ES2659409T3 - Conjugados de lípido-péptido-polímero y nanopartículas de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un conjugado que comprende: un péptido helicoidal que tiene de 10 a 100 aminoácidos; un primer polímero unido covalentemente al péptido helicoidal en el que el primer polímero es un polímero hidrófilo seleccionado entre el grupo que consiste en polietilenglicol, poli(N-isopropilacrilamida) y celulosa y en el que el primer polímero se une al péptido helicoidal en un aminoácido distinto del N o C terminal; y un resto hidrófobo unido covalentemente al extremo N del péptido helicoidal, en el que el resto hidrófobo comprende un resto lipídico o un polímero hidrófobo seleccionado entre el grupo que consiste en polibutadieno, poliestireno, un poliacrilato, un polimetacrilato y polidiacetileno.

Description

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DESCRIPCION
Conjugados de lípido-péptido-polímero y nanopartículas de los mismos
La invención descrita y reivindicada en el presente documento se hizo utilizando fondos proporcionados por el Departamento de Energía de los Estados Unidos con el Contrato N.° DE-AC02-05CH11231. El Gobierno tiene ciertos derechos en la presente invención.
Antecedentes de la invención
Las nanopartículas sintéticas basadas en péptidos/proteínas, lípidos y polímeros ofrecen una gran promesa para aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, tales como entrega de fármacos, nuevas formulaciones de vacunas, ingeniería de tejidos y terapias con proteínas. También son altamente deseables para las industrias alimentaria y cosmética. Se han desarrollado diversos enfoques para preparar nanopartículas con diferentes niveles de éxito tales como liposomas, dendrímeros, nanopartículas poliméricas reticuladas, polimerosomas y nanopartículas sintéticas similares a virus usando proteínas recombinantes. El enfoque polimérico tiende a proporcionar partículas grandes y existen informes limitados de producción de partículas con tamaños de aproximadamente 10-20 nm. Como vehículos principales para muchos sistemas terapéuticos, los liposomas pueden formar nanopartículas con un amplio intervalo de tamaños de 20-30 nm y se usan habitualmente para la entrega de fármacos y genes, así como para cosméticos para el cuidado de la piel y para la industria alimentaria. El proceso de formación de liposomas no es instantáneo y normalmente implica procedimientos de múltiples etapas, tales como tratamiento con ultrasonidos, extrusión, etc. Sin embargo, los liposomas tienden a formar agregados grandes y requieren la optimización del tamaño de partícula, la polidispersidad y el tiempo de vida útil. Pueden fabricarse nanopartículas sintéticas similares a virus, tales como Inflexal V®, usando proteínas recombinantes que se autoensamblan en nanopartículas de 20100 nm de diámetro capaces de presentar múltiples péptidos antigénicos en su superficie. Sin embargo, se requiere una purificación exhaustiva para retirar los compuestos residuales para evitar respuestas inmunitarias. Además, requieren refrigeración para evitar la desnaturalización de las proteínas. Ambas limitaciones dan como resultado altos costes y evitan su utilización amplia. Por tanto, todavía sigue siendo un reto importante preparar nanopartículas monodispersas con diámetros en el intervalo de decenas de nanómetros que sean estables a temperatura ambiente a bajo coste. Sorprendentemente, la presente invención satisface esta y otras necesidades.
El documento US 2010/015173 desvela componentes básicos de lipopéptidos, haces de lipopéptidos helicoidales y partículas sintéticas similares a virus formadas por agregación. Shu et al. desvela un diseño de conjugados de péptido-polímero de haces de hélices (2008, Biomacromolecules 9:2111-2117).
Breve sumario de la invención
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un conjugado que comprende: un péptido helicoidal que tiene de 10 a 100 aminoácidos;
un primer polímero unido covalentemente al péptido helicoidal
en el que el primer polímero es un polímero hidrófilo seleccionado entre el grupo que consiste en polietilenglicol, poli(W-isopropilacrilamida) y celulosa
y en el que el primer polímero se une al péptido helicoidal en un aminoácido distinto del N o C terminal; y
un resto hidrófobo unido covalentemente al extremo N del péptido helicoidal, en la que el resto hidrófobo comprende un resto lipídico o un polímero hidrófobo seleccionado entre el grupo que consiste en polibutadieno, poliestireno, un poliacrilato, un polimetacrilato y polidiacetileno.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un haz de hélices que comprende de 2 a 6 conjugados de la presente invención.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una partícula que comprende de 20 a 200 conjugados de la presente invención.
También se describe un método de formación de partículas de la presente invención poniendo en contacto una pluralidad de conjugados de la presente invención, de manera que los conjugados se autoensamblan para formar las partículas de la presente invención.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1A muestra un esquema de un conjugado de lípido-péptido-polímero de la presente invención usando polietilenglicol (PEG) como el polímero. La Figura 1B muestra un dibujo esquemático del conjugado de péptido- polímero lipidado que forma un haz de 3 hélices y su ensamblaje en nanoestructuras de orden superior.
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La Figura 2A muestra una Micrografía Electrónica de Transmisión (MET) de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1coi-W-HHH 2 y la Figura 2B muestra la MALDI-TOF (desorción e ionización por láser asistida por matriz-tiempo de vuelo por sus siglas en inglés) del conjugado de dC16-1coi-W-HHH 2.
La Figura 3A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P2K-EE 10 y la Figura 3B muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-1CW-P2K-EE 10.
La Figura 4A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P2K-GB 12 con partículas de oro y NaBH4 y la Figura 4B muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-1CW- P2K-GB 12. La Figura 4C muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-GB 12 con partículas de oro solamente.
La Figura 5A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P2K-HHH 1, la Figura 5B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 tanto al 4 % en peso (línea inferior) como al 16 % en peso (línea superior) y la Figura 5C muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-1CWP2K-HHH 1.
La Figura 6A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P2K-KK 5, la Figura 6B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-KK 5 tanto al 4 % en peso (inferior a la derecha) como al 16 % en peso (superior a la derecha) y la Figura 6C muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-1CWP2K-KK 5.
La Figura 7A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P2K-RGD 11, la Figura 7B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-RGD 11 al 4 % en peso y la Figura7C muestra la MALDI- TOF del conjugado de dC16-1CW-P2K-RGD 11.
La Figura 8A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW- P5K-HHH 3, Figura 8B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P5K-HHH 3 tanto al 4 % en peso (superior a la derecha) como al 8 % en peso (inferior a la derecha) y la Figura 8C muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-1CW-P5K- HHH 3.
La Figura 9A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-BB-P2K 8 y la Figura 9B muestra la MALDI-TOF del conjugado de dC16-BB-P2K 8.
La Figura 10A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de PBD-1CW (funcionalización final) 7 y la Figura 10C muestra la MALDI-TOF del conjugado de PBD-1CW 7.
La Figura 11A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de PS-BB (funcionalización lado) 9 y la Figura 11B muestra la MALDI-TOF del conjugado de PS-BB 9.
La Figura 12A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de sC14-1CW- P2K-DGR 13, la Figura 12B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de sC14-1CW-P2K-DGR 13 al 16 en peso. % y la Figura 12C muestra la MALDI-TOF del conjugado de sC14-1CW-P2K-DGR 13.
La Figura 13A muestra una imagen de MET de la partículas preparadas a partir del conjugado de sC16-1CW- P2K-KK 4, la Figura 13B muestra la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de las partículas preparadas a partir del conjugado de sC16-1CW-P2K-KK 4 tanto al 4 % en peso (inferior a la derecha) y al 16 % en peso (superior a la derecha) y la Figura 13C muestra la MALDI-TOF del conjugado de sC16-1CW-P2K-KK 4.
La Figura 14A muestra una imagen de MET de las partículas preparadas a partir del conjugado de tC16-1CW- P2K-KK 6 y la Figura 14C muestra la MALDI-TOF del conjugado de tC16-1CW-P2K-KK 6.
La Figura 15 muestra la MALDI para el conjugado de dC16-SR-PEG2K 14.
La Figura 16 muestra la MALDI para el conjugado de dC18-1CW-PEG2K 15.
La Figura 17 muestra la MALDI para el conjugado de dC16-1CW-P2K-KKKF1 17.
La Figura 18 muestra la MET de nanopartículas esféricas preparadas a partir del conjugado de dC18-1CW-P2K 15 (Figura 18A) con un tamaño similar a las preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16. Sin embargo, el estudio de CDB (Figura 18B) mostró una temperatura de transición mucho más alta para la cadena lipídica más larga con 35 °C, en comparación con 17 °C para las partículas preparadas a partir del conjugado de
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dC16-1CW-P2K 16.
La Figura 19 muestra el análisis de dispersión de rayos x de ángulo pequeño en solución de las micelas de anfífilo peptídico. La Figura 19A muestra la dispersión de rayos x de ángulo pequeño de las partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 a 5 mg/ml en tampón fosfato 25 mM. El ajuste de los datos (línea continua) a un factor de forma esférica de núcleo-corteza produce un diámetro de núcleo de ~3,8 nm, un espesor de la corteza de ~5,7 nm y una polidispersidad del ~7 %. La Figura 19B es una MET criogénica de hielo vítreo de partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 a 1 mg/ml en tampón fosfato 25 mM a pH 7,5. La Figura 19C muestra una MET con tinción negativa de partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 a 1 mg/ml en tampón fosfato 25 mM a pH 7,5. La Figura 19D muestra el análisis de equilibrio de sedimentación de partículas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 a 100 pM en 25 mM de tampón fosfato. El ajuste de los datos (línea continua) en un modelo de una sola especie produce un PM de 512 kDa que corresponde a 26 subunidades trimoleculares.
La Figura 20 muestra la estabilidad térmica de las micelas. La Figura 20A muestra la DXAP dependiente de la concentración de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 en tampón fosfato 25 mM (al 16 % en peso, primero desde la parte superior; al 8 % en peso, segundo; la 4 % en peso, tercero; al 0,5 % en peso, inferior). La Figura 20B muestra la DXAP dependiente de la temperatura de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 en tampón fosfato 25 mM tras el calentamiento de 25 °C a 85 °C, a una tasa de incremento de 1 °C/min y un tiempo de equilibrado de 1 min antes de la medición. La Figura 20C muestra el espectro de TERF de una mezcla de micelas preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 que encapsulan el par de colorantes de FRET DIL y DIO. Los resultados demuestran una fluorescencia mínima debida a la transferencia de energía después de 44 horas, lo que indica la ausencia de fugas de la carga.
La Figura 21 muestra las curvas de calorimetría diferencial de barrido (CDB) para los anfífilo peptídico a base de conjugados de péptido-polímero. La Figura 21A muestra la temperatura de fusión distintiva de lípidos en micelas compuestas de subunidades con diferentes grupos de cabeza. De la parte superior a la inferior: conjugado de SR-dC16-PEG2K 14, conjugado de 1coi-W-KK-dC16 19, conjugado de 1CWdC16-PEG2K 16 y conjugado de 1CWdC16-PEG5K 20. La Figura 21B muestra termogramas de CDB de 1CWdC16-PEG2K con diferentes tratamientos. De la parte superior a la inferior: recién preparado, 16 h de incubación a 20 °C, 1 semana de incubación a 20 °C e hibridado a 70 °C y enfriado lentamente a 20 °C. Los dibujos esquemáticos de la derecha muestran el proceso de evolución de las disposiciones de los grupos de cabeza.
La Figura 22 muestra la dependencia del tiempo de la recuperación de la fluorescencia de nanopartículas marcadas con fluoresceína tras la adición de nanopartículas no marcadas. SR-dC16-PEG2K refiere al conjugado 14 en la Tabla 1 y 1CW-dC16-PEG2K se refiere al conjugado 16 en la Tabla 1.
La Figura 23 muestra un esquema de síntesis representativo para la preparación de los conjugados de péptido- polímero anfífilos.
La Figura 24 muestra la medición de la concentración micelar crítica mediante el método de encapsulación de pireno.
La Figura 25 muestra la cromatografía de exclusión por tamaño de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 a 1 mg/ml en tampón fosfato 25 mM (pH = 7,4).
La Figura 26 muestra la dispersión de neutrones de ángulo pequeño de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 con colas de alquilo deuterado, a 5 mg/ml en tampón fosfato D2O 25 mM pH 7,4. Basado en el mejor análisis de ajuste de los datos, se estimó que el volumen específico de la micela era de 0,877 ml/g.
La Figura 27 muestra un análisis de dicroísmo circular dependiente de la temperatura de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CWP2K 16. Los datos muestran que los péptidos mantienen una alta helicidad en el intervalo de temperaturas de 25 °C a 85 °C del 74-55 %.
La Figura 28 muestra los perfiles de DXAP de muestras preparadas a partir del conjugado de dC16-1CW-P2K 16 que estaban recién preparadas (línea superior) e incubadas a 20 °C durante 16 horas (línea media) y 2 meses (línea inferior).
La Figura 29 muestra una MET con tinción negativa del conjugado de dC16-1CW-P2K-HHH 1 en tampón fosfato (pH = 7,4) almacenado a temperatura ambiente durante 9 meses, que muestra una fracción importante de micelas esféricas con ~15 nm de diámetro.
La Figura 30 muestra que la estructura terciaria del péptido se conserva tras el autoensamblaje de los anfífilos para formar micelas. La Figura 30A muestra los espectros de UV-vis de titulaciones de hemo en una solución ~4,3 pM de conjugado de BB-dC16-P2K 8, un haz de 4 hélices superenrolladas con cuatro sitios de unión hemo
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en el interior del haz. La Figura 30B muestra la absorbancia a 412 nm frente a la relación [hemo]/[haz de 4 hélices] para el conjugado de BB-dC16-P2K 8.
La Figura 31 muestra los espectros de dicroísmo circular del conjugado de SR-dC16-PEG2K 14 (arriba a la derecha) y el conjugado de 1CW-dC16PEGK 16 (abajo a la derecha). SR-dC16-PEG2K forma predominantemente un superenrollamiento, con un contenido helicoidal de menos del 5 %, en comparación con 1CW-dC16-PEG2K, que tiene un contenido helicoidal del 74 % en las mismas condiciones.
Descripción detallada de la invención
I. Generalidades
La presente invención proporciona conjugados de un resto de péptido, polímero y lípido, donde los conjugados se autoensamblan para formar trímeros o tetrámeros, haces de hélices, que después se autoensamblan para formar nanopartículas. Las nanopartículas pueden cargarse con un agente terapéutico o de diagnóstico para la detección y/o tratamiento de una enfermedad o afección. Los conjugados también pueden modificarse con otro resto de aminoácido para la unión a otros restos biológicos u otras partículas.
Un dibujo esquemático del conjugado y su conformación en una estructura de orden superior se representa en la Figura 1. El conjugado se compone de péptidos formadores de haces de 3 hélices superenrollados, con colas de dialquilo hidrófobas conjugadas con el extremo N y PEG hidrófilo acoplado al lado del péptido, formando un componente básico molecular anfífilo con una geometría en forma de cono. Tras la disolución de los conjugados en un tampón acuoso, se produce separación de fases, conduciendo a la formación de nanopartículas monodispersas con diámetros en el intervalo de 10-20 nm. Los superenrollamientos proporcionan la especificidad química y la funcionalidad no disponibles con liposomas y polimerosomas y tienen el potencial para ordenar señales químicas lateralmente en la superficie de la partícula para la orientación específica de sitio. La hélice peptídica actúa como una varilla rígida y determina la posición radial de las cadenas de polímero en una micela. Cuando se forman las micelas, las cadenas de polímero quedan confinadas y forzadas en estrecha proximidad y actúan como resortes, proporcionando una presión lateral negativa que imparte estabilidad potenciada a las micelas individuales, tanto como las repulsiones pueden estabilizar conjuntos voluminosos de partículas coloidales. La especificidad química, el tamaño y la forma también pueden adaptarse basándose en la demanda. Pueden encapsularse fármacos hidrófobos en el núcleo lipídico de la nanopartícula o puede unirse fármacos al péptido en sí para cargas útiles altas. De una manera similar, pueden incorporarse agentes de formación de imágenes y material genético. Pueden provocarse respuestas inmunitarias específicas mediante la presentación de señales químicas específicas en la superficie en una alta densidad de área.
II. Definiciones
"Conjugado" se refiere a un compuesto que tiene un resto de polímero, de péptido y de lípido todos unidos entre sí. Los conjugados son capaces de autoensamblarse para formar haces de hélices. Los haces de hélices se preparan a partir de 2 a 6 conjugados, normalmente 3 o 4.
"Polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a un polímero de restos de aminoácido. Los tres términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos de aminoácido son un mimético químico artificial de un correspondiente aminoácido natural, así como a polímeros de aminoácidos de origen natural y polímeros de aminoácidos de origen no natural. Como se usan en el presente documento, los términos abarcan cadenas de aminoácidos de cualquier longitud, incluyendo proteínas de longitud completa, en las que los restos de aminoácido están unidos por enlaces peptídicos covalentes. Los péptidos de la presente divulgación son helicoidales en la estructura y forman una estructura terciaria proteica superenrollada. La formación de estructura terciaria superenrollada proporciona un armazón estructural para posicionar polímeros conjugados y restringir la forma de subunidades individuales de la nanopartícula. Las hélices también potencian la rigidez de la subunidad y permiten el empaquetamiento geométrico de una manera similar a la de las partículas de virus.
"Polímero" se refiere a una macromolécula que tiene unidades de repetición unidas por enlaces covalentes. Los polímeros pueden ser hidrófilos, hidrófobos o anfífilos. Los polímeros hidrófilos son sustancialmente miscibles con agua e incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol. Los polímeros hidrófobos son sustancialmente inmiscibles con agua e incluyen, pero no se limitan a, polibutadieno y poliestireno. Los polímeros anfífilos tienen ambas propiedades hidrófilas e hidrófobas y normalmente son copolímeros en bloque de un hidrófilo y un polímero hidrófobo. Los polímeros incluyen homopolímeros, copolímeros aleatorios, copolímeros de bloques y otros. Los polímeros específicos útiles en la presente invención incluyen polietilenglicol, N-isopropilacrilamida (NIPAM), polibutadieno y poliestireno, entre otros.
"Resto hidrófobo" se refiere a polímeros o moléculas pequeñas que son hidrófobas. Los ejemplos de restos hidrófobos incluyen, pero no se limitan a, polímeros hidrófobos tales como polibutadieno y poliestireno, así como los restos lipídicos de la presente invención.
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"Resto lipídico" se refiere a un resto que tiene al menos un lípido. Los lípidos son moléculas pequeñas que tienen propiedades hidrófobas o anfífilas y son útiles para la preparación de vesículas, micelas y liposomas. Los lípidos incluyen, pero no se limitan a, grasas, ceras, ácidos grasos, colesterol, fosfolípidos, monoglicéridos, diglicéridos y triglicéridos. Los ácidos grasos pueden ser saturados, monoinsaturados o poliinsaturados. Los ejemplos de ácidos grasos incluyen, pero no se limitan a, ácido butírico (C4), ácido caproico (C6), ácido caprílico (C8), ácido cáprico (C10), ácido láurico (C12), ácido mirístico (C14), ácido palmítico (Cl6), ácido palmitoleico (C16), ácido esteárico (C18), ácido isoesteárico (C18), ácido oleico (C18), ácido vaccénico (C18), ácido linoleico (C18), ácido alfa-linoleico (C18), ácido gamma linolénico (C18), ácido araquídico (C20), ácido gadoleico (C20), ácido araquidónico (C20), ácido eicosapentaenoico (C20), ácido behénico (C22), ácido erúcico (C22), ácido docosahexaenoico (C22), ácido lignocérico (C24) y ácido hexacosanoico (C26). El resto lipídico puede incluir varios grupos de ácidos grasos utilizando grupos de ramificación tales como lisina y otras aminas ramificadas.
"Agente terapéutico" se refiere a un agente capaz de tratar y/o mejorar una afección o enfermedad. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, compuestos, fármacos, péptidos, oligonucleótidos, ADN, anticuerpos y otros.
"Agente de diagnóstico" se refiere a un agente capaz de diagnosticar una afección o enfermedad. Los agentes de diagnóstico incluyen, pero no se limitan a, tinciones y radiomarcadores.
"Poner en contacto" se refiere al proceso de poner en contacto al menos dos especies distintas de manera que puedan reaccionar. Se debe apreciar, sin embargo, que el producto de reacción resultante puede producirse directamente a partir de una reacción entre los reactivos añadidos o partir de un intermedio de uno o más de los reactivos añadidos que pueden producirse en la mezcla de reacción.
El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural y a aminoácidos sintéticos, así como a análogos de aminoácidos y a miméticos de aminoácidos que funcionan de una manera similar a los aminoácidos de origen natural. Son aminoácidos de origen natural aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se modifican posteriormente, por ejemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato y O-fosfoserina.
"Análogos de aminoácidos" se refiere a compuestos que tienen la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural, es decir, un carbono que está unido a un hidrógeno, un grupo carboxilo, un grupo amino y un grupo R, por ejemplo, homoserina, norleucina, sulfóxido de metionina, metil sulfonio de metionina. Dichos análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras principales peptídicas modificadas, pero conservan la misma estructura química básica que un aminoácido de origen natural.
Los "aminoácidos no naturales" no están codificados por el código genético y pueden tener, pero no necesariamente tienen, la misma estructura básica que un aminoácido de origen natural. Los aminoácidos no naturales incluyen, pero no se limitan a ácido azetidincarboxílico, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, butilglicina terciaria, ácido 2,4- diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N- etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alo-hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo- isoleucina, N-metilalanina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilpentilglicina, N-metilvalina, naftalanina, norvalina, ornitina, pentilglicina, ácido pipecólico y tioprolina.
"Miméticos de aminoácidos" se refiere a compuestos químicos que tienen una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona de una manera similar a un aminoácido de origen natural.
Los aminoácidos pueden denominarse en el presente documento mediante cualquiera de los habitualmente conocidos símbolos de tres letras o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Análogamente, los nucleótidos pueden denominarse por sus códigos de una sola letra aceptados comúnmente.
"Variantes modificadas de forma conservadora" se aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias particulares de ácidos nucleicos, "variantes modificadas de forma conservadora" se refiere a los ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas, o cuando el ácido nucleico no codifica una secuencia de aminoácidos, a secuencias esencialmente idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos ellos el aminoácido alanina. Por tanto, en cada posición donde se especifique una alanina por un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son una especie de variaciones modificadas de forma conservadora. Cada secuencia de ácido nucleico en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada variación silenciosa posible del ácido nucleico. Un experto reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que normalmente es el único codón para metionina, y TGG, que normalmente es el
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único codón para triptófano) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica. En consecuencia, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.
En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones, deleciones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido, polipéptido o secuencia proteica que alteren, añadan o eliminen un único aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada son una "variante modificada de forma conservadora", donde la alteración da como resultado la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar (es decir, hidrófobo, hidrófilo, cargado positivamente, neutral, cargado negativamente). Los aminoácidos hidrófobos ejemplificados incluyen valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina y triptófano. Los aminoácidos aromáticos ejemplificados incluyen fenilalanina, tirosina y triptófano. Los aminoácidos alifáticos ejemplificados incluyen serina y treonina. Los aminoácidos básicos ejemplificados incluyen lisina, arginina e histidina. Los aminoácidos ejemplificados con cadenas laterales de carboxilato incluyen aspartato y glutamato. Los aminoácidos ejemplificados con cadenas laterales de carboxamida incluyen asparagina y glutamina. Las tablas de sustitución conservadora que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Dichas variantes modificadas de manera conservadora se suman a, y no excluyen, variantes polimórficas, homólogos interespecies y alelos de la invención.
Los ocho grupos siguientes contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí:
1) Alanina (A), Glicina (G);
2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E);
3) Asparagina (N), Glutamina (Q);
4) Arginina (R), Lisina (K);
5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V);
6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptófano (W);
7) Serina (S), Treonina (T); y
8) Cisteína (C), Metionina (M)
(véase, por ejemplo, Creighton, Proteins (1984)).
"Haz de hélices" se refiere a una estructura formada mediante el autoensamblaje de una pluralidad de conjugados de la presente invención, donde los restos hidrófobos y péptidos de cada conjugado se alinean entre sí.
III. Conjugados, haces de hélices y partículas
La presente invención proporciona conjugados de un resto de péptido, de polímero y de lípido, donde los conjugados se autoensamblan para formar trímeros o tetrámeros de haces de hélices, que después se autoensamblan para formar nanopartículas.
Los conjugados comprenden un péptido con de 10 a 100 aminoácidos, en el que el péptido adopta una estructura helicoidal. El conjugado también incluye un primer polímero unido covalentemente al péptido y un resto hidrófobo unido covalentemente al extremo N del péptido, en el que el resto hidrófobo comprende un segundo polímero o un resto lipídico.
Son péptidos útiles en los conjugados de la presente invención los que adoptan una conformación helicoidal. Los péptidos son de 10 a 100 aminoácidos. En algunas realizaciones, el péptido puede ser la SEQ ID NO: 1 (1CW), la SEQ ID NO: 2 (BB), la SEQ ID NO: 4 (SR) y la SEQ ID NO: 5 (1coi-W).
En una realización preferida, la presente invención comprende secuencias peptídicas que se autoasocian. En otra realización, la secuencia peptídica puede ser un péptido de haz de 3 hélices diseñado de novo, tal como, pero no limitado a la SEQ ID NO: 1 (1CW). En aspectos particulares, pueden añadirse 1-50 aminoácidos adicionales al extremo C del péptido sin interferir con la formación de micelas. En algunas realizaciones, el péptido incluye 1-25 aminoácidos adicionales en el extremo C, preferentemente 1-10, más preferentemente 1-5. En otra realización, la secuencia peptídica puede ser una secuencia peptídica de control que forma un superenrollamiento al azar, tal como, pero no limitada a la SEQ ID NO: 4 (SR). El péptido puede diseñarse basándose en la SEQ ID NO: 5 (1coi-W) y tienen características similares, incluyendo PI y la hidrofobia. En otra realización más, la secuencia peptídica puede ser un péptido de unión a hemo que es capaz de formar haces de 4 hélices tal como la SEQ ID NO: 2 (BB).
Los conjugados de la presente invención también incluyen un primer polímero. El primer polímero es un polímero hidrófilo. Los polímeros hidrófilos son miscibles con agua e incluyen polietilenglicol (PEG o P), poli(N- isopropilacrilamida) (NIPAM) y celulosa. En algunas otras realizaciones, el primer polímero es polietilenglicol.
El primer polímero puede unirse al péptido a través de enlace covalente, iónico y otros medios de enlace. En algunas realizaciones, el primer polímero se une al péptido a través de enlaces covalentes. El primer polímero se une al péptido en un aminoácido distinto del N o C terminal. Cualquier enlace covalente adecuado es útil para unir el
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primer polímero al péptido. Por ejemplo, el enlace covalente puede ser a través de un enlace éster, amida, éter, tioéter o carbono. En algunas realizaciones, el primer polímero puede modificarse con una maleimida que reacciona con un grupo sulfhidrilo del péptido, tal como en una cisteína. En otras realizaciones, el primer polímero se une al péptido a través de química de clic, mediante reacción de una azida y un alquino para formar un anillo de triazol.
En algunas realizaciones, el resto hidrófobo puede ser un segundo polímero. Los polímeros útiles como resto hidrófobo incluyen polímeros hidrófobos, que incluyen polibutadieno, poliestireno, poliacrilatos, polimetacrilatos, polidiacetileno y otros. En algunas otras realizaciones, el resto hidrófobo puede ser polibutadieno.
En otras realizaciones, el resto hidrófobo puede ser un resto lipídico. Los restos lipídicos útiles en la presente invención incluyen de 1 a 20 cadenas de alquilo largas, de 1 a 10 cadenas de alquilo o de 1 a 6 cadenas de alquilo o 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cadenas de alquilo. Los restos lipídicos pueden prepararse a partir de ácidos grasos, que incluyen, pero no se limitan a, ácido cáprico (C10), ácido láurico (C12), ácido mirístico (C14), ácido palmítico (C16), ácido palmitoleico (C16), esteárico ácido (C18), ácido isoesteárico (C18), ácido oleico (C18), ácido vaccénico (C18), ácido linoleico (C18), ácido alfa linoleico (C18), ácido gamma linolénico (C18), ácido araquídico (C20), ácido gadoleico (C20), ácido araquidónico (C20), ácido eicosapentaenoico (C20), ácido behénico (C22), ácido erúcico (C22), ácido docosahexaenoico (C22), ácido lignocérico (C24) y ácido hexacosanoico (C26).
Los grupos alquilo de ejemplo en los restos lipídicos incluyen cadenas de alquilo C10-20, tales como grupos alquilo C10, C12, C14, C16, C18 o C20. Los grupos alquilo pueden ser saturados o parcialmente insaturados. En algunas realizaciones, los restos lipídicos tienen al menos un grupo alquilo C14 o al menos un grupo alquilo C16. Cuando los restos lipídicos incluyen más de un grupo alquilo, el resto lipídico también incluye un enlazador ramificado que proporciona la unión de múltiples grupos alquilo. Los enlazadores ramificados útiles en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, lisina, ácido glutámico y otras aminas y ácidos carboxílicos ramificados. En algunas realizaciones, el resto lipídico incluye de 1 a 6 grupos alquilo C10-20. El resto lipídico puede incluir 1, 2, 3, 4, 5 o 6 grupos alquilo C10-20. En otras realizaciones, el resto lipídico incluye 1, 2 o 4 grupos alquilo C10-20.
En otras realizaciones más, el resto lipídico incluye 1 grupo alquilo C10-20. En otras realizaciones más, el resto lipídico incluye 2 grupos alquilo C10-20.
El resto hidrófobo se une al péptido en el extremo N.
Cuando el primer polímero se une al péptido en un punto distinto del extremo N o C y el resto hidrófobo se une al extremo N, los conjugados de la presente invención también pueden incluir un componente unido al extremo C. El componente en el extremo C puede ser cualquier resto de unión o marcador útil que puede incluir, pero no se limita a, un resto de aminoácido, un oligonucleótido, un polipéptido, un anticuerpo, un agente de diagnóstico, un agente terapéutico, un polímero y otros. En algunas realizaciones, el conjugado incluye un resto de aminoácido unido al extremo C del péptido. El resto de aminoácido puede tener cualquier número adecuado de aminoácidos, tales como de 2 a aproximadamente 100, o de 2 a aproximadamente 50, o de 2 a aproximadamente 20 aminoácidos. En otras realizaciones, el resto de aminoácido puede ser GGG, HHH, KK, EE, RGD y AYSSGAPPMPPF y combinaciones de los mismos. Otros restos de aminoácido son útiles en los conjugados de la presente invención.
En otra realización, el conjugado incluye el péptido de la SEQ ID NO: 1 (1CW), polietilenglicol como el primer polímero, el resto hidrófobo que tiene lisina y dos cadenas de alquilo C16 y un resto de aminoácido de 2 a aproximadamente 20 aminoácidos unido covalentemente al extremo C del péptido. En algunas otras realizaciones, el conjugado incluye el péptido de la SEQ ID NO: 1 (1CW), polietilenglicol como el primer polímero, el resto hidrófobo que tiene lisina y dos cadenas de alquilo C18 y un resto de aminoácido de 2 a aproximadamente 20 aminoácidos unidos covalentemente al extremo C del péptido.
En otra realización, el anfífilo se construye mediante la unión covalente de polietilenglicol (PEG) de 2000 Da (PEG2k o P2K) a la Cys14 de un péptido formador de haz de 3 hélices de SEQ iD NO: 1 (1CW). Se unen dos cadenas de alquilo C16 al péptido N terminal con un enlazador de ácido (6)-amino-hexanoico insertado entre el péptido y la cola C16 doble. En otra realización, el anfífilo peptídico de SEQ ID NO: 5 (1coi-W) puede conjugarse con cualquier polímero.
La presente invención también proporciona haces de hélices, formados a partir del autoensamblaje de una pluralidad de conjugados. Los haces de hélices pueden formarse a partir de 2, 3, 4, 5 o 6 conjugados. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un haz de hélices que tiene de 2 a 6 conjugados de la presente invención. En otras realizaciones, los haces de hélices incluyen 3 conjugados. En algunas otras realizaciones, el haz de hélices incluye 4 conjugados.
La presente invención también proporciona partículas formadas a partir del autoensamblaje de los haces de hélices, de manera que el resto hidrófobo forma una estructura micelar que tiene un bolsillo hidrófobo y el péptido y el primer polímero están en el exterior de la micela formada por el resto hidrófobo. Las partículas incluyen cualquier número adecuado de conjugados. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona una partícula que tiene de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 conjugados de la presente invención. Las partículas pueden ser de cualquier tamaño adecuado. Por ejemplo, las partículas pueden ser de aproximadamente 5 nm a aproximadamente
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500 nm de diámetro, o de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 nm de diámetro, o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 50 nm de diámetro, o de aproximadamente 5 nm a aproximadamente 25 nm de diámetro.
Las partículas de la presente invención pueden incluir carga en el interior hidrófobo de la partícula. La carga útil en las partículas de la presente invención incluye, pero no se limita a, un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, ADN y un oligonucleótido.
Los conjugados, haces de hélices y partículas de la presente invención pueden unirse a otras partículas, tales como nanopartículas de oro y nanopartículas magnéticas que normalmente tienen unos pocos nanómetros de diámetro con fines de formación de imágenes y manipulación.
Tabla 1. Conjugados
Conjugado
Extremo N 1 Péptido Primer polímero 3 Resto de aminoácidos C terminal Tamaño de partículas (nm)
1
dC16 1CW PEG2K HHH 16 nm
2
dC16 1coi-W - HHH 8-10 nm
3
dC16 1CW PEG5K HHH 20-50 nm
4
sC16 1CW PEG2K KK 10-13 nm
5
dC16 1CW PEG2K KK 14-17 nm
6
tC16 1CW PEG2K KK nanovarillas de 10 nm de diámetro
7
PBD 1CW - - 10-13 nm
8
dC16 BB PEG2K - 10-15 nm
9
MeC(O) BB PS - 10-12 nm
10
dC16 1CW PEG2K EE 14-17 nm
11
dC16 1CW PEG2K RGD 14-17 nm
12
dC16 1CW PEG2K GB 4 14-17 nm
13
sC14 1CW PEG2K DGR 10-13 nm
14
dC16 SR PEG2K - 10-15 nm
15
dC18 1CW PEG2K - 12-15 nm
16
dC16 1CW PEG2K - 10-15 nm
17
dC16 1CW PEG2K KK(Kf1 ) 5 -
18
dC16 SR PEG2K KK(Kf1 ) 5 -
19
dC16 1coi-W PEG2K KK -
20
dC16 1CW PEG5K - -
La "s", la "d" y la "t" se refieren a la cantidad de cadenas de ácido graso en el resto lipídico:
1, 2 y 4, respectivamente. El "C16" se refiere al número de carbonos en la cadena de ácido graso, tal como ácido mirístico (C14), ácido palmítico (C16) y ácido esteárico (C18). PBD es polibutadieno. 2 1CW es la SEQ ID NO: 1; BB es la SEQ ID NO: 2; SR es la SEQ ID NO: 4; 1coi-W es la SEQ ID NO: 5. Los conjugados 1-6, 10-12 y 17-18 contienen una secuencia enlazadora GGG entre el péptido y el resto de aminoácido C terminal. 3 PEG es polietilenglicol; PS es poliestireno. Polímero unido en Cys-14. 4 GB es AYSSGAPPMPPF, SEQ ID NO: 3. 5 Kf1 es lisina con carboxifluoresceína conjugada con el grupo £-amino de la cadena lateral. Como se usa en toda la presente solicitud, los conjugados de la presente invención pueden escribirse en forma abreviada como dC16- 1CW-PEG2K o 1CW-dC16-PEG2K o cualquier otra combinación de los tres componentes.
IV. Métodos de preparación de nanopartículas
Las nanopartículas de la presente invención pueden prepararse por cualquier método adecuado conocido para un experto en la materia. Por ejemplo, las nanopartículas pueden prepararse disolviendo en primer lugar los conjugados en un disolvente adecuado a cualquier concentración de aproximadamente 1 nM a aproximadamente 1 M o de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 mM, o de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM. Como alternativa, los conjugados pueden disolverse para formar de aproximadamente el 0,1 a aproximadamente el 50 % en peso de la solución, o de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 50 % en peso, o de aproximadamente el 1 a aproximadamente el 25 % en peso. Los conjugados se autoensamblan para formar los haces de hélices de la presente invención. Los haces de hélices después se autoensamblan para formar las partículas. En algunos aspectos, la presente divulgación proporciona un método de formación de partículas de la presente invención poniendo en contacto una pluralidad de conjugados de la presente invención de manera que los conjugados se autoensamblen para formar las partículas de la presente invención.
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La presente divulgación también proporciona partículas preparadas disolviendo los conjugados de la presente invención a una concentración como se ha descrito anteriormente, de manera que los conjugados se autoensamblen para formar haces de hélices y permitiendo después que los haces de hélices se autoensamblen para formar las partículas.
V. Ejemplos
Materiales. Se adquirieron aminoácidos protegidos con Fmoc, hexafluorofosfato de 2-(1 H-benzotriazol-1 -il)-1,1,3,3- tetrametiluronio (HBTU), hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilaminium (HCTU) de EMD Biosciences y se usaron sin purificación adicional. Los grupos protectores de cadena lateral de los aminoácidos protegidos con Fmoc fueron los siguientes: Lys(Boc), Glu(OtBu), Asp(OtBu), Cys(Trt), Arg(Pbf), Su(Trt), Trp(Boc), Gln(Trt). Además, se usó Lys(Fmoc) para la conjugación de dos ácidos palmíticoa a cada péptido y se añadió un enlazador, Fmoc-6-Ahx-OH (Sigma Aldrich), entre el péptido y las colas de alquilo. Se adquirieron diisopropiletilpropilamina (DIPEA) de calidad de síntesis de péptidos, ácido trifluoroacético (TFA), triisopropilsilano, dietil éter, dimetilformamida (DMF) de calidad HPLC, diclorometano (DCM) y acetonitrilo de Fisher y se usaron sin purificación adicional. Se adquirieron piperidina y ácido palmítico de Sigma Aldrich. Se adquirió el reactivo de tinción negativa ácido fosfotúngstico de Ted Pella y se preparó como la solución madre al 2 % en peso en agua DI.
Ejemplo 1. Preparación de conjugados
Los péptidos, denominados en lo sucesivo en el presente documento como
1CW (EVEALEKKVAALECKVQALEKKVEALEHGW),
BB (GGGEIWKLHEEFLKKFEELLKLHEERLKKM),
SR (EGKAGEKAGAALKCGVQELEKGAEAGEGGW), y
1coi-W (EVEALEKKVAALESKVQALEKKVEALEHGW), se han descrito anteriormente en detalle. El extremo C de los péptidos puede prepararse con GGG, HHH, KK, EE, RGD y AYSSGAPPMPPF y combinaciones de los mismos, y otras secuencias peptídicas a través de la síntesis en fase sólida con Fmoc. El esquema de la Figura 23 es típico de los procedimientos utilizados para la síntesis de conjugados.
Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador en fase sólida Protein Technologies Prelude usando química de protección con carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc) patrón sobre resina de Wang (Nova Biochem), normalmente a una escala de 0,05 mmol. Los grupos protectores de cadena lateral fueron los siguientes: Lys(Boc), Glu(OtBu), Asp(OtBu), Cys(Trt), Arg(Pbf), Su(Trt), Trp(Boc), Ser(tBu), Gln(Trt). Los péptidos sintetizados con restos adicionales añadidos al extremo C incluyen opcionalmente una secuencia de unión GGG intersticial. Para la síntesis de conjugados de 1CW-PEG, la serina en la posición 14 se mutó a cisteína para facilitar la conjugación de PEG funcionalizado terminalmente con maleimida. De forma similar para BB, la lisina en la posición 15 se mutó a cisteína. Para la síntesis de dC16-1CW-P2K, se unió ácido Fmoc-hexanoico entre el péptido y el ácido graso como un enlazador. Después se unión Fmoc-Lys(Fmoc)-OH al extremo N para permitir el acoplamiento simultáneo de ácido palmítico a la amina de la cadena lateral de lisina y el extremo N del péptido, produciendo de este modo una cola de alcano doble, y la cisteína en la posición 15 se usó para el acoplamiento de PEG funcionalizado con maleimida de peso molecular 2000 g/mol y 5000 g/mol (Rapp Polymere) a la mitad de la secuencia peptídica. Se sintetizó tC16- 1CW-P2K con dos rondas consecutivas de acoplamiento con Fmoc-Lys(Fmoc)-OH en el extremo N generando cuatro puntos de ramificación para unir ácidos palmíticos. Para el péptido 9, antes de la escisión del péptido de la resina, el extremo N se acetiló usando una mezcla 1:1 (v/v) de anhídrido acético:solución de piridina durante 30 min. Los péptidos se escindieron de la resina y se desprotegieron simultáneamente usando ácido trifluoroacético (TFA)/etanoditiol/agua 90:8:2 durante 3,5 h. Los péptidos en bruto se precipitaron en éter frío y posteriormente se disolvieron en agua y se liofilizaron. Después se acopló PEG funcionalizado terminalmente con maleimida, adquirido de Rapp Polymere (Alemania), a los restos de cisteína de los péptidos, que estaban en forma de polvo de color blanco, en tampón fosfato de potasio 25 mM a pH 8 durante 1 h. Se utilizaron PEG de 3 de tres pesos moleculares variables: 750, 2000 y 5000 Da. Estos se denominan en adelante PEG750, PEG2K y PEG5K, respectivamente.
Para la preparación de conjugados de BB-PEG, la lisina en la posición 15 se mutó a cisteína para facilitar el acoplamiento de PEG funcionalizado con maleimida de peso molecular 2000 g/mol y 5000 g/mol (Rapp Polymere) a la mitad de la secuencia peptídica. Los péptidos se sintetizaron en un sintetizador en fase sólida Protein Technologies Prelude usando química de protección con carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc) patrón sobre resina de PEG-PAL (Applied Biosystems), normalmente a una escala de 0,05 mmol. Los péptidos se disolvieron en tampón fosfato (25 mm, pH = 8) a una concentración de 10 mg/ml. La solución se purgó con nitrógeno durante 5 minutos antes de la adición de polietilenglicol funcionalizado con maleimida. Se añadió PEG-maleimida en 7-8 equivalentes de los péptidos. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante al menos una noche antes de la purificación por HPLC.
El conjugado dilipídico dC16-1CW-P2K se preparó haciendo reaccionar ácido Fmoc-hexanoico que estaba unido entre el péptido y el ácido graso como un enlazador. Después se unió Fmoc-Lys(Fmoc)-OH al extremo N para permitir el acoplamiento simultáneo de ácido palmítico a la amina de la cadena lateral de lisina y el extremo N del péptido, produciendo de este modo una cola de alcano doble. Los conjugados en bruto se precipitaron en éter frío y
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posteriormente se disolvieron en solución y se liofilizaron, dando como resultado un polvo de color blanco.
El conjugado tetralipídico tC16-1CW-P2K se sintetizó con dos rondas consecutivas de acoplamiento con Fmoc- Lys(Fmoc)-OH en el extremo N generando cuatro puntos de ramificación para unir ácidos palmíticos. Los péptidos se escindieron de la resina y simultáneamente se desprotegieron usando ácido trifluoroacético (TFA)/etanodiol/agua 90:8:2 durante 3,5 h.
También se sintetizaron péptidos en un sintetizador en fase sólida Protein Technologies Prelude usando química de protección con carbamato de 9-fluorenilmetilo (Fmoc) patrón sobre resina de PEG-PAL (Applied Biosystems), normalmente a una escala de 0,05 mmol. Se añadió Fmoc-Lys(Fmoc)-OH (EMD Bioscience) al extremo N para permitir el acoplamiento de dos moléculas de ácido palmítico al extremo N del péptido. Los péptidos palmitoilados se escindieron de la resina y simultáneamente se desprotegieron usando ácido trifluoroacético (TFA)/etanoditiol/agua 90:8:2 durante 3,5 h. Los péptidos en bruto se precipitaron en éter frío y posteriormente se disolvieron en solución y se liofilizaron, dando como resultado un polvo de color blanco. La cisteína en la posición 14 facilita el acoplamiento específico de sitio de PEG funcionalizado con maleimida de peso molecular 2000 g/mol o 5000 g/mol (Rapp Polymere) a la mitad de la secuencia peptídica.
Los conjugados 1, 3, 5-6, 8 10-12 y 14-16 se prepararon mediante el método anterior. No se usaron aminoácidos adicionales para los conjugados de 14-16. El conjugado 2 se preparó como se ha descrito anteriormente, sin la etapa de unir el polímero al péptido. El conjugado 4 se preparó acoplando ácido palmítico al extremo N del péptido sin el resto Fmoc-Lys(Fmoc)-OH intersticial. El conjugado 13 se preparó acoplando ácido palmítico al extremo N del péptido sin los restos ácido aminohexanoico y Fmoc-Lys(Fmoc)-OH intersticiales.
El conjugado 7 se preparó mediante el siguiente método: se disolvió polibutadieno terminado con carboxilo (PBD, Polymer sourse) en una mezcla de diclorometano y dimetilformamida. En presencia de HCTU y DIPEA, el PBD se hizo reaccionar con el grupo amino en el extremo N del péptido (1-CW) a través de síntesis en fase sólida. Tras la terminación de la reacción de acoplamiento entre el PBD y el péptido, el conjugado se escindió con TFA al 95 %, TIS al 2,5 % y H2O al 2,5 % durante 1 hora. El PBD-1CW en bruto se purificó por HPLC y se caracterizó mediante MALDI.
Se preparó conjugado de 9 usando BB con poliestireno en su lateral mediante la preparación en primer lugar de péptido de manera que pudiera desprotegerse selectivamente para dar como resultado grupos amino libres que podrían utilizarse para acoplar polímeros terminados en carboxi a la cadena peptídica. Más específicamente, se usó lisina protegida con aliloxicarbonilo (Alloc), Lys(Alloc), como el aminoácido en la posición 15a de la cadena peptídica. La retirada del grupo Alloc se consiguió mediante la utilización de catalizador de paladio. El péptido unido a la resina con el extremo N acilado como anteriormente se trató con catalizador tetraquis (trifenilfosfina) paladio(0) Pd(PPh3)4 y agente de captura de radicales PhSiH3 en DCM. La reacción se repitió dos veces más. En la siguiente etapa, los grupos sin amino de la lisina resultantes se utilizaron para la conjugación de polímero terminado con carboxi usando química de HCTU/DIPEA. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 48 horas. La resina hecha reaccionar con polímero se escindió y desprotegió y la mezcla escindida se precipitó en dietil éter frío y se purificó por HPLC-FI. La MALDI del conjugado BB-PS se muestra en la Figura 11B. Se descubrió que el peso molecular del conjugado era de 4720 Da.
Los conjugados 17 y 18 se prepararon mediante la incorporación de lisina protegida con aliloxicarbonilo (Alloc), Lys(Alloc), como el primer aminoácido en el extremo C de la cadena peptídica. Después de la acilación del extremo N con grupos de unión y ácido palmítico como se ha descrito anteriormente, la retirada del grupo Alloc se consiguió mediante la utilización de catalizador de paladio. El péptido unido a resina se trató con catalizador tetraquis (trifenilfosfina) paladio(0) Pd(PPh3)4 y agente de captura de radicales PhSiH3 en DCM. La reacción se repitió dos veces más. En la siguiente etapa, los grupos amino libres resultantes de la lisina se utilizaron para conjugar fluoresceína terminada con carboxi usando química de HCTU/DIPEA. La reacción se realizó a temperatura ambiente durante 12 horas y se repitió dos veces. La resina se escindió y la mezcla escindida se precipitó en dietil éter frío. El péptido marcado con fluoresceína en bruto se hizo reaccionar con PEG2000 funcionalizado terminalmente con maleimida en tampón fosfato (pH = 7,4) durante la noche. La mezcla se purificó por HPLC.
Ejemplo 2. Autoensamblaje de conjugados para formar haces de hélices
Se prepararon como se ha descrito anteriormente en J.Y. Shu, C. Tan, W.F. DeGrado, T. Xu, Biomacromolecules, 2008, 9(8), 2111-2117. Las secuencias peptídicas se seleccionan de manera que formen haces de hélices instantáneamente tras disolverlas en solución tamponada acuosa.
Ejemplo 3. Autoensamblaje de haces de hélices para formar nanopartículas
Se disolvieron conjugados de péptido-polímero liofilizadas en tampón fosfato (pH = 8) a una concentración de 10 mg/ml (~1,5 mM). Tras tratamiento de ultrasonidos durante 30 s, las soluciones se diluyeron a 1 mg/ml (0,15 mM) o 0,1 mg/ml en tampón fosfato (pH = 8). Se aplicaron 5 pl de la solución de péptido diluida a una rejilla de cobre recubierta con carbono agujereada descargada (Ted Pella Cu 400 malla 01824) durante 4 minutos antes de retirar
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por absorción el exceso de solución con papel de filtro (papel de filtro Whatman 1). La muestra en la rejilla se tiñó negativamente con 5 pl de ácido fosfotúngstico al 2 % (p/v) (ajustado a pH = 3,3 con NaOH 1 M) durante 2 minutos. La solución de tinción exceso se retiró. Después del secado completo, las rejillas se examinaron por MET a 120 kV (Philips/FEI Tecnai 12).
Ejemplo 4. Preparación de dC18-1CW-P2K (15)
Para construir nanopartículas con empaquetamiento lipídico más compacto dentro del núcleo hidrófobo por encima de la temperatura ambiente, se preparó un nuevo conjugado de péptido-polímero con dos cadenas de ácido esteárico unidas en el extremo N de 1CW (denominado dC 18-1CW-P2K, Conjugado 15). La MET (Figura 18A) mostró la formación de nanopartículas esféricas con un tamaño similar al de dC16-1CW-P2K. Sin embargo, el estudio por CDB (Figura 18B) mostró una temperatura de transición mucho más alta para la cadena lipídica más larga con 35 °C, en comparación con 17 °C para dC16-1CW-P2K. No se unieron aminoácidos adicionales en el extremo C. La MET muestra un tamaño de partícula de aproximadamente ~15 nm de diámetro.
Ejemplo 5. Caracterización de nanopartículas
Métodos
Cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC-FI). Los conjugados anfífilos se purificaron usando HPLC-FI (Beckman Coulter) en una columna C4 (Vydac). El caudal fue de 10 ml/min para las ejecuciones semipreparativas y los conjugados se inyectaron a una concentración de 10 mg/ml. La elución se controló con un detector de diodos en serie a longitudes de onda de 220 nm y 280 nm. Los conjugados se eluyeron con un gradiente lineal AB, donde el disolvente A consistía en agua más TFA al 0,1 % (v/v) y el disolvente B consistía en acetonitrilo más TFA al 0,1 % (v/v). Se usó un gradiente lineal del 30 al 100 % de B durante 30 min, con una elución típica del ~85 % de B. El rendimiento de la purificación es del ~40 %.
Espectrometría MALDI-TOF. La identidad y pureza de los péptidos se verificaron por espectrometría de masas MALDI-TOF usando matriz de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico. Los espectros de masas se registraron en un Applied Biosystems VoyagerDE Pro.
Concentración micelar crítica (CMC). Se usó el método de solubilidad de pireno para determinar la concentración micelar crítica. Se preparó una solución saturada de pireno en PBS (~6 x 10-7 pM) y se usó para disolver las muestras. Se recogieron espectros de fluorescencia usando un espectrofluorómetro Jasco FP-6500 con un ancho de banda de 0,5 mm tanto para excitación como para emisión. Para los espectros de excitación de fluorescencia, la A em fue de 390 nm. Cuando se solubiliza en medio acuoso a concentraciones bajas de conjugado de péptido-polímero, el pireno presenta un pico de excitación de ~333 nm. Como la concentración del conjugado anfífilo aumenta de manera que se forman micelas, el pico a ~333 nm se desplaza a ~338 nm, que corresponde a la excitación del pireno que se ha incorporado en el núcleo hidrófobo de las micelas. La relación de los picos a 338 y 333 nm se trazó para determinar la CMC, que corresponde a la intersección de las extrapolaciones lineales de las dos primeras pendientes en el conjunto de datos.
Microscopía electrónica de criotransmisión. Preparación de la criomuestra se realizó en un Vitrobot (FP5350/60). Se pipetearon 5 pl de solución de péptido en una rejilla de carbono agujereada y se transfirieron durante 2 s para retirar el exceso de solución. La muestra se sumergió rápidamente en etano líquido y se transfirió a un criosoporte que contenía nitrógeno líquido. Se obtuvieron imágenes de las muestras en un microscopio JEOL 4000 a -177 °C utilizando condiciones de baja dosis.
Microscopía electrónica de transmisión con tinción negativa. Se disolvió polvo de péptido liofilizado a 1 mg/ml en tampón fosfato 25 mM a pH 7,4. Se añadieron gota a gota 5 pl de solución de péptido en una rejilla recubierta con carbono agujereada descargada (Ted Pella 01824). Después de retirar la solución de péptido en exceso, después se aplicaron 5 pl de solución de ácido fosfotúngstico (al 2 % en peso, pH = 3,3) durante 2 minutos. Las muestras se secaron al aire y se examinaron mediante un microscopio electrónico de transmisión 12 FEI Tecnai a 120 kV.
Dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP). Se realizó la DXAP en la línea de rayo 7.3.3 en la Fuente de Luz Avanzada, Laboratorio Nacional Lawrence Berkeley (EE.UU.). Las muestras se disolvieron en tampón de KH2PO4 25 mM, pH 7,4 a un intervalo de concentraciones, del 0,5 % en peso al 16 % en peso. Las muestras de la concentración más baja se midieron en una célula de flujo circulante casera con ventanas de mica moscovita de 0,025 mm de espesor y se contaron durante 5 s 50 veces para reunir el factor de forma (Lipfert et al., Rev. Sci. Instrum. 77, (2006)). Las muestras de mayor concentración se midieron en tubos capilares de paredes delgadas ricas en boro de 2 mm para investigar tanto los factores tanto de forma como de estructura. Se realizaron estudios de temperatura in situ usando un soporte de capilares conectado a un dispositivo Peltier. Las muestras se calentaron de 25 °C a 85 °C a una tasa de incremento de 1 °C/min y se mantuvieron durante 1 min para asegurar el equilibrio antes de la obtención de 10 imágenes de exposiciones de 5 s. La distancia de la muestra al detector era de ~1,7 m, proporcionando un intervalo q de 0,01 a 0,3 A'1, donde q = 4nsin(0/2)/A, 0 = ángulo de dispersión y A = 1,24 A. La energía de rayos X era 10 keV. La dispersión se recogió con un detector PILATUS. Se integraron patrones de
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difracción 2D radialmente para reunir un perfil 1D de la intensidad de dispersión. Los factores de formas se ajustaron usando el modelo de esfera de núcleo-corteza incluido en el paquete de análisis de software SANS proporcionado por el Centro Nacional para la Investigación de Neutrones en el Instituto Nacional de Patrones y Tecnología (NCNR- NIST, por sus siglas en inglés) de los Estados Unidos. En más detalle, los factores de forma se ajustaron a un modelo de esfera de núcleo-corteza que incluye una distribución gaussiana en el tamaño global de la micela. Los datos se ajustaron con un intervalo q limitado entre 0,04 y 0,15 A"1 con el fin de reunir el mejor ajuste en el intervalo q de interés. Parece que hay una ligera disminución en el tamaño micelar durante las primeras 16 horas, como se ve en el desplazamiento en el mínimo de dispersión a un q de ~0,06 A"1, posiblemente debido al envejecimiento de las micelas hacia un mejor empaquetamiento de la subunidad. Los resultados de DXAP confirmaron una estabilidad excepcional a largo plazo de las micelas, ya que no hay agregación ni aumentos en los tamaños de las micelas en el transcurso de 2 meses.
Dispersión de neutrones de ángulo pequeño (ADNP). La ADNP de las micelas se realizó en la línea de rayo CG- 3 en el Reactor de Isótopos de Alto Flujo, Laboratorio Nacional de Oak Ridge (EE.UU.). Las muestras se disolvieron en tampón de KH2PO4 25 mM, pH 7,4 a 5 mg/ml y se midieron en cubetas cilindricas de longitud de etapa 1 mm que contenían un volumen de muestra de ~300 pl. La distancia de la muestra al detector era de ~1,1 m, proporcionando un intervalo q de 0,01 a 0,3 A-1, donde q = 4nsin(9/2)/A, 0 = ángulo de dispersión y A = 6 A. Se recogió dispersión durante 60 min en un detector de H3 2D y los patrones de difracción se integraron radialmente para reunir un perfil 1D de la intensidad de dispersión. Los factores de formas se ajustaron mediante un modelo de núcleo-corteza con anchos interfaciales (Berndt et al., Angew. Chem. Int. Ed., 45:1737-1741 (2006)). El ajuste de los datos a un factor de forma esférica de núcleo-corteza con anchos interfaciales permitió estimar que el volumen específico de la micela era de 0,877 ml/g.
Ultracentrifugación analítica. Se realizaron experimentos de equilibrio de sedimentación en un Beckman Optima XL-A a 25 °C con muestras solubilizados en fosfato 25 mM a pH 7,4. La longitud de la trayectoria de las células era de 1,2 cm y se usó el rotor An-60Ti. Las mediciones a 5000, 7000 y 10000 rpm se tomaron después de 10 h de centrifugar a cada velocidad para asegurar el equilibrio, que se verificó mediante concordancia de los conjuntos de datos tempranos y tardíos. La distribución radial de la absorbancia se controló a 280 nm. Las concentraciones de muestra eran de 100 pM y los volúmenes de muestra eran de 120 pl. Se estimó que el volumen específico de 1CW- dC16-P2K era de 0,877 ml/g usando el software Sednterp (
http://www.jphilo.mailway.com) y confiando en el ajuste del perfil de ADNP de 1CW-dC16-P2K a un modelo de núcleo-corteza con anchos interfaciales (Fig. S4) para estimar el número de moléculas de agua que penetran la corteza de la micela. La densidad del tampón era de 1,004 g/ml. Se hicieron ajustes no lineales globales usando el programa de software UltraScan (
http://www.ultrascan.uthscsa.edu/).
Dispersión de luz dinámica (DLD). Se tomaron mediciones del tamaño por DLD en un Malvern Zetasizer Nano-ZS con un láser de 633 nm y un ángulo de dispersión de 17 ° para determinar el radio hidrodinámico de las muestras en solución. Las muestras se pasaron a través de filtros de 0,22 pm antes de las mediciones.
Cromatografía de exclusión por tamaño (CET). La CET se realizó en una columna BioSep-SEC-S 3000 (Phenomenex). El caudal era de 1 ml/min con tampón fosfato 25 mM (pH = 7,4) como disolvente de elución. El perfil de elución se controló con un detector de UV-vis a longitudes de onda de 220 nm y 280 nm. El volumen de elución de las nanopartículas autoensambladas compuestas de 1CW-dC16-P2K es de ~6,5 ml, correspondiente al de patrones de proteína con un PM de 670 kDa.
Dicroísmo circular (DC). Se hicieron mediciones de DC dependiente de la temperatura en un espectropolarímetro Jasco J810. Se recogieron espectros de DC 260 a 190 nm a intervalos de 0,2 nm, una velocidad de un 100 nm/min, un tiempo de respuesta de 4 s y un ancho de banda de 1 nm. Se midieron curvas de temperatura de fusión usando soluciones ~200 pM. La elipticidad se controló a 222 nm a medida que la temperatura aumentó de 5 ° a 95 °C en incrementos de 5 °C a una velocidad de 1 °C/min, con un tiempo de equilibrado de 1 min a cada temperatura antes de que se tomase la medida. La helicidad del cien por cien se estimó usando la fórmula
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El dicroísmo circular dependiente de la temperatura muestra que los péptidos mantienen una alta helicidad en el intervalo de temperaturas de 25 °C a 85 °C del 74-55 %. Para la comparación, péptidos sin cadena lipídica unida se despliegan significativamente mostrando solo un ~20 % de helicidad tras el calentamiento a 85 °C (véase, por ejemplo, Forood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:838-842 (1993); Chen et al., Biochemistry, 13:3350-3359 (1974)). Espectros de dicroísmo circular de SR-dC16-PEG2K y 1CW-dC16-PEG2K. SRdC16-PEG2K forma predominantemente un superenrollamiento, con un contenido helicoidal de menos del 5 %, en comparación con 1CW-dC16PEG2K, que tiene un contenido helicoidal del 74 % en las mismas condiciones. Esto confirma que la secuencia peptídica codificada adopta una conformación superenrollada en su mayor parte, como se ha diseñado.
Calorimetría diferencial de barrido (CDB). Se realizó la CDB en un calorímetro VP-MicroCal (GE). Se cargaron ~600 pl de muestra y tampón en dos células de acero inoxidable paralelas que se sellaron herméticamente a una
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presión de ~27 psi (0,19 MPa) para evitar la evaporación de agua durante el ciclo de calentamiento. La temperatura se aumentó de 5 ° a 85 °C a una velocidad de 1 °C/min, con un tiempo de equilibrio de 15 min a 5 °C. Se obtuvieron termogramas de CDB después de la normalización de concentración y la corrección de línea de base usando el software Origin proporcionado por el MicroCal.
Dinámica del intercambio de subunidades usando micelas marcadas con colorante autoinactivable. Se
prepararon nanopartículas marcadas con fluoresceína (donadoras) a una concentración de 16 pM en tampón fosfato 25 mM a pH 7,4. Se prepararon nanopartículas no marcadas (aceptoras) a una concentración de 3,6 pM usando el mismo tampón. Las dos soluciones se mezclaron en una relación de volumen 5:1, proporcionando una relación molar donador:aceptor 1:40. La intensidad de fluorescencia dependiente del tiempo se registró cada 30 segundos tras la mezcla, con la longitud de onda de excitación a 488 nm y emisión a 527 nm.
Transferencia de energía resonante de Forster (TERF). Se usaron un par de TERF lipófilo, perclorato de 3,3'- dioctadeciloxacarbocianina (DiO, donador) y perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina (Dil, aceptor) para medir la transferencia de energía tras la mezcla. Se disolvieron DiO y Dil en acetona a una concentración de 0,1 mg/ml, respectivamente. Se añadieron independientemente 50 pl de DiO y 50 pl de Dil a 0,5 ml de solución acuosa de péptido (1 mg/ml, pH = 7,4). Después de 24 horas de agitación a temperatura ambiente, la acetona se evaporó con viales dejados abiertos durante 24 horas. Las soluciones después se sometieron a centrifugación y a diálisis por centrifugación para retirar cualquier agregado insoluble y colorante soluble del sobrenadante. Las nanopartículas encapsuladas por colorante resultantes se caracterizaron por cromatografía de exclusión por tamaño. La encapsulación de moléculas de colorante dentro de nanopartículas se confirmó por la superposición de perfiles de elución controlados a 220 nm y 490 nm, respectivamente, para DiO, a 220 nm y 560 nm, respectivamente, para Dil. La intensidad de fluorescencia dependiente del tiempo se registró durante 44 horas tras la mezcla de las soluciones de nanopartículas con una longitud de onda de excitación a 488 nm.
Estimación de energía elástica. Con el fin de estimar la energía elástica almacenada en las cadenas de PEG cuando se comprimen en la geometría confinada de la corteza de la micela, los inventores modelaron las cadenas de polímero para que fueran muelles elásticos descritos por una constante de muelle elástico, k = 3kBT/(Nb2), donde kB es la constante de Boltzmann, N es el número de monómeros de Kuhn y b es la longitud de Kuhn. Se considera que la energía elástica es U = 1/2kx2, donde x es la diferencia de radio entre una cadena de PEG comprimida en la corteza y una cadena de PEG no perturbada libre en solución. Se tabula que el radio de giro de PEG de peso molecular de 2000 Da en solución acuosa es de ~1,4 nm. Se estimó que el radio de giro de PEG en la micela era de ~0,5 nm mediante comparación del volumen cónico disponible para cada subunidad de haz de 3 hélices PEGilado y el volumen ocupado por el superenrollamiento solo. Ambos se midieron usando dispersión de rayos X de ángulo pequeño y dispersión de neutrones de ángulo pequeño. Esto produjo una energía elástica almacenada de ~10 kcal/mol de las partículas.
Resultados
Se disolvieron conjugados de péptido-polímero liofilizadas en tampón fosfato (pH = 8) a una concentración de 10 mg/ml (~1,5 mM). Tras tratamiento con ultrasonidos durante 30 s, las soluciones se diluyeron a 1 mg/ml (0,15 mM) o 0,1 mg/ml en tampón fosfato (pH = 8). Se aplicaron 5 pl de la solución de péptido diluido a una rejilla de cobre recubierta con carbono agujereada descargada (Ted Pella Cu 400 malla 01824) durante 4 minutos antes de retirar por absorción el exceso de solución con papel de filtro (papel de filtro Whatman 1).
Usando el método de solubilidad de pireno (Astafieva et al., Macromolecules, 26:7339-7352 (1993)), se descubrió que la concentración micelar crítica (CMC) de 1CW-dC16-PEG2K era de 4 pM, comparable a otros sistemas anfífilos de péptidos (Mackay et al., Nat. Mater., 8:993-999 (2009). Por encima de la CMC, dC16-1CW-P2K-HHH formar micelas uniformes. Los experimentos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño (DXAP) de la solución (Figura 19A) indican la formación de micelas esféricas de núcleo-corteza, de ~15 nm de diámetro. Las colas de alquilo C16 forman el núcleo hidrófobo, de ~3,8 nm de diámetro y los conjugados de 1CW-PEG2K forman una envoltura hidrófila de ~5,7 nm de espesor. Las Figuras 19B y C muestran la imagen de crio-MET y la imagen de TEM de nanopartículas secas con tinción negativa, donde las nanopartículas micelares pueden verse claramente. El número de agregación es de 78 lo que corresponde a 26 subunidades trimoleculares por micela, como se determina por los resultados de ultracentrifugación analítica (UCA) de la Figura 19D y se confirmó adicionalmente con cromatografía de exclusión por tamaño (CET) (véase La Figura 25) para conjugados de dC16-1CW-PEG2K similares.
1CW-dC16-PEG2K forma micelas de manera espontánea en un amplio intervalo de concentraciones de anfífilo simplemente disolviendo el anfífilo liofilizado en medios acuosos. La Figura 20A muestra una serie de perfiles de DXAP de soluciones de 1CW-dC16PEG2K con concentraciones que varían del 0,5 al 16 % en peso. Los perfiles de dispersión a q > 0,08 A'1 pueden ajustarse a un modelo de núcleo-corteza esférico, similar al mostrado en la Figura 19A, confirmando la integridad de la micela individual y la ausencia de agregados aleatorios. A medida que aumenta la fracción de volumen de micelas al 34 % en volumen al 16 % en peso de dC16-1CW-PEG2K, las micelas comienzan a coensamblarse en estructuras con ordenamiento similar al líquido reflejado por el pico de difracción ancha a q ~0,035 A-1 que corresponde a una distancia entre partículas de ~18 nm.
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Las micelas presentaron una excelente estabilidad térmica. Los perfiles de DXAP in situ de una solución al 16 % en peso de 1CW-dC16-PEG2K calentada de 25 °C a 85 °C se muestran en la Figura 20B. La helicidad del péptido se reduce del 74 % al 55 %, pero el grupo de cabeza sigue siendo principalmente helicoidal (Figura 27). La distancia entre las partículas disminuye durante el calentamiento, debido, más que probablemente, a un aumento de la concentración de micelas que surge de la condensación de agua en la pared del capilar durante el proceso de calentamiento. Los perfiles de dispersión para un q > 0,08 A"1 confirmaron la formación de micelas bien definidas, incluso a temperaturas elevadas. Las micelas también presentaron una estabilidad excepcional a largo plazo sin requisitos de almacenamiento. El perfil de DXAP de la solución de micelas se mantuvo igual después del almacenamiento durante 2 meses a temperatura ambiente (Figura 28). En el caso de micelas de dC16-1CW- P2KHHH todavía pueden verse claramente después de 9 meses (Figura 29).
La estabilidad de las micelas se estudió adicionalmente usando transferencia de energía resonante de Forster (TERF) para cuantificar fugas de la carga. Se secuestraron independientemente un par de TERF lipófilo, perclorato de 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina (DiO, donador) y perclorato de 1,1'-dioctadecil-3,3,3,3-tetrametilindocarbocianina (Dil, aceptor), en micelas de 1CW-dC16-PEG2K. Se observó una fluorescencia mínima debido a la transferencia de energía y esencialmente no se observaron fugas de la carga después de más de 44 horas de la mezcla a temperatura ambiente, en consonancia con la cinética de intercambio de subunidades extremadamente lenta (Figura 20C).
El empaquetamiento de alquilo del resto lipídico en el núcleo hidrófobo de las nanopartículas refleja la organización ordenada de los péptidos helicoidales de los grupos de cabeza. La Figura 21A muestra las curvas de calorimetría diferencial de barrido (CDB) para SR-dC16PEG2K, 1CW-dC16, dC16-1CW-P2K y 1CW-dC16-P5K tras el calentamiento de 5 °C a 85 °C. Todas las soluciones se incubaron a 20 °C durante 16 horas antes de las mediciones de CDB. Puede observarse un pico endotérmico agudo con una temperatura de fusión de 42 °C para SR-dC16- PEG2K y la conjugación de PEG con la cadena lateral de un superenrollamiento no compromete el orden de la cadena de alquilo. Sin embargo, este no es el caso para anfífilos diseñados basados en conjugados de péptido- polímero helicoidales. Se observaron dos picos amplios centrados a 17 y 32 °C para 1CW-dC16-P2K y se observó principalmente un pico centrado a 17 °C para 1CW-dC16-P5K cuando el peso molecular del PEG conjugado aumenta a 5000 Da. La correlación de los resultados de la CDB con los resultados de la autoextinción de la fluorescencia indica que la estabilidad de excepción de las nanopartículas se consigue principalmente a través del empaquetamiento del grupo de cabeza que conduce a una energía de repulsión significativa almacenada dentro de las nanopartículas, aunque esto se realiza sacrificando el empaquetamiento de la cadena lipídica.
dC16-1CW-PEG2K se basa en un péptido que se autoasocia para formar un haz de 3 hélices. Tras la disolución, el péptido se pliega en una hélice instantáneamente y una fracción de péptidos forman haces de hélices durante la formación de micelas. Como se muestra en la Figura 30, esto se confirmó mediante los resultados de hemo- titulación de H10H24-dC16-PEG2K que forma micelas, de ~12 nm de diámetro. Con el tiempo, los péptidos forman haces de hélices a través de una difusión lateral. La Figura 21 muestra las exploraciones de CDB de soluciones de 1cw-dC16-PEG2K recién preparadas, que se incubaron a 20 °C durante 16 horas y 1 semana, y se calentaron a 70 °C y se enfriaron lentamente, respectivamente. El pico endotérmico centrado a 17 °C se intensifica con una incubación más larga y corresponde a 1CW-dC16-PEG2K formando un haz de 3 hélices. Este proceso de autoasociación del grupo de cabeza es lento para 1CW-dC16-PEG2K debido a la cristalización de cadenas de alquilo en el núcleo y puede acelerarse mediante el calentamiento de la solución a 70 °C, después de lo cual solo se observa un pico a 17 °C como se muestra en la Figura 20. Para CW-dC16-PEG5K, una cadena de PEG más larga conduce a una mayor presión lateral que ensancha las cadenas de alquilo y los grupos de cabeza se disponen localmente para formar haces de 3 hélices durante la incubación a 20 °C.
Sin quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que la estabilidad de las micelas surge de la conjugación de las cadenas de PEG con el exterior del haz de hélices. Con la conjugación de PEG, todas las soluciones de micelas parecen ser estables durante días, a diferencia de 1CW-dC16 que forma grandes precipitados en unas pocas horas. Para delinear los efectos de la estructura de la proteína, la cinética de intercambio de subunidades se estudió mediante el control de la recuperación de la fluorescencia de un fluoróforo autoextinguible, fluoresceína, que estaba unido al péptido C terminal. Se prepararon nanopartículas marcadas con fluoresceína (donadores) a una concentración de 16 pM en tampón fosfato 25 mM a pH 7,4. Se prepararon nanopartículas no marcadas (aceptor) a una concentración de 3,6 mM usando el mismo tampón. Las dos soluciones se mezclaron en una relación de volumen de 11:1, proporcionando una relación molar donador:aceptor de 1:40. La intensidad de la fluorescencia dependiente del tiempo se registró cada 30 segundos después de la mezcla, con la longitud de onda de excitación a 488 nm y la de emisión a 515 nm. La mezcla de nanopartículas marcadas preformadas con nanopartículas no marcadas dará como resultado la recuperación de la fluorescencia en un grado variable dependiendo de la cinética de la desorción de subunidades de nanopartículas preexistentes. Se determinó que, a pesar de que el núcleo hidrófobo está principalmente desordenado, las micelas de 1CW-dC16-PEG2K presentan una cinética de intercambio de subunidades mucho más lenta que la de SR-dC16-PEG2K (Figura 22). Esta es una prueba importante de que son los muelles de PEG los que estabilizan las micelas. Los presentes estudios demuestran que, después de la formación de las micelas, los péptidos helicoidales determinan la posición de las cadenas de PEG tanto radial como lateralmente en una micela y confinan las cadenas de PEG para potenciar la repulsión entrópica.
Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, un experto en la materia apreciará que pueden ponerse en práctica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
5 Secuencias
SEQ ID NO: 1
EVEALEKKVAALECKVQALEKKVEALEHGW SEQ ID NO: 2
10 GGGEIWKLHEEFLCKFEELLKLHEERLKKM
SEQ ID NO: 3 AYSSGAPPMPPF SEQ ID NO: 4
EGKAGEKAGAALKCGVQELEKGAEAGEGGW 15 SEQ ID NO: 5
EVEALEKKVAALESKVQALEKKVEALEHGW

Claims (14)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    REIVINDICACIONES
    1. Un conjugado que comprende:
    un péptido helicoidal que tiene de 10 a 100 aminoácidos; un primer polímero unido covalentemente al péptido helicoidal
    en el que el primer polímero es un polímero hidrófilo seleccionado entre el grupo que consiste en polietilenglicol, poli(W-isopropilacrilamida) y celulosa
    y en el que el primer polímero se une al péptido helicoidal en un aminoácido distinto del N o C terminal; y un resto hidrófobo unido covalentemente al extremo N del péptido helicoidal, en el que el resto hidrófobo comprende un resto lipídico o un polímero hidrófobo seleccionado entre el grupo que consiste en polibutadieno, poliestireno, un poliacrilato, un polimetacrilato y polidiacetileno.
  2. 2. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el péptido helicoidal se selecciona entre el grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1, la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 5.
  3. 3. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el primer polímero es polietilenglicol.
  4. 4. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el polímero hidrófobo comprende polibutadieno.
  5. 5. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el resto lipídico contiene de 1 a 6 grupos alquilo C10-20.
  6. 6. El conjugado de la reivindicación 1, en el que el resto lipídico comprende 1, 2 o 4 grupos alquilo C10-20.
  7. 7. El conjugado de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un resto de aminoácido adicional unido covalentemente al extremo C del péptido helicoidal.
  8. 8. El conjugado de la reivindicación 7, en el que el resto de aminoácido adicional comprende un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en GGG, HHH, KK, EE, RGD y AYSSGAPPMPPF.
  9. 9. El conjugado de la reivindicación 1, en el que
    el péptido helicoidal comprende la SEQ ID NO: 1; el primer polímero comprende polietilenglicol;
    el resto hidrófobo comprende el resto lipídico que comprende lisina y dos cadenas de alquilo C16; y un resto de aminoácido de 2 a 20 aminoácidos, unido covalentemente al extremo C del péptido.
  10. 10. Un haz de hélices que comprende de 2 a 6 conjugados de la reivindicación 1.
  11. 11. El haz de hélices de la reivindicación 10, que comprende 3 conjugados.
  12. 12. El haz de hélices de la reivindicación 10, que comprende 4 conjugados.
  13. 13. Una partícula que comprende de 20 a 200 conjugados de la reivindicación 1.
  14. 14. La partícula de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente al menos un miembro seleccionado entre el grupo que consiste en un agente terapéutico, un agente de diagnóstico, ADN y un oligonucleótido.
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