ES2692148T3 - Composiciones para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el oxalato - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende oxalato descarboxilasa, para usar en el tratamiento terapéutico de una afección relacionada con el oxalato reduciendo la concentración de oxalato en un ser humano, en donde la composición se administra más de una vez al día de forma continua cada día durante un periodo de meses o años y en donde dicha afección relacionada con el oxalato se selecciona del grupo que consiste en hiperoxaluria, hiperoxaluria primaria, enfermedad idiopática de cálculos renales por oxalato de calcio (urolitiasis) y hiperoxaluria entérica.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones para tratar o prevenir una enfermedad relacionada con el oxalato Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a composiciones para usar en metodos para tratar y prevenir afecciones relacionadas con el oxalato. Mas particularmente, la invencion se refiere a composiciones para usar en dichos metodos que comprenden enzimas que degradan el oxalato o son reductoras del oxalato.

Antecedentes

La enfermedad de calculos en el tracto renal-urinario (urolitiasis) es un importante problema sanitario a nivel mundial. La mayorfa de los calculos asociados con la urolitiasis se componen de oxalato de calcio solo u oxalato de calcio mas fosfato de calcio. Otras enfermedades tambien se han asociado con un exceso de oxalato. Estas incluyen vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en fase terminal, afecciones de la conductancia cardiaca, enfermedad de Crohn y otras enfermedades entericas.

El acido oxalico y/o su sal, oxalato, se encuentra en una amplia variedad de alimentos y, por lo tanto, es un componente de muchos constituyentes en la dieta humana y animal. Un aumento de la absorcion de oxalato puede ocurrir despues de comer alimentos que contienen cantidades elevadas de acido oxalico. Alimentos tales como las espinacas y el ruibarbo son bien conocidos por contener cantidades elevadas de oxalato, pero un gran numero de otros alimentos y bebidas tambien contienen oxalato. Debido a que el oxalato se encuentra en una amplia variedad de alimentos, las dietas con bajo contenido en oxalato y que tambien sean sabrosas, son diffciles de formular. Ademas, el cumplimiento con una dieta baja en oxalato es frecuentemente problematico.

El oxalato endogeno tambien se produce metabolicamente mediante enzimas tisulares normales. El oxalato, que incluye el oxalato de la dieta que se absorbe asf como el oxalato que se produce metabolicamente, no se metaboliza adicionalmente por las enzimas tisulares y por lo tanto debe ser excretado. Esta excrecion se produce principalmente a traves de los rinones. La concentracion de oxalato en los fluidos renales es decisiva, en donde un aumento de las concentraciones de oxalato causa un mayor riesgo de formacion de cristales de oxalato de calcio y, por lo tanto, la posterior formacion de calculos renales.

El riesgo de formacion de calculos renales gira en torno a una variedad de factores que todavfa no se han entendido completamente. La enfermedad de calculo renal o del tracto urinario se produce en hasta el 12% de la poblacion en los pafses occidentales y cerca del 70% de estos calculos estan compuestos por oxalato de calcio u oxalato de calcio mas fosfato de calcio. Algunos individuos (por ejemplo, pacientes con enfermedad intestinal, como la enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria intestinal o esteatorrea, y tambien pacientes que han sido sometidos a cirugfa de derivacion yeyuno-ileal) absorben mas oxalato de sus dietas que las demas. Para estos individuos, la incidencia de urolitiasis por oxalato se incrementa notablemente. El aumento de la incidencia de la enfermedad se debe al incremento de los niveles de oxalato en los rinones y la orina, y ello, el sfndrome hiperoxalurico mas comun en el hombre, se conoce como hiperoxaluria enterica. El oxalato tambien es un problema en pacientes con enfermedad renal en fase terminal y hay pruebas recientes (Solomons, C. C., M. H. Melmed, S. M. Heitler [1991] "Calcium citrate for vulvar vestibulitis" Journal of Reproductive Medicine 36:879-882) de que el oxalato urinario elevado tambien esta implicado en la vestibulitis vulvar (vulvodinia).

Las bacterias que degradan el oxalato se han aislado a partir de heces humanas (Allison, M. J., H. M. Cook, D. B. Milne, S. Gallagher, R. V. Clayman [1986] "Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans" J. Nutr. 116:455-460). Se encontro que estas bacterias eran similares a las bacterias reductoras de oxalato que se habfan aislado a partir de los contenidos intestinales de una variedad de especies animales (Dawson, K. A., M. J. Allison, P. A. Hartman [1980] "Isolation and some characteristics of anaerobic oxalate-degrading bacteria the rumen" Appl. Environ. Microbiol. 40:833-839; Allison, M. J., H. M. Cook [1981] "Oxalate degradation by microbes of the large bowel of herbivores: the effect of dietary oxalate" Science 212:675-676; Daniel, S. L., P. A. Hartman, M. J. Allison [1987] "Microbial degradation of oxalate in the gastrointestinal tracts of rats" Appl. Environ. Microbiol. 53:1793-1797). Estas bacterias son diferentes de cualquier organismo descrito anteriormente y se les ha otorgado a ambas una nueva especie y un nuevo nombre de genero (Allison, M. J., K. A. Dawson, W. R. Mayberry, J. G. Foss [1985] "Oxalabacter formigenes gen. nov., sp. nov.: oxalate-degrading anaerobes that inhabit the gastrointestinal tract" Arch. Microbiol. 141:1-7).

No todos los seres humanos son portadores de poblaciones de O. formigenes en sus tractos intestinales (Allison, M. J., S. L. Daniel, N. A. Comick [1995] "Oxalate-degrading bacteria" En Khan, S. R. (compilador), Calcium Oxalate in Biological Systems CRC Press; Doane, L. T., M. Liebman, D. R. Caldwell [1989] "Microbial oxalate degradation: effects on oxalate and calcium balance in humans" Nutrition Research 9:957-964). En las muestras fecales de personas que han tenido una cirugfa de derivacion yeyuno-ileal hay concentraciones bajas o una falta completa de bacterias que degradan oxalato (Allison et al. [1986] "Oxalate degradation by gastrointestinal bacteria from humans" J. Nutr. 116:455-460). Tambien, ciertos seres humanos y animales pueden conservar colonias de O. formigenes pero sin embargo tener niveles excesivos de oxalato por razones que no se entienden claramente.

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Lo que es necesario son metodos para el tratamiento de seres humanos y animales para reducir los niveles de oxalato en sus organismos, de modo que se traten o se eviten las afecciones relacionadas con el oxalato. Los metodos deseables incluirfan la administracion de composiciones reductoras de oxalato.

Previamente, se han descrito composiciones reductoras de oxalato por ejemplo en los documentos US6177478B1, US2002102238 A1, WO9852586 A1, US6355242 B1 y US6200562 B1.

Breve compendio de la invencion

La presente invencion comprende composiciones para uso en metodos para tratar y prevenir afecciones relacionadas con el oxalato de acuerdo con la reivindicacion 1. Las composiciones de la presente invencion comprenden oxalato descarboxilasa que reduce el oxalato en el tracto intestinal. Esta reduccion en el tracto intestinal conduce a una reduccion de los niveles sistemicos de oxalato, favoreciendo de este modo un buen estado de salud.

Las enzimas formil-CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa se han identificado por desempenar una funcion en la degradacion del oxalato. Las enzimas utilizadas en los metodos y composiciones incluyen, pero no se limitan a, formil-CoA transferasa, oxalil-CoA descarboxilasa, oxalato oxidasa, oxalato descarboxilasa y otras enzimas, cofactores y coenzimas que son sustituyentes de las rutas de degradacion del oxalato o estan implicadas en las rutas metabolicas del oxalato, particularmente en la reduccion del oxalato.

En una realizacion de la presente invencion, un hospedador apropiado se puede transformar con polinucleotidos exogenos que codifican esta enzima o actividades enzimaticas relacionadas, confiriendo de esta manera al hospedador transformado la capacidad para aumentar la degradacion de oxalato. El hospedador puede ser, por ejemplo, un microbio que esta particularmente bien adaptado para la administracion oral y/o la colonizacion del intestino. Alternativamente, el hospedador puede ser una planta que, una vez transformada, producira las actividades enzimaticas deseadas, haciendo de este modo que estas actividades esten disponibles en el intestino cuando se consume el material vegetal. Alternativamente, la planta transformada puede tener una menor cantidad de oxalato, opcionalmente debido a las acciones de las protefnas proporcionadas por la transformacion y, por lo tanto, cuando se consume, la planta no proporcionara una mayor cantidad de oxalato a la dieta que lo que harfa una planta no transformada.

La presente invencion tambien comprende composiciones que comprenden enzimas para reducir los niveles de oxalato con el fin de tratar o prevenir afecciones relacionadas con el oxalato. Por ejemplo, una reduccion en los niveles de oxalato se logra mediante la administracion de enzimas que actuan degradando el oxalato. Estas enzimas se pueden aislar y purificar o se pueden administrar como un lisado celular. El lisado celular se puede preparar a partir de cualquier microorganismo que tiene funciones reductoras del oxalato, por ejemplo, O. formigenes. En una realizacion especffica, las enzimas que se administran son una o varias de las enzimas tales como, pero no limitadas a, oxalato descarboxilasa, oxalato oxidasa, formil-CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa. Opcionalmente, se pueden administrar factores adicionales que mejoran la actividad de la enzima. Estos factores adicionales pueden ser, por ejemplo, de oxalil CoA, MgCl2 y TPP (difosfato de tiamina, una forma activa de la vitamina B1). Las composiciones que incluyen enzimas comprenden una o varias enzimas, y opcionalmente, cofactores, coenzimas y otros agentes que mejoran la actividad enzimatica, de forma individual o en combinacion.

En una realizacion de la presente invencion, una reduccion de los niveles de oxalato se logra mediante la administracion de enzimas que degradan el oxalato, producidas por un microbio recombinante, tal como Escherichia coli que se ha transformado para expresar enzimas que degradan el oxalato. El hospedador recombinante se puede administrar en una forma viable o no. Un aspecto adicional de la presente invencion se refiere a composiciones farmaceuticas y/o a suplementos nutricionales para administracion oral. Estas composiciones liberan las enzimas que degradan el oxalato, en el intestino de seres humanos o animales. Las composiciones de la presente invencion comprenden formulaciones farmaceuticamente aceptables. Por ejemplo, las composiciones de la presente invencion comprenden un sistema de administracion de dosis que proporciona las composiciones en las ubicaciones deseadas, tal como la entrega de las composiciones en el intestino del receptor. Las composiciones de la presente invencion se pueden administrar como un componente de los alimentos, tales como leche, carnes y yogur.

Afecciones relacionadas con el oxalato incluyen, pero no se limitan a, hiperoxaluria, hiperoxaluria primaria, enfermedad idiopatica de calculos renales por oxalato de calcio (urolitiasis), hiperoxaluria enterica, vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en fase terminal, afecciones de la conductancia cardiaca, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa.

Breve descripcion de las Figuras

La Fig. 1A es una representacion grafica de datos procedentes de una dieta rica en calcio.

La Fig. 1B es una representacion grafica de datos de una dieta baja en calcio.

La Fig. 2A es una representacion grafica del oxalato excretado.

La Fig. 2B es una representacion grafica del oxalato excretado.

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La Fig. 2C es una representacion grafica del oxalato excretado.

Las Figs. 3A-C son una representacion grafica del oxalato excretado.

La Fig. 4 es una representacion grafica del oxalato excretado.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion comprende composiciones para uso de acuerdo con la reivindicacion 1.

Las composiciones comprenden enzimas que son componentes de las rutas de reduccion del oxalato. Tales composiciones comprenden una o varias enzimas y opcionalmente incluyen cofactores, coenzimas y otros factores necesarios o deseados para la actividad enzimatica. Las composiciones comprenden una o varias enzimas incluyendo enzimas reductoras del oxalato que se encuentran en plantas, animales o seres humanos. Las composiciones comprenden una o varias de las enzimas reductoras del oxalato que se describen en el presente documento. Tal como se utiliza en esta memoria, la expresion "una o varias enzimas" significa que se contempla una enzima, tal como formil-CoA transferasa, o que se contempla mas de una enzima, por ejemplo, formil-CoA transferasa y oxalato descarboxilasa. Tal y como se conoce en la tecnica, la expresion no significa una molecula de enzima, sino multiplos de moleculas de uno o varios tipos de enzimas.

Tal y como se utiliza en esta memoria, las expresiones enzimas que degradan el oxalato y enzimas reductoras de oxalato son intercambiables y se refieren tanto a las enzimas implicadas en la reduccion o la degradacion del oxalato en cualquier organismo, como a fragmentos activos o protefnas recombinantes que comprenden fragmentos activos capaces de reducir o degradar el oxalato.

Las composiciones enzimaticas de la presente invencion tambien pueden comprender formulaciones que proporcionan una proteccion a las moleculas enzimaticas activas frente a la degradacion en el estomago o el medio intestinal. Por ejemplo, las composiciones enzimaticas comprenden composiciones que pueden proteger o confinar las enzimas. Las enzimas se pueden estar unidas covalentemente a otros compuestos, incluyendo, pero no limitados a PEG. La enzima se puede confinar o atrapar dentro de una estructura tal como el interior de una estructura de malla tridimensional, por ejemplo, preparada a base de polfmeros que, o bien se degradan para liberar las enzimas o tienen tamanos de poro que permiten que la enzima salga de la estructura o permiten que los sustratos penetren en la estructura para llegar a las enzimas. Por ejemplo, el tamano del poro permitirfa que oxalato y formiato de bajo peso molecular difundan a la zona en la que estan presentes las enzimas. Ademas, las enzimas se pueden fijar o no covalentemente a la estructura del polfmero. Metodos y dispositivos protegen enzimas activas de la degradacion proteolftica o de otros entornos nocivos para las enzimas.

La presente invencion se refiere a la introduccion de composiciones que comprenden una o mas enzimas que degradan el oxalato, en el tracto intestinal humano en donde la actividad de las composiciones reduce la cantidad y/o la concentracion de oxalato presente, reduciendo de este modo el riesgo de enfermedad debida al oxalato.

La presente invencion comprende composiciones para el tratamiento y prevencion de afecciones relacionadas con el oxalato en seres humanos y animales. Tales composiciones pueden administrarse una o mas veces al dfa durante uno o mas dfas dependiendo de la gravedad de la afeccion relacionada con oxalato o de la cantidad de oxalato que haya en el intestino o fluidos corporales del ser humano o animal. Los tratamientos pueden continuar siempre que niveles no deseados de oxalato esten presentes en el ser humano o animal. Por ejemplo, la composicion de enzima se puede administrar una o mas veces al dfa durante un perfodo de tiempo, incluyendo desde un dfa hasta anos. En el caso de seres humanos o animales con afecciones relacionadas con oxalato cronicas, se puede administrar la composicion durante toda la vida del ser humano o animal.

Los metodos para tratar y prevenir afecciones relacionadas con oxalato comprenden administrar una composicion que comprende una cantidad eficaz de enzimas que reducen el oxalato. La cantidad de enzima en la composicion comprende una cantidad de unidades operativas de la actividad de la enzima que reduce el oxalato que reducira una porcion del oxalato presente en el intestino del individuo o un nivel de unidades operativas de la actividad de la enzima que reduce el oxalato que iniciara una reduccion de la cantidad de oxalato o mantendra una cantidad reducida de oxalato en el individuo, en comparacion con la cantidad de oxalato presente antes de la administracion de la composicion. El numero de unidades operativas de la actividad de la enzima que reduce el oxalato que se puede utilizar en una composicion de dosis unica, puede variar desde aproximadamente 0,0001 unidades a aproximadamente 5.000 unidades, desde aproximadamente 5 unidades a 100 unidades, y todos los intervalos comprendidos entre los mismos. Las composiciones pueden incluir ademas otras enzimas, cofactores, sustratos, coenzimas, minerales y otros agentes que son utiles en la reduccion del oxalato. Una unidad de la enzima es la cantidad de enzima que degradara un micromol de oxalato por minuto a 37°C.

En una realizacion, la presente invencion comprende metodos para la preparacion y administracion de composiciones que comprenden una o varias enzimas que degradan el oxalato, obtenidas a partir de cualquier fuente, en el tracto intestinal humano o animal, en donde la actividad de una o varias enzimas reduce la cantidad de oxalato presente en el intestino y produce una reduccion de las concentraciones de oxalato en los rinones y en otros fluidos celulares. Las enzimas introducidas degradan el oxalato.

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Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teorfa particular, se cree que el enriquecimiento del contenido del intestino con una o varias especies de bacterias que degradan el oxalato o de enzimas reductoras del oxalato provoca una reduccion del oxalato en el contenido intestinal. Algunas de las bacterias o de las enzimas administradas llevan a cabo una degradacion del oxalato en el sitio de la absorcion o cerca del mismo. La actividad de las bacterias o de las enzimas administradas disminuye el nivel de absorcion de oxalato de la dieta. Una reduccion de la concentracion de oxalato en el intestino tambien puede conducir a una eliminacion del oxalato desde las celulas y la circulacion general. Mas especfficamente, una reduccion de la concentracion de oxalato en el intestino tambien puede conducir a una mayor secrecion de oxalato en el intestino desde la sangre y, por lo tanto, reducir la cantidad de oxalato que se tiene que excretar en la orina. Por lo tanto, los metodos para administrar bacterias reductoras de oxalato o enzimas reductoras de oxalato, se pueden usar para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el oxalato, tales como hiperoxaluria primaria, ademas del tratamiento de la hiperoxaluria dietetica. Las composiciones de la presente invencion son particularmente ventajosas para favorecer niveles de oxalato saludables en los seres humanos y los animales.

Composiciones farmaceuticas y nutraceuticas para la introduccion de una o varias enzimas que degradan el oxalato, solas o en combinaciones, en el intestino incluyen bacterias o enzimas que se han liofilizado o congelado en forma de lfquido o pasta y se han encapsulado en una capsula de gel u otra proteccion enterica. El material de la capsula de gel es preferiblemente un material polfmero que forma una pfldora o una capsula para la administracion que es resistente a la degradacion por la acidez gastrica y las enzimas del estomago, pero que se degrada con la liberacion simultanea de composiciones que degradan el oxalato, mediante el pH mas elevado y el contenido en acidos biliares en el intestino. La composicion liberada convierte a continuacion el oxalato presente en el intestino en productos inocuos. Los vehfculos farmaceuticos o nutraceuticos tambien se pueden combinar con las enzimas. Estos incluirfan, por ejemplo, tampon de solucion salina-fosfato. Los metodos comprenden la administracion de composiciones que reducen el oxalato en el tracto intestinal de seres humanos o animales.

Las composiciones reductoras de oxalato que comprenden una o varias enzimas reductoras de oxalato, o combinaciones de bacterias y enzimas, que se van a administrar, se pueden entregar en forma de capsulas o microcapsulas disenadas para proteger la composicion de los efectos adversos del acido estomacal. Se puede utilizar uno o varios de los diversos metodos de recubrimiento protector enterico. Descripciones de tales capas entericas incluyen el uso de acetato ftalato de celulosa (CAP) (Yacobi, A., E. H. Walega, 1988, Oral sustained release formulations: Dosing and evaluation, Pergammon Press). Otras descripciones de tecnologfa de encapsulacion incluyen el documento de patente de EE.UU. n° 5.286.495. Las composiciones de la presente invencion tambien se pueden formular como supositorios.

Otros metodos de administracion de estas composiciones que comprenden uno o varios microorganismos, una o varias enzimas reductoras de oxalato o combinaciones y mezclas, en el intestino incluyen la adicion de las composiciones directamente a las fuentes de alimentos. Se pueden anadir una o varias bacterias como celulas recogidas recientemente, celulas liofilizadas o celulas protegidas de otro modo. Una o varias enzimas se pueden anadir como protefnas liofilizadas, encapsuladas o composiciones enzimaticas microencapsuladas, enzimas que forman complejos con otros materiales para mantener la actividad de las enzimas, y otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica para la adicion de enzimas activas a composiciones. Los alimentos pueden estar complementados con composiciones que degradan el oxalato sin afectar al sabor o a la apariencia. Estos alimentos pueden ser, por ejemplo, yogur, leche, mantequilla de cacahuete o chocolate. Despues de la ingestion, cuando los productos alimenticios estan siendo digeridos y absorbidos por el intestino, las composiciones que degradan el oxalato, incluyendo uno o varios microorganismos, una o varias enzimas o combinaciones, degradan el oxalato presente en el intestino, reduciendo de este modo la absorcion de oxalato en el torrente sangufneo.

Como se senalo anteriormente, se puede complementar una variedad de alimentos con composiciones que degradan el oxalato. Los metodos para preparar tales alimentos que contienen composiciones reductoras del oxalato, incluyen la mezcla por adicion de un material alimenticio con una composicion reductora del oxalato. Por ejemplo, los microbios reductores de oxalato se pueden cultivar en un medio y separar del medio, por ejemplo, mediante centrifugacion. Cultivos tradicionales de yogur obtenidos a partir de un producto lacteo comercial, se pueden mezclar con el cultivo microbiano que degrada oxalato. Esta mezcla de cultivos se puede anadir a continuacion a la premezcla basica de yogur lacteo sin afectar negativamente al sabor o a la consistencia. A continuacion, se puede producir el yogur y envasarlo utilizando procedimientos comerciales tradicionales. En otro ejemplo, las bacterias que degradan el oxalato se puede anadir a los yogures ya producidos. En un metodo similar, una composicion reductora de oxalato que comprende una o varias enzimas reductoras de oxalato, se puede anadir al cultivo bacteriano del yogur o al producto alimenticio de yogur.

Otro ejemplo de los metodos es anadir la composicion reductora de oxalato a la leche despues de que se ha homogeneizado y esterilizado. Tal metodo se utiliza actualmente en la industria lactea para la adicion de organismos Lactobacillus acidophilis a la leche. Se puede utilizar cualquier fuente alimenticia que contenga bacterias mediante la complementacion con bacterias que degradan el oxalato. Estos productos alimenticios incluyen queso o productos carnicos que tienen microorganismos deseables anadidos durante el procesamiento. Los alimentos que comprenden composiciones reductoras de oxalato que comprenden enzimas que reducen el oxalato, no se limitan a aquellos alimentos que comprenden microorganismos, sino que incluyen cualquier fuente alimenticia a la que se pueden anadir enzimas activas. Los materiales que se consideran generalmente materiales alimenticios se pueden utilizar

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como material de soporte para las enzimas, de manera que las enzimas son activas sobre el oxalato presente en el material alimenticio en cualquier etapa de la produccion o del crecimiento del material alimenticio, o en cualquier etapa de la digestion del ser humano o animal, o sobre el oxalato presente en el intestino.

En una realizacion, las cepas de bacterias, por ejemplo, O. formigenes, usadas son cultivos puros que se afslan a partir de cultivos anaerobios que se han inoculado con diluciones de contenidos intestinales procedentes de seres humanos normales, o para usar con animales, procedentes de animales normales. Se puede emplear un medio que contiene oxalato de calcio especial que permite la deteccion de colonias que degradan el oxalato. En una realizacion, la pureza de cada cepa se puede asegurar mediante el uso de al menos dos etapas posteriores de clonacion repetitiva.

Las cepas de O. formigenes utiles se han caracterizado basandose en varias pruebas, estas incluyen: patrones de acidos grasos celulares, patrones de protefnas celulares, ADN y ARN (Jensen, N. S., M. J. Allison (1995) "Studies on the diversity among anaerobic oxalate degrading bacteria now in the species Oxalobacter formigenes" Resumen del General Meeting of the Amer. Soc. Microbiol., 1-29), y respuestas a sondas de oligonucleotidos (Sidhu et al. 1996). Se han descrito dos grupos de estas bacterias (Grupos I y II, en donde ambos estan presentes en la presente descripcion de las especies). Las cepas utilizadas se han seleccionado basandose en la capacidad para degradar el oxalato, y la evidencia de la capacidad para colonizar el tracto intestinal humano. Las cepas seleccionadas incluyen representantes de ambos Grupos I y II de las especies.

Una realizacion implica procedimientos para la seleccion, preparacion y administracion de las bacterias que degradan el oxalato apropiadas a una diversidad de sujetos. En lugar destacado, pero no exclusivamente, se trata de personas o animales que no albergan estas bacterias en sus intestinos. Estas personas o animales no colonizados o debilmente colonizados se identifican utilizando pruebas que permiten una deteccion rapida y definitiva de O. formigenes, incluso cuando los organismos estan a concentraciones relativamente bajas en poblaciones bacterianas mezcladas, tal como se encuentran en los contenidos intestinales. Los metodos tambien se pueden usar para tratar individuos cuyas bacterias que degradan el oxalato se han agotado debido a, por ejemplo, un tratamiento antibiotico o en situaciones postoperatorias. Los metodos tambien se pueden usar para tratar individuos o animales que tienen colonias de bacterias que degradan el oxalato, pero que todavfa tienen niveles poco saludables de oxalato debido a, por ejemplo, una susceptibilidad hacia el oxalato y/o una produccion excesiva de oxalato endogeno.

Las bacterias que pueden ser utilizadas se pueden identificar al menos con dos metodos:

1) Se pueden utilizar sondas de oligonucleotidos especfficas para estas bacterias; y/o

2) Una prueba de cultivo en donde se inocula un medio anaerobio con oxalato 10 mM y despues de la incubacion a 37°C, durante 1 a 7 dfas, se determina la perdida de oxalato.

Los cultivos puros de cepas de O. formigenes se pueden cultivar en grandes cultivos por lotes en fermentador y las celulas se pueden recoger utilizando tecnicas conocidas por los expertos en la tecnica. Las celulas de una cepa aislada seleccionada o de mezclas de cepas conocidas se pueden tratar segun sea necesario (por ejemplo, liofilizadas con trehalosa o glicerol) para conservar la viabilidad y luego se colocan en capsulas disenadas para proteger las celulas durante su paso a traves del estomago acido (capsulas con capa enterica).

Las celulas se ingieren en cantidades y a intervalos determinados segun las necesidades de los individuos. En algunos casos, un uso aislado o periodico puede ser todo lo que se necesita y en otros casos puede ser necesaria una ingestion regular (por ejemplo, con las comidas).

La invencion se refiere ademas a la administracion en el tracto intestinal humano de enzimas que degradan el oxalato preparadas a partir de organismos reductores de oxalato, tales como celulas de O. formigenes o a partir de otras fuentes, o por metodos tales como mediante medios recombinantes. En una realizacion, las enzimas que degradan el oxalato se pueden purificar y preparar como una composicion farmaceutica o nutraceutica para consumo oral. En una realizacion preferida, estas enzimas se producen de forma recombinante. Las secuencias de ADN que codifican estas enzimas son conocidas por los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en el documento WO 98/16632. Estas secuencias, u otras secuencias que codifican protefnas que degradan el oxalato, se pueden expresar en un hospedador adecuado. El hospedador puede ser, por ejemplo, E. coli o Lactobacillus. El hospedador transformado incluirfa senales reguladoras y transportadoras apropiadas. La protefna expresada se puede aislar, purificar y administrar como se describe en esta memoria. Alternativamente, se puede administrar el hospedador recombinante que expresa las protefnas deseadas que degradan el oxalato. El hospedador recombinante se puede administrar ya sea en una forma viable o no viable. En otra realizacion preferida, las enzimas se revisten o se formulan o modifican de otra manera para proteger las enzimas, de modo que no se inactiven en el estomago y esten disponibles para ejercer su actividad degradante del oxalato en el intestino delgado. Ejemplos de tales formulaciones son conocidos por los expertos en la tecnica y se describen, por ejemplo, en el documento de Patente de EE.UU. n° 5.286.495.

Las enzimas que degradan el oxalato tal y como se emplean en esta memoria, incluyen todas las enzimas implicadas en las rutas del oxalato e incluyen, pero no se limitan a, la oxalato oxidasa, oxalato descarboxilasa, formil

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CoA transferasa y oxalil-CoA descarboxilasa. La oxalato oxidasa se expresa en las plantas superiores y cataliza la oxidacion dependiente de oxfgeno del oxalato a CO2 con una formacion concomitante de H2O2. Las oxalato oxidasas se han purificado a partir de muchas fuentes, por ejemplo, plantulas, rafces y hojas de cebada; tallos y hojas de remolacha; germen de trigo; hojas de sorgo; y cascara de platano. Un procedimiento de purificacion rapida en tres etapas se ha desarrollado para obtener oxalato oxidasa a partir de rafces de cebada. El gen que codifica la oxalato oxidasa de la rafz de la cebada se ha clonado, secuenciado y expresado.

La oxalato descarboxilasa esta presente principalmente en los hongos. Una oxalato descarboxilasa bacteriana se ha descrito recientemente en B. subtilis y esta codificada por el gen yvrk. Las oxalato decarboxilasas catalizan la degradacion de oxalato libre en CO2 y formiato. Esta enzima se ha descrito en varios hongos, incluyendo Myrothecium, verrucaria, ciertas cepas de Aspergillus niger y hongos de pudricion blanca, Coriolus versicolor. El gen que codifica la oxalato descarboxilasa de Flammulina velutipes se ha clonado y secuenciado; vease el documento WO 98/42827.

La oxalil-CoA descarboxilasa es activa sobre un sustrato activado con CoA y la convierte en formil-CoA. Una formil CoA transferasa actua entonces para intercambiar formiato y oxalato en CoA. Estas enzimas se han estudiado en las bacterias que degradan el oxalato, Pseudomonas oxalaticus presente en el suelo y en Oxalobacter formigenes, que reside en el tracto gastrointestinal de los vertebrados, incluidos los humanos. Se ha observado que O. formigenes tiene una relacion simbiotica con su hospedador mediante la regulacion de la absorcion de acido oxalico en el intestino, asf como los niveles de acido oxalico en plasma. Como resultado se ha encontrado que la ausencia de esta bacteria es un factor de riesgo en las afecciones relacionadas con el oxalato, como la urolitiasis de oxalato de calcio recurrente idiopatica y la hiperoxaluria enterica derivada de una cirugfa de derivacion yeyuno-ileal, fibrosis qrnstica y enfermedad inflamatoria intestinal.

Patentes que describen diversas enzimas que degradan el oxalato y los genes que codifican estas enzimas incluyen los documentos de Patentes de EE.UU. n° 5.912.125; 6.090.628; y 6.214.980. La expresion enzima que degrada el oxalato incluye, pero no se limita a, oxalato oxidasa, oxalato descarboxilasa, oxalil-CoA descarboxilasa y formil-CoA transferasa, e incluye enzimas que son capaces de interaccionar con oxalato o acido oxalico. Estas enzimas se pueden obtener a partir de fuentes naturales o se pueden sintetizar utilizando medios recombinantes conocidos en la tecnica, e incluyen todos los fragmentos, tales como sitios de union, sitios activos o fragmentos capaces de interaccionar con oxalato o acido oxalico. Esta expresion tambien incluye pero no se limita a, todos los cofactores necesarios, coenzimas, metales, o la union a materiales de sustrato que son necesarios para la enzima en la interaccion con oxalato o acido oxalico. La presente invencion tambien contempla cualquier pareja de union de estas enzimas e incluye anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que se unen o interaccionan con las enzimas.

El uso de O. formigenes es particularmente ventajoso por que es un microorganismo anaerobio que no crece en entornos de tejidos aerobios y no produce ningun compuesto que sea toxico para los seres humanos o animales. Como una alternativa a O. formigenes o un hospedador recombinante, se pueden utilizar otras bacterias que degradan el oxalato, tales como Clostridium, Bacillus subtilis, Pseudomonas, Lactobacili, Bifidobacteria. Enzimas que degradan el oxalato, preparadas a partir de tales bacterias alternativas se pueden administrar o se puede administrar el microbio completo.

La presente invencion comprende composiciones para la administracion de composiciones que comprenden una o mas enzimas o combinaciones de bacterias y enzimas en el tracto gastrointestinal humano. Tales composiciones son eficaces en la reduccion de la cantidad y/o concentracion de oxalato presente. Tales composiciones son eficaces en el tratamiento y la prevencion de afecciones relacionadas con el oxalato. Un aspecto de la presente invencion comprende composiciones para la introduccion de enzimas que degradan el oxalato en el tracto gastrointestinal de un ser humano. Tales enzimas incluyen, pero no se limitan a oxalato oxidasa, oxalato descarboxilasa, oxalil-CoA descarboxilasa y formil-CoA transferasa. Estas enzimas se pueden obtener a partir de fuentes conocidas por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, la enzima vegetal, oxalato oxidasa (OXO) se puede purificar a partir de plantulas de cebada, y la oxalato descarboxilasa se puede purificar a partir de fuentes bacterianas o fungicas.

Alternativamente, las enzimas que degradan el oxalato se pueden obtener por medios recombinantes. Por ejemplo, medios recombinantes tales como clonacion, expresion y purificacion se pueden utilizar para obtener enzimas reductoras del oxalato, por ejemplo, la enzima oxalato descarboxilasa de B. subtilis. Tales metodos recombinantes son conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, se describe en general la clonacion y la expresion del gen de la oxalato descarboxilasa de B. subtilis (YvrK): El gen de la protema oxalato descarboxilasa (YvrK) se ha clonado en el plasmido pET-9a y pET-14b (Novagen, WI), bajo el control de un promotor fuerte del bacteriofago T7, para una hiperexpresion como protema citosolica soluble. El hospedador para la expresion era la cepa de E. coli BL 21 (DE3) pLysS, un lisogeno aDE3 carente de proteasas y que contiene una copia cromosomica del gen de la polimerasa de ARN T7, bajo el control de lacUV5. Ademas, esta cepa es portadora de un plasmido compatible con pET que codifica la lisozima de T7, una enzima bifuncional que corta un enlace en la capa de peptidoglicanos de la pared celular e inhibe la ARN polimerasa de T7. Esto permite un mayor control de la expresion basal no inducida y permite el uso de metodos que destruyen la membrana interna, tales como congelacion-descongelacion o detergentes suaves, etc.) para lisar de forma eficaz la celula. La expresion del producto genico se induce mediante la adicion de isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG). Por consiguiente, un aspecto comprende metodos que comprenden la

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administracion de enzimas que degradan el oxalato que han sido producidas por un microbio recombinante. Una variedad de vectores de expresion y de hospedadores se puede utilizar para producir enzimas que degradan el oxalato como protefnas recombinantes, y tales metodos son conocidos por los expertos en la tecnica.

Otro aspecto comprende metodos para reducir la absorcion de oxalato suministrando bacterias que degradan el oxalato al tracto gastrointestinal de un ser humano o un animal. Tales bacterias pueden incluir, pero no se limitan a Oxalobacter formigenes, Clostridium, Lactobacilli, Bifidobacteria y Pseudomonas. O. formigenes se ha aislado a partir de muestras fecales humanas y se ha clonado mediante la seleccion de colonias individuales. Esto incluye la cepa HC-1 que se obtuvo originalmente a traves de Ixion Biotechnology en 1996 por el Dr. Milton Allison. Por ejemplo, se puede utilizar material congelado de la cepa HC-1 humana. Los metodos de la presente invencion comprenden enriquecer los intestinos con una o mas especies de bacterias que degradan el oxalato, reduciendo de forma general el oxalato contenido en los intestinos, reduciendo la absorcion de oxalato en los intestinos, reduciendo la concentracion de oxalato en la sangre y los fluidos renales y reduciendo los efectos perjudiciales en el cuerpo debidos a la presencia de oxalato.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion comprende composiciones para suministrar enzimas que degradan el oxalato, que pueden reducir el oxalato en el tracto intestinal de personas que tienen un riesgo incrementado frente a enfermedades y/o afecciones relacionadas con el oxalato. Tales enfermedades y afecciones incluyen, pero no se limitan a, la hiperoxaluria, hiperoxaluria primaria, enfermedad idiopatica de calculos renales por oxalato de calcio (urolitiasis), hiperoxaluria enterica, vulvodinia, oxalosis asociada con enfermedad renal en fase terminal, afecciones de la conductancia cardiaca, enfermedad inflamatoria intestinal, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, personas que han sido sometidas a cirugfa de derivacion yeyuno-ileal, personas que tienen una concentracion insuficiente de bacterias que degradan el oxalato y otras enfermedades entericas. Los seres humanos que se han sometido a tratamiento con antibioticos, tratamiento quimioterapeutico u otros tratamientos que modifican la flora intestinal, se tratan con las composiciones y metodos de la presente invencion. La presente invencion se usa para restaurar la capacidad de reducir el oxalato en seres humanos con flora intestinal modificada. Un aumento de los niveles de excrecion de oxalato urinario favorece la formacion de calculos renales, contribuye a la cicatrizacion renal e incluso puede dar lugar a una insuficiencia renal. Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion comprende composiciones para reducir la formacion de calculos renales.

Una reduccion de las concentraciones globales de oxalato en el intestino tambien puede conducir a la eliminacion de oxalato a partir de las celulas y la circulacion general. Mas especfficamente, una reduccion de la concentracion de oxalato en el intestino tambien puede conducir a una mayor secrecion de oxalato al intestino desde la sangre. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teorfa en particular, actualmente se cree que existe un gradiente transepitelial para la eliminacion enterica de oxalato. Por consiguiente, un aspecto de la presente invencion comprende composiciones para reducir los niveles sangufneos de oxalato e incrementar la excrecion de oxalato, favoreciendo la excrecion de oxalato desde la sangre a traves de un gradiente transepitelial de oxalato para la excrecion de oxalato en el colon. Un metodo comprende proporcionar una composicion en el intestino de un ser humano para reducir la concentracion o el nivel de oxalato de un ser humano. Tal reduccion puede comprender la reduccion de la cantidad de oxalato que se encuentra en el intestino, en la sangre, en el suero, en los fluidos tisulares y en otros fluidos corporales.

Una composicion comprende una pasta de O. formigenes preparada para la administracion oral. Para cada lote de pasta de O. formigenes, se utiliza un solo vial de reserva de HC-1 para generar un cultivo de siembra con el fin de iniciar el crecimiento en una produccion por fermentacion a gran escala. Las bacterias de cada fermentacion se recogen por centrifugacion y se mezclan con excipientes crioprotectores, que proporcionan proteccion contra la liofilizacion. La pasta de celulas tambien se puede someter a liofilizacion dando como resultado un polvo fino que tiene una potencia en el rango de 107 a 109 ufcs/gramo. El polvo resultante se coloca en capsulas de gelatina que tienen una capa enterica para una administracion segura de las bacterias en el intestino delgado.

Las composiciones comprenden composiciones preparadas a partir de extractos de una o varia bacterias reductoras de oxalato, en el intervalo desde aproximadamente 103 a aproximadamente 1012 ufcs/gramo, desde aproximadamente 103 a aproximadamente 1010 ufcs/gramo, desde aproximadamente 105 a aproximadamente 1012 ufcs/gramo, desde aproximadamente 105 a aproximadamente 1010 ufcs/gramo, desde aproximadamente 107 a aproximadamente 109 ufcs/gramo, desde aproximadamente 107 a aproximadamente 108 ufcs/gramo y todos los intervalos intermedios.

Las composiciones de la presente invencion comprenden composiciones que comprenden adicionalmente una o varias enzimas que tienen actividad reductora de oxalato. Un aspecto comprende administrar una cantidad eficaz de una composicion de enzimas al tracto gastrointestinal de un ser humano o un animal. Una cantidad eficaz de una composicion enzimatica es capaz de reducir una porcion de oxalato en el intestino o disminuir la concentracion de oxalato en un ser humano desde el nivel medido antes de la administracion de la composicion. Una medicion de este tipo puede ser una medicion del oxalato presente en el intestino procedente de fuentes alimenticias o puede ser un nivel medido en un fluido corporal como la sangre o la orina.

La presente invencion comprende composiciones que contienen composiciones reductoras de oxalato que comprenden una o varias enzimas reductoras de oxalato para uso segun la reivindicacion 1 que incluyen la

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administracion de tales composiciones mas de una vez al dfa, mas de dos veces al dfa, mas de tres veces al dfa y en un intervalo de 1 a 15 veces al dfa. Tal administracion puede ser de forma continua, como todos los dfas durante un perfodo meses o anos, para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el oxalato. Por ejemplo, a una persona se le pueden administrar composiciones que reducen el oxalato mas de una vez al dfa durante anos para tratar o prevenir afecciones relacionadas con el oxalato. Una administracion de este tipo puede tener lugar a traves de rutas conocidas para la administracion de productos farmaceuticos. La administracion a traves de vfas orales o intestinales o en combinacion con materiales alimenticios, se contempla en la presente invencion.

Cabe senalar que, tal como se utiliza en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el", “la” incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.

Todas las patentes, solicitudes de patentes y referencias incluidas en este documento se incorporan especfficamente como referencias en su totalidad.

A continuacion se encuentran los ejemplos que ilustran procedimientos para la puesta en practica de la invencion. Estos ejemplos no deben interpretarse en modo alguno como una imposicion de limitaciones del alcance de la presente invencion. Por el contrario, se ha de entender claramente que se puede recurrir a otras realizaciones, modificaciones y equivalentes diferentes de las mismas que los expertos en la tecnica puedan sugerir despues de leer la descripcion del presente documento, sin apartarse del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los ejemplos 1, 2, 4, 5, 6 y 7 no son parte de la invencion.

Ejemplo 1

Tratamiento de pacientes con riesgo elevado.

Pacientes hiperoxaluricos primarios ingirieron capsulas con capa enterica que contenfan polvo liofilizado de O. formigenes dos veces al dfa, preferiblemente con sus dos comidas principales diarias. Cada capsula de tamano 2 contenfa aproximadamente 137 mg de polvo a granel liofilizado que contenfa al menos 108 unidades formadoras de colonias (ufcs)/gramo.

Para sujetos de alto riesgo esto puede ser un tratamiento de por vida. Los sujetos en estudios clfnicos mostraron que la colonizacion se reducfa cuando se interrumpfa el tratamiento. En el estudio clfnico, el tratamiento se realizo durante 4 semanas y hubo dos semanas de seguimiento. El tratamiento de 4 semanas dio como resultado una disminucion significativa de los niveles de oxalato en sangre y orina, en comparacion con los niveles basales. Sin embargo, durante el perfodo de seguimiento, el recuento de Oxalobacter en heces disminuyo y los valores de oxalato en plasma y orina empezaron a aumentar. Por lo tanto, se propone que sera necesario una toma continua de composiciones reductoras del oxalato para proporcionar las condiciones de oxalato reducido. Las composiciones que comprenden bacterias que pueden colonizar y establecerse de forma continua en el intestino, podrfan provocar que fueran necesarias menos administraciones de composiciones reductoras de oxalato.

Las capsulas con capa enterica de celulas O. formigenes pueden ser ingeridas por poblaciones de pacientes con alto riesgo de enfermedad relacionada con el oxalato. Estas incluyen:

1. Las personas que producen demasiado oxalato endogeno debido, por ejemplo, a un defecto genetico como hiperoxaluria primaria.

2. Las personas con riesgo de urolitiasis con oxalato urinario elevado debido a una enfermedad enterica (hiperoxaluria enterica).

3. Las personas que tienen antecedentes de urolitiasis con episodios multiples de litiasis idiopatica.

4. Las personas con niveles elevados de oxalato serico debido a una enfermedad renal en fase terminal.

5. Las personas con vestibulitis vulvar.

6. Las personas que tienen dietas con altos niveles de oxalato, tales como las que se encuentran en determinadas zonas y estaciones en la India y Arabia Saudita. Esto tambien incluirfa individuos que prefieren alimentos como las espinacas que tienen un nivel elevado de oxalato.

A cualquiera de las personas o animales descritos anteriormente se les proporciona una composicion de la presente invencion. Por ejemplo, una persona con niveles de oxalato endogeno mas elevados de lo normal, se trata dos veces al dfa, con una capsula disenada para la entrega de su contenido en el intestino grueso, en donde la capsula contiene aproximadamente 106 ufcs de O. formigenes. La capsula se administra preferiblemente con la comida.

Ejemplo 2

Tratamiento de pacientes con poco riesgo:

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Celulas de O. formigenes protegidas entericamente, tales como las proporcionadas en capsulas con capa enterica tambien, pueden ser ingeridas por individuos en poblaciones con poco riesgo de enfermedad relacionada con el oxalato. Serfa deseable colonizar estos pacientes con uno o dos tratamientos que comprenden composiciones de materiales reductores del oxalato, tales como bacterias reductoras del oxalato. Estos pacientes tambien podrfan recibir tratamientos de rutina con materiales que reducen el oxalato, como suplementos o adiciones a alimentos tales como leche o yogur. Estos incluyen:

1. Las personas que han perdido poblaciones de bacterias normales que degradan el oxalato debido a: tratamientos con antibioticos orales o episodios de enfermedad diarreica.

2. Los ninos pueden ser inoculados de modo que se establezca mas facilmente una poblacion normal protectora de Oxalobacter que como es el caso anos mas tarde, cuando actuan los principios de exclusion competitivos.

Las personas o animales que tienen poco riesgo se tratan dos veces al dfa, con una capsula disenada para entregar su contenido en el intestino grueso, en donde la capsula contiene al menos 107 ufcs de uno o varios organismos reductores de oxalato, tales como O. formigenes. La capsula se administra preferiblemente con la comida.

Ejemplo 3

Uso de enzimas que degradan el oxalato procedentes de Oxalobacter formigenes para controlar la hiperoxaluria.

Se realizo un estudio para evaluar la eficacia de enzimas que degradan el oxalato procedentes de Oxalobacter formigenes para el control de la hiperoxaluria.

Animales utilizados: ratas macho Sprague Dawley: PC 250-300 g

Dietas utilizadas: Dieta normal (D.N.): Harlan Teklad TD 89222; 0,5% de Ca, 0,4% de P.

Farmaco utilizado: mezcla liofilizada de Oxalobacter formigenes lisado (fuente de enzimas) con oxalil CoA, MgCh y TPP.

Sistema de Entrega de Farmacos (capsulas): capsulas de tamano 9 para estudios preclfnicos en ratas (Capsu-Gel). Eudragit L-100-55 con capa enterica (Hulls America, Inc.). Recogida de orina basal de 24 horas. Analisis fecal para Oxalobacter formigenes - las ratas no fueron colonizadas con Oxalobacter formigenes.

Protocolo experimental:

A. Estudios a largo plazo:

Protocolo Animal:

Grupo I (n = 4): Alimentado con dieta de oxalato con lisado. Las ratas recibieron dos capsulas todos los dfas a las 4:00 pm y dieta de oxalato durante la noche. La dieta se retiro durante el dfa (8:00 am a 4:00 pm)

Grupo II (n = 4): Alimentado con dieta de oxalato como se ha descrito para el Grupo I (Testigos hiperoxaluricos).

Las muestras de orina de 24 h se recogieron el Dfa 7 y el Dfa 9 del tratamiento anterior.

Los datos de la concentracion media de oxalato urinario para los dos grupos de ratas mostrados anteriormente, indicaban que la alimentacion con lisado de Oxalobacter reducfa la concentracion de oxalato urinario en las ratas del Grupo I, en comparacion con los testigos hiperoxaluricos (Grupo II). Las enzimas no pueden estar activas durante un largo periodo de tiempo en el tracto gastrointestinal; por lo tanto, se realizaron estudios a corto plazo, como se describe a continuacion.

B. Estudios a corto plazo:

Protocolo Animal:

Grupo I (n = 4): Alimentado con 1 capsula a las 8:00 am; dieta de oxalato durante dos horas (las ratas se mantuvieron en ayunas durante la noche para que comieran bien durante este periodo) y 1 capsula a las 10:00 am.

Grupo II (n = 4): Dieta de oxalato durante dos horas como para el Grupo I.

Se recogio la orina de todos los animales para el siguiente periodo de cinco horas y se analizo la concentracion de oxalato.

Esto se realizo los dfas 11, 12 y 15 de este estudio.

Los resultados de este estudio muestran que la alimentacion con lisado de Oxalobacter produce una disminucion significativa de los niveles de oxalato urinario en un periodo de 5 horas despues de la administracion de oxalato y del

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farmaco en las ratas del Grupo I, en comparacion con el grupo testigo hiperoxalurico (Grupo II). En ese momento, se realizo un estudio cruzado entre los dos grupos de ratas.

C. Estudios cruzados:

Protocolo Animal:

Grupo I: Alimentado con dieta de oxalato dos veces al dfa de 8:00 a 10:00 am y de 3:00 pm a 5:00 pm.

Grupo II: Alimentado con 1 capsula dos veces al dfa antes de la alimentacion con la dieta de oxalato como para el Grupo I.

Se llevaron a cabo estudios a corto plazo para analizar el efecto de una alimentacion con lisado de Oxalobacter sobre los niveles de oxalato en orina, tal y como se ha descrito en la Seccion B anterior, el dfa 2 y el dfa 5 despues de los estudios cruzados.

Los estudios cruzados mostraron que las ratas del Grupo II que previamente eran hiperoxaluricas, que fueron alimentadas con lisado Oxalobacter, mostraron un descenso de los niveles de oxalato urinario. En cambio, las ratas del Grupo I revirtieron a hiperoxaluria tras la retirada del farmaco.

Ejemplo 4

Tratamiento de las ratas con celulas de Oxalobacter formigenes.

Se realizo un estudio para evaluar el destino del oxalato de la dieta cuando las celulas de Oxalobacter formigenes se incluyen en la dieta.

Metodos:

Ratas machos Wistar se alimentaron con una dieta normal de calcio (1%), alta en oxalato (0,5%), o una dieta baja en calcio (0,02%), alta en oxalato (0,5%) en dos experimentos distintos. Se proporciono oxalato 14C (2,0 pCi) el dfa 1 y de nuevo el dfa 7 del estudio. Las celulas de Oxalobacter formigenes (380 mg/d) se administraron a las ratas en agua potable los dfas 5-11. El destino del oxalato 14C se midio basandose en el analisis del 14C en las heces, la orina y el aire espirado. Las ratas sirvieron como autocontroles y las mediciones durante el perfodo de control (antes de que se proporcionaran las celulas de Oxalobacter) se realizaron durante los dfas 1-4; durante el periodo experimental (cuando se proporcionaron las celulas bacterianas) las mediciones se realizaron los dfas 7-11.

Resultados:

1. Cuando las ratas fueron alimentadas con la dieta de calcio normal (1%), menos del 1% de la dosis administrada de 14C procedente del oxalato, se recupero en el aire espirado (como dioxido de carbono producido a partir de oxalato 14C en el intestino, absorbido en la sangre y luego espirado), sin embargo en todos los casos la mayorfa del 14C se recupero durante el periodo en el que las ratas fueron alimentadas con celulas de Oxalobacter (Fig. 1a). Esto difiere de los resultados obtenidos cuando la dieta era baja en calcio (0,02%), cuando mas del 50% del 14C procedente del oxalato se recupero como dioxido de carbono en el aire espirado durante el periodo experimental, cuando las ratas fueron alimentadas con celulas de Oxalobacter (Fig. 1b). Estos resultados son sorprendentemente diferentes de las cantidades muy bajas de 14C (menos del 5%) recuperadas durante el periodo de control (antes de la alimentacion con celulas de Oxalobacter). Por lo tanto, alimentar las ratas con celulas de Oxalobacter formigenes aumenta notablemente la cantidad de oxalato de la dieta que se degrada en el tracto intestinal.

2. La ingestion de celulas de Oxalobacter tambien disminufa la cantidad de oxalato 14C que se excretaba en la orina. Los valores de las recogidas durante 4 dfas durante los periodos de control y experimental y durante un solo dfa en cada uno de estos periodos, se muestran en las Figs. 2a y 2b respectivamente. Las cantidades de oxalato recuperado en las heces de las ratas, tambien fueron mas bajas durante el periodo experimental (cuando se ingirieron celulas de Oxalobacter) que las que se encontraron en el periodo de control (Fig. 2c).

La mayorfa de las ratas de laboratorio no son portadoras de Oxalobacter en sus tractos intestinales (no estan colonizadas). Los presentes resultados mostraron que la administracion ventajosa de estas bacterias que degradan el oxalato a las ratas, causaba que una gran parte del oxalato de la dieta se degradara y que por consiguiente se excretara menos oxalato de la dieta en la orina.

Los efectos del calcio de la dieta sobre la degradacion del oxalato son caracterfsticos. El calcio forma un complejo con el oxalato de manera que su solubilidad y disponibilidad para el ataque de Oxalobacter es limitada y la cantidad que se degrada cuando las ratas se alimentan con una dieta rica en calcio es mucho menor que las cantidades degradadas cuando la dieta es baja en calcio.

Ejemplo 5

Efecto de la ingestion de O. formigenes sobre la excrecion de oxalato urinario en cerdos.

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Los cerdos estan colonizados de manera natural con Oxalobacter. La descolonizacion se logro en cerdos experimentales mediante la complementacion de la dieta con antibioticos. Los cerdos fueron alimentados con Oxalobacter en caldo de cultivo, que ingirieron rapidamente. Los cerdos fueron alimentados con una alimentacion a base de soja/mafz complementada con 1300 mg de oxalato/kg. La dieta basal contenfa 680 mg de oxalato/kg. Los resultados se muestran en las Figs. 3a-c para tres cerdos individuales.

En los tres cerdos el oxalato urinario disminuyo drasticamente durante el consumo de Oxalobacter. El nivel de excrecion de oxalato en estos cerdos se redujo a un mfnimo de aproximadamente 6 mg/g de creatinina en los tres cerdos. Esto se compara con un nivel de 8-10 mg/g de creatinina que se ha observado en los seres humanos que toman dietas con formulas exentas de oxalato. Este nivel se equipara a la sfntesis endogena en seres humanos cuando se ha eliminado la carga de la dieta. Parece que este nivel refleja la sfntesis endogena en cerdos y que la absorcion intestinal se ha eliminado con el tratamiento con Oxalobacter. Ademas, estos resultados indican que el Oxalobacter ingerido era capaz de eliminar tanto el oxalato cristalino anadido como el oxalato de origen alimentario que estaba biodisponible.

En este experimento cada cerdo ingirio 1,0 g de pasta de celulas con la comida de la manana. Con una DO600 de 0,6, el recuento de celulas viables es 2,1 x 108 celulas/ml, que se extrapola a 2,1 x 1013 celulas por 100 L. El fermentador de 100 L nos proporciona un promedio de 50-60 g en peso humedo de celulas. Por lo tanto, 1 g en peso humedo de celulas es aproximadamente 3,5 x 1011 celulas viables.

La dosis de 3,5 x 1011 celulas viables como se ha indicado mas arriba, podrfa eliminar la absorcion intestinal de aproximadamente 2,0 g de oxalato presente por kg de dieta (1300 mg de oxalato anadido + 680 mg presentes en la dieta). Los animales consumieron 1 kg de dieta por comida.

El peso corporal de los cerdos es de aproximadamente 90 kg (200 libras) y se cree que el sistema digestivo de los cerdos es muy similar al de los humanos. En los seres humanos el consumo medio diario de oxalato es de aproximadamente 100-400 mg, dependiendo de la composicion de la dieta que tambien se divide en tres comidas/dfa, por lo tanto, una dosis diaria promedio de 108 a 1010 celulas viables serfa suficiente para evitar que la absorcion de oxalato de la dieta.

Ejemplo 6

Efecto del suplemento de O. formigenes sobre la excrecion de oxalato urinario en ratas alimentadas con una dieta rica en oxalato.

Se realizo un estudio para determinar el efecto de la formulacion IxOC-3 sobre el estado de la colonizacion y los niveles de oxalato en orina despues de una dieta rica en oxalato. Una formulacion IxOC-3 comprende celulas viables liofilizadas de una bacteria reductora de oxalato, tal como O. formigenes. La formulacion contiene aproximadamente 106 - 107 ufcs/gramo por dosis. La formulacion tambien comprende agentes de crioconservacion tales como trehalosa y maltodextrina.

Metodos:

Ratas macho Harlan Sprague Dawley se asignaron aleatoriamente a 3 grupos (6 animales/grupo). Los animales del grupo 1 sirvieron como grupo testigo y se les administro una formulacion de placebo con capa enterica de tamano 9, dos veces al dfa mediante sonda oral, con un nivel de dosis de 10° unidades formadoras de colonias (ufcs). A los animales de los grupos 2 y 3 se les administro la formulacion IxOC-3 de Oxalobacter formigenes en forma de capsulas con capa enterica de tamano 9, dos veces al dfa mediante sonda oral, con niveles de dosis de 106 y 107 ufcs, respectivamente. La capsula en la sonda fue seguida por un lavado con agua del grifo esterilizada en autoclave en los tres grupos. Despues de un perfodo inicial de aclimatacion, todos los grupos fueron alimentados con una dieta convencional complementada con 1% de oxalato por gramo.

Los materiales del ensayo y el material testigo del placebo se prepararon siguiendo un protocolo estandarizado. Antes del uso, se analizaron muestras representativas de cada material del ensayo para confirmar la identidad, la pureza y la potencia de las capsulas del ensayo, asf como para confirmar la ausencia de Oxalobacter formigenes en el material testigo del placebo durante el perfodo de la dosificacion.

La dieta se restringio a dos perfodos de 1 hora diaria, comenzando 15 minutos despues de la sonda de la manana y la tarde, para asegurar que las capsulas se dosificaban a un estomago vacfo. Se proporciono agua a voluntad. El consumo de alimentos se registro dos veces al dfa. Se recogieron muestras de orina y de heces de 24 horas el Dfa 1 (antes de la dieta complementada con oxalato) y luego semanalmente. Los datos de la orina se analizaron a traves de un analisis de medidas repetidas para estudiar las diferencias en los parametros urinarios medios en todos los grupos de dosificacion y a lo largo del tiempo. Un grupo de dosificacion por termino de interaccion en el tiempo tambien se incluyo para evaluar cualquier posible interaccion entre el grupo de dosificacion y el tiempo.

Resultados:

Los resultados del analisis indicaban que habfa una interaccion estadfsticamente significativa entre los grupos de

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dosis y el tiempo (p <0,0001) para todos los parametros, lo que indica que el perfil de parametros urinarios a lo largo del tiempo era diferente entre los grupos de dosificacion. Para ayudar en la interpretacion de esta interaccion, se realizo un analisis de los datos por momentos para cada parametro, para determinar si habfa una diferencia entre los grupos de dosificacion con respecto a los parametros urinarios medios. Este analisis revelo que para los grupos de dosis baja y dosis mas elevada, habfa un incremento en el oxalato urinario desde el inicio hasta el dfa 7 (p <0,0001 ambos grupos), pero no hubo un incremento desde el dfa 7 hasta el dfa 28 (p = 0,1094 dosis baja y p = 0,6910 dosis alta). Para el grupo de placebo, sin embargo, hubo un aumento desde el inicio hasta el dfa 28 (p = 0,0010). Tambien el dfa 21 y el dfa 28, los niveles de oxalato urinario medio en el Grupo I placebo eran significativamente mas elevados que los de los grupos de dosis baja (Grupo II) y alta (Grupo III), pero no habfa ninguna diferencia significativa entre la dosis baja y la dosis alta. Por lo tanto, hubo una disminucion significativa general de la excrecion de oxalato urinario en las ratas tratadas, en comparacion con las ratas que fueron alimentadas con el placebo.

Ejemplo 7

Efectos de la administracion oral de O. formigenes sobre los niveles de oxalato urinario en pacientes que padecen hiperoxaluria primaria (HP).

Metodos:

Nueve pacientes con biopsia probada de hiperoxaluria primaria (HP) participaron en el estudio. Despues de recibir unas evaluaciones iniciales de referencia, a todos los sujetos se les administro 1 g de pasta de celulas de Oxalobacter formigenes (> 1010 ufcs/gramo) entregado con sus comidas principales durante 4 semanas. Durante este perfodo de tiempo, todos los pacientes continuaron tomando su medicacion normal, se les pidio que comieran su dieta normal y mantuvieran su consumo normal de lfquidos. A excepcion de espinacas y ruibarbo, no estaban prohibidos los alimentos ricos en oxalato. La colonizacion de Oxolobacter y su influencia sobre los niveles plasmaticos y urinarios de oxalato se midieron las semanas 5 y 6. La eficacia del tratamiento se vigilo en terminos de excrecion de oxalato urinario en los sujetos con funcion renal normal y oxalato en plasma en sujetos con enfermedad renal en fase terminal (ESRD).

Resultados:

1. El tratamiento mostro una disminucion significativa del oxalato urinario en los sujetos con funcion urinaria normal. El oxalato en plasma disminuyo significativamente en siete de los nueve sujetos. Hubo una disminucion drastica del oxalato en plasma en dos sujetos con ESRD proporcionando una evidencia de la eliminacion enterica del oxalato endogeno en el intestino, frente a un gradiente transepitelial.

2. El consumo de la cepa HC-1 de O. formigenes a dosificaciones en el intervalo de 0,25 g a 2,0 g por comida, fue bien tolerado por los voluntarios normales y sanos que recibieron dietas que contenfan niveles medios o altos de oxalato. Una dosificacion de pasta de celulas de 1,0 g dos veces al dfa durante 28 dfas, fue bien tolerada por los pacientes con HP.

Ejemplo 8

Tratamiento de pacientes de alto riesgo con composiciones de enzimas que reducen el oxalato.

Pacientes hiperoxaluricos primarios se alimentan con una o varias capsulas con capa enterica que contienen una composicion liofilizada de enzimas reductoras de oxalato, que comprende oxalato descarboxilasa y/u oxalato oxidasa, dos veces al dfa preferiblemente en las dos comidas principales del dfa. Se administra una cantidad eficaz de la composicion enzimatica. Por ejemplo, cada capsula de tamano 2 contiene aproximadamente 5-100 unidades de cada enzima.

Los sujetos con alto riesgo, se tratan con una administracion continua durante un perfodo de tiempo prolongado, probablemente un tratamiento de por vida. La colonizacion se reducira cuando se detenga el tratamiento.

Las capsulas de capa enterica de composiciones reductoras del oxalato que comprenden enzimas reductoras de oxalato, se pueden administrar a poblaciones de pacientes con alto riesgo de enfermedad relacionada con el oxalato. Estas incluyen:

1. Las personas que producen demasiado oxalato endogeno debido, por ejemplo, a un defecto genetico como hiperoxaluria primaria

2. Las personas con riesgo de urolitiasis con oxalato urinario elevado debido a una enfermedad enterica (hiperoxaluria enterica).

3. Las personas que tienen antecedentes de urolitiasis con multiples episodios de litiasis idiopatica.

4. Las personas con niveles elevados de oxalato serico debido a una enfermedad renal en fase terminal.

5. Las personas con vestibulitis vulvar.

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6. Las personas que tienen dietas con altos niveles de oxalato, tales como las que se encuentran en determinadas zonas y estaciones en la India y en Arabia Saudita. Esto tambien incluirfa individuos que prefieren alimentos como las espinacas que tienen un alto contenido en oxalato.

A cualquiera de las personas o animales descritos anteriormente se les proporciona una composicion de la presente invencion. Por ejemplo, una persona con niveles de oxalato endogeno mas elevados de lo normal, se trata dos veces al dfa, con una capsula disenada para la entrega de su contenido en el intestino grueso, en donde la capsula contiene aproximadamente una cantidad eficaz equivalente de una composicion enzimatica que tiene actividad enzimatica similar a la proporcionada por 107 ufcs de una bacteria reductora de oxalato, tal como O. formigenes. La capsula se administra preferiblemente con la comida.

Ejemplo 9

Tratamiento de pacientes con poco riesgo con composiciones de enzimas reductoras de oxalato.

Composiciones con capa enterica, reductoras de oxalato que comprenden una mezcla de enzimas reductoras del oxalato, oxalato descarboxilasa y/u oxalato oxidasa, tales como las proporcionadas en capsulas con capa enterica, tambien se pueden administrar a individuos en poblaciones con menor riesgo de enfermedad relacionada con el oxalato o con riesgo de afecciones relacionadas con el oxalato. Una cantidad eficaz de la composicion enzimatica se administra con el regimen de tratamiento deseado.

Serfa deseable que la administracion de las composiciones a estos pacientes fuera durante perfodos de tiempo mas cortos cuando tienen riesgo de afecciones relacionadas con el oxalato o simultaneamente con materiales que contribuyen a una afeccion relacionada con el oxalato. Estos pacientes tambien podrfan recibir tratamientos rutinarios con composiciones reductoras del oxalato, ya sea como suplementos o como adiciones a alimentos tales como la leche o el yogur. Estos incluyen personas que han perdido las poblaciones normales de bacterias que degradan el oxalato debido a: tratamientos con antibioticos orales o episodios de enfermedad diarreica, o ninos.

Las personas o animales que tienen poco riesgo son tratados dos veces al dfa, con una capsula disenada para la entrega de su contenido en el intestino grueso, en donde la capsula contiene una cantidad eficaz de la composicion enzimatica. Por ejemplo, cada capsula de tamano 2 contiene aproximadamente 5-100 unidades de cada enzima. La capsula se administra preferiblemente con la comida.

Debe entenderse que los ejemplos y las realizaciones descritos en este documento solo tienen fines ilustrativos y que los expertos en la tecnica podran sugerir diversas modificaciones o cambios que los tengan en cuenta y se tienen que incluir en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica que comprende oxalato descarboxilasa, para usar en el tratamiento terapeutico de una afeccion relacionada con el oxalato reduciendo la concentracion de oxalato en un ser humano, en donde la composicion se administra mas de una vez al dfa de forma continua cada dfa durante un periodo de meses o anos y

   5 en donde dicha afeccion relacionada con el oxalato se selecciona del grupo que consiste en hiperoxaluria, hiperoxaluria primaria, enfermedad idiopatica de calculos renales por oxalato de calcio (urolitiasis) y hiperoxaluria enterica.
2. 2. La composicion farmaceutica para el uso segun la reivindicacion 1, donde la composicion comprende una capa enterica.

   10 3. La composicion farmaceutica para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde la una o mas

   enzimas estan presentes en una cantidad de 5 a 5000 unidades de actividad de la actividad de enzima reductora de oxalato.
3. 4. La composicion farmaceutica para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde la composicion comprende ademas coenzimas y/o cofactores.