ES2647353T3 - Péptidos HnRNP A3 relacionados y uso del mismo para el diagnóstico de artritis reumatoide - Google Patents

Abstract

Péptido para uso en el diagnóstico de la artritis reumatoide in vitro con una longitud de 10 a 20 residuos de aminoácidos, caracterizado porque el péptido a) comprende al menos un residuo de citrulina, y b) presenta una identidad de secuencia sobre toda la secuencia del péptido de >= 80% en comparación con la SEQ ID Nº 2; en el que al menos un residuo de citrulina se encuentra en una posición en la secuencia del péptido correspondiente a un residuo de arginina en la secuencia de la proteína humana hnRNP A3.

Description

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15

25

paso de trabajo

tampón/material volumen por pocillo incubaciones/condiciones

lavado

PBS + 0,1% Tween20 300 µL una vez por 1 minuto, 600 rpm

bloque

PBS + leche en polvo al 5% 140 µL 1 Stunde, 600 rpm

lavado

PBS + 0,1% Tween20 300 µL 3 veces, cada caso 1 minuto, 600 rpm

incubación con anticuerpoprimario

suero diluido 1:200 en PBS + leche en polvo al 5% 120 µL 1 hora, 450 rpm

lavado

PBS + 0,1% Tween20 300 µL 3 veces, cada caso 1 minuto, 600 rpm

incubación con anticuerpo secundario

diluir anticuerpoconjugado etiquetado con enzima en PBS + 5% de leche en polvo (α-humana IgG-HRP, 1:5.000) 120 µL 30 min, 600 rpm

lavado

PBS + 0,1% de Tween20 300 µL 4 veces, cada caso 1 minuto, 600 rpm

desarrollo del color

Sustrato TMB (BlauFast) 100 µL espera 5 minutos

detenimiento del desarrollo

0,5 M de ácido sulfúrico 100 µL -

medida a 450 nm

Lector ELISA - -

(Ref: 620 nm)

Aquí es un esquema de la placa. Los pocillos negros están recubiertos con péptido en tampón de bloqueo libre de proteínas y los pocillos blancos son los controles de suero. Para cada suero en doble determinación se 35 necesitan cuatro pocillos (marco negro).

55 *SAC-control secundario de anticuerpo

Con los valores en bruto de DO de cada muestra (suero y el control de suero correspondiente) en cada caso que se genera el valor mediano. Al restar SAC y en blanco se obtienen los valores netos. Entonces se calcula la diferencia de los dos valores netos. A partir del análisis estadístico de controles sanos, se deriva el valor de corte específico del péptido. Para la evaluación positiva/negativa, el nivel doble de corte se utiliza para reducir los sueros de falsos positivos (especificidad alta).

65 Ejemplo 2:

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El propósito de este experimento consistió en determinar si los péptidos de la invención pueden usarse para diagnosticar específicamente AR.

Los sueros (véase la tabla) de pacientes con AR, SLE, MCTD, esclerosis sistémica, poli/dermatomiositis,

5 síndrome de Sjögren primario, artritis reactiva, y la osteoartritis y controles sanos se investigaron. Los sueros fueron tomados del banco de suero local y fueron derivados de pacientes clínicamente y serológicamente bien definidos. Todos los pacientes con AR cumplieron los criterios revisados de 1987 del Colegio Americano de Reumatología; todos los pacientes con LES obtuvieron los criterios de 1982 del Colegio Estadounidense de Reumatología, y todos los pacientes con MCTD cumplieron con los criterios de Alarcon-Segovia et al. Para los estudios con artritis

10 temprana, se seleccionaron 54 sueros de pacientes con una autorreactividad comercial CCP2 ELISA. Los anticuerpos anti-CCP se midieron mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (de segunda generación) (ELISA, Axis Shields Diagnostics) y se consideraron positivos en un valor de corte >5 unidades arbitrarias según lo sugerido por el fabricante.

15 Como se muestra en la Figura 1, los péptidos z2 (SEQ ID Nº 3), z4 (SEQ ID Nº 5), z8 (SEQ ID Nº 7) y cz8 (SEQ ID Nº 9) muestran la reactividad con suero de un alto número de pacientes con AR, mientras que los que no contienen citrulina no mostraron una reactividad significativa con el suero de pacientes con AR. Los péptidos z2, z4, z8 y cz8 no mostraron reactividad significativa con el suero de controles sanos.

20 Como se muestra en la Tabla 1, los péptidos de la invención son capaces de detectar específicamente el suero de pacientes con AR y no revelan reactividad cruzada significativa con suero de otros pacientes negativos para AR.

Tabla 1. Los resultados positivos de ELISA se presentan acumulados para los péptidos Z1 (SEQ ID Nº 14), Z2 (SEQ 25 ID Nº 3), Z3 (SEQ ID Nº 15), Z4 (SEQ ID Nº 5), Z8 (SEQ ID Nº 7)

30

35

Diagnóstico

n Positivo (n) Porcentaje

AR temprana

54 24 44%

Artritis reumatoide

29 22 76%

Enfermedad de tejido conectivo mezclado

20 0 0%

Síndrome de Sjögren primario

21 0 0%

Poli/dermatomiositis

10 0 0%

Esclerodermia

24 0 0%

SLE

20 0 0%

Artritis reactiva

22 0 0%

Osteoartritis

26 1 4%

Controles sanos

24 1 4%

40 Mientras tanto, el número total de individuos con AR temprana que han sido probados se ha ampliado 54 a 92, mientras que el porcentaje de positivos sigue siendo el mismo.

Ejemplo 3:

45 Los objetivos específicos de este estudio fueron (i) para determinar la frecuencia de Z1 (SEQ ID Nº 14), Z2 (SEQ ID Nº 3), Z3 (SEQ ID Nº 15), Z4 (SEQ ID Nº 5), Z8 (SEQ ID Nº 7) en artritis temprana y positividad en artritis erosiva en pacientes con AR muy temprana; (ii) comparar la reactividad de Z1 (SEQ ID Nº 14), Z2 (SEQ ID Nº 3), Z3 (SEQ ID Nº 15), Z4 (SEQ ID Nº 5), Z8 (SEQ ID Nº 7) y CCP2 de pacientes diagnosticados con AR temprana que

50 progresaron a desarrollar erosiones para vincular la progresión radiológica y las variables serológicas, y así determinar posibles factores pronósticos para el desarrollo de enfermedad erosiva. Además, se ensayó el líquido sinovial de pacientes con AR. Las pruebas de ELISA se realizaron como se describió anteriormente.

55 Como se muestra en la Tabla 2, los péptidos Z1 (SEQ ID Nº 14), Z2 (SEQ ID Nº 3), Z3 (SEQ ID Nº 15), Z4 (SEQ ID Nº 5), Z8 (SEQ ID Nº 7) son capaces de detectar AR temprana con una sensibilidad significativa y pueden identificar AR temprana que no fue detectada por CCP2 ELISA.

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Claims (1)

1. imagen1