo de acuerdo con la revindication 23, donde la enzima ADN polimerasa comprende la secuencia de aminoacidos que consiste en la SEQ ID NO: 2.

25. El metodo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 23 o 24, donde el ADN molde es lineal o circular y bicatenario o monocatenario.

26. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25 donde, si el ADN molde es bicatenario, comprende ademas una etapa adicional, antes de la etapa (a), de desnaturalizacion del ADN molde.

27. El metodo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, donde la amplificacion del ADN molde se realiza mediante una tecnica seleccionada de la lista que consiste en: reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), amplificacion isotermica de desplazamiento multiple (MDA), amplificacion por clrculo rodante (RCA), amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), amplificacion basada en la secuencia de acido nucleico (NASBA), reaccion en cadena de la ligasa (LCR), amplificacion dependiente de helicasa (HDA), metodo de amplificacion por ramification (RAM) o amplificacion mediada por bucle (LAMP).