ES2646089T3 - Métodos para aumentar la lipólisis - Google Patents

Abstract

Un método cosmético o estético no terapéutico para aumentar la lipólisis en una célula adipocítica blanca de un sujeto, comprendiendo dicho método aplicar una corriente eléctrica a la célula adipocítica blanca que produce la hidrólisis de lípidos en la célula adipocítica blanca, en el que dicha célula adipocítica blanca permanece viable después de dicha aplicación y en el que dicha corriente eléctrica a nivel de las células adipocíticas blancas es de 2 mA a 7 mA.

Description

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DESCRIPCION

Metodos para aumentar la lipolisis CAMPO TECNICO

La presente solicitud se refiere a metodos para aumentar la lipolisis en celulas, especialmente la lipolisis asociada a adipocitos. Dichos metodos pueden comprender la aplicacion de una corriente electrica a las celulas. La aplicacion de tal corriente aumenta la lipolisis en las celulas al tiempo que conserva sustancialmente la viabilidad de las celulas.

ANTECEDENTES DE LA INVENClON

Las mujeres, as^ como un numero creciente de hombres, estan obsesionados por la forma en que se ven y buscan nuevas alternativas para mejorar su imagen corporal. Aunque eficaz, la extirpacion quirurgica de la grasa es costosa y tambien puede ser arriesgada. Como tal, se han disenado diversos metodos menos intrusivos y se usan para reducir la cantidad y la apariencia de grasa.

Uno de estos metodos es la electrolipolisis, en la que se dice que la estimulacion electrica causa la reduccion en la cantidad o la apariencia de grasa. Dicha tecnologfa se describe en diversas publicaciones (tales como las Patentes de Estados Unidos N.° 5.913.836 (expedida el 22 de junio de 199), 5.425.752 (expedida el 20 de junio de 1995), 5.810.762 (expedida el 22 de septiembre de 1998), 6.326.177 (expedida el 4 de diciembre de 2001), 6.697.670 (expedida el 4 de febrero de 204), las solicitudes de patente de Estados Unidos N.° 2002/0138117 (publicada el 26 de septiembre de 2002), 2002/0193831 (publicada el 19 de diciembre de 2002) y la publicacion de solicitud de patente internacional n.° WO/1995/029732 (publicada el 9 de noviembre de 1995)). Estas tecnicas generalmente implican la reduccion del numero de adipocitos, principalmente induciendo la muerte celular que puede producir una respuesta inflamatoria y, a largo plazo, aumentar el numero de celulas adiposas como una reaccion de rebote directo.

Otra clase de metodos para reducir la aparicion de grasa consiste en modular la actividad de receptores espedficos en celulas que contienen lfpidos para activar la lipolisis en estas celulas, ya sea disminuyendo la liponeogenesis o aumentando la lipolisis. Un receptor implicado en la mediacion de los efectos liponeogenicos/lipolfticos es el receptor de sulfonilurea-1 (SUR 1). Este receptor, descrito en la patente de Estados Unidos N.° 6.492.130 (expedida el 10 de diciembre de 2002), se expresa mediante adipocitos y activa los canales de potasio.

Otro receptor implicado en la lipolisis es el receptor p-adrenergico. Las vfas de senalizacion acopladas a receptores p-adrenergicos son estimuladas por hormonas naturales, tales como la noradrenalina y la adrenalina. Tras la activacion de estos receptores, la subunidad as de la protema Gs normalmente acoplada a los receptores, se disocia y activa la adenilato ciclasa unida a la membrana, que transforma ATP en AMP dclico (cAMP). En consecuencia, el AMPc intracelular se acumula y activa la protema cinasa A (PKA). Despues, la PKA fosforila y activa la lipasa sensible a las hormonas que rapidamente conduce a la activacion de una cascada lipolftica y a la liberacion de acidos grasos libres y glicerol.

Las vfas de transduccion de senales asociadas a receptores p-adrenergicos se activan rapidamente tras la estimulacion e inducen modificaciones intracelulares drasticas. La actividad de estos receptores esta, por lo tanto, estrechamente regulada. Treinta minutos despues de su activacion, los receptores p-adrenergicos son fosforilados por diversas cinasas celulares (tal como PKA, protema cinasa C o PKC, y el receptor cinasa p-adrenergico o p-ARK) que disminuyen la actividad de los receptores y finalmente, dos horas mas tarde, conduce a la desensibilizacion (por ejemplo, falta de respuesta) de los receptores. Ademas, cuando los receptores se estimulan durante un largo penodo de tiempo, los receptores se internalizan y se degradan, lo que finalmente reduce el numero total de receptores y mejora aun mas el fenomeno de desensibilizacion. Como tal, estos receptores p-adrenergicos ya no son capaces de estimular la lipolisis en los adipocitos (fenomenos de "desensibilizacion").

Este fenomeno de "desensibilizacion" se observa con frecuencia en sujetos obesos o en sujetos que tienen un exceso de deposicion de grasa androide o ginoide. En consecuencia, en estos sujetos, la estimulacion de los receptores p-adrenergicos no conduce a la lipolisis y la reduccion de grasa.

Sena muy deseable disponer de metodos para aumentar la lipolisis en un sujeto. En una realizacion, dichos metodos no debenan implicar al receptor p-adrenergico o sus vfas de senalizacion asociadas y/o provocar la desensibilizacion de dichos receptores. En otra realizacion, dichos metodos debenan limitar la muerte celular y/o conservar la viabilidad celular. El documento FR-A-2 694 501 representa la tecnica anterior mas relevante.

RESUMEN DE LA INVENCION

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un metodo para aumentar la lipolisis en una celula de un sujeto, comprendiendo dicho metodo aplicar una corriente electrica a dicha celula, en el que dicha celula sigue siendo sustancialmente viable despues de dicha aplicacion.

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En otra realizacion de la presente invencion, dicha corriente electrica es bifasica o monofasica.

De acuerdo con la presente invencion, dicha corriente electrica a nivel de celula es de aproximadamente 2 mA a aproximadamente 6 mA, mas preferiblemente es de aproximadamente 4 mA.

En otra realizacion, dicha corriente electrica provoca una despolarizacion de la membrana de dicha celula. Ademas, la despolarizacion provoca una alteracion en la actividad de un canal de iones en dicha celula.

De acuerdo con la presente invencion, dicha despolarizacion provoca una disminucion en la actividad de un canal ionico en dicha celula. El canal ionico es preferiblemente uno de la familia de canales ionicos seleccionado del grupo que consiste en EAG, KCNQ, SK, slo y Kv.

Ademas, el canal ionico se selecciona del grupo que consiste en eag, erg, elk, KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5, Kv1, Kv2, Kv3, Kv4, Kv5, Kv6, Kv7, Kv8, y Kv9.

Ademas, el canal ionico es un canal de potasio.

En una realizacion adicional, el sujeto es un mairnfero, mas preferiblemente un ser humano.

De acuerdo con la presente invencion, el adipocito se situa en un tejido subcutaneo, un tejido adiposo visceral o un tejido intramuscular. Ademas, el tejido subcutaneo esta situado en una region seleccionada del grupo que consiste en brazo, rodilla, pantorrilla, abdomen, muslo, nalga y cadera.

De acuerdo con la presente invencion, el aumento en la lipolisis es al menos 1,5 veces con respecto al nivel de lipolisis en una celula de control.

La invencion se define en la reivindicacion 1. Cualquier realizacion que no este dentro del alcance de la presente reivindicacion 1 no es parte de la invencion.

BREVE DESCRIPCION DEL DIBUJO

La figura 1 ilustra un histograma de los medios y las desviaciones estandar para las diversas condiciones evaluadas, en el que los resultados se expresan como 105 M de glicerol liberado;

la figura 2 ilustra el efecto de la estimulacion electrica bifasica sobre la lipolisis de adipocitos en seres humanos;

la figura 3 ilustra los efectos de la estimulacion electrica monofasica sobre la lipolisis de adipocitos en seres humanos; y

la figura 4 ilustra un transcurso temporal de las concentraciones de glicerol (se mide cada 10 min); la figura 5 ilustra un histograma de los medios y las desviaciones estandar de las concentraciones de glicerol; y

la figura 6 ilustra un histograma de los cambios porcentuales relativos a los valores de referencia. DESCRIPCION DETALLADA DE LA REALIZACION PREFERIDA

De acuerdo con la presente invencion, se proporcionan metodos, usos y paquetes para aumentar la lipolisis. Dichos metodos, usos y paquetes comprenden la aplicacion de una corriente electrica y conservan sustancialmente la viabilidad.

En un primer aspecto, la presente invencion proporciona un metodo para aumentar la lipolisis en una celula. El termino "lipolisis" pretende referirse a la hidrolisis de lfpidos. Mas espedficamente, el termino "lipolisis" de celulas grasas tambien se usa para incluir la hidrolisis de trigliceridos intracelulares y la liberacion de acidos grasos libres y glicerol de las celulas. La lipolisis generalmente tiene lugar intracelularmente en celulas que contienen una gota de lfpido. La lipolisis se puede medir de diversas maneras para los expertos en la tecnica, tales como la evaluacion de la liberacion de acidos grasos libres y de la liberacion de glicerol (veanse los Ejemplos a continuacion), mediante bioluminiscencia, etc. La evaluacion de la liberacion de glicerol de las celulas es la mejor manera de medir la lipolisis, ya que el glicerol no puede volver a entrar en las celulas grasas cuando se libera, mientras que los acidos grasos libres pueden hacerlo.

El metodo comprende aplicar una corriente electrica a la celula. En una realizacion, dicha celula sigue siendo sustancialmente viable despues de la aplicacion de la corriente. Como se usa en el presente documento, el termino "viable" o "viabilidad" pretende referirse a la capacidad de una celula para realizar sus funciones previstas. Las funciones de la celula pueden variar de acuerdo con el tipo de celula. Las funciones celulares pueden incluir, por ejemplo, division celular, traduccion, transcripcion, ensamblaje y maduracion de protemas, secrecion de protemas, almacenamiento de compuestos (por ejemplo, protemas, lfpidos, etc.), capacidad de respuesta a estfmulos externos, migracion, etc. Un metodo en el que una celula sigue siendo "sustancialmente viable" despues de la aplicacion de la

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corriente electrica es uno que no altera irreversiblemente la capacidad de la celula para realizar su funcion prevista. Como alternativa, cuando se aplica a una poblacion de celulas, dicho metodo no induce la muerte celular (ya sea por apoptosis o lisis) en la mayona de las celulas, ni causa una alteracion en las funciones de la mayona de las celulas. En una realizacion, la aplicacion de la corriente electrica conserva la viabilidad de mas del 50 % de las celulas, mas del 60 % de las celulas, mas del 70 % de las celulas, mas del 80 % de las celulas, mas del 90 % de las celulas, mas del 95 % de las celulas, o mas del 99 % de las celulas. En la presente invencion, la viabilidad de las celulas de grasa se refiere a su capacidad para activar la lipolisis mediante receptores p-adrenergicos y mediante una cantidad no significativa de lisis celular.

Como se ha mencionado anteriormente, la corriente electrica debena ser adecuada para administracion o aplicacion a nivel fisiologico. La corriente electrica se puede medir en amperios (A) o miliamperios (mA). La intensidad de la corriente electrica se puede medir de diferentes maneras usando diversos medios conocidos por los expertos en la tecnica. En una realizacion, la intensidad de la corriente electrica se mide usando un ampenmetro (veanse los Ejemplos anteriores), o con un osciloscopio. La corriente electrica aplicada es inferior a 7 mA. Por ejemplo, la corriente electrica puede ser de aproximadamente 2 mA a aproximadamente 6 mA. En otra realizacion mas, la corriente electrica puede ser de 4 mA. La corriente electrica anterior es un "fieltro" al nivel de la celula. Un experto en la tecnica tendra que ajustar este valor en funcion del sujeto a tratar, el porcentaje de grasa y/o musculo del area a tratar en un sujeto. Este valor tambien variara segun la impedancia de la piel. Un experto en la tecnica sabra facilmente como medir el fieltro de corriente electrica a nivel de la celula, es decir, la corriente que llega a la celula y a la que esta sometida la celula.

En una realizacion, la corriente electrica aplicada puede despolarizar la membrana de la celula. Las celulas vivas mantienen una diferencia en las concentraciones de iones (por ejemplo, cationes) a traves de su membrana celular. Esta diferencia en la distribucion de iones a ambos lados de la membrana celular permite la formacion de una diferencia de potencial a traves de la membrana celular (por ejemplo, el potencial de membrana). Normalmente, en las celulas en reposo, el espacio intracelular contiene mas electrolitos negativos (por ejemplo, aniones) o menos iones positivos (cationes) que el medio extracelular. En los metodos descritos en el presente documento, la aplicacion de la corriente electrica puede alterar (por ejemplo, disminuir) la diferencia de potencial entre cada lado de la membrana de la celula y, en consecuencia, alterar (por ejemplo, disminuir) el potencial de la membrana.

El potencial de voltaje o de membrana surge de las diferencias en la concentracion de los electrolitos (por ejemplo, iones) a traves de la membrana celular. Para conseguir esta diferencia en la concentracion ionica, estas celulas generalmente contienen canales ionicos y bombas de iones. La expresion "canal ionico" pretende referirse a un polipeptido que abarca la membrana capaz de controlar el movimiento de ciertos iones a traves de la membrana. Dicho canal permite la formacion de un gradiente ionico a cada lado de la membrana celular y, en consecuencia, permite la polarizacion de la membrana celular. En otra realizacion, la despolarizacion causada por la corriente electrica puede alterar (por ejemplo, disminuir) la actividad de dicho canal ionico en la celula.

En algunas celulas, es la diferencia en la concentracion de electrolitos (o iones) de potasio (K+) y sodio (Na+) la que permite la formacion de un potencial de membrana. Como tal, en una realizacion, el canal ionico descrito anteriormente es un canal de potasio. En otra realizacion mas, el canal de potasio puede comprender una de las secuencias polipeptfdicas. De una manera mas general, en la presente invencion, la corriente electrica puede interferir con los canales ionicos para abrir dicho canal o cerrar el mismo para crear un potencial de membrana que surge de las diferencias en la concentracion de los electrolitos (por ejemplo, iones) a traves de la membrana celular. Los canales ionicos que pueden verse afectados en la presente invencion son, por ejemplo, pero sin limitacion, los de las familias EAG (eag, erg, y elk), KCNQ (KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, y KCNQ5), SK, slo, y Kv (Kv1, Kv2, Kv3, Kv4, Kv5, Kv6, Kv7, Kv8, y Kv9). Todas estas familias de canales ionicos, y sus miembros espedficos, se conocen por los expertos en la tecnica.

Ramirez-Ponce et al. han demostrado la presencia de canales de potasio abiertos por voltaje en membranas de adipocitos blancos de rata (1990, "Electrical activity in white adipose tissue of rat", Rev. Esp. Fisiol. 46(2): 133-188; 1991, "Effects of noradrenaline and insulin on electrical activity in white adipose tissue of rat", Rev. Esp. Fisiol. 47: 217-21; 1996", Voltage-Dependent Potassium Channels in White Adipocytes", Biochemic and Biophysical Research Communications; y 1998, "Noradrenaline modulates the electrical activity of white adipocytes by a cAMP-dependent mechanism", J Endocrinol) y humanos (2003, "Human Adipose Cells Have Voltage-dependent Potassium Currents", J. Membrane Biol. 196: 129-134). Han demostrado que las hormonas lipolfticas (por ejemplo, noradrenalina) y no lipolfticas (por ejemplo, insulina) modulan las propiedades electricas de las membranas de adipocitos blancos. Mas espedficamente, han demostrado que la noradrenalina causa una despolarizacion de la membrana de adipocitos, mientras que la insulina provoca una hiperpolarizacion. Han sugerido que, cuando los adipocitos se estimulan con noradrenalina, la acumulacion resultante de cAMP intracelular modula (por ejemplo bloquea) la conductancia de los canales de potasio. El efecto de cAMP en los canales de potasio abiertos por voltaje tambien se ha investigado en otros tipos de celulas (Bruggmann et al. 1993, "Ether-a-go-go encodes a voltage-gated channel permeable to K+ and Ca2+ and modulated by cAMP", Nature 365: 445-448; Chung y Kaczmare 1995, "Modulation of the inactivation of voltage-dependent potassium channels by cAMP", J. Neurosci. 15: 3927-3935; Deadwyler et al. 1995, "Cannabinoids modulate voltage sensitive potassium A-current in hippocampal neurons via a cAMP-dependent process", Pharmacol. Exp. Ther. 273(2): 734-743; Wilson et al. 2000, "ATP and beta adrenergic stimulation enhance voltage

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gated K current inactivation in brown adipocytes", Am. J. Physiol. 279: C1847-C1858).

Se pueden usar diversas celulas en los metodos descritos anteriormente. Dichas celulas incluyen, pero sin limitacion, adipocitos. El termino "adipocito" pretende referirse a una celula cuya funcion mas conocida es el almacenamiento y la descomposicion de la grasa. Los adipocitos generalmente se tinen positivamente con rojo aceite O (que muestra la acumulacion intracelular de lfpidos) y expresan la lipoprotema lipasa, as^ como la glicerol 3- fosfato deshidrogenasa. Existen dos tipos de adipocitos: adipocitos blancos y marrones. Los adipocitos blancos contienen principalmente una gran gota de lfpidos, mientras que los adipocitos marrones contienen principalmente pequenas gotas de lfpidos y muchas mitocondrias. La funcion celular de los adipocitos marrones es la produccion de energfa termica. A menos que se especifique otra cosa, y como se usa en el presente documento, el termino "adipocito" se usa para referirse a adipocitos blancos.

En aun otra realizacion, el adipocito puede estar localizado en diversos tejidos. Los metodos se pueden aplicar en cualquier lugar donde haya adipocitos. Los adipocitos pueden ubicarse en el brazo (por ejemplo, cara lateral o posterior), el abdomen (por ejemplo, por encima y por debajo del ombligo), en las caderas, en el muslo (por ejemplo, cara externa, posterior o interna), alrededor del area de la rodilla (por ejemplo, por encima del area de la rodilla, cara interna), las pantorrillas (por ejemplo, cara posterior), la nalga.

Los metodos descritos en el presente documento pueden usarse en tejido adiposo que puede someterse a una corriente electrica. Dichos tejidos incluyen, pero sin limitacion, tejidos adiposos subcutaneos, tejidos adiposos viscerales y tejidos intramusculares.

Los metodos descritos en el presente documento se pueden usar para aumentar la lipolisis en una celula en al menos 1,5 veces con respecto a una celula de control. La celula de control, como se describe en el presente documento, es una celula que no se ha sometido a la corriente electrica, tal como la celula de control descrita en los Ejemplos a continuacion. La celula de control no ha sido sometida a ningun tratamiento que altere su nivel lipolftico. La celula de control puede derivarse del mismo sujeto que la celula sometida a la corriente electrica.

En otra realizacion, los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para eliminar grasa en areas muy espedficas, por ejemplo, en tejidos que contienen una cantidad de grasa que puede eliminarse por razones esteticas/cosmeticas o terapeuticas. La deposicion de grasa en los hombres se observa habitualmente en la region abdominal (por ejemplo, grasa androide), mientras que en las mujeres, por lo general se observa en las regiones de la cadera, el muslo y los gluteos (por ejemplo, grasa ginoide). La grasa androide normalmente se asocia con un mayor riesgo de complicaciones cardiovasculares. Aunque la grasa androide se ve generalmente en los hombres y la grasa ginoide en las mujeres, el patron de deposicion de grasa no esta determinado unicamente por el sexo. Algunas mujeres, por ejemplo durante o despues de la menopausia, pasaran de un patron de deposicion de grasa ginoide a un patron de deposicion de grasa androide. Los metodos descritos en el presente documento tambien pueden servir en el tratamiento de otros trastornos asociados con la distribucion de grasa, tales como lipodistrofia y obesidad. Los metodos descritos en el presente documento pueden usarse para acelerar el retorno a un estado de grasa normal despues de uno o mas embarazos, detener o ralentizar el efecto anti-lipolttico de la insulina en sujetos que padecen diabetes tipo II, o favorecer el uso de lfpidos durante una sesion de entrenamiento.

Los metodos descritos en el presente documento pueden usarse en solitario o en combinacion con otras tecnicas conocidas para aumentar la lipolisis. Por ejemplo, los metodos pueden usarse en combinacion con farmacos conocidos por inducir lipolisis, tales como agonistas del receptor p-adrenergico, u otros farmacos tales como metilxantinas (cafema o teofilina) o suplementos de estrogenos. Los metodos tambien podnan usarse en asociacion con un regimen de ejercicios dirigido a reducir el porcentaje de grasa. Dicho regimen de ejercicio puede incluir, pero sin limitacion, entrenamiento cardiovascular y entrenamiento con pesas (por ejemplo, para desarrollar masa muscular y/o mejorar la resistencia muscular). Los metodos tambien podnan usarse junto con una dieta destinada a reducir el porcentaje de grasa y/o el peso total (por ejemplo, una dieta baja en carbohidratos, una dieta baja en grasas). Los metodos tambien pueden usarse junto con otros medios esteticos/cosmeticos destinados a reducir la aparicion de grasa (por ejemplo, crema anticelulttica, drenaje linfatico, etc.). Los metodos pueden usarse adicionalmente junto con bebidas electrolfticas (tales como Gatoraid™, Ultimate replenished™, etc.) que modificaran el contenido de electrolitos de un tejido, modulando asf el efecto de los metodos de la presente invencion. Los metodos de la presente invencion tambien pueden ir seguidos de un programa de ejercicio al que un paciente se adherira para mejorar el metabolismo eliminando la grasa liberada de este modo por el metodo de la presente invencion.

La corriente electrica descrita en el presente documento tambien se puede usar para aumentar la lipolisis en una celula. Se han descrito anteriormente diferentes realizaciones de la corriente electrica. La corriente electrica usada en el presente documento tambien puede conservar la viabilidad de una celula. La corriente electrica se puede aplicar, por ejemplo, en adipocitos o en areas que contienen tejidos adiposos (se han descrito anteriormente diferentes realizaciones de los adipocitos y de los tejidos adiposos). La corriente electrica tambien puede ser adecuada para ser aplicada a un mairnfero, y ademas a un ser humano.

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La presente invencion tambien comprende paquetes que comprenden medios para aplicar la corriente electrica e instrucciones para su uso en el aumento de la lipolisis. Se han descrito anteriormente diferentes realizaciones de las corrientes electricas y los usos.

La presente invencion se entendera mas facilmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos que se proporcionan para ilustrar la invencion en lugar de limitar su alcance.

EJEMPLO I

Preparacion de adipocitos para la estimulacion y medicion de la lipolisis Material y metodos

Muestras tisulares. Se obtuvieron tejidos adiposos de 11 mujeres premenopausicas, menores de 45 anos, que se sometieron a una liposuccion o una cirugfa estetica en la region supraiKaca.

Aislamiento de adipocitos. Los tejidos adiposos se colocaron primero en tampon de Krebs y se transportaron al laboratorio. Fragmentos de tejido adiposo fresco se incubaron entonces en una solucion de colagenasa tipo II (reconstituida en tampon de Krebs, 5 mg de colagenasa por g de tejido, Sigma) durante 30 minutos a 37 °C en agitacion (100 rpm) en una atmosfera controlada (O2 al 95 %, CO2 al 5 %) (Rodbell, 1964). Despues del penodo de incubacion, la suspension celular se filtro a traves de una malla de nailon de 250 pm y se separo de la fraccion estromal y vascular por flotacion. Los adipocitos recuperados se lavaron despues tres veces con 5 ml de tampon de Krebs (precalentado a 37 °C, sin colagenasa) para eliminar cualquier rastro de la colagenasa. Para el ultimo lavado, la concentracion de adipocitos se ajusto a 500 celulas/50 pl. Los adipocitos se contaron usando un hemocitometro Neubauer usando colorante azul de tripano. Solamente los adipocitos que contienen una gota de lfpido definida se consideraron para los fines presentados en el presente documento. La concentracion celular se ajusto despues entre 500 y 1000 adipocitos/50 pl. La tecnica de aislamiento de adipocitos descrita en el presente documento permite el estudio de la estructura celular, el ion celular y la transferencia de nutrientes y la regulacion hormonal de la lipolisis.

Estimulacion electrica. La suspension celular se coloco entre dos electrodos de caucho de carbono. Los electrodos tienen 4,7 cm de ancho y 1,4 cm de largo. Se colocaron a 8 cm de distancia en una placa de Petri. Los electrodos se disenaron de tal manera que, cuando la placa de Petri se cierra, entran en contacto con el fondo de la placa.

Se uso un generador de potencia (tal como K0406, 0-30Vdc, 50 mA o Grass S80 adaptado para seguir en tiempo real la variacion de corriente e impedancia, a fin de poder mantener preferiblemente la constante de corriente a nivel de la celula) para controlar estrictamente la corriente. En todas las experimentaciones realizadas, se usaron impulsos de ondas cuadradas de 500 ms seguido de un penodo no estimulante de 500 ms (correspondiente a una frecuencia de 1 Hz). La intensidad de la corriente era de 4, 8 o 20 mA. La intensidad de la corriente se controlo estrechamente con un ampenmetro (tal como FLUKE 179) en el lado del anodo. Los impulsos se controlaron con un osciloscopio (Tektronix™ TDS 2022, osciloscopio de almacenamiento digital, Estados Unidos).

Las celulas se estimularon electricamente durante 30 minutos en un bano de agua agitada (40 rpm) a 37 °C. Las celulas no sometidas a la corriente electrica se usaron como celulas de control (por ejemplo, INICIAL) o se estimularon con isoproterenol (SIGMA: ISO, 10-4 M).

La resistencia a lo largo de un electrodo vana de alguna manera entre 30 y 60 ohms. La resistencia de la solucion se estima en aproximadamente 10 ohms. Esta diferencia en resistencias permite la formacion de un campo electrico que cubre toda la superficie de la placa de Petri. Debido a que la resistencia de la solucion es menor que la resistencia del electrodo y debido a que la solucion se agita durante todo el penodo de estimulacion, se cree que los adipocitos se estimulan uniformemente.

Evaluacion de la lipolisis. Debido a que los acidos grasos libres pueden reesterificarse dentro del adipocito mientras que el glicerol no lo esta, la lipolisis se evaluo midiendo la liberacion de glicerol. El glicerol se midio indirectamente mediante la evaluacion de la formacion de NADH producida durante su transformacion enzimatica. El NADH se midio usando un espectrofotometro (Pharmacia LKB-Novaspec), a una longitud de onda de 340 nm. Los resultados se expresan como pmol de glicerol liberado por 106 adipocitos por 30 minutos.

Evaluacion de la viabilidad celular. La viabilidad celular se evaluo contando celulas viables usando un hematocitometro Neubauer y el colorante azul de tripano. La viabilidad celular se evaluo antes de la estimulacion electrica (0 min) y despues de la estimulacion electrica (30 min, 60 min, o 90 min).

Analisis estad^stico. Los experimentos se realizaron por triplicado. Se usaron celulas obtenidas de once (11) individuos para el control (INICIAL), estimulacion con isoproterenol (ISO) y condiciones de 4 mA. Se usaron celulas de cuatro (4) individuos para la condicion de 8 mA y de siete (7) individuos para la condicion de 20 mA. Se calcularon la media y la desviacion estandar.

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EJEMPLO II

Lipolisis de los adipocitos obtenida despues de la estimulacion electrica Resultados

Se aislaron los adipocitos y se estimularon electricamente como se describe en el Ejemplo 1. La Tabla 1 resume los resultados obtenidos.

Tabla 1

Analisis estadistico de los datos obtenidos (mM de glicerol)

Condicion experimental

INICIAL ISO 4 mA 8 mA 20 mA

Media

1,4 3,7 2,3 2,1 1,4

Desviacion estandar

0,4 2,1 0,8 0,9 0,7

Coeficiente de variacion

29 % 57 % 34 % 41 % 53 %

N

11 11 11 4 7

Los resultados presentados en el presente documento muestran que la lipolisis de los adipocitos se aumento 2,6 veces cuando los adipocitos se estimularon con isoproterenol en comparacion con los valores de control (INICIAL, por ejemplo, sin tratamiento). A una concentracion de 10-4 M, se sabe que el isoproterenol estimula los receptores p-adrenergicos, estimula la lipolisis y facilita la liberacion de glicerol.

Como se muestra en la figura 1, una estimulacion electrica con una corriente de 4 mA aumento la lipolisis de los adipocitos 1,6 veces por encima de los valores iniciales (p <0,001). La lipolisis medida para la condicion de isoproterenol (ISO) es significativamente mas alta que la lipolisis medida para la condicion de control (INICIAL). La lipolisis medida para la condicion de 4 mA es significativamente mas alta que la lipolisis medida para la condicion de control (INICIAL), pero no es significativamente diferente de la lipolisis medida para la condicion de isoproterenol (ISO). La estimulacion de la lipolisis inducida por la corriente de 4 mA no es estadfsticamente diferente de la inducida por la administracion de isoproterenol.

EJEMPLO III

Lipolisis de los adipocitos obtenida despues de la estimulacion electrica bifasica

Se probo si la estimulacion electrica bifasica puede inducir la lipolisis en adipocitos.

Se usaron 4 mujeres entre 40-52 anos de edad como sujeto. El tejido adiposo se obtuvo de areas suprailfacas a traves de la liposuccion.

Se describe que el isoproterenol (ISO) aumento la lipolisis de los adipocitos en un 15 %, es decir, a un nivel no significativo (figura 2). Estos datos son muy importantes ya que muestran claramente que las 4 mujeres son resistentes a la perdida de grasa a traves de la estimulacion del receptor p-adrenergico, que se conoce como la principal via de estimulacion de la lipolisis de los adipocitos. Por otro lado, la estimulacion bifasica de 6 mA aumento de manera significativa (a traves de procedimientos de prueba T repetidos) la lipolisis en 2,3 veces sobre el valor inicial, contrarrestando de este modo la resistencia p-adrenergica adipodtica observada con ISO. Ademas, la estimulacion bifasica de 4 mA aumento la lipolisis inicial en 1,8x, por lo tanto, a un nivel mas bajo que la estimulacion de 6 mA.

Estos datos confirman que una estimulacion electrica bifasica puede ceder con exito a perdidas de grasa en el tejido adiposo.

EJEMPLO IV

Lipolisis de adipocitos obtenida despues de la estimulacion electrica monofasica

En correlacion con la presente invencion, tambien se midio la estimulacion monofasica en la lipolisis de adipocitos en seres humanos.

Se describe que las estimulaciones monofasicas de 2 mA y 6 mA aumentaron la lipolisis inicial en menos del 15 % (figura 3). Este nivel de estimulacion no parece significativo a traves de procedimientos de prueba T repetidos.

Estos datos confirman que en el caso de las estimulaciones monofasicas, una corriente entre 2 mA y 6 mA, y preferiblemente 4 mA, logro aumentar significativamente la lipolisis de los adipocitos.

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EJEMPLOV

Viabilidad celular despues de la estimulacion electrica del adipocito

La viabilidad celular se determino usando dos maneras: en primer lugar a traves de un colorante azul de tripano que consiste en contar solamente las celulas que mostraban su membrana coloreada con azul de tripano, mientras que las celulas con su color citosolico se consideraron no viables; en segundo lugar, las celulas se estimularon por ISO despues de haber sido estimuladas electricamente durante 30 minutos. Por lo tanto, si la estimulacion electrica afecta al metabolismo de las celulas, su respuesta a ISO disminuira.

Para el estudio monofasico, la estimulacion de 2 mA y 4 mA no tuvo efecto sobre el recuento celular y la estimulacion con ISO de la lipolisis fue normal. Sin embargo, los 6 mA mostraron una pequena disminucion del recuento celular, pero la estimulacion ISO tambien fue normal.

Despues de la estimulacion bifasica, las estimulaciones de 4 mA y 6 mA no tuvieron efecto sobre el recuento celular y la estimulacion con ISO de la lipolisis de adipocitos fue normal.

Los datos respaldan el hecho de que las estimulaciones monofasicas a 2 mA y 4 mA, asf como las estimulaciones bifasicas a 4 mA y 6 mA no afectan a la viabilidad celular. Ademas, se debe tener en cuenta que, en el presente estudio, las celulas se aislaron del tejido humano y, por lo tanto, eran mucho mas fragiles que in situ. Por lo tanto, es razonable considerar para una persona experta en la tecnica que la presente estimulacion electrica (monofasica 2 mA 4 mA, bifasica 4 mA 6 mA) no tiene ningun efecto sobre la viabilidad de las celulas si se aplica in vivo.

EJEMPLO VI

Flujo de corriente pasante

En correlacion con la presente invencion, se evaluo una prueba previa para medir la eficacia de la corriente que fluye a traves de la piel. Se realizo una estimulacion electrica transcutanea muscular. El objetivo fue evaluar la perdida de amplitud de la corriente que fluye a traves de la piel. Ademas, tambien se evaluo la medicion de la intensidad de la perdida de corriente debido a la resistencia de la piel.

Se uso una corriente de 4 mA con una corriente monofasica de 500 ms. No se observo dolor en el paciente, por lo que la corriente no estimulaba las fibras nerviosas responsables de la sensacion de dolor. Tambien se observo que una aplicacion de una corriente de 4 mA da como resultado una contraccion muscular, por lo tanto, el reclutamiento de fibras motoras. En consecuencia, una persona experta en la tecnica reconocera que una gran mayona de la corriente flma a traves de la barrera cutanea y los adipocitos con el fin de alcanzar las fibras musculares y producir una contraccion muscular. Al menos 3,8 mA de los 4 mA se hicieron fluir a traves de la piel de manera eficiente. En consecuencia, el 95 % de la estimulacion de corriente aplicada fluyo a traves de la barrera cutanea. Ademas, la onda de estimulacion cuadrada no se vio afectada ya que se estimularon neuronas motoras alfa. Las neuronas motoras alfa se despolarizan de manera eficiente mediante ondas de estimulacion cuadradas. La observacion en el osciloscopio mostro que solamente se aprecio una leve deformacion de la onda. Se observo una pequena curva de la onda que estaba asociada a la capacitancia de la piel.

Estos datos demuestran que el 95 % de la estimulacion de corriente aplicada fluyo a traves de la barrera cutanea y que la onda estimulante se puede considerar como una onda cuadrada fisiologicamente.

EJEMPLO VII

Microdialisis in vivo

En correlacion con la presente invencion, se ensayo la microdialisis in vivo. La microdialisis es una tecnica que permite estimular el tejido adiposo in vivo.

En resumen, ha de implantarse una sonda en los tejidos adiposos que se ubicaran en el espacio intersticial donde se alcanzara un equilibrio entre el fluido intersticial y la solucion fisiologica que circula en la sonda. Cuando se alcanza este equilibrio, la sonda puede atrapar moleculas liberadas de las celulas.

Los resultados se obtienen en concentraciones reales expresadas en micro molar (jM) de glicerol con el fin de obtener mediciones validas de la lipolisis. Se ensayaron tres condiciones experimentales: (1) INICIAL (actividad de lipolisis normal sin ninguna estimulacion); (2) estimulacion electrica de corriente bifasica de 6 mA; (3) estimulacion electrica de corriente bifasica de 7,6 mA.

El sujeto utilizado en el presente estudio fue una mujer de 45 anos (que pesaba 166 libras y que media 5 pies 8) y la sonda se implanto en el tejido adiposo abdominal. La estimulacion bifasica de 6 mA se aplico durante 30 min, asf como la estimulacion bifasica de 7,6 mA. En primer lugar, es importante tener en cuenta que se observo que el

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campo electrico cruzaba la pared de la piel y llegaba al tejido adiposo. Los resultados obtenidos confirman esta afirmacion.

La Tabla 2 y la figura 4 describen un transcurso temporal de concentraciones de glicerol medidas durante el experimento (mediciones cada 10 minutos).

Tabla 2

Transcurso de tiempo de concentraciones durante el experimento (mediciones cada 10 minutos).

INICIAL (30 min) 6 mA 20 min) Inicial (10 min) 7,6 mA (20 min) Inicial (10 min)

B1 B2 B3 S1 S2 B4 S3 S4 B5

MM de glicerol

3,75 3,57 3,5 4,8 6,03 3,3 4,12 3,5 3,5

Los resultados obtenidos se representan en la Tabla y la figura 5.

Tabla 3

Tabla resumen que presenta las concentraciones medias (uM) con las desviaciones estandar (DE) y los cambios

porcentuales relativos a las concentraciones medias iniciales,

Concentraciones en microM de glicerol

Condiciones INICIAL 6 mA 7,6 mA

Media 3,52 5,42 3,81

D.E. 0,16 0,87 0,44

% de cambio 100 % 154 % 108 %

Estos resultados demuestran que la estimulacion electrica de 6 mA produjo una lipolisis significativamente estimulada a un nivel un 54 % mayor que el valor inicial normal (figura 6). La estimulacion electrica de 7,6 mA no produjo una lipolisis significativa. Estos resultados, tomados in vivo en un sujeto vivo humano, validan los resultados encontrados in vitro.

Estos datos demuestran la correlacion entre los datos in vitro obtenidos y la capacidad de la presente invencion para aumentar la lipolisis de celulas grasas in vivo.

Sin desear quedar ligado por una teona espedfica, estos resultados sugieren que la corriente electrica aplicada a las celulas modifica el potencial de sus membranas, probablemente inactivando (por ejemplo, cerrando) los canales de potasio abiertos por voltaje. En cambio, la acumulacion de potasio intracelular podna activar las vfas lipolfticas sin activar los receptores p-adrenergicos.

Aunque la invencion se ha descrito en relacion con realizaciones espedficas de la misma, se entendera que es apta para modificaciones adicionales y esta solicitud esta destinada a incluir cualquier variacion, uso o adaptacion de la invencion siguiendo, en general, los principios de la invencion e incluyendo dichas desviaciones de la presente descripcion como parte de la practica conocida o habitual en la tecnica a la que pertenece la invencion y que puede aplicarse a las caractensticas esenciales expuestas anteriormente en el presente documento, y como se indica a continuacion en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (7)

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   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo cosmetico o estetico no terapeutico para aumentar la lipolisis en una celula adipoctica blanca de un sujeto, comprendiendo dicho metodo aplicar una corriente electrica a la celula adipodtica blanca que produce la hidrolisis de Kpidos en la celula adipodtica blanca, en el que dicha celula adipodtica blanca permanece viable despues de dicha aplicacion y en el que dicha corriente electrica a nivel de las celulas adipodticas blancas es de 2 mA a 7 mA.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha corriente electrica es monofasica o bifasica.
3. 3. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que dicha corriente electrica a nivel de

   las celulas adipocticas blancas es de 2 mA a 6 mA, y preferiblemente 4 mA.
4. 4. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha corriente electrica provoca una despolarizacion de la membrana de dicha celula adipodtica blanca, que a su vez provoca una alteracion en la actividad de un canal ionico en dicha celula adipodtica blanca.
5. 5. El metodo de la reivindicacion 4, en el que dicho canal ionico es uno de una familia de canales ionicos seleccionada del grupo que consiste en eter a go-go -EAG-, canal de K+ dependiente de voltaje relacionado con el smdrome de QT largo -KCNQ-, canal activado por calcio de pequena conductancia -SK-, slowpoke -slo-, ERG, ELK, y canal de K+ dependiente de voltaje -Kv-.
6. 6. El metodo de la reivindicacion 4, en el que dicho canal ionico es un canal de potasio.
7. 7. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que dicho aumento en la lipolisis es al

   menos 1,5 veces con respecto al nivel de lipolisis en una celula adipoctica blanca de control.