ES2675120T3 - Tratamiento de biopolímeros de alto peso molecular con fluidos supercríticos - Google Patents

Abstract

Método para producir micropartículas o nanopartículas a partir de una solución acuosa de un biopolímero con un peso molecular de 70 kDa o superior, que comprende la etapa de a) pulverizar la solución acuosa junto con una mezcla de un gas compresible que comprende dióxido de carbono y un codisolvente/antidisolvente orgánico soluble en agua dentro de una cámara presurizada a una temperatura de 25 a 80ºC y a una presión que oscila entre 8 y 40 mPa, estando presente el codisolvente/antidisolvente en la mezcla en una concentración de un 20% a un 80% (p:p) en dióxido de carbono subcrítico o supercrítico.

Description

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DESCRIPCION

Tratamiento de biopolímeros de alto peso molecular con fluidos supercríticos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para generar partículas, aglomerados y fibras micrométricas y nanométricas a partir de biopolímeros de alto peso molecular solubles en agua aplicando la tecnología de fluidos supercríticos. La invención se refiere además a los productos resultantes y a métodos de utilización de los productos resultantes.

Antecedentes

La formación de partículas utilizando fluidos supercríticos se ha venido investigando durante muchas décadas y ha resultado en el desarrollo de numerosos procesos donde se utiliza un fluido supercrítico (SCF) como disolvente, tal como en el proceso de "expansión rápida de soluciones supercríticas" (RESS), como antidisolvente en el proceso "antidisolvente gaseoso" (GAS), o como codisolvente en el proceso de "despresurización de una solución orgánica líquida expandida" (DELOS). Han surgido numerosas variaciones y otros desarrollos de procesos de formación de partículas [1-4]. Sin embargo, muchos de estos procesos requieren disolventes orgánicos para disolver el soluto a precipitar (publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n° US 2004/0110871 A1 de Perrut et al.).

En las publicaciones internacionales n° WO 1995/01221 y WO 1996/00610 se describen métodos para formar partículas basados en el método de antidisolvente, donde una solución acuosa de una sustancia se pone en contacto con un codisolvente (también denominado modificador) (como etanol) y un fluido supercrítico en una boquilla coaxial. Tal como se indica en el documento WO 1996/00610, el fluido supercrítico puede contener opcionalmente un bajo nivel de un codisolvente (es decir, etanol), preferiblemente no más de un 20%. Sin embargo, un nivel tan bajo de codisolvente no es suficiente para precipitar biopolímeros de alto peso molecular, tales como polisacáridos.

Cocero et al. [5] presentaron otra estrategia para formar nanopartículas de p-caroteno basada en el proceso de "extracción de emulsiones con fluido supercrítico" (SFEE), relacionado con el proceso GAS. En el proceso SFEE, una nanoemulsión de un disolvente orgánico (diclorometano) que porta el soluto se dispersa en agua para formar una emulsión aceite-en-agua y se seca utilizando CO2 supercrítico (SC-CO2). Cada gotita simula un pequeño precipitador GAS en el que, después de la expansión con CO2y extracción del disolvente orgánico, se forman partículas ultrapequeñas suspendidas en agua, con una concentración final de disolvente orgánico de aproximadamente 1 ppm [5].

En el proceso DELOS [6], primero se disuelve el soluto en un disolvente orgánico y se añade un fluido comprimido, tal como CO2, para expandir la solución a la temperatura y presión deseadas. Después, la solución expandida se despresuriza rápidamente a condiciones atmosféricas, lo que resulta en la formación de cristales de soluto de un tamaño submicrométrico o micrométrico debido a la enorme caída de la temperatura que se produce con la despresurización.

También se conocen procesos de formación de partículas por tratamiento de soluciones acuosas que contienen el soluto, que se pulverizan en una cámara de precipitación de alta presión junto con CO2 comprimido enriquecido con etanol. Esta estrategia a veces se denomina proceso de secado con fluido supercrítico, y ha sido aplicada para precipitar proteínas [7], enzimas [8], lactosa, maltosa, trehalosa, rafinosa, ciclodextrina, dextranos de bajo peso molecular, dextranos de peso molecular medio, hasta aproximadamente 68.800 g/mol, e inulina [9], formando polvos fluidos. Bouchard et al. [10, 11] han estudiado el efecto de las condiciones de pulverización y el diseño de la boquilla, así como la influencia de diversos codisolventes añadidos al CO2, en la forma y distribución de tamaño de las partículas obtenidas por secado con fluido supercrítico. Se comprobó que el metanol y el etanol utilizados como codisolventes en el proceso de secado con SCF actuaban como antidisolvente en la precipitación de glicina, fenilalanina y lisozima, además de su función de aumentar la solubilidad acuosa en SC-CO2 y la eliminación de agua por evaporación, mientras que el 2-propanol y la acetona no actuaban como antidisolvente e influían principalmente en la eliminación de agua por evaporación [11]. En el proceso de secado con fluido supercrítico también se ensayaron diversas configuraciones de la boquilla, incluyendo una mezcladora T simple con diámetro interior pequeño o boquillas convergentes coaxiales, con y sin cámara de mezcla, así como con generador de ondas ultrasónicas [10], lo que demostró que el diseño de la boquilla, la presión de procesamiento y los caudales tenían un efecto destacado en el tamaño de partícula, comprobándose a la vez que la morfología estaba relacionada más probablemente con el mecanismo de precipitación que con el proceso de atomización [10]. Se desarrolló un modelo matemático para

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la transferencia de masa desde una gota acuosa a SC-CO2 + etanol para estudiar el secado de soluciones acuosas de lisozima con mezclas CO2 + etanol [12].

También se aplicó otra estrategia utilizando SC-CO2 para secar extractos acuosos de té verde aplicando una variación del proceso de "partículas de soluciones saturadas con gas" (PGSS) utilizando únicamente CO2 presurizado como medio de secado en una cámara de pulverización a una temperatura moderada, que oscila entre 30 y 60°C, y 20 MPa, para obtener polvos fluidos que contienen los ingredientes activos intactos, tales como polifenoles antioxidantes. Kluge et al. [13, 14] aplicaron el proceso SFEE para obtener nanopartículas compuestas de un fármaco antiinflamatorio (KetoprofenTM) y polímero biodegradable amorfo de ácido coglicólico-poliláctico (PLGA), comprobando que la concentración de PLGA en la emulsión afectaba al tamaño de partícula y a la distribución del tamaño de partícula. Se describió un proceso para la encapsulación de un aceite esencial de lavandín en una matriz de almidón modificado con anhídrido n-octenilsuccínico (OSAN), pulverizando una emulsión acuosa del aceite con SC-CO2 aplicando una técnica de secado con PGSS, donde la emulsión se mezcló de forma continua con CO2 a 10 MPa y se pulverizó dentro de una cámara de precipitación a presión atmosférica [5]. El aceite también se encapsuló en polietilenglicol (PEG) aplicando una técnica de PGSS, utilizándose el PEG en una forma fundida que contenía CO2 presurizado formando una solución saturada de gas, que se mezcló con el aceite de lavandín y se pulverizó dentro de una cámara de precipitación a presión atmosférica [15].

La técnica anterior no proporciona una solución en relación con la formación de partículas, aglomerados o fibras micrométricas/nanométricas (micropartículas o nanopartículas) a partir de biopolímeros de alto peso molecular (HMW) solubles en agua, tales como gomas y polisacáridos HMW, con pesos moleculares que oscilan entre aproximadamente 70.000 g/mol (70 kDa) y hasta 1.000.000 g/mol (1.000 kDa), aplicando una técnica de secado con SCF (SFD) y/o con antidisolvente gaseoso (GAS). Tal como es sabido por los expertos en la técnica, los biopolímeros HMW, en particular los polisacáridos, forman soluciones altamente viscosas. Este es un desafío muy importante, que complica el proceso de pulverización y atomización involucrado en SFD y GAS. Por ejemplo, el p-glucano (BG), con un peso molecular (MW) de hasta 500 kDa, puede formar soluciones con viscosidades entre 100 y 1.500 mPa s a concentraciones tan bajas como de aproximadamente un 1% (p/p) en agua. Además, en la técnica anterior tampoco existe indicación alguna relativa a la impregnación de estas micropartículas o nanopartículas con materiales bioactivos o a la encapsulación de materiales bioactivos en micropartículas o nanopartículas preparadas a partir de biopolímeros HMW aplicando la tecnología de fluidos supercríticos para su uso en productos cosméticos, farmacéuticos, agrícolas, nutracéuticos o alimentarios.

Sumario de la invención

En un aspecto de la invención, el proceso SFD/GAS aquí descrito sorprendentemente es capaz de procesar soluciones acuosas altamente viscosas de biopolímeros HMW en partículas, aglomerados y/o fibras secos.

En un aspecto, la invención puede comprender un método para producir micropartículas o nanopartículas, tal como se define más abajo, a partir de una solución acuosa de un biopolímero de alto peso molecular, con un peso molecular de 70 kDa o superior, que comprende la etapa de pulverizar la solución acuosa junto con una mezcla de un gas compresible que comprende dióxido de carbono y un codisolvente/antidisolvente orgánico soluble en agua dentro de una cámara presurizada a una temperatura de 25 a 80°C y a una presión que oscila entre 8 y 40 mPa, estando presente el codisolvente/antidisolvente en la mezcla en una concentración de un 20% a un 80% (p:p) en dióxido de carbono subcrítico o supercrítico. En una realización, después de terminar la precipitación de partículas, la cámara se lava con cantidades suficientes de un gas compresible para eliminar cualquier codisolvente/antidisolvente residual. El codisolvente/antidisolvente soluble en agua puede comprender etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos. La solución acuosa y el gas compresible/codisolvente/antidisolvente se pueden pulverizar dentro de la cámara presurizada a través de una boquilla coaxial. Antes de pulverizar la solución acuosa dentro de la cámara presurizada, la solución acuosa se puede mezclar con un disolvente orgánico soluble en agua.

En una realización, la cámara se puede lavar con un segundo gas que tiene una densidad diferente a la del gas compresible con el fin de eliminar cualquier disolvente residual.

Las micropartículas o nanopartículas formadas en un método aquí descrito se pueden impregnar con un bioactivo mediante un método que comprende las etapas de:

a) solubilizar el bioactivo en un disolvente adecuado;

b) inyectar de forma continua el bioactivo solubilizado dentro de la cámara presurizada para provocar su precipitación o dispersión sobre las micropartículas o nanopartículas previamente formadas, sin que se solubilizen las micropartículas o nanopartículas previamente formadas; y

c) lavar la cámara con cantidades suficientes de un gas compresible para eliminar cualquier disolvente residual.

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El gas de lavado en la etapa (c) puede comprender un segundo gas con una densidad inferior a la del gas compresible utilizado en la reivindicación 1 para eliminar residuos de disolventes con el fin de obtener un producto seco. El material bioactivo puede comprender un material esencialmente soluble en un disolvente seleccionado entre el grupo consistente en agua o un disolvente orgánico soluble en agua, CO2 subcrítico o supercrítico, etanol expandido con gas o mezclas de los mismos, pero mucho menos soluble en mezclas de CO2 presurizado y el disolvente en comparación con su solubilidad en las condiciones utilizadas para formar las micropartículas o nanopartículas.

En otro aspecto, la invención puede comprender un método para microencapsular un material bioactivo con un biopolímero, que comprende las etapas de:

a) solubilizar el bioactivo en un disolvente que comprende agua o un disolvente orgánico soluble en agua, CO2 subcrítico o supercrítico, un líquido expandido con gas, lípidos o mezclas de los mismos;

b) mezclar de forma continua el bioactivo solubilizado en una solución acuosa de un biopolímero para producir una mezcla; y

c) pulverizar la mezcla acuosa de bioactivo y biopolímero junto con una mezcla de un gas compresible y un codisolvente/antidisolvente dentro de una cámara presurizada.

En una realización, el disolvente bioactivo puede comprender agua, etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos, y el codisolvente/antidisolvente puede comprender etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos. El gas compresible comprende dióxido de carbono. Después de terminar la precipitación de partículas, la cámara se puede lavar con cantidades suficientes del gas compresible para eliminar cualquier disolvente residual o codisolvente/ antidisolvente. Alternativamente, la cámara se puede lavar utilizando un segundo gas con una densidad inferior a la del gas compresible utilizado en la etapa (c) para eliminar cualquier disolvente residual o codisolvente/antidisolvente con el fin de obtener un producto seco.

En una realización, el biopolímero de alto peso molecular comprende un polisacárido en cualquier método aquí descrito o reivindicado. El polisacárido tiene un peso molecular de 70 kDa o superior y puede comprender goma arábiga o p-glucano.

En una realización, el bioactivo puede comprender cualquier material bioactivo como se define aquí y, en algunos ejemplos de realización, puede comprender aceite de pescado, aceite vegetal o aceite vegetal saturado con carotenoides.

En otro aspecto más, la invención puede comprender un producto producido por un método aquí descrito, que comprende micropartículas o nanopartículas o aglomerados de las mismas de un biopolímero con un peso molecular superior a 70 kDa y con una densidad aparente inferior a 0,10 g/ml. En una realización, el producto puede comprender p-glucano con una densidad aparente de aproximadamente 0,01 g/ml después de molienda para formar aglomerados de fibras fluidas con una longitud inferior a 5 mm. El p-glucano producido de acuerdo con los métodos aquí descritos es altamente soluble en agua, de modo que se obtiene una solución acuosa al 1% (p/p) en aproximadamente 45 minutos a 45°C, y en aproximadamente 30 minutos a 55°C.

En una realización, los productos formados por los métodos aquí descritos comprenden un biopolímero con un peso molecular esencialmente similar al del biopolímero antes del procesamiento.

Breve descripción de las figuras

En las figuras, los elementos similares tienen asignados números de referencia similares. Las figuras no están necesariamente a escala; en su lugar, se hace énfasis en los principios de la presente invención. Adicionalmente, cada una de las realizaciones mostradas solo es una de diversas disposiciones posibles utilizando los conceptos fundamentales de la presente invención. Las figuras se describen brevemente a continuación:

Figura 1: representación esquemática de una realización de un aparato para la formación,

microencapsulación e impregnación de partículas: A) célula de visualización equipada con filtros; B) boquilla coaxial; C) baño de aire circulante termostático; D) dispositivo emulsionante; E) válvula de aguja; F) válvula microdosificadora calentada; G) rotámetro; H) válvula de retención y válvula de cierre; I e I') bomba de émbolo; J) depósito superior; K) depósito de solución acuosa; L) bomba de émbolo; M) válvula de aguja; N) botella de CO2; O) bomba de jeringa; P) válvula de cierre; Q) botella de N2; R) válvula de cierre; S) depósito de etanol; T) bomba de HPLC; U) válvula de retención; V) mezcladora estática; W) regulador de presión; X) célula UV/VIS; Y, Z) válvula de cierre. (Abreviaturas: PI - indicador de presión; TIC - indicador y controlador de temperatura.)

Figura 2: tres configuraciones de boquillas coaxiales (A, B y C) ensayadas en el proceso de secado

supercrítico.

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Figuras 3A y 3B: dos tipos de dispositivo emulsionante utilizados para inyectar de forma continua aceite de pescado y/o una solución que contiene el material bioactivo en la solución acuosa de matriz envolvente.

Figura 4: muestra precipitados de goma arábiga con las configuraciones de boquilla A y B.

Figura 5: polvo de goma arábiga obtenido mediante el proceso SFD/GAS.

Figura 6: estructura de tipo tela de araña de p-glucano (BG) obtenida mediante el proceso SFD/GAS.

Figura 7: partículas de GA impregnadas con aceite de colza rico en carotenoides.

Figura 8: muestra 0,8175 g de polvo de GA antes (derecha) y después (izquierda) del procesamiento

con el proceso SFD/GAS y el aumento sustancial de volumen.

Figura 9: muestra la morfología de partículas de goma arábiga (GA) obtenidas mediante el proceso

SFD/GAS.

Figura 10: muestra la morfología de partículas de p-glucano (BG) obtenidas mediante el proceso

SFD/GAS.

Figura 11: muestra la morfología de partículas de una mezcla de goma arábiga con p-glucano (GA_BG)

obtenidas mediante el proceso SFD/GAS.

Figura 12: muestra la morfología de partículas de goma arábiga y p-glucano con coinyección de aceite

de pescado + EtOH + CO2 (GA_BG_FO) en el proceso SFD/GAS.

Figura 13: muestra esferas reventando con nanoglóbulos de goma arábiga y p-glucano (GA_BG).

Figuras 14A-C: imágenes de aglomerados de nanoesferas de GA obtenidos a 10 MPa y 40°C generados por preinyeción de 4 ml/min de antidisolvente (etanol) en la solución acuosa del biopolímero antes de la atomización utilizando una boquilla coaxial y CO2 presurizado a un caudal de 25 ml/min premezclado con etanol absoluto a 16 ml/min (Figuras 14A y 14B) o 20 ml/min (Figura 14C).

Figura 15: gráfico que representa la distribución del tamaño de partícula obtenida a 10 MPa.

Figura 16: gráfico que representa la distribución del tamaño de partícula obtenida a 24 MPa.

Figura 17: gráfico que representa la distribución del tamaño de partícula para partículas de GA

generadas preinyectando diferentes cantidades de antidisolvente (etanol) en la solución acuosa del biopolímero antes de la atomización.

Descripción detallada de realizaciones preferentes

La invención se refiere a métodos para producir nuevas micropartículas y nanopartículas que comprenden biopolímeros de alto peso molecular, con un peso molecular de 70 kDa o superior, que pueden o no comprender un material bioactivo añadido. En la descripción de la presente invención, todos los términos no definidos aquí tienen los significados reconocidos en la técnica común. En la medida en que la siguiente descripción se refiere a una realización específica o a un uso particular de la invención, dicha descripción está concebida para ser únicamente ilustrativa y no limitativa de la invención reivindicada.

Tal como se utiliza aquí, la expresión "micropartículas o nanopartículas" significa cualquier tipo de partículas, aglomerados, fibras, fibrillas, esferas, glóbulos u otras conformaciones tridimensionales de un biopolímero con una dimensión en la escala micrométrica en el caso de las micropartículas o en la escala nanométrica en el caso de las nanopartículas. En una realización, las micropartículas son partículas con una dimensión entre aproximadamente 1.000 nm y 100 micrómetros y las nanopartículas son partículas con una dimensión inferior a aproximadamente 1.000 nm, preferiblemente inferior a aproximadamente 100 nm. En una realización, las micropartículas o nanopartículas pueden tener forma esférica, alargada o cualquier otra forma regular o irregular.

Tal como se utiliza aquí, los biopolímeros de alto peso molecular están formados por moléculas que tienen pesos moleculares entre aproximadamente 70.000 g/mol y más de 1.000.000 g/mol (es decir, entre 70 y 1.000 kDa), que son polímeros producidos por organismos vivos o de origen biológico y que esencialmente son solubles en agua. Ejemplos de biopolímeros incluyen, de forma no limitativa, gomas y polisacáridos, tales como goma arábiga (que también incluye glicoproteínas) o p-glucano.

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El término "bioactivo" se refiere a cualquier sustancia que interactúa con cualquier tejido celular en el cuerpo humano o animal o que interactúa con células procariotas o eucariotas. El material bioactivo puede incluir sustancias farmacéuticas o nutracéuticas, sustancias antiinflamatorias, antimicrobianas, antivirales o antifúngicas, o generalmente se considera que tienen un efecto beneficioso sobre la salud o el bienestar. En una realización, un material bioactivo adecuado para su uso con la presente invención incluye un material esencialmente soluble en agua, etanol, etanol acuoso, disolventes orgánicos solubles en agua o disolventes expandidos con gas, tal como etanol expandido con CO2, o mezclas de los mismos, y puede incluir un material basado en lípidos, como aceite de pescado o aceites vegetales u otros aceites especializados, u otros lípidos que comprenden ácidos grasos monoinsaturados o poliinsaturados o materiales bioactivos solubles en lípidos, como carotenoides, fitosteroles o tocoferoles, así como polifenoles, terpenoides, antioxidantes, péptidos, proteínas o cualquier otra sustancia que pueda demostrar efectos beneficiosos para la salud y que pueda emplearse para impregnar las partículas, aglomerados o fibras formados. El bioactivo puede ser soluble en agua o en disolventes solubles en agua, pero puede precipitar cuando se procesa con los procesos de secado con fluido supercrítico/antidisolvente gaseoso.

La presente invención se refiere a métodos para producir micropartículas y nanopartículas a partir de biopolímeros de alto peso molecular, con un peso molecular de 70 kDa o más, utilizando la tecnología de fluidos supercríticos. También se refiere a métodos para microencapsular o impregnar materiales bioactivos en aglomerados o sobre las micropartículas o nanopartículas. Las micropartículas y nanopartículas generalmente tienen un área superficial grande, baja densidad aparente y pueden ser altamente porosas. Estas propiedades pueden facilitar una manipulación y dispersión más sencillas, así como una disolución en agua mucho más rápida que un polvo de los mismos biopolímeros preparados por métodos de la técnica anterior.

En un aspecto, la invención se refiere a un proceso que combina la técnica de secado con fluido supercrítico con una técnica de antidisolvente gaseoso (SFD/GAS) para formar partículas a partir de soluciones acuosas que contienen biopolímeros HMW.

En una realización, la invención comprende un método para producir micropartículas o nanopartículas que incluye las etapas de pulverizar la solución acuosa de biopolímeros dentro de una cámara presurizada a través de una boquilla coaxial junto con una mezcla de un gas presurizado y un codisolvente/ antidisolvente. El gas presurizado comprende dióxido de carbono y el codisolvente/antidisolvente comprende un disolvente orgánico soluble en agua, tal como etanol, acetona o isopropanol. En una realización puede ser preferible inyectar el codisolvente/antidisolvente dentro de la solución acuosa de biopolímero antes de la pulverización para generar aglomerados de nanopartículas. Tal como se utiliza aquí, la expresión "boquilla coaxial" significa cualquier boquilla que tenga una configuración coaxial. Tal como se conocen en la técnica, las boquillas coaxiales tienen normalmente al menos dos pasos que comparten un eje común y terminan una junto a la otra en un extremo de salida, llevando cada paso el flujo de un material específico.

En una realización, los biopolímeros HMW pueden comprender polisacáridos como goma arábiga (GA) o p- glucano (BG). El proceso SFD/GAS se realiza en condiciones de temperatura moderada, que oscila entre 25 y 80°C, y a presión elevada, que oscila entre 8 y 40 MPa. El disolvente comprende un codisolvente orgánico soluble en agua, por ejemplo, de forma no limitativa, disolventes como etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos, en concentraciones entre el 20 y el 80% (p/p) en CO2 subcrítico o supercrítico. El disolvente actúa como codisolvente para aumentar la solubilidad acuosa en CO2 y como antidisolvente para precipitar los biopolímeros HMW.

La morfología del precipitado de biopolímero HMW obtenido del proceso SFD/GAS depende básicamente de la naturaleza del biopolímero. Por ejemplo, el precipitado de BG es diferente del de gA obtenido mediante el proceso SFD/GAS utilizando etanol como codisolvente/antidisolvente. Mientras que la GA forma partículas esféricas y amorfas, micrométricas/nanométricas, y aglomerados de nanopartículas, el BG forma fibrillas y estructuras de tipo laminar altamente porosas de gran área superficial, similares a una estructura de tela de araña formada por fibrillas con un grosor que oscila entre menos de 100 nanómetros y aproximadamente 1 micrómetro. La densidad aparente de las micropartículas y nanopartículas de GA puede ser inferior a aproximadamente 0,10 g/ml e inferior a aproximadamente 0,05 g/ml, por ejemplo entre aproximadamente 0,017 y aproximadamente 0,042 g/ml. La densidad aparente de las micropartículas y nanopartículas de BG es incluso más baja, pudiendo ser inferior a aproximadamente 0,050 g/ml e inferior a aproximadamente 0,010 g/ml, por ejemplo aproximadamente 0,005 g/ml. Estas densidades aparentes son similares a las de los aerogeles de GA o BG producidos siguiendo otros métodos.

En otra realización de la invención, se pueden formar aglomerados de nanopartículas mediante un proceso que comprende las etapas de:

a) inyectar de forma continua un codisolvente/antidisolvente en la solución acuosa del biopolímero para obtener una mezcla; y

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b) pulverizar de forma continua la mezcla junto con un fluido de secado a través de una boquilla coaxial dentro de una cámara de precipitación.

El codisolvente/antidisolvente puede comprender un disolvente orgánico soluble en agua, tal como etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos, y el fluido de secado puede comprender dióxido de carbono presurizado y el mismo codisolvente/antidisolvente. Debido a la mayor carga inicial de antidisolvente en la solución acuosa de biopolímero, la precipitación de las partículas se inicia antes de la atomización y conduce a una precipitación de biopolímeros más rápida una vez que la solución entra en contacto con la mezcla CO2 + codisolvente/antidisolvente en la boquilla coaxial. Sin limitarnos a una teoría, la precipitación rápida puede deberse a que el antidisolvente disminuye la constante dieléctrica de la solución acuosa. Como resultado se forman nanopartículas de menor tamaño, que después se pueden aglomerar en agrupaciones más grandes.

La mayoría de las micropartículas y nanopartículas tienen una morfología esférica y un diámetro que normalmente oscila entre menos de 100 nanómetros y 1 micrómetro. Las partículas pueden formar aglomerados con un tamaño de partícula medio que oscila entre aproximadamente 10 micrómetros y 40 micrómetros.

El proceso se puede adaptar para comprender un método de impregnación de un bioactivo sobre micropartículas o nanopartículas del biopolímero HMW formado mediante el proceso SFD/GAS. Por tanto, las micropartículas y nanopartículas impregnadas pueden emplearse como vehículo para el bioactivo, por ejemplo como un sistema de administración en aplicaciones farmacéuticas, cosméticas, agrícolas, nutracéuticas o alimentarias.

En términos generales, la solución acuosa de biopolímeros se puede pulverizar dentro de una cámara presurizada a través de una boquilla coaxial junto con una mezcla de un gas presurizado y un codisolvente/antidisolvente (que comprende un disolvente orgánico soluble en agua, como etanol, acetona o isopropanol o sus mezclas). En una alternativa, el codisolvente/antidisolvente se puede inyectar en la solución acuosa de biopolímero antes de la pulverización, lo que facilita la formación de aglomerados de micropartículas o nanopartículas. Después, el bioactivo se puede impregnar sobre las micropartículas o nanopartículas pulverizando una solución, dispersión o emulsión que lo contiene sobre las partículas en diferentes condiciones de procesamiento (es decir, presión, temperatura) y/o empleando otra mezcla fluida para la atomización en una boquilla coaxial diferente a la utilizada durante la precipitación de partículas para evitar la extracción del bioactivo. El fluido de atomización puede estar compuesto por CO2 presurizado, nitrógeno, aire, etanol, agua, cualquier gas compresible o licuado, fluidos subcríticos y supercríticos o mezclas de los mismos, con el fin de evitar la solubilización/extracción del bioactivo de la matriz de micropartículas o nanopartículas durante la impregnación.

Alternativamente, la etapa de impregnación puede realizarse directamente después de la formación de micropartículas o nanopartículas, introduciendo una mezcla fluida que porta el bioactivo y cambiando las condiciones de proceso (es decir, presión, temperatura), modificando así la solubilidad en el fluido, para provocar la precipitación del bioactivo sobre las micropartículas o nanopartículas. Alternativamente, se pueden utilizar otras técnicas de fluidos supercríticos conocidas para la impregnación de vehículos conocidas por los expertos. El bioactivo se puede disolver o dispersar en un disolvente apropiado (es decir CO2 subcrítico o supercrítico, nitrógeno, disolventes orgánicos, etanol, agua, lípidos, otros gases compresibles o licuados o fluidos subcríticos y supercríticos o mezclas de los mismos) y pulverizar sobre las partículas, aplicando así el bioactivo bajo condiciones de procesamiento apropiadas para evitar el colapso de las fibras debido a la tensión interfacial, la acción capilar u otros efectos.

Cuando el material bioactivo presenta una alta solubilidad en CO2 presurizado, o un codisolvente/antidisolvente (tal como un disolvente orgánico soluble en agua, por ejemplo etanol, acetona o isopropanol o sus mezclas) bajo las condiciones requeridas para encapsulación/precipitación durante el proceso SFD/GAS, esto conduciría a la extracción y el agotamiento del bioactivo de las micropartículas o nanopartículas durante el procesamiento SFD/GAS. Por tanto, el proceso SFD/GAS que conduce a la formación de micropartículas o nanopartículas puede ir seguido de una etapa de impregnación, que puede comprender la pulverización de una solución/dispersión o emulsión del bioactivo sobre las micropartículas o nanopartículas utilizando diferentes condiciones de procesamiento (presión, temperatura) y/o utilizando otra mezcla fluida para la atomización en una boquilla coaxial diferente a la utilizada para precipitar las partículas. De este modo se puede evitar la extracción del material bioactivo.

El fluido de atomización puede comprender CO2 presurizado, nitrógeno, aire, etanol, agua, cualquier gas compresible o licuado, fluidos subcríticos y supercríticos o mezclas de los mismos para evitar la solubilización del bioactivo durante la impregnación. Para atomizar o dispersar el material bioactivo en la boquilla coaxial, éste se puede disolver primero en un disolvente adecuado, que puede comprender agua, CO2 presurizado, un

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disolvente orgánico, lípidos o mezclas de los mismos, antes de la etapa de pulverización e impregnación, en una etapa de procesamiento independiente, o según un proceso de inyección en continuo.

En otra realización, se puede pulverizar una dispersión o emulsión del material sobre las micropartículas o nanopartículas formadas por el proceso SFD/GAS. Preferiblemente, las micropartículas o nanopartículas se pueden fluidificar para formar un lecho fluidizado aplicando métodos conocidos en la técnica y después se puede pulverizar el bioactivo sobre las partículas, facilitando una distribución uniforme.

En otra realización, el proceso se puede adaptar para microencapsular un bioactivo, formando el biopolímero HMW una envoltura alrededor del bioactivo. En una realización, y en términos generales, se prepara una solución/dispersión o emulsión del bioactivo en una solución acuosa del biopolímero utilizando métodos conocidos por los expertos o un proceso de inyección continua. La mezcla se pulveriza después dentro de una cámara presurizada junto con una mezcla del fluido de secado, que puede comprender CO2 presurizado y etanol, utilizando una boquilla coaxial.

El término "microcápsulas" significa partículas que comprenden el biopolímero de alto peso molecular y un bioactivo, que puede estar o no totalmente encerrado por las disposiciones de las partículas del biopolímero. Las partículas pueden comprender esferas u otras formas regulares o irregulares, y su tamaño puede variar de modo que la microcápsula tenga al menos una dimensión inferior a aproximadamente 1 mm, preferiblemente inferior a aproximadamente 500 pm y en especial inferior a aproximadamente 100 pm.

El bioactivo se solubiliza en un disolvente adecuado, que comprende agua, un disolvente orgánico soluble en agua, como etanol, acetona o isopropanol, CO2 subcrítico o supercrítico, lípidos o un disolvente expandido con gas, o mezclas de los mismos. Después, el bioactivo solubilizado se inyecta en una solución acuosa del material envolvente para producir una mezcla, provocando la disolución del disolvente en la fase acuosa que conduce al principio de la formación de la envoltura. Sin limitarnos a una teoría, se cree que el disolvente disminuye la constante dieléctrica en la solución acuosa, provocando el inicio de la formación de la envoltura, dispersándose el bioactivo finamente debido a la formación de hilos. La mezcla se inyecta después dentro de una cámara presurizada junto con una mezcla de un gas presurizado y un codisolvente/antidisolvente para formar el material envolvente de microcápsula y el material bioactivo.

El material bioactivo puede ser soluble en agua, en disolventes orgánicos solubles en agua, como etanol, acetona o isopropanol, o en lípidos, para facilitar la preparación de una dispersión o emulsión con la solución de biopolímero HMW, pero insoluble o menos soluble en CO2, en un codisolvente/antidisolvente que comprende disolventes orgánicos solubles en agua, como etanol, acetona o isopropanol o sus mezclas, en las condiciones de procesamiento del proceso SFD/GAS. Por consiguiente, cuando la solución/dispersión o emulsión acuosa del biopolímero HMW que porta el material bioactivo está siendo pulverizada dentro de la cámara presurizada aplicando el proceso SFD/GAS, el material bioactivo puede coprecipitar con el biopolímero HMW y, por tanto, puede encapsularse mediante los aglomerados de micropartículas o nanopartículas que precipitan o se puede impregnar en las partículas.

Es sabido que el dióxido de carbono presurizado puede actuar como biocida, conduciendo a la inactivación de bacterias, mohos, hongos y esporas [16, 17]. Por tanto, en una realización, las condiciones utilizadas en el proceso SFD/GAS que emplea dióxido de carbono presurizado y altas concentraciones de etanol facilitan la esterilidad del producto, destruyendo o inactivando posibles microorganismos presentes en el material de partida, de modo que los polvos o fibras producidos mediante este proceso SFD/GAS son esencialmente estériles, reduciendo así la necesidad de conservantes en el producto seco final.

Las micropartículas o nanopartículas resultantes de los métodos arriba descritos tienen propiedades que las distinguen de las del estado anterior de la técnica. Por ejemplo, las partículas de BG producidas mediante los métodos aquí descritos adquieren normalmente forma de fibras y tienen una densidad aparente considerablemente más baja y una solubilización notablemente mejor que los productos de BG de la técnica anterior. Sin limitarnos a una teoría, se cree que la estructura tridimensional y la gran área superficial que resulta de la morfología con poros muy finos de las fibras facilitan la disolución en agua. La estructura de las microfibrillas ayuda a evitar que las fibras de BG se apelmacen cuando se introducen en agua. Además, la baja densidad aparente de las microfibrillas, que es de aproximadamente 0,01 g/ml, facilita la dispersión fina de las partículas fibrosas cuando se introducen en agua, manteniendo los hilos fibrosos más separados cuando se ponen en contacto con agua que el material en polvo. La estructura porosa y fibrosa y la morfología de las microfibras conducen a un comportamiento similar al de una esponja, facilitando la absorción de agua para humedecer uniformemente las fibras y evitando el apelmazamiento debido a la capilaridad.

Por tanto, las microfibras producidas mediante el método SFD/GAS consistentes en p-glucano de avena o cebada con un alto peso molecular se disuelven mucho más rápido en agua que otros polvos de BG comerciales disponibles en la actualidad.

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Ejemplos

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar aspectos de la presente invención aquí descrita y no para limitar en modo alguno la invención reivindicada. Los siguientes ejemplos investigan los efectos de diversos parámetros de proceso, tales como el diseño de boquilla, el caudal, la concentración de sólidos y la presión en la morfología de las partículas, la distribución del tamaño de partícula y finalmente el contenido de aceite en microcápsulas de aceite de pescado, producidas de acuerdo con realizaciones de la presente invención.

Ejemplo 1 - Materiales

Se adquirió goma arábiga (GA) y se utilizó sin ningún tratamiento adicional (ACROS Organic, Fisher Scientific, Canadá). En los diferentes experimentos se utilizó polvo de p-glucano (BG) (contenido en humedad del 8,7% y contenido de BG del 75% con respecto al peso seco) previamente extraído de cebada en nuestro laboratorio de acuerdo con los protocolos descritos por Ghotra et al. [18]. El aceite de pescado refinado extraído de boquerón y sardina se obtuvo de Ocean Nutrition Canada (OnC, Halifax, NS, Canadá) con un contenido del 8% y 25% de ácido eicosapentaenoico (EPA) y ácido docosahexaenoico (DHA), respectivamente. Se utilizó etanol anhidro de uso alimentario (Commercial Alcohol, Winnipeg, MB, Canadá) con una pureza y un contenido de agua indicados de un 99,99% y un 0,008% en volumen, respectivamente, sin ninguna purificación adicional. Para determinar el contenido de lípidos de las microcápsulas de aceite de pescado se utilizó hexano de calidad analítica (Fisher Scientific, Canadá). De Praxair (Edmonton, AB, Canadá) se compró CO2 totalmente seco con una pureza de un 99,9% y nitrógeno con una pureza de un 99,998%. Para los experimentos de impregnación, se preparó un aceite de colza saturado con carotenoides mediante extracción de zanahorias de acuerdo con las condiciones optimizadas descritas por Sun y Temelli [19].

Ejemplo 2 - Aparato

El aparato utilizado para la formación de micropartículas o nanopartículas, microencapsulación e impregnación consistía en una célula de visualización de 200 ml con un diámetro interior de 40 mm (Nova-Swiss, Effretikon, Suiza) equipada con una boquilla coaxial, calentadores con control de temperatura y baño de aire circulante, mostrada esquemáticamente en la Figura 1. El sistema se presurizó con CO2 mediante una bomba de jeringa (O) (Isco Modelo 260D, Isco Inc., Lincoln, NE). El CO2 se calentó previamente a 45°C utilizando calentadores eléctricos con control de temperatura y se mezcló con etanol, que se bombeo al interior del sistema con una bomba de HPLC (T) (Gilson 305, bomba de HPLC, Gilson Inc., Middleton, WI).

La mezcla de CO2 + etanol pasó a través de una mezcladora estática de doble hélice antes de inyectarse dentro de la célula de visualización circulando dentro del canal exterior de la boquilla coaxial (B). El caudal de CO2 se ajustó utilizando una válvula dosificadora (F) calentada en la salida de la célula de visualización y se controló mediante un rotámetro (G) situado detrás de una botella colectora sellada de captura de etanol. Los controles de la bomba de jeringa ISCO, que estaban ajustados a un modo de presión constante, mostraban el caudal de CO2 suministrado al interior del sistema.

Una solución acuosa que contenía los biopolímeros a precipitar se bombeó mediante una bomba dosificadora de émbolo (L) (LEWA GmbH, Leonberg, Alemania) dentro del tubo interior de la boquilla coaxial y se pulverizó dentro de la célula de visualización (A). Debido a la alta viscosidad de las soluciones acuosas que contenían los biopolímeros HMW, como BG, la bomba dosificadora de émbolo se equipó con válvulas de seta de retención adicionales con carga de muelle (Swagelock Inc., Edmonton, AB) a la entrada y salida de la bomba. Para la boquilla coaxial se ensayaron tres disposiciones diferentes consistentes en dos tubos de acero inoxidable sin soldadura y opcionalmente un tapón con un orificio o una pieza de inserción con orificio instalados en la punta de la boquilla, tal como se muestra en la Figura 2.

El tubo exterior de la boquilla coaxial tenía un diámetro exterior y un diámetro interior de 6,35 y 3,05 mm, mientras que los diámetros del tubo interior eran de 1,59 y 1,08 mm, respectivamente. Dentro de la punta de boquilla (boquillas B y C) del tubo exterior se instalaron piezas de inserción con orificio roscado de estilo tornillo de sujeción modificado (ZM-35-M4-5-SS, O'Keefe Controls, Trumbull, CT). El diámetro de orificio para la boquilla B era de 1,75 mm, mientras que para la boquilla C se ensayaron dos diámetros de orificio, en concreto 0,51 y 0,89 mm. Para el diseño C, tanto la longitud de orificio como la separación entre la punta del tubo interior y el orificio de boquilla tenían una magnitud de aproximadamente 1 mm. El chorro que salía de la punta de boquilla se podía observar a través de la ventanilla en el centro de la célula de visualización, lo que posibilitaba la observación de la ruptura del chorro, la atomización, la precipitación de partículas y el atasco de boquilla. La distancia entre la punta de boquilla y la placa de filtro en el fondo de la célula de visualización era de aproximadamente 7 cm. El filtro para recoger las partículas consistía en una frita de metal sinterizado con un tamaño de poro de 10 pm, que se cubrió con un filtro de nailon de 0,1 pm para cada experimento con el fin de recoger las partículas.

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Para generar de forma continua una emulsión de aceite de pescado en la solución acuosa, se montaron dos dispositivos emulsionantes (EMD) diferentes, tal como se muestra en la Figura 3.

Para todos los experimentos, la solución acuosa con el material de envoltura se bombeó dentro de la entrada

1 del EMD. Además, en el caso de los experimentos de microencapsulación, una mezcla de aceite de pescado + etanol expandido con CO2 (CX EtOH) se inyectó a través de la entrada 2 del EMD (Figura 3) para dispersar el aceite en la solución acuosa. El primer diseño (Figura 3A) consistía en un elemento de aspersión de acero inoxidable sinterizado (Mott Corp., Farmington, CT) con un diámetro exterior de 6,35 mm y un tamaño de poro medio entre 0,2 y 5 pm dispuesto dentro de un tubo de acero inoxidable con un diámetro interior de 7,04 mm, dejando así únicamente un espacio anular muy estrecho entre el elemento de aspersión y el tubo de alojamiento con el fin de generar altas velocidades de cizalladura que faciliten la emulsión de membrana. El segundo diseño (Figura 3B) consistía en una conexión en T de acero inoxidable (Swagelok Inc., Edmonton, AB) con una boquilla hecha a medida con un tapón redondo y un orificio con un diámetro de 50 pm (Lenox Laser Inc., Glen Arm, MD) apuntando a la entrada del tubo de salida (diámetro exterior y diámetro interior de 6,35 y 2 mm, respectivamente), dejando únicamente una separación estrecha entre la punta de boquilla y el tubo de salida (0,5 mm) para generar altas velocidades de cizalladura en el punto de inyección del aceite con el fin de facilitar la emulsión.

Para los experimentos de microencapsulación, el depósito superior del aparato se utilizó para preparar una mezcla de aceite de pescado + CX EtOH. El depósito superior (60 ml), conectado con una bomba de émbolo de cabezal doble (Minipump, Milton Roy, Ivyland, PA), donde un cabezal de bomba se utilizó para la circulación de la mezcla de aceite de pescado + CX EtOH con un caudal de 9,2 ml/min desde el fondo hasta la parte superior del depósito para facilitar el equilibrado, mientras que el otro cabezal de bomba ajustado a un caudal entre 0,4 y 0,8 ml/min, se utilizó para inyectar dicha mezcla de aceite de pescado en el dispositivo emulsionante en la entrada 2 (Figura 3). Dado que se comprobó que el funcionamiento de las válvulas de retención de esta bomba era impredecible a temperaturas elevadas, en el cabezal de bomba utilizado para inyectar la mezcla de aceite de pescado en el EMD se instalaron válvulas de retención externas adicionales con carga de muelle (Swagelok Inc., Edmonton, AB). En la salida de la célula de visualización se utilizó un detector UV/VIS de alta presión (X) (Milton Roy, Ivyland, PA) ajustado a una longitud de onda de 290 nm para controlar la concentración de etanol en la corriente de salida de la célula de visualización, lo que permitía observar in situ cuándo se alcanzaba el régimen permanente.

Ejemplo 3 - Formación de partículas secas

Los experimentos de formación de micropartículas o nanopartículas, microencapsulación e impregnación se llevaron a cabo con la célula de visualización previamente calentada a 40°C, mientras que la mezcla de CO2 + EtOH se calentó previamente a 45°C en el tubo que conducía a la boquilla. Se eligió una temperatura ligeramente más alta en el precalentador para compensar el enfriamiento debido al efecto Joule-Thomson durante la expansión en la boquilla. La temperatura en la cámara de pulverización disminuía durante la pulverización desde 40°C hasta un valor constante de aproximadamente 38°C. Para los experimentos de formación de partículas se evaluaron diversos parámetros y condiciones de proceso durante ensayos preliminares, incluyendo presión, caudales, configuración de boquillas, configuración de dispositivo emulsionante y concentración de sólidos en la solución acuosa, tal como se muestra en la Tabla 1. En la Tabla

2 se proporciona una sinopsis de las condiciones experimentales estudiadas.

Con el fin de preparar partículas de nanoaglomerado secas a partir de una solución acuosa que contenía un 10% (p/p) de GA, la solución de GA se bombeó a un caudal de 2 ml/min y se mezcló con etanol absoluto a un caudal de 4 ml/min utilizando el dispositivo emulsionante con la configuración de boquillas (Figura 3B) antes de la pulverización. Esta solución de GA presaturada en etanol acuoso se pulverizó de forma continua dentro de la cámara de precipitación a 10 MPa y 40°C utilizando la boquilla coaxial junto con CO2 presurizado a un caudal de 25 ml/min, que se mezcló previamente con etanol absoluto a un caudal de 16 o de 20 ml/min.

Tabla 1. Lista de parámetros ensayados para la formación y microencapsulación de partículas

Parámetro de proceso

Rango Unidad

Temperatura

40 °C

Presión

24 MPa

10 MPa

Configuración de boquilla

A, B, C % en peso

Diámetro de orificio

0,89 mm

0,51 mm

Caudal de CO2

21 ml/min

25 ml/min

32 ml/min

Parámetro de proceso

Rango Unidad

Caudal de EtOH

12 24 ml/min ml/min

Caudal de solución acuosa

0,45 ml/min ml/min

0,9 ml/min

1,9 ml/min

2,8

Concentración de sólidos# BG

0,84 % en peso

(% en peso, como base)

0,95 % en peso

1,67 % en peso

GA 21,8 % en peso

10 % en peso

GA + B 10 + 0,5 % en peso

G

Configuración de dispositivo emulsionante

BOQUILLA DE FRITA

# GA: goma arábiga, BG: p-glucano.

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Tabla 2. Condiciones experimentales para la formación y encapsulación de partículas

Experimento#

P Caudal [ml/min] Solución de pulverización Configuración de emulsionante*

[MPa]

Aceite de pescado CO2 EtOH Solución Soluto [% en peso] [ml]

GA 1

24 25 24 0,45 GA 10 5 FRITA

GA 2

24 25 24 0,45 GA 10 4,5 FRITA

GA 3

24 23 12 0,45 GA 10 5 FRITA

BG 1

24 25 24 0,73 BG 0,84 4,5 sin FRITA/tapón

BG 2

24 25 24 0,785 BG 0,84 21,5 sin FRITA/tapón

BG 3

24 25 24 0,73 BG 1,67 18 sin FRITA/tapón

GA BG 1

24 25 24 GA 10 5 sin FRITA/tapón

BG 0,5 5

GA BG 2

24 25 24 1,9 GA 9,8 1,5 sin FRITA/tapón

BG 0,5 1,5

GA BG 3

24 25 24 1,9 GA 9,93 7 BOQUILLA

BG 0,5 7

GA BG 4

10 25 24 1,88 GA 9,87 7,5 BOQUILLA

BG 0,52 7,5

GA BG FO-1

24 0,3 25 24 1,9 GA 9,93 8,5 BOQUILLA

BG 0,5 8,5

GA BG FO-2

10 0,3 25 24 1,88 GA 9,87 7 BOQUILLA

BG 0,52 7

GA BG FO-3

10 0,8 25 24 1,42 GA 9,87 10 BOQUILLA

BG 0,52 10

# GA: goma arábiga; BG: p-glucano; FO: aceite de pescado.* FRITA: EMD tipo A; sin FRITA/tapón: elemento de aspersión sustituido por un tapón; BOQUILLA: EMD tipo B.

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Para los experimentos de formación de partículas, el sistema se calentó a 40°C y se presurizó con CO2 hasta la presión experimental. Se estableció un caudal continuo de CO2 ajustando la válvula dosificadora calentada en la salida de la célula de visualización. La bomba de codisolvente (T) se puso en marcha para suministrar EtOH al sistema de forma continua con el caudal deseado. Después de aproximadamente 10 minutos se alcanzó el régimen permanente, tal como demostraba la absorción constante indicada por el detector UV/VIS, así como una temperatura constante en la célula de visualización. El proceso de pulverización se puso en marcha encendiendo la bomba (L) que suministraba la solución acuosa de biopolímero HMW dentro de la boquilla coaxial.

La pulverización de la solución acuosa se podía observar a través de la ventanilla de la célula de visualización, de modo que, si se atascaba la boquilla, se generaba un impulso de presión cerrando la válvula de cierre (Z) en la entrada de la boquilla durante unos segundos para poder interrumpir el flujo de la mezcla de CO2 + EtOH entrante y se generaba un impulso de presión, que generalmente eliminaba el taponamiento del orificio de la boquilla. La pulverización de la solución acuosa se realizó durante aproximadamente 5 a 10 minutos hasta que la cámara de pulverización parecía estar llena de partículas, que giraban en espiral dentro de la cámara de pulverización. Sin embargo, después de unos minutos, la visión de la boquilla quedó bloqueada debido al depósito de partículas finas en la cavidad de la ventanilla de la célula. Utilizando los indicadores de presión instalados delante y detrás de la boquilla se podían detectar atascos de la boquilla controlando la caída de presión a su través.

Al final del experimento, el tubo entre la boquilla y la bomba (L) se sometió a un retrolavado con cuidado abriendo la válvula de aguja (M), de modo que se expulsó de la línea la solución acuosa restante para evitar que cayeran gotas de la boquilla sobre las partículas secadas durante la etapa de despresurización. Después de detener la pulverización, la bomba de etanol se paró y la célula de visualización se lavó con CO2 puro en las mismas condiciones de presión y temperatura, hasta que ya no se recogió más etanol en el recipiente colector en la salida de la célula de visualización. Después se cerró la válvula de entrada (P) de CO2 y se abrió la válvula de la botella de nitrógeno (R), lo que condujo gradualmente a un cambio de presión dentro de la célula de visualización hasta el nivel de presión de la botella de nitrógeno, que era de aproximadamente 16 MPa. A continuación, la célula de visualización se lavó con nitrógeno presurizado hasta sustituir todo el CO2, según se controló mediante el detector UV/VIS. Así, dentro de la célula de visualización no se formó nada de CO2 líquido y todo el etanol restante potencialmente disuelto en CO2 se expulsó de la célula antes de la despresurización. En cuanto se retiró todo el CO2 de la célula, la célula de visualización se despresurizó lentamente hasta la presión atmosférica y se recogieron las partículas precipitadas sobre el papel de filtro dentro de la célula de visualización.

Ejemplo 4 - Impregnación de partículas con un bioactivo

La impregnación de aglomerados de nanopartículas precipitadas de una solución acuosa de GA presaturada con etanol tal como se describe más arriba se llevó a cabo después del proceso de precipitación de partículas en la misma cámara. Después de la precipitación y el secado, la cámara que contenía las partículas se lavó con CO2 presurizado a 10 MPa para eliminar el etanol residual. Una vez que ya no se recogía más etanol en la salida del recipiente, se inyectó aceite de colza saturado con carotenoides (CO) a un caudal de aproximadamente 0,05 ml/min junto con CO2 presurizado a un caudal de 40 ml/min a 10 MPa y 40°C, provocando así que las partículas se fluidificaran dentro de la cámara y que el aceite rico en carotenoides se dispersara finamente sobre las partículas. La atomización de CO se facilitó mediante CO2 presurizado, que conduce a una disminución de la tensión interfacial entre el aceite de colza y el CO2 a presiones elevadas, ayudando así a la formación de gotitas finas. La cantidad total de aceite rico en carotenoides pulverizado sobre las partículas era aproximadamente un 20% de la masa de partículas presentes en la cámara de precipitación. En lugar de CO2 es posible utilizar nitrógeno presurizado para la etapa de impregnación con el fin de fluidificar las partículas y atomizar el aceite en la boquilla coaxial.

Ejemplo 5 - Microencapsulación de un bioactivo

Se llevaron a cabo experimentos de microencapsulación similares a los experimentos de formación/secado de partículas, excepto que antes de los experimentos se introdujeron 5 ml de aceite de pescado y 20 ml de EtOH en el depósito superior, que se había calentado previamente a 40°C. Después, el depósito superior se presurizó a 9 MPa con adición de CO2 utilizando el regulador de presión (W). Luego se cerró la válvula (Y) y se puso en marcha la bomba de circulación (I y I') ajustada a un caudal de 18 ml/min, mientras que la válvula (E) estaba abierta, hasta alcanzar el equilibrio de la mezcla de EtOH + aceite de pescado + CO2. La circulación se puso en marcha aproximadamente 40 minutos antes de comenzar los experimentos de formación de partículas, tal como se describe en el Ejemplo 3. En el proceso de microencapsulación, en primer lugar se puso en marcha la inyección de solución acuosa de biopolímero HMW dentro de la cámara de precipitación de alta presión junto con CO2 presurizado + etanol y después, en cuanto precipitaron los primeros sólidos en la célula de visualización, se puso en marcha la inyección de aceite abriendo la válvula (H) y cerrando la válvula (E), después de haber ajustado el cabezal de bomba (I) al caudal deseado. Los caudales de la mezcla de solución acuosa y aceite de pescado + etanol + CO2 se eligieron para obtener una carga de aceite teórica en las

partículas de aproximadamente un 15-20% en peso. De modo similar a los protocolos de formación de partículas, la pulverización se llevó a cabo hasta que la célula de visualización parecía estar llena de partículas, lo que normalmente equivalía a aproximadamente 1 g de sólidos, momento en el que la inyección de aceite desde el depósito superior se interrumpió cerrando la válvula (H) y deteniendo inmediatamente la bomba (I y 5 I'). Al mismo tiempo, la inyección de solución acuosa se detuvo apagando la bomba (L). En cuanto terminó la

pulverización, se paró la bomba de codisolvente de etanol y se siguió el protocolo de formación de partículas para despresurizar y recoger el polvo seco.

Ejemplo 6 - Caracterización de partículas obtenidas en los Ejemplos 3-5

El tamaño y la morfología de las partículas se evaluaron utilizando un microscopio electrónico de barrido (MEB). 10 Con este fin, las partículas se dispusieron sobre un adaptador de muestras adhesivo y se revistieron con una capa conductora delgada (150 A) de oro utilizando un pulverizador catódico Nanotek SEMprep II (Prestwich, Manchester, Reino Unido). Las muestras se analizaron con un MEB equipado con un detector Bruker Silicon Drift (BSD) y una fuente de cristal LaB6 capaz de proporcionar imágenes de 20x a 100.000x con una resolución de 5 a 10 nm (Zeiss EVO MA 15, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania).

15 La distribución del tamaño de partícula del polvo seco se determinó por triplicado para cada muestra utilizando un analizador de tamaño de partículas por difracción láser (CILAS 1180, Cilas, Orleans, Francia) con un intervalo de medición de 0,04 a 2.500 pm. La distribución del tamaño de partícula para los nanoaglomerados de GA se llevó a cabo utilizando un analizador de tamaño de partículas por difracción láser equipado con un sistema de muestreo de vacío de dispersión de polvo seco por torbellino (Beckman Coulter, 13 320 Series 20 Laser Diffraction Particle Size Analyzer, Beckman Coulter Inc., Brea, CA).

La densidad aparente aproximada se estimó pesando las partículas directamente después de recogerlas de la célula de visualización y determinando su volumen en un tubo graduado.

Con el fin de determinar el contenido de lípidos en las microcápsulas, el polvo se disolvió en 20 ml de agua a 75°C y después se mezcló a fondo con 40 ml de hexano en un embudo de decantación. La fase orgánica que 25 contenía hexano y aceite de pescado se transfirió a un vaso de precipitados y el hexano se evaporó bajo la campana extractora utilizando un ventilador de aire caliente a aproximadamente 50°C. El aceite de pescado restante se determinó por gravimetría.

En la Tabla 3 se muestra una sinopsis de los resultados obtenidos con diversas condiciones experimentales, tales como aspecto visual, densidad aparente, masa de polvo recogida e índice de las imágenes de MEB para 30 la morfología de las partículas.

Tabla 3. Sumario de resultados experimentales de la formación y encapsulación de partículas

Experimento

Partículas recogidas [g] Densidad aparente part. [g/ml] Aspecto del precipitado Imágenes MEB

GA 1

0,500 0,035 polvo voluminoso fino Figura 7 A, B, D-I

GA 2

0,120 0,017 polvo voluminoso fino similar a GA 1

GA 3

0,083 0,042 polvo voluminoso fino Figura 7 C

BG 1

0,029 0,006 tela de araña de fibrillas sin MEB

voluminosas

BG 2

0,157 0,006 tela de araña de fibrillas Figura 8 A-I

voluminosas

BG 3

0,188 fibrillas más gruesas sin MEB

GA BG 1

0,270 polvo voluminoso fino Fig. 9 A-G, Fig. 11

GA BG 2

0,055 polvo voluminoso fino sin MEB

GA BG 3

0,965 polvo voluminoso fino sin MEB

GA BG 4

0,791 0,038 polvo voluminoso fino Figura 9 H, I

GA BG FO 1

0,942 polvo voluminoso fino Figura 10 D-G, I

GA BG FO 2

0,716 0,023 polvo voluminoso fino Figura 10 A, C

GA BG FO 3

0,951 polvo voluminoso fino Figura 10 B, H

Selección de parámetros de proceso

En una realización se comprobó que el caudal máximo de la bomba de jeringa (O) que resultaba en un flujo 35 continuo constante era de aproximadamente 25 ml/min. Con este caudal de CO2 y el límite superior de la bomba de HPLC (T) capaz de suministrar 24 ml/min de etanol, se comprobó que el mejor caudal para la solución acuosa relativamente viscosa estaba dentro del intervalo de 0,9 a 1,9 ml/min. Con estos caudales, los mejores resultados en términos de ruptura de chorro, atomización y precipitación de partículas se lograron con el diseño de boquilla C mostrado en la Figura 2. En la Figura 4 se muestran los precipitados obtenidos empleando las 40 configuraciones de boquilla de las Figuras 2A y B. Los precipitados consistían en estructuras en forma de barra

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que distaban mucho de un polvo, lo que era el resultado directo de la inyección de caudales bajos de la solución altamente viscosa, con lo que no se formaban gotitas finas. Las configuraciones de boquilla mostradas en las Figuras 2A y B requieren caudales más altos para la precipitación de partículas finas.

Debido a la viscosidad relativamente alta de las soluciones acuosas utilizadas (por ejemplo, una solución acuosa de un 0,5% en peso de concentrado de BG tenía una viscosidad de aproximadamente 19 mPa s a 40°C y una velocidad de cizalladura de 129 s-1), era imposible generar una ruptura de chorro y una dispersión fina con las boquillas A y B a los caudales muy bajos que se podían lograr con las bombas disponibles. Por tanto, todos los experimentos posteriores se llevaron a cabo con la configuración de boquilla C con un diámetro de orificio de 0,89 mm. Además, durante los ensayos preliminares, el dispositivo de emulsión consistente en el elemento de aspersión (Figura 3A) no demostró funcionar bien con caudales muy bajos; también provocó problemas durante la etapa de despresurización, dado que a través de los tubos porosos se expulsó líquido a presión, que cayó sobre las partículas secas y destruyó las muestras. Por consiguiente, para todas las series posteriores se utilizó el dispositivo mostrado en la Figura 3B empleando una boquilla.

Aspecto visual

Las partículas obtenidas en experimentos con éxito eran en su mayor parte partículas apelusadas fluidas tal como se muestra en la Figura 5, excepto cuando se pulverizaron soluciones de BG puro, que produjeron fibrillas finas y estructuras a modo de tela de araña (Figura 6). La Figura 7 muestra partículas de GA impregnadas con aceite de colza (CO) rico en carotenoides. La impregnación de partículas fluidificadas utilizando CO2 presurizado como fluido de atomización para CO resultó en una impregnación uniforme, que es evidente en la imagen derecha inferior (Figura 7). La atomización de CO se facilitó mediante CO2 presurizado con un caudal alto, lo que ayuda a la fluidificación de las partículas y conduce a una disminución de la tensión interfacial entre CO y CO2. La disminución de la tensión interfacial facilita la formación de gotitas finas, que es esencial para la dispersión fina y la impregnación uniforme.

Densidad aparente

La densidad aparente de las partículas obtenidas era muy baja y, en el caso de la GA, oscilaba entre 0,017 y 0,042 g/ml, mientras que en el caso de las fibrillas de BG (Figura 6) era de aproximadamente 0,006 g/ml. Debido a la densidad aparente muy baja, el material procesado ocupa un volumen mucho más grande que el material de partida, tal como se muestra en la Figura 8 en relación con la GA, que tiene la misma cantidad de GA (0,8175 g) antes y después del procesamiento.

Morfología de las partículas

Las morfologías observadas bajo MEB eran muy diversas, desde partículas perfectamente esféricas, partículas asimétricas porosas y estructuras amorfas en el caso de la GA (Figura 9), hasta fibrillas ultrafinas (< 100 nm) y láminas nanoporosas en el caso del BG (Figura 10). La morfología de las partículas obtenidas por coprecipitación de GA + BG parecía una mezcla de partículas finas tanto esféricas como amorfas entrelazadas con estructuras fibrosas (Figura 11). Las partículas más llamativas con aglomerados de nanoesferas se obtuvieron mediante el protocolo de microencapsulación, lo que se puede atribuir al mayor contenido de etanol de la mezcla total antes de la atomización (Figura 12). Por tanto, el efecto antidisolvente del etanol en el BG puede haber provocado la formación de núcleos locales antes de la atomización. La morfología de las partículas depende del mecanismo de precipitación, que se puede deber al efecto de antidisolvente o al efecto de secado por pulverización. Esto se demostró en relación con la precipitación de lisozimas en un proceso PGSS [20], en el que una atomización asistida con nitrógeno produjo partículas esféricas, mientras que una atomización asistida con CO2 dependía de las condiciones en la mezcladora previa, ya que a temperaturas elevadas se formaban partículas esféricas, pero a temperaturas más bajas se formaban fibrillas. Se notificó que el efecto antidisolvente debido a la mayor solubilidad del CO2 en el disolvente era más pronunciado [20]. Por tanto, si el efecto antidisolvente es suficientemente fuerte para inducir una precipitación antes de que pueda tener lugar la atomización, es menos probable que se obtengan partículas esféricas. En el caso del BG, el etanol presente en la fase de CO2 provocaba una precipitación muy rápida debido al efecto antidisolvente, lo que puede ser la razón por la que el BG formaba principalmente fibrillas y láminas, mientras que la GA formaba esferas y estructuras amorfas.

El mecanismo exacto de la precipitación de GA es desconocido. Sin limitarnos a una teoría, la precipitación puede depender de la hidrodinámica en la boquilla coaxial antes de la atomización y de la concentración de etanol en la fase de CO2, ya que un contenido elevado de etanol aumentaría la solubilidad en agua y por tanto aceleraría el proceso de secado. Una mayor competencia por el agua e interacciones entre el etanol y el agua conducirían a una menor cantidad de agua disponible para mantener los polisacáridos dispersos y éstos precipitarían.

En el caso de los experimentos con inyección de aceite de pescado + etanol + CO2, el CO2 inyectado con el aceite de pescado puede actuar como un "intensificador de pulverización" y puede facilitar la atomización, en

especial de la solución viscosa, y provocar inestabilidades internas en el chorro debido a la formación de burbujas de gas, lo que conduce a una formación de gotitas más finas en la boquilla coaxial y a una mejor atomización. Se obtuvieron aglomerados de nanoesferas en estructuras esféricas y en forma de barra.

Además, algunas de las esferas parecían estallar y producir esferas huecas y glóbulos minúsculos en 5 experimentos en los que se utilizaba una mezcla de GA y BG (GA_BG) (Figura 13).

Los aglomerados de nanoesferas producidos saturando previamente la solución acuosa de GA antes de la atomización dentro de la cámara de precipitación consistían en nanoesferas con un diámetro de entre menos de 100 nm y 1 micrómetro (Figuras 14A-C).

Distribución del tamaño de partícula

10 La distribución del tamaño de partícula (DTP) se determinó en las partículas precipitadas con 10 y 24 MPa con y sin coinyección de aceite de pescado + etanol + CO2 tal como se muestra en las Figuras 15 y 16, respectivamente. La DTP con 10 MPa muestra que las partículas se aglomeraban en partículas más grandes dentro del intervalo entre 500 y 1.000 pm en el caso de GA_BG, mientras que también había un pico en la distribución en el rango submicrónico.

15 Entre los experimentos llevados a cabo con 10 MPa y los llevados a cabo con 24 MPa se instaló una válvula de retención adicional en el cabezal (I) de la bomba de inyección para la mezcla de aceite de pescado, ya que parecía que las válvulas de retención internas de la bomba no funcionaban adecuadamente. No obstante, se puede ver claramente en el caso del polvo de GA_BG obtenido con 10 MPa que la DTP era multimodal, apoyando las observaciones de las imágenes de MEB que indicaban que las partículas eran muy diversas y 20 no uniformes en el tamaño y se aglomeraban. Por otro lado, los experimentos con 10 MPa con coinyección de mezcla de aceite de pescado resultaron en una DTP más uniforme. El diámetro medio de partícula de los polvos obtenidos con 10 MPa era sustancialmente más pequeño que el obtenido con 24 MPa (Tabla 4).

Tabla 4. Diámetro medio de partícula con condiciones experimentales seleccionadas.

Presión [MPa]

Condiciones experimentales* Diámetro al 50% Q3 D50[pm] Diámetro medio de partícula [pm]

24

GA BG 3 73,2 117,8

GA BG FO 1 52,9 105,1

10

GA BG 4 29,4 69,6

GA BG FO 2 34,2 47,5

* véase la Tabla 2.

25 La distribución del tamaño de partícula de los aglomerados de nanoesferas mostraba que la cantidad total de etanol inyectado en el sistema influía en el diámetro medio de partícula. La inyección de etanol se dividió entre una cantidad más pequeña (4 ml/min) inyectada dentro de la solución acuosa de GA bombeada a 2 ml/min antes de la atomización dentro de la cámara de precipitación y una cantidad más grande (16 o 20 ml/min) inyectada dentro del CO2 presurizado a 25 ml/min antes de llegar a la boquilla coaxial para la atomización y 30 precipitación. Los aglomerados con 4 + 20 ml/min de etanol total inyectado mostraban un tamaño medio de partícula más pequeño, de aproximadamente 19 micrómetros, mientras que los precipitados generados con la inyección de 4 + 16 ml/min de etanol producían aglomerados de nanopartículas con un diámetro medio de partícula de aproximadamente 27 micrómetros (Figura 17; Tabla 5).

_____________Tabla 5. Efecto de la cantidad total de etanol en el diámetro medio de partícula_____________

Estadística de volumen (aritmética) | MUESTRA GA 16 + 4 |

Cálculos de 0,375 pm a 2.000 pm

Volumen:

100%

Media:

27,61 pm S.D.: 51,47 pm

Mediana:

14,47 pm Varianza: 2.649 pm2

Relación media/mediana:

1,907 C.V.: 186%

Modo:

18,00 pm Asimetría: 4,534 Asimetría derecha

Curtosis: 22,45 Leptocúrtico

< 10%

< 25% < 50% < 75% < 90%

3,099 pm

7,418 pm 14,47 pm 25,16 pm 43,90 pm

< 1 pm

< 10 pm < 100 pm < 1.000 pm

3,19%

34,7% 95,2% 100%

> 1 pm

> 10 pm > 100 pm > 1.000 pm

96,8%

65,3% 4,78% 0%

Estadística de volumen (aritmética) | MUESTRA GA 20 + 4

Cálculos de 0,375 pm a 2.000 pm

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Volumen:

100%

Media:

19,11 jm S.D.: 27,54 jm

Mediana:

11,55 jm Varianza: 758,6 jm2

Relación media/mediana:

1,654 C.V.: 144%

Modo:

12,40 jm Asimetría: 4,363 Asimetría derecha

Curtosis: 23,81 Leptocúrtico

< 10%

< 25% < 50% < 75% < 90%

2,372 |jm

5,716 jm 11,55 jm 21,71 jm 36,93 jm

< 1 jm

< 10 jm < 100 jm < 1.000 jm

3,80%

44,1% 97,6% 100%

> 1 jm

> 10 jm > 100 jm > 1.000 jm

96,2%

55,9% 2,40% 0%

Peso molecular del BG antes y después del procesamiento

El peso molecular (MW) del BG se determinó antes y después del procesamiento con el proceso SFD/GAS por cromatografía de exclusión por tamaños. El MW medio de las moléculas de BG oscilaba entre 474 y 483 kDa antes del procesamiento y entre 452 a 445 kDa después del mismo, lo que indica que la cizalladura que se produce durante el proceso SFD/GAS no afecta sustancialmente al MW de los biopolímeros. Los expertos en la técnica saben que estos biopolímeros se pueden degradar por determinadas operaciones de procesamiento convencionales; no obstante, es crítico mantener el MW original para la funcionalidad. Resultó sorprendente comprobar que los biopolímeros no se degradaban por las operaciones de procesamiento aquí descritas memoria.

Contenido de lípidos en las microcápsulas

El contenido de lípidos de las partículas se determinó disolviendo en primer lugar el polvo (0,5 g) en 20 ml de agua. El polvo se disolvió fácilmente en agua sin formar apelmazamientos y la solución desprendía un olor a aceite de pescado. Sin embargo, las partículas no tenían ese olor claro a pescado que podría indicar que la encapsulación se había completado. No obstante, parecía que la muestra presentaba una cantidad muy pequeña de aceite (GA_BG_Fo_3), ya que en la parte superior de la solución no había nada de aceite de pescado visible. Después de la disolución se determinó que el contenido de lípidos del polvo era de aproximadamente un 1% en la muestra generada mediante el experimento GA_BG_Fo_3. Este contenido de aceite era mucho menor que lo esperado. De acuerdo con la relación estimada de aceite y sólido inyectados en el sistema, el polvo debería contener aproximadamente del 15 al 20% en peso de aceite de pescado. Por tanto, se puede suponer que la mayor parte del aceite se extrajo mediante la mezcla de CO2 + etanol bajo las condiciones reinantes en la cámara de pulverización. Por consiguiente, sería necesario optimizar la presión de CO2 y reducir potencialmente el contenido de etanol a un nivel mucho más bajo. Se ha demostrado que el etanol aumenta sustancialmente la solubilidad de triglicéridos en SC-CO2 [21], que puede llegar a aproximadamente un 5% en peso en CO2 a 50°C y 10 MPa en caso de presencia de un 10% en peso de etanol en CO2. Por otro lado, la eliminación de aceite superficial de las microcápsulas debido al poder disolvente del CO2 + etanol, con lo que se producen microcápsulas limpias, puede ser una ventaja en términos de estabilidad de oxidación del polvo de aceite de pescado.

Podían preverse dos razones potenciales para este bajo contenido de aceite. En primer lugar, el caudal de inyección seleccionado en la bomba (I) se ajustó a niveles muy bajos basándose en el funcionamiento de esta bomba para líquidos no compresibles. Sin embargo, la mezcla de aceite de pescado + etanol + CO2 es compresible, de modo que la cantidad de mezcla inyectada era probablemente mucho más baja de lo previsto, lo que podría ser la razón principal de la baja carga de aceite en las partículas. Además, parte del aceite de pescado podría haber sido extraído de las partículas después de la precipitación debido a la solubilidad relativamente alta del aceite de pescado en la mezcla de SC-CO2 + etanol. Por tanto, este proceso se puede optimizar adicionalmente con el fin de encontrar mejores condiciones de procesamiento para aumentar la carga de aceite en las partículas y minimizar la cantidad de aceite extraído de las cápsulas.

En una realización alternativa, en la solución acuosa solo se inyecta una pequeña cantidad de etanol en combinación con el aceite de pescado y la solución cargada se pulveriza después dentro de una cámara de precipitación más grande con nitrógeno caliente como medio de secado, en lugar de CO2, para evitar la extracción de aceite de las partículas después de la precipitación.

Rendimiento de solubilización

Con el fin de evaluar el rendimiento de solubilización se determinó el tiempo requerido para disolver 1 g de las microfibrillas de BG en 100 ml de agua a diversas temperaturas y se comparó con el tiempo que normalmente se requiere para disolver un polvo de BG obtenido mediante métodos convencionales.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

Después del proceso SFD/GAS, las microfibrillas de BG precipitadas se molieron en un molinillo de café durante aproximadamente 10 segundos para desintegrar las fibrillas con el fin de formar aglomerados de fibra fluidos con una longitud de hasta 5 mm. Después de la molienda, la densidad aparente de las microfibras molidas era de aproximadamente 0,01 g/ml; por tanto, el volumen absorbido por las fibras es aproximadamente igual al de una solución acuosa de las fibras al 1% (p/p). Las fibras desintegradas se utilizaron después para experimentos de solubilización, en los que el tiempo requerido para preparar una solución acuosa al 1% (p/p) utilizando una placa de agitación magnética se determinó con temperaturas de agua de 45 y 55°C.

Con el fin de preparar una solución acuosa al 1% (p/p), 1 g de las microfibras molidas se introdujo lentamente a lo largo de un período de aproximadamente 2 minutos en un vaso de precipitados que contenía 100 g de agua a 45 y 55°C. Durante la adición de las fibras y hasta la disolución completa, el agua se calentó y agitó de forma constante con una placa de agitación magnética. El tiempo requerido para disolver por completo las microfibras en agua a 45 y 55°C para obtener una solución clara con una concentración de un 1% (p/p) fue de aproximadamente 45 y 30 minutos, respectivamente. El aumento de la temperatura conduce a una disminución del tiempo requerido para la solubilización.

En comparación, la preparación de una solución al 1% (p/p) utilizando polvo de BG preparado por precipitación y secado convencional puede durar hasta varias horas, incluso agitándolo en agua a 80°C, lo que puede ser atribuido al apelmazamiento del polvo cuando entra en contacto con agua y a una menor área superficial.

Referencias

Las referencias que se mencionan aquí como un número entre corchetes son representativas del estado actual de la técnica y los contenidos de cada una de las mismas se incorporan aquí por referencia (en los casos permitidos) como si se hubieran reproducido en su totalidad.

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Claims (20)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   Reivindicaciones

   1. Método para producir micropartículas o nanopartículas a partir de una solución acuosa de un biopolímero con un peso molecular de 70 kDa o superior, que comprende la etapa de a) pulverizar la solución acuosa junto con una mezcla de un gas compresible que comprende dióxido de carbono y un codisolvente/antidisolvente orgánico soluble en agua dentro de una cámara presurizada a una temperatura de 25 a 80°C y a una presión que oscila entre 8 y 40 mPa, estando presente el codisolvente/antidisolvente en la mezcla en una concentración de un 20% a un 80% (p:p) en dióxido de carbono subcrítico o supercrítico.
2. 2. Método de la reivindicación 1, que además comprende la etapa de lavar la cámara después de terminar la precipitación de partículas con cantidades suficientes de un gas compresible para eliminar cualquier codisolvente/ antidisolvente residual.
3. 3. Método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde el codisolvente/ antidisolvente soluble en agua comprende etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos.
4. 4. Método de la reivindicación 1, donde la solución acuosa y el gas compresible/codisolvente/antidisolvente se puede pulverizar dentro de la cámara presurizada a través de una boquilla coaxial.
5. 5. Método de la reivindicación 1, donde el biopolímero comprende un polisacárido.
6. 6. Método de la reivindicación 5, donde el polisacárido comprende goma arábiga o p-glucano.
7. 7. Método de la reivindicación 1, donde un disolvente orgánico soluble en agua se mezcla con la solución acuosa antes de la etapa (a).
8. 8. Método de la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de lavar la cámara con un segundo gas que tiene una densidad diferente a la del gas compresible para eliminar cualquier disolvente residual.
9. 9. Producto obtenido mediante el método de la reivindicación 1, y que comprende micropartículas o nanopartículas o aglomerados de las mismas de un biopolímero que tiene un peso molecular superior a 70 kDa y una densidad aparente inferior a 0,10 g/ml.
10. 10. Producto de la reivindicación 9, que comprende p-glucano con una densidad aparente de 0,01 g/ml después de la molienda para formar aglomerados de fibras fluidas con una longitud inferior a 5 mm.
11. 11. Producto de la reivindicación 9, que es altamente soluble en agua, de modo que se forma una solución acuosa al 1% (p/p) en 45 minutos a 45°C y en 30 minutos a 55°C.
12. 12. Método para microencapsular un material bioactivo con un biopolímero, que comprende las etapas de

    a) solubilizar el bioactivo en un disolvente que comprende agua o un disolvente orgánico soluble en agua, CO2 subcrítico o supercrítico, un líquido expandido con gas, lípidos o mezclas de los mismos;

    b) mezclar de forma continua el bioactivo solubilizado en una solución acuosa de un biopolímero para producir una mezcla; y

    c) pulverizar la mezcla acuosa de bioactivo y biopolímero junto con una mezcla de un gas compresible y un codisolvente/antidisolvente dentro de una cámara presurizada.
13. 13. Método de la reivindicación 12, donde el disolvente bioactivo comprende agua, etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos.
14. 14. Método de la reivindicación 12, donde el codisolvente/antidisolvente comprende etanol, acetona o isopropanol o mezclas de los mismos.
15. 15. Método de la reivindicación 12, donde el gas compresible comprende dióxido de carbono.
16. 16. Método de la reivindicación 12, que comprende la etapa adicional de lavar la cámara después de terminar la precipitación de partículas con cantidades suficientes del gas compresible para eliminar cualquier disolvente residual o codisolvente/antidisolvente.
17. 17. Método de la reivindicación 16, que comprende la etapa adicional de lavar la cámara con un segundo gas con una densidad inferior a la del gas compresible utilizado en la etapa (c) para eliminar cualquier disolvente restante o codisolvente/antidisolvente con el fin de obtener un producto seco.

    10
18. 18. Método de la reivindicación 12, donde el bioactivo comprende un material que es esencialmente soluble en un disolvente seleccionado entre el grupo consistente en agua o un disolvente orgánico soluble en agua, CO2 subcrítico o supercrítico, etanol expandido con gas, lípidos o mezclas de los mismos y donde dicho bioactivo es mucho menos soluble en mezclas de CO2 presurizado y el disolvente en las condiciones utilizadas para precipitar el biopolímero en la reivindicación 1.
19. 19. Método de la reivindicación 12, donde el bioactivo solubilizado se inyecta dentro de la cámara presurizada utilizando nitrógeno presurizado.
20. 20. Método de cualquiera de las reivindicaciones 12-19, donde el bioactivo se selecciona entre un aceite de pescado, un aceite vegetal, un lípido que comprende ácidos grasos monoinsaurados o poliinsaturados, un carotenoide, un fitosterol, un tocoferol, un polifenol, un terpenoide, un antioxidante, un péptido, una proteína, una sustancia farmacéutica, una sustancia nutracéutica, un agente antiinflamatorio, antimicrobiano, antiviral o antifúngico.

    imagen1

    ^alentadores eléctricos

    \

    con control de temperatura

    FIG. 1

    l I I

    ABC

    FIG. 2

    A

    entrada 2

    JJ

    imagen2

    B

    entrada 2

    JJ

    imagen3

    C

    emulsión

    FIG. 3

    imagen4

    FIG. 4