ES2693539T3 - Composiciones y métodos para encapsular vacunas para la vacunación y el refuerzo por vía oral de peces y otros animales - Google Patents

Abstract

Un método de preparación de una composición para la administración por vía oral de un agente inmunogénico, que comprende: (i) preparar una solución acuosa ácida que comprende al menos un polímero bioadhesivo, en donde el polímero bioadhesivo es quitosano y la solución ácida tiene un pH lo suficientemente bajo para gelatinizar el quitosano; (ii) combinar un polisacárido o un oligosacárido de cadena corta en la solución con el quitosano para formar una solución; (iii) combinar un agente farmacéuticamente activo que comprende dicho agente inmunogénico con un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en beta-glucano, escualeno y aceite de escualano en una emulsión de agua en aceite; (iv) agregar la emulsión de agente farmacéuticamente activo y adyuvante de la etapa (iii) a la solución formada en la etapa (ii); y (v) hacer precipitar o extrudir el producto de la etapa (iv) en una solución de reticulación.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones y metodos para encapsular vacunas para la vacunacion y el refuerzo por via oral de peces y otros animales

Antecedentes de la invencion Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una composicion que comprende un agente farmaceuticamente activo como, por ejemplo, pero sin limitarse a el, un agente inmunogenico (p.ej. una vacuna) y un sistema de administracion bioadhesivo, que permite la administracion oral y la administracion del agente farmaceuticamente activo esencialmente inalterado en la mucosa intestinal.

Antecedentes de la tecnica relacionada

Los agentes farmaceuticamente activos administrados por via oral presentan un importante problema en el transito por el estomago del animal, un organo cuyo contenido representa un entorno digestivo duro que consiste en un pH bajo y enzimas especlficamente disenadas para desnaturalizar protelnas. Como consecuencia, no se ha demostrado que la bacterina ni las vacunas subunitarias administradas por via oral sean eficaces ya que los antlgenos son modificados generalmente en el estomago antes de su presentacion a las celulas inmunosensibles de la mucosa del intestino. Se ha analizado una serie de enfoques para proporcionar un vehlculo de administracion oral que pueda transitar por el estomago, pero la mayorla de ellos han sido infructuosos a escala comercial. Uno de dichos enfoques implica el cambio transitorio del pH del estomago, la neutralizacion de enzimas gastricas y la estimulacion de la respuesta inmune de la mucosa (vease
www.perosbio. com).

En 2003 se vacunaron aproximadamente 200 millones de peces en Chile, principalmente contra Yersiniosis, Septicemia Rickettsial Salmonldea (SRS) y Necrosis Pancreatica Infecciosa (IPN) (Bravo, 2007). De las mas de 20 vacunas para peces de acuicultura adquiridas por el mercado chileno desde 1999 hasta 2003, ninguna fue una vacuna de administracion por via oral.

SRS es una patologla de los peces salmonidos causada por la bacteria intracelular Piscrickettsia salmonis y constituye la principal enfermedad infecciosa en la industria del salmon chilena, con perdidas anuales por encima del 20 %. A diferencia de otras enfermedades bacterianas, la vacunacion contra SRS no es tan eficaz para prevenir la enfermedad o reducir la necesidad de una medicacion tras la infeccion. Esto se debe a la gradual disminucion de la inmunogenicidad contra SRS en los peces vacunados. El refuerzo de la titulacion de anticuerpos en la sangre mediante vacunacion en un estadio posterior deberla permitir una proteccion continua de los animales a lo largo de todo el perlodo de crecimiento comercial. Sin embargo, resulta enormemente diflcil y economicamente impracticable proporcionar refuerzos de vacunas parentales a animales grandes en los cercados de mallas de cultivo.

Practicamente todas las vacunas existentes se administran a los animales acuaticos por inyeccion, lo cual es traumatico, inconveniente y requiere tiempo y gasto, presenta una serie de efectos secundarios y puede fracasar a la hora de inducir una respuesta inmunogenica apropiada en los tejidos de la mucosa. Por lo tanto, serla de gran valor contar con un metodo y un sistema de administracion que elimine estos inconvenientes.

Tal vez los sistemas de administracion de antlgeno mas conocidos sean aquellos que se derivan de los esteres polimericos lineales de acido lactico y acido glicolico (es decir, poli DL-lactida-co-glicolido, PLGA, revisado por Wu (Wu, 2004). En dichos sistemas, se encapsulan los componentes de vacuna subunitaria inmunogenica en perlas o veslculas de tipo liposoma de poli-acrilato y poli-glicolida/lactida a traves de procesos en los que se utilizan disolventes organicos volatiles, como diclorometano o cloroformo. Se utilizan los disolventes para formar emulsiones de soluciones de pollmero o pellculas de llpido secas. La encapsulacion de antlgenos en microcapsulas de PLGA proporciona una serie de ventajas incluyendo una rapida degradacion por hidrolisis y la posterior penetracion de las placas de Peyer (cumulos de tejido linfatico en la mucosa intestinal de los vertebrados superiores pero no los peces). Una de las principales desventajas de las microcapsulas de PLGA es el uso necesario de disolventes organicos. El contacto con disolventes organicos puede inactivar o reducir la eficacia de la vacuna alterando la inmunogenicidad de las protelnas de la superficie crlticas para inducir las respuestas inmunitarias humorales y celulares. Por otra parte, los procesos con poli-acrilato y poli-glucolido/lactida tienen como resultado normalmente microperlas con una eficiencia de captura de antlgeno o inmunogeno extremadamente baja.

Se han empleado microesferas de pollmero y las partlculas laminares (p.ej., liposomas) para mejorar la administracion parenteral y mucosa de antlgenos. Dado que es posible que los linfocitos de la mucosa no reconozcan ni absorban eficientemente las propias vacunas, normalmente es necesario administrarlas conjuntamente con potenciadores y adyuvantes de la penetracion. Se conocen diferentes clases de mezclas de pollmeros para su posible uso como mucoadhesivos (Malik et al., 2007). Entre ellos se incluyen pollmeros sinteticos como poli(acido acrllico) (PAA), hidroxipropil metil celulosa y derivados de poli(acrilato de metilo) as! como los pollmeros naturales como acido hialuronico y quitosano.

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Se han utilizado quitosano y diversos derivados de quitosano para diversas aplicaciones como biomaterial para ingenierla de tejidos, cicatrizacion de heridas y como excipiente para la administracion de farmacos (Chopra et al., 2006; Dang y Leong, 2006). Ocasionalmente, se ha sometido a ensayo quitosano como adyuvante para aplicacion mucosa (Kim et al., 2007), pero normalmente se aplica directamente a una superficie mucosa como pueda ser la aplicacion intranasal para obtener una respuesta IgA en la mucosa nasofarlngea de animales terrestres (Kang et al., 2007). Sin embargo, el uso de quitosano y diversos derivados de quitosano en la administracion de vacunas sigue estando muy limitado debido a sus deficientes caracterlsticas flsico-qulmicas como puedan ser la alta temperatura de transicion y la energla libre interfacial, que tienen como resultado una interaccion con las superficies mucosas por debajo de la optima y una escasa interpenetracion e interdifusion del pollmero. Este problema se agudiza ademas cuando se emplea para vertebrados inferiores poiquilotermos como los salmones. El quitosano tambien presenta el inconveniente adicional de una baja resistencia mecanica y solubilidad.

Por tanto, queda pendiente la necesidad de sistemas y procesos eficaces para la microencapsulacion de sustancias inmunogenicas con pollmeros que tengan propiedades adhesivas y cohesivas superiores.

La patente estadounidense US 2011/293657 se refiere a una composition que comprende un agente farmaceuticamente activo y un sistema de administracion bioadhesivo que preve la administracion por via oral de una vacuna a animales, particularmente animales acuaticos.

Sumario de la invencion

La presente invencion supera los inconvenientes de los sistemas de encapsulation mencionados, en donde la presente invencion divulga una composicion disenada para la administracion por via oral de una vacuna primaria y/o de refuerzo que se puede utilizar para animales alojados no solamente en criaderos, sino tambien en cercados de mallas de cultivo. Las excepcionales propiedades mucoadhesivas de las composiciones de la presente invencion proporcionan un logrado metodo de administracion de farmacos transmucoso, especialmente para vertebrados inferiores con un sistema digestivo menos desarrollado y sin placas de Peyer, como los peces.

La invencion proporciona un metodo para preparar una composicion para administracion por via oral de un agente inmunogenico que comprende:

(i) preparar una solution acuosa acida que comprende al menos un pollmero bioadhesivo, en donde el pollmero bioadhesivo es quitosano y la solucion acida tiene un pH lo suficientemente bajo como para gelatinizar el quitosano;

(ii) combinar un polisacarido de cadena corta u oligosacarido en la solucion con el quitosano para formar una solucion;

(iii) combinar un agente farmaceuticamente activo que comprende dicho agente inmunogenico con un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en beta-glucano, escualeno y aceite de escualano en una emulsion agua en aceite;

(iv) agregar la emulsion del agente farmaceuticamente activo y adyuvante de la etapa (iii) a la solucion formada en la etapa (ii); y

(v) hacer precipitar o extrudir el producto de la etapa (iv) en una solucion de reticulation.

La invencion proporciona ademas una composicion para la administracion por via oral de un agente inmunogenico que comprende al menos un agente farmaceuticamente activo en una cantidad de 0,05 % a 10 % p/p de la composicion, al menos un pollmero bioadhesivo en una cantidad de aproximadamente 0,05 % a 10 % p/p de la composicion, al menos un polisacarido de cadena corta u oligosacarido en una cantidad de 0,05 % to 30 % p/p de la composicion y de 0,1 % a 20 % p/p de un compuesto adyuvante seleccionado del grupo que consiste en un beta- glucano, escualeno y escualano, en donde la composicion se prepara a traves de un metodo de la invencion. Por otra parte, la invencion proporciona un agente inmunogenico preparado de acuerdo con un metodo de la invencion para su uso en la vacunacion o refuerzo oral de un animal contra un patogeno.

Un aspecto de la presente invencion proporciona un metodo de production de un vehlculo de administracion bioadhesivo para la vacunacion de animales, como por ejemplo animales acuaticos, en donde el vehlculo de administracion se presenta en forma de micropartlculas que comprenden un agente inmunogenico incorporado o impregnado en una matriz compuesta de un quitosano reticulado y al menos un oligosacarido o polisacarido de cadena corta. Es posible utilizar cualquier oligosacarido aplicable o polisacarido de cadena corta en la composicion. Entre los polisacaridos de cadena corta comunes se incluyen maltodextrinas y ciclodextrinas. Los oligosacaridos pueden incluir fructo-oligosacaridos (FOS), galacto-oligosacaridos (GOS) o inulina. Por otra parte, las micropartlculas secas incluyen y se seleccionan del grupo que consiste en beta-glucano, escualeno y escualano.

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En una realizacion, la composicion comprende o consiste en al menos un agente farmaceuticamente activo en una cantidad de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 10 % p/p de la composicion, al menos un polimero bio- adhesivo en una cantidad de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 10 % p/p de la composicion, al menos un polisacarido de cadena corta u oligosacarido en una cantidad de aproximadamente 0,05 % a aproximadamente 30 % p/p de la composicion y al menos un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en un beta-glucano, escualeno y escualano en una cantidad de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 20 % p/p de la composicion.

En una realizacion en particular de la invencion, el metodo comprende producir un vehiculo de administracion bioadhesivo que contiene una vacuna SRS para su uso en salmones.

Otro aspecto descrito en el presente documento proporciona un regimen de alimentacion en donde se alimenta a los animales con un pienso convencional que contiene un vehiculo de administracion bioadhesivo que comprende un polisacarido cationico en combinacion con un agente farmaceuticamente activo para la vacunacion oral de animales. En una realizacion en particular, el animal vacunado es un pez.

Se describe asimismo en el presente documento un metodo para preparar una composicion para la administracion por via oral de un agente farmaceuticamente activo que comprende:

a. preparar una solucion acida acuosa que comprende al menos un polimero bioadhesivo, en donde el polimero bioadhesivo es quitosano y la solucion acida tiene un pH lo suficientemente bajo como para solubilizar el quitosano.

b. combinar un oligosacarido/polisacarido de cadena corta seleccionado del grupo que consiste en inulina, maltodextrina y ciclodextrina en la solucion con el quitosano solubilizado para formar una solucion de oligosacarido/polisacarido de cadena corta- quitosano:

c. introducir un complejo de azucar/emulsionante en la solucion de oligosacarido/polisacarido de cadena corta- quitosano para formar una emulsion suave al mismo tiempo que se mantiene el pH de la solucion acido;

d. combinar o emulsionar el agente farmaceuticamente activo con un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en beta-glucano, aceite de higado de tiburon y escualano en una solucion;

e. agregar la solucion del agente farmaceuticamente activo y el adyuvante a la emulsion bioadhesiva suave;

f. formar microparticulas, perlas o hidrogel haciendo precipitar la emulsion en una solucion de reticulacion; y

g. secar las microparticulas, perlas o hidrogel a traves de medios convencionales.

Las microparticulas secadas pueden molerse ademas para obtener un tamano de particula inferior a 500 micrometros.

Preferentemente, la solucion de reticulacion comprende de aproximadamente 1 % a aproximadamente 20 % de aniones fosfato o carbonato. La solucion de reticulacion puede comprender ademas de aproximadamente 1 % a 30 % de un azucar y/o un alcohol.

Otros aspectos y ventajas de la invencion se haran evidentes de forma mas completa a partir de la siguiente divulgacion y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripcion de los dibujos

La Figura 1 presenta el porcentaje de material seco que se recupero de diversas formulaciones de oligosacaridos tras la reticulacion y la deshidratacion.

La Figura 2 presenta la deteccion por transferencia de Western de antigeno SRS en suspension espesa de quitosano y despues del liofilizado y la molienda. Calle 1:4 ng SRS en suspension espesa de quitosano; Calle 2: 2 ng SRS en suspension espesa de quitosano; Calle 3: 1 ng SRS en suspension espesa de quitosano; Calles 4, 5, 6 son las cantidades de SRS correspondiente en la matriz de quitosano liofilizada y molida.

La Figura 3 presenta el analisis de transferencia de Western en el que se presenta la recuperacion del antigeno en el pienso de los peces. Las calles 1-5 son varias diluciones de antigeno en tampon. Las calles 6-9 son las correspondientes diluciones o pienso para peces que contienen una cantidad similar de antigeno.

Descripcion detallada de la invencion

Definiciones

Al describir la presente invencion, se utiliza la siguiente terminologia de acuerdo con las definiciones que se exponen a continuacion.

Un “agente farmaceuticamente activo” se define como un material biologico que tiene como resultado la prevencion, cura o alivio de una enfermedad en cualquier animal. Se pretende que todas las vacunas queden incluidas en esta

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definicion de agentes farmaceuticamente activos.

Un “inmunogeno” o un “agente inmunogenico” se define como una sustancia o una composicion de materia que es capaz de aumentar una respuesta inmunitaria especlfica en un animal. Entre los agentes inmunogenicos se incluyen peptidos y protelnas inmunogenicos incluyendo mezclas que comprenden peptidos y/o protelnas inmunogenicos; partlculas virales inactivas intactas, atenuadas e infecciosas; procariotas matados intactos, atenuados e infecciosos (p.ej., bacterinas), protozoos matados intactos, atenuados e infecciosos incluyendo cualquier estadio del ciclo vital de los mismos y patogenos multicelulares matados intactos, atenuados e infecciosos, vacunas subunitarias recombinantes y vectores recombinantes para suministrar y expresar genes que codifican las protelnas inmunogenicas (p.ej., vacunas de ADN).

“Vacunacion” se define como un proceso que tiene como resultado una respuesta inmuno especlfica generada por un animal contra un inmunogeno o un agente inmunogenico.

Un “sistema de administration bioadhesivo” se define como una composicion que tiene como resultado la administration de un inmunogeno o un agente inmunogenico en el emplazamiento deseado del tejido linfoide asociado al intestino (TLAI) de la mucosa intestinal.

Una molecula “mucoadhesiva” es un componente de un sistema de administracion bioadhesivo que se une especlficamente a tejidos mucosos. Dichas moleculas incluyen, pero sin limitarse a ellas, quitosano, acido hialuronico, goma karaya y guar cationico.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona una sustancia inmunogenica mejorada para administracion por via oral. La invencion se basa en el descubrimiento de propiedades sinergicas inesperadas de una mezcla compleja de quitosano y polisacaridos de cadena corta, como fructo-oligosacarido.

Los fructanos o fructosanos son oligosacaridos o polisacaridos de cadena corta que comprenden una secuencia de unidades de anhidrofructosa combinadas opcionalmente con uno o mas restos sacaridos diferentes de la fructosa. Los fructanos pueden ser lineales o ramificados. Los fructanos pueden ser productos obtenidos directamente de una planta o una fuente microbiana u otros productos con una cadena larga que ha sido modificada (aumentada o reducida) por division, slntesis o hidrolisis, en particular de la variedad enzimatica. Los fructanos tienen generalmente un grado de polimerizacion de 2 a aproximadamente 1000, preferentemente de 3 a aproximadamente 60.

El polisacarido de cadena corta u oligosacarido se utiliza preferentemente en una cantidad comprendida entre 0,01 y 30 % en peso con respecto al peso total de la composicion. Mas preferentemente, esta cantidad oscila entre 0,05 y 15 % en peso con respecto al peso total de la composicion y, mas preferentemente, entre 1 y 10 % en peso.

Los polisacaridos de cadena corta preferentes son inulinas, maltodextrinas o ciclodextrinas. Las inulinas se refieren a un grupo de oligosacaridos que contienen fructosa de origen natural. Dado que la fibra de inulina es resistente a la digestion en el tracto gastrointestinal superior (es decir, el estomago), llega al intestino grueso esencialmente intacto, en el que puede ser digerido por bacterias indlgenas. Las inulinas consisten generalmente en cadenas de polifructosa en las que las unidades de fructosa estan conectadas entre si sobre todo o exclusivamente por uniones p-(2-1). La inulina se da en la naturaleza en general como una mezcla polidispersa de cadenas de polifructosa, la mayorla de las cuales terminan en una unidad glucosilo. Se derivan de las ralces de la achicoria comun (Cichoriumintybus), la dalia y la alcachofa de Jerusalen. Por otra parte, se puede obtener inulina de slntesis bacteriana o puede prepararse in vitro por slntesis enzimatica a partir de sacarosa. Se ha demostrado que la inulina estimula la inmunidad mucosa y parece ser que mejora la eficacia de una vacuna de Salmonella en ratones (Benyacoub et al., 2008). Aunque no esta claro el mecanismo de action, varios estudios han propuesto que la inulina puede inducir cambios en el epitelio del colon estimulando la proliferation de criptas que aumentan la concentration de poliaminas, cambiando el perfil de las mucinas y/o modulando las funciones tanto endocrinas como inmunitarias (Roberfroid, 2005). Las inulinas tambien estimulan el crecimiento de especies de Bifidobacterium en el intestino grueso. El grado de polimerizacion promedio de las inulinas distribuidas en el comercio como suplementos nutricionales es de 10 a 12.

Maltodextrina se refiere a un grupo de hidratos de carbono (complejos) polisacaridos de cadena corta que se definen como una unidad de repetition de un azucar simple (como glucosa o dextrosa). La maltodextrina se deriva de un almidon natural por exposition a un acido o a enzimas para digerir parcialmente y descomponer el almidon en pollmeros mas pequenos.

Las ciclodextrinas (CD) se refieren a una familia de oligosacaridos clclicos. Las CD derivan su sistema de nomenclatura del numero de restos de glucosa en su estructura, de manera que el hexamero de glucosa se denomina a-CD, el heptamero p-CD y el octomero x-CD.

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Estos polisacaridos de cadena corta funcionan en la composicion de la presente invencion como vehlculos de farmaco multifuncionales, a traves de la formacion de un complejo de inclusion o la formacion del conjugado hidrato de carbono/vacuna y potenciando as! posiblemente la biodisponibilidad de la vacuna.

Quitosano es un polisacarido cationico lineal que se gelifica o se reticula en presencia de aniones, como citrato, fosfato o sulfato. Se ha demostrado que quitosano posee utiles propiedades como pueda ser la ausencia de toxicidad, una alta biocompatibilidad y la falta de antigenicidad. Si bien el quitosano en si es insoluble en agua en gran medida, la solubilidad aumenta notablemente si se desplaza el pH hacia un estado acido. Para obtener una concentracion de pollmero apreciable es necesario pues preparar la solucion o dispersion con el uso simultaneo de un acido. Para poder eliminar con mayor facilidad el acido de la composicion despues, se llego a la conclusion de que el acido debla tener un punto de ebullicion bajo, concretamente de forma preferente y como maximo 140 °C, en particular, como maximo 120 °C, siendo especialmente preferente como maximo 100 °C y siendo preferente sobre todo como maximo 80 °C, como por ejemplo cloruro de hidrogeno, bromuro de hidrogeno, acido trifluoroacetico, acido formico y acido acetico. Otros acidos adecuados tienen la capacidad de formar un azeotropo binario con un punto de ebullicion mas bajo con agua, como acido acetico o acido propionico.

El quitosano puede obtenerse a traves de la desacetilacion de quitina, el compuesto principal de los exoesqueletos de los crustaceos. El quitosano [a-(1~4)-2-amino-2-desoxi-p-D-glucano], un mucopolisacarido Intimamente relacionado con la celulosa, presenta propiedades qulmicas que se determinan segun el peso molecular, el grado de desacetilacion y la viscosidad. El quitosano puede formar micropartlculas y nanopartlculas que pueden encapsular grandes cantidades de antlgenos (van der Lubben et al., 2001; Davis, 2006). En el entorno acido del estomago, el quitosano retiene sus cargas positivas que mantienen las partlculas unidas. Se ha demostrado que micropartlculas de quitosano cargadas con ovoalbumina pueden ser absorbidas por las placas de Peyer del tejido linfoide asociado al intestino de vertebrados superiores. Por otra parte, tras la co-administracion de quitosano con antlgenos en estudios de vacunacion nasal, se observo una fuerte potenciacion de las respuestas inmunitarias tanto mucosa como sistemicas en ratones (van der Lubben et al., 2001).

A continuacion, se explica un metodo general para preparar las composiciones para suministrarlos a la mucosa del intestino. Generalmente, una solucion acuosa, suspension o emulsion de un agente farmaceuticamente activo (p.ej., un agente inmunogenico, incluyendo, pero sin limitarse a ellos vacunas) y, si se desea, incluyendo pero sin limitarse a ellos beta-glucano, lipopolisacarido, sales de aluminio, virosomas y/o escualeno. El escualeno o su forma saturada - escualano- es un aceite natural de hidrocarburo o producido principalmente a partir del aceite de hlgado de tiburon o un aceite vegetal como aceite de oliva. En el organismo del animal, el escualeno desempena un papel vital en la slntesis de colesterol, hormonas esteroides y vitamina D. Los p-glucanos (beta-glucanos) son polisacaridos de monomeros de D-glucosa unidos mediante enlaces p-glucosldicos. Los p-glucanos son un grupo diverso de moleculas que pueden variar con respecto a la masa molecular, la solubilidad y la viscosidad y la configuracion tridimensional. Se dan sobre todo de forma comun como celulosa en las plantas, el salvado de los granos de cereal y la pared celular de las levaduras de panadero, ciertos hongos, setas y bacterias.

Se disuelve o suspende el complejo de vacuna/adyuvante en una solucion acuosa de un pollmero mucoadhesivo adecuado como por ejemplo, pero sin limitarse solo a ellos, quitosano y un polisacarido de cadena corta u oligosacarido adecuado, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, inulina, maltodextrina y ciclodextrina. A continuacion, se dispersa la solucion/suspension resultante directamente por atomizacion en una solucion de reticulacion acuosa que contiene sales de fosfato hidrosolubles. Tras el contacto, tiene lugar una reaccion de intercambio salino (reticulacion) que tiene como resultado la formacion de perlas o capsulas en las que queda retenido el agente farmaceuticamente activo. A continuacion, se recoge la suspension resultante de micropartlculas o perlas que contiene el agente farmaceuticamente activo encapsulado, se seca y se muele si es necesario para formar partlculas que tienen un tamano comprendido en el intervalo de 10 a 1000 micrometres. Los detalles acerca de su preparacion se exponen en la serie de etapas que se expone a continuacion:

Etapa (a): Preparacion de hidrogel mucoadhesivo complejo: Se dispersa un pollmero mucoadhesivo como quitosano, a una concentracion de 1 a 10 % (p/p) (en una solucion de acido acetico 0,1-5 N, a una temperatura en el intervalo de 20 a 65 °C hasta que todo el granulado de pollmero queda totalmente disuelto. Preferentemente, el quitosano esta desacetilado en al menos un 85 %. Por otra parte, preferentemente el pH de la solucion acuosa acida es de aproximadamente 2 a aproximadamente 5. La gelatinizacion del granulado de pollmero es necesaria para preparar una micropartlcula que posee las propiedades inmunogenicas.

En realizaciones de la invencion, se anaden asimismo componentes de polisacarido de cadena corta a una concentracion de aproximadamente 1 a 30 % (p/p) para mejorar la proteccion del antlgeno contra la acidez del estomago, los acidos biliares y las proteasas y aumentar la adsorcion intestinal y la biodisponibilidad del antlgeno. Entre los ejemplos de materiales que se pueden aplicar se incluyen, sin limitarse a ellos, oligosacarido de quitosano (COS), inulina, fruto-oligosacaridos (FOS) y diversas dextrinas, como maltodextrinas y ciclodextrinas. Estos componentes para aumentar la absorcion pueden disolverse mas facilmente en los jugos intestinales que en otros materiales de matriz. En consecuencia, es posible aumentar la permeabilidad y biodegradabilidad del pollmero de matriz con el resultado de una mejor liberacion del agente farmaceuticamente activo en una localization deseada del TLAI de la mucosa intestinal.

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Etapa (b): Formacion de complejo del material mucoadhesivo y un polisacarido de cadena corta u oligosacarido. Sin pretender vincularse a teoria alguna, se cree que el proceso descrito en el presente documento produce una nueva composicion compleja mediada por un complejo emulsionante/azucar y que comprende polisacaridos y oligosacaridos en forma de una matriz compleja que tiene un caracter de microparticula insoluble. Generalmente, los emulsionantes pueden ser, pero sin limitarse a ellos, cualquiera entre monogliceridos, esteres de sorbitano, esteres de propilen glicol, lecitina, polisorbatos y esteres de sacarosa de acidos grasos saturados de cadena media y larga, y los azucares seran cualquier mono- o disacarido, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, glucosa, fructosa o sacarosa. Se anade una solucion que comprende una mezcla de mediacion emulsionante/azucar (que contiene de 0,5 a 12,5 % p/p de emulsionante y de 5 a 30 % p/p de azucar) al polisacarido mucoadhesivo y la solucion de polisacarido de cadena corta u oligosacarido a un intervalo de temperatura de 20 a 65 °C y pH 3-5 hasta que se forma una emulsion suave y estable. Se estabiliza esta emulsion por interaccion entre la carga positiva del polisacarido cationico, el emulsionante y los grupos hidroxilo de los polisacaridos de cadena corta u oligosacaridos. La mayor hidrofobia y elasticidad del polisacarido mucoadhesivo y el emulsionante ayuda a retrasar o impedir la penetracion de agua o jugos gastricos en la matriz una vez formada en microparticulas.

Etapa (c): Adicion de sustancia inmunogenica. Se mezcla una solucion que comprende un agente farmaceuticamente activo, como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, un inmunogeno o un antigeno inmunogenico con un adyuvante como beta-glucano o se emulsiona con aceite de escualeno en una cantidad de aproximadamente 0,1 % a 10 % (p/p) en peso de la composicion y, mas preferentemente de aproximadamente 1 % a 4 % y despues se mezcla en la solucion mucoadhesiva descrita en la Etapa (b) anterior.

Etapa (d) Reaccion de reticulacion. Se puede secar la suspension espesa para producir un polvo a traves de una serie de metodos conocidos dentro de la especialidad entre los que se incluyen, sin limitarse a ellos, secado por pulverizacion a baja temperatura, secado en cinta, liofilizacion, secado en tambor o secado instantaneo. En una realizacion preferente, se extruye la suspension espesa a traves de un tubo o una aguja que oscila entre 10 pm y 1,000 pm de diametro para caer gota a gota o en una corriente continua en una solucion reticulada que contiene 115 % de trifosfato de sodio (TPP) en 1-30 % alcohol en solucion acuosa. Alternativamente, se puede atomizar por pulverizado la suspension espesa en una solucion de alcohol/acuosa que contiene 1-10 % de trifosfato sodico. Se pueden recoger las particulas humedas del bano de reticulacion en cualquier medio adecuado conocido en la especialidad (p.ej., filtracion, centrifugacion, etc.) y mezclarse con cualquier agente espesante aceptable como metil celulosa, pectina, alginato, goma de xantana, carboximetil celulosa, hidroxipropil celulosa y similares y pulverizarse en aglomerados de pienso (es decir, revestir en su superficie). Alternativamente, se pueden secar las particulas humedas utilizando procesos convencionales conocidos en la especialidad como por ejemplo, pero sin limitarse a ellos, secado al vacio, liofilizacion, secado por pulverizacion y secado en tunel, molerse hasta la clase de tamano apropiada si es necesario y a continuacion, mezclarse con aceite de pescado u otro pescado comestible antes de su aplicacion al pienso disponible en el mercado por revestimiento en su superficie aplicando los metodos conocidos en la tecnica.

En una realizacion, se mezcla la suspension espesa con sacarosa antes del proceso de secado y/o el proceso de extrusion y se reticula en 1-15 % p/p TPP + 1- 30 % p/p azucar en 1-30 % p/p de alcohol en solucion acuosa seguido de secado.

Estrategia de alimentacion para vacunacion oral: Los peces que tienen un sistema inmunitario maduro (para el Salmon Atlantico generalmente a aproximadamente 0,5 g) estan preparados para su vacunacion oral. No obstante, la presente invention proporciona una estrategia flexible que permite tambien la vacunacion o un refuerzo de la respuesta inmunogenica de peces mas grandes y otros animales. Para inducir eficazmente la respuesta inmunogenica, debera alimentarse a los peces u otros animales por via oral en un solo episodio a una dosis similar o mayor de inmunogeno que la proporcionada habitualmente por inyeccion o inmersion. Para aumentar al maximo la inmunogenicidad del pez y dependiendo del tipo de inmunogeno, el tamano del pez y la capacidad de respuesta, se puede repetir este unico episodio de alimentacion (p.ej., cada tres dias durante hasta diez episodios de alimentacion).

Ejemplos

Ejemplo 1

Production de un sistema de administration bioadhesivo que contiene antigeno de ovoalbumina de huevo. Se disolvio quitosano DE superior (>80 %, Sigma, St. Louis, Mo.), (3 gramos) en 100 ml de acido acetico 0,5 N a 50 °C. Se agregaron veinte (20) gramos de inulina instantanea (Cargil, Minneapolis, Minn.) o veinte (20) gramos de maltodextrina DEI o veinte (20) gramos de ciclodextrina para preparar una suspension espesa acida. Se agregaron tres (3) gramos de lecitina de soja (Archer-Daniels-Midland Co., Decatur, Ill.) a la suspension espesa acida y se dejo formar el complejo con mezclado continuo con la solucion de quitosano durante 30 minutos. A continuacion, se ajusto el pH de la suspension espesa compleja acida a 5,8 con hidroxido sodico y se dejo enfriar la suspension espesa hasta la temperatura ambiente. Se incorporo una solucion de 10 ml que contenia 100 mg de ovoalbumina de huevo y 100 mg de beta-glucano (Sigma) en la suspension espesa y se extrudio la suspension espesa a traves de una aguja de 21 G en una solucion de 50 ml que contenia 10 % p/p de trifosfato sodico, 40 % p/p de sacarosa y

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20 % de isopropanol para formar tiras de hidrogel. Al cabo de aproximadamente 2 horas de endurecimiento en la solucion de reticulacion, se recogieron las tiras de hidrogel firmes, se liofilizaron durante toda la noche y se molieron a un tamano de partlcula por debajo de 200 micrometros. En la Figura 1 se muestra el porcentaje de material seco que se recupero tras la reticulacion y el secado de diferentes formulaciones de polisacarido de cadena corta u oligosacaridos. Se demuestra que la ciclodextrina quedo capturada sobre todo (94 %) dentro de los pollmeros de quitosano reticulados en comparacion con la inulina (66 %) o maltodextrina DE1 (84 %).

Ejemplo 2

Produccion de partlculas bioadhesivas que contienen vacuna contra la septicemia Rickettsial salmonidea (SRS). Se preparo una suspension espesa compleja a un pH 5,8 (100 ml) tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se mezclaron diez (10) ml de solucion que contenla la vacuna SRS atenuada (5 x 1011/ml bacterias SRS matadas) sin adyuvante (disponible en el mercado distribuido por el fabricante de la vacuna) con 100 mg de beta-glucano y se mezclo en la solucion de quitosano). A continuacion, se extrudio la suspension espesa en 50 ml de solucion de reticulacion tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se dejaron endurecer las tiras de hidrogel durante 3 horas y despues se recogieron desde la solucion y se liofilizaron durante toda la noche y se molieron a un tamano de partlcula por debajo de 200 micrometres. En la Figura 2 se representa el analisis de cromatografla de gel de transferencia de Western que presenta la recuperacion de varias cantidades de antlgeno SRS desde el polvo de quitosano liofilizado en relacion con su cantidad en la suspension espesa de quitosano antes de la liofilizacion. El analisis demuestra que el antlgeno retuvo su inmunogenicidad y actividad dentro de la matriz de quitosano y no quedo afectada por el proceso de encapsulation.

Ejemplo 3

Pienso para animales que contiene micropartlculas inmunogenicas para administration por via oral. Se mezclaron quince (15) gramos de micropartlculas inmunogenicas secadas preparadas como en los Ejemplos 1 y 2 con 30 g de aceite de pescado. Se pulverizo la mezcla oleosa sobre 1 kg de pienso comercial convencional para animales incluyendo peces, ganado y pollos o animales de companla. En la Figura 3 se representa un analisis de cromatografla de gel de transferencia de Western en el que se presenta la recuperacion del antlgeno desde el pienso para peces en relacion con una cantidad similar en tampon PBS. El analisis demuestra que el antlgeno retuvo su inmunogenicidad y actividad a lo largo del proceso de encapsulacion y el revestimiento del pienso para peces.

Ejemplo 4

Vacunacion oral de salmon atlantico utilizando las micropartlculas inmunogenicas de la presente invention. Se reservan crlas de salmon atlantico de aproximadamente 10 g de tamano en 30 kg/m3 de agua fresca y a una temperatura de 12 °C. Se mantiene la calidad del agua intercambiando rapidamente el agua del tanque a traves de sistemas mecanicos y de biofiltracion. Se alimenta a los peces 4 veces diarias con una ration total de 2 % su peso en un pienso comercial. Cada 3 dlas, se reemplazan las dietas con una dieta revestida en su superficie con la vacuna al 2 % tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 durante un perlodo de hasta 30 dlas. Se mide la titulacion de anticuerpos elevada contra la vacuna suministrada oralmente en el suero sangulneo de los peces durante los siguientes cuatro meses.

Ejemplo 5

Produccion de partlculas bioadhesivas que contienen vacuna contra la anemia infecciosa de salmon (ISA). La anemia infecciosa del salmon (ISA) es una enfermedad ortomixovlrica que ha producido unos efectos devastadores en las piscifactorlas de salmon del atlantico. Se produjo pienso para peces que contiene micropartlculas inmunogenicas contra ISA tal como se ha descrito en los Ejemplos 1 y 3. Se preparo una suspension espesa completa a un pH 5,8 (100 ml) que contenla ciclodextrina (polisacarido de cadena corta u oligosacarido) tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se emulsionaron ocho (8) ml de solucion que contenla vacuna contra ISAV recombinante (disponible en el mercado distribuida por el fabricante de la vacuna) con 10 ml de escualeno y 2 ml de Span-80 utilizando una homogeneizadora Ultra-Torax a 15.000 rpm y se mezclo la emulsion en la solucion de quitosano utilizando una mezcladora manual de baja velocidad a 1000 rpm). A continuacion, se extrudio la suspension espesa en 50 ml de una solucion de reticulacion tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Se dejo endurecer las tiras de hidrogel durante 3 horas y despues se recogieron de la solucion y se liofilizaron durante toda la noche y se molieron a un tamano de partlcula por debajo de 200 micrometres.

Ejemplo 6

Se desarrollan vacunas orales bivalentes para salmon atlantico contra SRS e ISAV utilizando el pienso revestido en su superficie con micropartlculas inmunogenicas de la presente invencion. Se crlan crlas de salmon atlantico de aproximadamente 10 g de tamano tal como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se alimenta a los peces 4 veces diariamente con una racion total de 2 % de peso corporal de un pienso comercial. Cada tres (3) dlas durante un perlodo de hasta 30 dlas, se reemplaza la dieta con un pienso revestido en su superficie que contiene 2 % de

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vacuna SRS y 2 % de vacuna ISAV tal como se ha descrito en el Ejemplo 3 y 5, respectivamente. Se miden las titulaciones elevadas de anticuerpos contra las vacunas bivalentes administradas oralmente en el suero sangulneo del pez durante los siguientes cuatro meses.

Referencias

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo de preparation de una composition para la administration por via oral de un agente inmunogenico, que comprende:

   (i) preparar una solution acuosa acida que comprende al menos un pollmero bioadhesivo, en donde el pollmero bioadhesivo es quitosano y la solucion acida tiene un pH lo suficientemente bajo para gelatinizar el quitosano;

   (ii) combinar un polisacarido o un oligosacarido de cadena corta en la solucion con el quitosano para formar una solucion;

   (iii) combinar un agente farmaceuticamente activo que comprende dicho agente inmunogenico con un adyuvante seleccionado del grupo que consiste en beta-glucano, escualeno y aceite de escualano en una emulsion de agua en aceite;

   (iv) agregar la emulsion de agente farmaceuticamente activo y adyuvante de la etapa (iii) a la solucion formada en la etapa (ii); y

   (v) hacer precipitar o extrudir el producto de la etapa (iv) en una solucion de reticulation.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el polisacarido o el oligosacarido de cadena corta se seleccionan entre inulina, maltodextrinas o ciclodextrinas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la composicion comprende del 0,1 % al 10 % del compuesto adyuvante.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el compuesto adyuvante se selecciona entre beta glucanos.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde en el agente farmaceutico se emulsiona en el aceite para formar una emulsion estable de agua en aceite.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en donde el agente de reticulacion comprende del 1 % al 20 % de aniones fosfato o carbonato.
7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la solucion de reticulacion comprende ademas del 1 % al 30 % de un azucar.
8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la solucion de reticulacion comprende ademas del 1 % al 30 % de un alcohol.
9. 9. Una composicion para la administracion por via oral de un agente inmunogenico que comprende al menos un agente farmaceuticamente activo en una cantidad del 0,05 % al 10 % p/p de la composicion, al menos un pollmero bio-adhesivo en una cantidad de aproximadamente el 0,05 % al 10 % p/p de la composicion, al menos un polisacarido o un oligosacarido de cadena corta en una cantidad del 0,05 % al 30 % p/p de la composicion y del 0,1 % al 20 % p/p de un compuesto adyuvante seleccionado del grupo que consiste en un beta-glucano, un escualeno y un escualano, en donde la composicion se prepara a traves del metodo de la reivindicacion 1.
10. 10. La composicion de la reivindicacion 9, en donde dicho agente farmaceuticamente activo se selecciona del grupo que consiste en peptidos inmunogenicos, protelnas inmunogenicas; partlculas virales inactivas intactas, partlculas virales atenuadas, partlculas virales infecciosas; procariotas matados intactos, procariotas atenuados, procariotas infecciosos, protozoos matados intactos, protozoos atenuados, protozoos infecciosos, patogenos multicelulares matados intactos, patogenos multicelulares atenuados, patogenos multicelulares infecciosos, vacunas subunitarias recombinantes, vectores recombinantes que codifican protelnas inmunogenicas y una mezcla de los mismos, en donde dicho agente inmunogenico es una mezcla o una emulsion de un agente farmaceuticamente activo y un compuesto adyuvante.
11. 11. La composicion de la reivindicacion 9, en donde dicho pollmero bioadhesivo se selecciona del grupo que consiste en quitosano, dimetil quitosano, trimetil quitosano, carboximetil quitosano, guar cationica y una mezcla de los mismos.
12. 12. La composicion de la reivindicacion 9, en donde dichos polisacarido u oligosacarido de cadena corta se seleccionan del grupo que consiste en fructanos, maltodextrinas, ciclodextrinas y una mezcla de los mismos.
13. 13. Un agente inmunogenico preparado de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1 para su uso en la vacunacion o el refuerzo por via oral de un animal contra un patogeno.
14. 14. Un agente inmunogenico de acuerdo con la reivindicacion 13 cuando se mezcla con un vehlculo llquido para dispersion o pulverizacion sobre el pienso animal.