BRPI0611351A2 - método para aumentar a lipólise em uma célula de um indivìduo, uso de uma corrente elétrica para aumentar a lipólise em uma célula, e, kit - Google Patents

Abstract

MéTODO PARA AUMENTAR A LIPóLISE EM UMA CéLULA DE UM INDIVìDUO, USO DE UMA CORRENTE ELéTRICA PARA AUMENTAR A LIPóLISE EM UMA CéLULA, E, KIT. São descritos aqui métodos de aumentar a lipólise em uma célula. Tais métodos compreendem a aplicação de uma corrente elétrica em uma célula. Em uma forma de realização, a aplicação da corrente elétrica não altera substancialmente a viabilidade de tal célula e/ou preserva a viabilidade de tal célula. Em uma forma de realização, tal célula é um adipócito. Usos e embalagens correspondentes são também descritos.

Description

"MÉTODO PARA AUMENTAR A LIPÓLISE EM UMA CÉLULA DE UMINDIVÍDUO, USO DE UMA CORRENTE ELÉTRICA PARAAUMENTAR A LIPÓLISE EM UMA CÉLULA, E, KIT"

CAMPO TÉCNICO

O presente pedido refere-se a métodos para aumentar a lipóliseem células, especialmente lipólise associada com adipócito. Tais métodospodem compreender a aplicação de uma corrente elétrica nas células. Aaplicação de tal corrente aumenta a lipólise nas células, enquantosubstancialmente preservando a viabilidade celular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

As mulheres, bem como um número crescente de homens, sãoobcecados por sua aparência e procuram novas alternativas para melhorar suaimagem corporal. Contudo, a remoção eficaz, cirúrgica da gordura édispendiosa e pode também ser arriscada. Como tal, vários métodos menosintrusivos foram projetados e são usados para reduzir a quantidade eaparência da gordura.

Um destes métodos é eletrolipólise, em que estimulaçãoelétrica é dito causar a redução da quantidade ou aparência da gordura. Taltecnologia é descrita em várias publicações (tais como Patentes U.S. Nos.5.913.836 (emitida em 22 de junho de 1999), 5.425.752 (emitida em 20 dejunho de 1995), 5.810.762 (emitida em 22 de setembro de 1998), 6.326.177(emitida em 4 de dezembro de 2001), 6.697.670 (emitida em 4 de fevereiro de2004, pedidos de patente U.S. No. 2002/0138117 (publicado em 26 desetembro de 2002), 2002/0193831 (publicado em 19 de dezembro de 2002) epublicação de pedido de patente internacional No. WO/1995/029732(publicado em 9 de novembro de 1995)). Estas técnicas usualmente envolvema redução do número de adipócitos, na maior parte pela indução da mortecelular, que pode produzir uma resposta inflamatória e, no longo termo,aumentar o número de células adiposas como uma reação de repercussãodireta.

Outra classe de métodos para reduzir a aparência da gorduraconsiste em modular a atividade dos receptores específicos de célulascontendo lipídeo para ativar a lipólise nestas células, pela diminuição daliponeogênese ou aumento da lipólise. Um receptor implicado em mediar osefeitos liponeogênicos/lipolíticos é o receptor da sulfoniluréia-1 (SUR 1). Estereceptor, descrito na Patente U.S. No. 6.492.130 (emitida em 10 de dezembrode 2002), é expresso por adipócitos e ativa os canais de potássio.

Outro receptor implicado na lipólise é o receptor β-adrenérgico. Os receptores β-adrenérgicos acoplados, sinalizando caminhos,são estimulados pelos hormônios naturais, tais como noradrenalina eadrenalina. Na ativação destes receptores, a subunidade as da proteína Gs,normalmente acoplada aos receptores, dissocia-se e ativa a adenilato ciclaseda membrana, o que transforma o ATP em AMP cíclico (cAMP).

Conseqüentemente, o cAMP intracelular acumula-se e ativa a proteína cinaseA (PKA). A PKA então fosforila e ativa a lipase sensível a hormônio, querapidamente resulta na ativação de uma cascata lipolítica e na liberação deácidos graxos livres e glicerol.

As vias de transdução de sinal associadas com os receptores β-adrenérgicos são rapidamente ativados no quando estimulados e induzemmodificações intracelulares drásticas. A atividade destes receptores é assimfirmemente regulada. Trinta minutos em seguida a sua ativação, os receptoresβ-adrenérgicos são fosforilados por várias cinases celulares (tais como PKA,proteína cinase C ou PKC e a cinase do receptor β-adrenérgico ou β-ARK), oque diminui a atividade dos receptores e finalmente resulta, duas horasdepois, na dessensibilização (p. ex., irresponsividade) dos receptores. Alémdisso, quando os receptores são estimulados durante um longo período detempo, os receptores são internalizados e degradados, o que finalmente reduzo número total de receptores e ainda aumenta o fenômeno dadessensibilização. Como tal, estes receptores β-adrenérgicos não são maiscapazes de estimular a lipólise nos adipócitos (fenômenos de"dessensibilização").

Este fenômeno de "dessensibilização" é freqüentementeobservado em indivíduos obesos ou em indivíduos tendo excessiva deposiçãode gordura andróide ou ginóide. Conseqüentemente, nestes indivíduos, aestimulação dos receptores β-adrenérgicos não resulta em lipólise e reduçãode gordura.

Seria altamente desejável sermos providos de métodos paraaumentar a lipólise em um indivíduo. Em uma forma de realização, taismétodos não deveriam envolver o receptor β-adrenérgico ou suas vias desinalização associadas e/ou causar a dessensibilização de tais receptores. Emoutra forma de realização, tais métodos devem limitar a morte celular e/oupreservar a viabilidade celular.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, é provido um método paraaumentar a lipólise em uma cédula de um indivíduo, dito métodocompreendendo aplicar uma corrente elétrica a dita célula, em que dita célulapermanece substancialmente viável em seguida a dita aplicação.

Ainda de acordo com a presente invenção, é provido o uso deuma corrente elétrica para aumentar a lipólise em uma célula, em que ditacorrente elétrica substancialmente preserva a viabilidade de dita célula.

Ainda de acordo com a presente invenção, é provida umaembalagem compreendendo: meios para aplicar uma corrente elétrica; einstruções para utilizar ditos meios no aumento da lipólise em uma célula; emque dita corrente elétrica substancialmente preserva a viabilidade de ditacélula.

Em outra forma de realização da presente invenção, ditacorrente elétrica é bifásica ou monofásica.De acordo com a presente invenção, dita corrente elétrica nonível celular é de cerca de 2 mA a cerca de 6 mA, mais preferivelmente decerca de 4 mA.

Em outra forma de realização, dita corrente elétrica provocauma despolarização da membrana de dita célula. Além disso, a despolarizaçãoprovoca uma alteração da atividade de um canal de íons em dita célula.

De acordo com a presente invenção, dita despolarizaçãoprovoca uma diminuição da atividade de um canal de íon em dita célula. Ocanal de íon é preferivelmente um da família de canais de íons selecionada dogrupo consistindo de EAG, kcnq, sk, SLO e Kv.

Além disso, o canal de íon é selecionado dentre o grupoconsistindo de eag, erg, elk, KCNQl, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5,Kvl, Kv2, Kv3, Kv4, Kv5, Kv6, Kv7, Kv8 e Kv9.

Além disso, o canal de íons é um canal de potássio.

Em outra forma de realização da presente invenção, dita célulaé um adipócito.

Em outra forma de realização, o indivíduo é um mamífero,mais preferivelmente um humano.

De acordo com a presente invenção, o adipócito é localizadoem um tecido subcutâneo, um tecido adiposo visceral ou um tecidointramuscular. Além disso, o tecido subcutâneo é localizado em uma regiãoselecionado do grupo consistindo de braço, joelho, panturrilha, abdome, coxa,nádegas e quadris.

De acordo com a presente invenção, o aumento da lipólise épelo menos 1,5 vezes o nível de lipólise de uma célula de controle.

De acordo com a presente invenção, é descrito um uso dapresente invenção para tratar distúrbio associado com distribuição de gordura.Mais preferivelmente, o distúrbio associado com a distribuição de gordura éselecionado do grupo consistindo de lipodistrofia e obesidade.Em outra forma de realização, o uso da presente invenção éainda associado com outro tratamento selecionado do grupo consistindo deum regime de exercício, uma dieta, meios estéticos/cosméticos e bebidaseletrolíticas.

BREVE DESCRIÇÃO DO DESENHO

A Fig. 1 ilustra um histograma das médias e desvios padrãopara as várias condições testadas, em que os resultados são expressos comoIO5 M de glicerol liberado;

A Fig. 2 ilustra o efeito da estimulação elétrica bifásica emlipólise de adipócito em humanos;

A Fig. 3 ilustra os efeitos da estimulação elétrica monofásicana lipólise de adipócito em humanos; e

A Fig. 4 ilustra um curso de tempo das concentrações deglicerol (medidas a cada 10 min);

A Fig. 5 ilustra um histograma dos meios e desvios padrõesdas concentrações de glicerol; e

A Fig. 6 ilustra um histograma das mudanças percentuaisrelativas aos valores de linha de referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA FORMA de REALIZAÇÃO PREFERIDA

De acordo com a presente invenção, são providos métodos,usos e embalagens para aumentar a lipólise. Tais métodos, usos e embalagenscompreendem a aplicação de uma corrente elétrica que substancialmentepreserve a viabilidade.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo de aumentar a lipólise em uma célula. O termo "lipólise" pretendesignificar a hidrólise de lipídeos. Mais especificamente, o termo "lipólise" decélula adiposa é também usado para abranger a hidrólise de triglicerídeosintracelulares e a liberação de ácidos graxos livres e glicerol das células. Alipólise usualmente ocorre intracelularmente em células contendo umagotícula de lipídeo. A lipólise pode ser medida por várias maneiras paraaqueles hábeis na arte, tais como a avaliação da liberação de ácidos graxoslivres e da liberação de glicerol (reporte-se aos Exemplos abaixo) porbioluminescência etc. A avaliação da liberação de glicerol das células é umamelhor maneira de medir a lipólise, uma vez que o glicerol não poderepenetrar nas células adiposas quando liberado, enquanto os ácidos graxoslivres podem.

O método compreende aplicar uma corrente elétrica à célula.Em uma forma de realização, dita célula permanece substancialmente viávelem seguida à aplicação da corrente. Como aqui usado, o termo "viável" ou"viabilidade" significa a capacidade de uma célula realizar suas funçõespretendidas. As funções das células podem variar de acordo com o tipo decélula. As funções celulares podem incluir, por exemplo, divisão celular,translação, transcrição, montagem e maturação da proteína, secreção daproteína, armazenagem de compostos (p. ex., proteínas, lipídeos etc.),responsividade a estímulos externos, migração etc. Um método em que umacélula permanece "substancialmente viável" em seguida à aplicação dacorrente elétrica é um que não altera irreversivelmente a capacidade dascélulas de realizar sua função. Alternativamente, quando aplicado a umapopulação de células, tal método não induz a morte celular (por apoptose oulise) na maioria das células, nem causa uma alteração nas funções da maioriadas células. Em uma forma de realização, a aplicação da corrente elétricapreserva a viabilidade de mais do que 50% das células, mais do que 60% dascélulas, mais do que 70% das células, mais do que 80% das células, mais doque 90% das células, mais do que 95% das células ou mais do que 99% dascélulas. Na presente invenção, a viabilidade das células adiposas refere-se asua capacidade de ativar a lipólise pelos receptores β-adrenérgicos e por graunão-significativo de lise celular.

Como mencionado acima, a corrente elétrica deve seradequada para administração ou aplicação no nível fisiológico. A correnteelétrica pode ser medida em ampéres (A) ou miliampéres (mA). A intensidadeda corrente elétrica pode ser medida de diferentes maneiras, empregando-sevários meios conhecidos por aqueles hábeis na arte. Em uma forma derealização, a intensidade da corrente elétrica é medida usando-se umamperímetro (reporte-se aos Exemplos acima) ou com um osciloscópio. Emuma forma de realização, a corrente elétrica aplicada é menor do que 8 mA e,em uma outra forma de realização, menos do que 7 mA. Por exemplo, acorrente elétrica pode ser de cerca de 2 mA a cerca de 6 mA. Em ainda outraforma de realização, a corrente elétrica pode ser de 4 mA. A corrente elétricaacima é uma "sentida" no nível da célula. Uma pessoa hábil na arte terá queajustar este valor em função do indivíduo a ser tratado, da percentagem degordura e/ou músculo da área a ser tratada em um indivíduo. Este valortambém variará de acordo com a impedância da pele. Uma pessoa hábil naarte prontamente saberá como medir a corrente elétrica "sentida" no nível dacélula, isto é, a corrente que alcança a célula e a que a célula é submetida.

Em uma forma de realização, a corrente elétrica aplicada podedespolarizar a membrana da célula. As células vivas mantêm uma diferençanas concentrações de íons (p. ex., cátions) através de sua membrana celular.

Esta diferença em distribuição de íons em um ou outro lado das membranacelular possibilita a formação de uma diferença de potencial através damembrana celular (p. ex., o potencial da membrana). Usualmente, em célulasem repouso, o espaço intracelular contém eletrólitos mais negativos (p. ex.,ânions) ou íons menos positivos (cátions) do que o ambiente extracelular. Nosmétodos descritos aqui, a aplicação da corrente elétrica pode alterar (p. ex.,diminuir) a diferença de potencial entre ambos os lados da membrana celulare, conseqüentemente, alterar (p. ex., diminuir) o potencial da membrana.

A voltagem ou potencial da membrana origina-se dediferenças na concentração dos eletrólitos (p. ex., íons) através da membranacelular. A fim de obter-se esta diferença de concentração iônica, estas célulasusualmente contêm canais de íons e bombas de íons. A expressão "canal deíons" significa um polipeptídeo atravessando a membrana, capaz de controlaro movimento de certos íons através da membrana. Tal canal possibilita aformação de um gradiente de íons em qualquer dos dois lados da membranacelular e, conseqüentemente, possibilita a polarização da membrana celular.Em outra forma de realização, a despolarização causada pela corrente elétricapode alterar (p. ex., diminuir) a atividade de tal canal de íons na célula.

Em algumas células, é a diferença na concentração deeletrólitos (ou íons) de potássio (K+) e sódio (Na+) que possibilita a formaçãode um potencial da membrana. Como tal, em uma forma de realização, ocanal de íons descrito acima é um canal de potássio. Em ainda outra forma derealização, o canal de potássio pode compreender uma das seqüênciaspolipeptídicas. Em uma maneira mais geral, na presente invenção a correnteelétrica pode interferir com os canais de íon para abrir tal canal ou fechá-lo,para criar um potencial de membrana originando-se de diferenças deconcentração dos eletrólitos (p. ex., íons) através da membrana celular. Oscanais de íons que podem ser afetados na presente invenção são, por exemplo,mas sem limitação, aqueles das famílias EAG (eag, erg, e elk), KCNQ(KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, CKNQ4 E KCN05), SK, slo e KV (Kvl, Kv2,Kv3, Kv4, Kv5, Kv6, Kv7, Kv8 e Kv9). Todos estas famílias de canais deíons e seus membros específicos são conhecidos daqueles hábeis na arte.

Ramirez-Ponce et al. demonstraram a presença de canais depotássio ativados por voltagem em rato (1990, "Electrical activity in whiteadipose tissue of rat", Rev. Esp. Fisiol. 46(2): 133 - 188; 1991 "Effects ofnoradrenaline and insulin on electrical activity in white adipose tissue of rat",Rev. Esp. Fisiol. 47: 217 - 21; 1996, "Voltagem-Dependent PotassionChannels in White Adipocytes", Biochemic and Biophysical ResearchCommunications; e 1998, "Noradrenaline modulates the electrical activity ofwhite adipocytes by a cAMP-dependent mechanism", J. Endocrinol) emembranas adipócitas brancas humanas (2003, "Human Adipose Cells HaveVoltage-dependent Potassium Currentes", J. Membrana Biol. 196: 129 - 134).Eles mostraram que os hormônios lipolíticos (p. ex., noradrenalina) e não-lipolíticos (p. ex., insulina) modulam as propriedades das membranasadipócitas brancas. Mais especificamente, eles mostraram que a noradrenalinaprovoca a despolarização da membrana adipócita, enquanto que a insulinaprovoca uma hiperpolarização. Eles sugeriram que, quando os adipócitos sãoestimulados com noradrenalina, o acúmulo resultante do cAMP intracelularmodula (p. ex., bloqueia) a condutância dos canais de potássio. O efeito docAMP sobre os canais de potássio ativados por voltagem tem também sidoinvestigado em outros tipos de célula (Bruggmann et al. 1993, "Ether-a-go-goencodes a voltagem-gated channel permeable to K e Ca and modulated bycAMP", Nature 365: 445-448; Chung e Kaczamare 1995, "Modulation of theinactivation of voltagem-dependent potassium channels por cAMP", J.Neurosci. 15: 3927 - 3935; Deadwyler et al. 1995, "Cannabinoids modulatevoltage sensitive potassium A-current em hippocampal neurons via a cAMP-dependent process", Pharmacol. Exp. Ther. 273(2): 734-743: Wilson et al.2000, "ATP e beta adrenergic stimulation enhance voltagem-gated K currentinactivation in brown adipocytes", Am. J. Physiol. 279: C1847 - C185 8).

Várias células podem ser usadas nos métodos descritos acima.Tais células incluem mas não são limitadas a adipócitos. O termo "adipócito"significa uma célula cuja função mais conhecida é o armazenamento edecomposição de gordura. Os adipócitos usualmente tingem positivamentecom Oil-Red-O (que mostra o acúmulo intracelular de lipídeos) e expressam alipoproteína lipase, bem como a glicerol 3-fosfato desidrogenase. Há doistipos de adipócitos: adipócitos brancos e marrons. Os adipócitos brancoscontêm na maior parte uma grande gotícula de lipídeo, enquanto que osadipócitos marrons contêm principalmente diversas pequenas gotículas delipídeos e muitas mitocôndrias. A função celular dos adipócitos marrons é aprodução de energia térmica. A menos que de outro modo especificado ecomo usado aqui, o termo "adipócito" é usado para indicar adipócitosbrancos.

Em ainda outra forma de realização, o adipócito pode serlocalizado em vários tecidos. Os métodos podem ser aplicados em cada localem que os adipócitos estão presentes. Os adipócitos podem ser localizados nobraço (p. ex., face lateral ou posterior, abdome (p. ex., acima e abaixo doumbigo), nos quadris, na coxa (p. ex., face externa, posterior ou interna), emtorno da área do joelho (p. ex., acima da face interna da área do joelho),panturrilhas (p. ex., face posterior, nádegas.

Os métodos descritos aqui podem ser usados em tecidoadiposo que pode ser submetido a uma corrente elétrica. Tais tecidos incluemmas não são limitados a tecidos adiposos subcutâneos, tecidos adipososviscerais e tecidos intramusculares.

Os métodos descritos aqui podem ser usados para aumentar alipólise em uma célula por pelo menos 1,5 vezes com respeito a uma célula decontrole. A célula de controle, como aqui descrito, é uma célula que não foisubmetida a corrente elétrica, tal como a célula de controle descrita nosExemplos abaixo. A célula de controle não foi submetida a quaisquertratamentos que altere seu nível lipolítico. A célula de controle pode serderivada do mesmo indivíduo que a célula submetida a corrente elétrica.

Em outra forma de realização, os métodos aqui descritospodem ser usados para remover gordura em cada área específica, p.ex., nostecidos contendo uma quantidade de gordura que pode ser removida porrazões estéticas/cosméticas ou terapêuticas. A deposição de gordura noshomens é usualmente observada na região abdominal (p. ex., gorduraandróide), enquanto que em mulheres é usualmente observada nos quadris,coxa e nádegas (p. ex., gordura ginóide). A gordura andróide é usualmenteassociada com um risco mais elevado de complicações cardiovasculares.Embora a gordura andróide seja geralmente vista em homens e a gorduraginóide em mulheres, o padrão de deposição de gordura não é unicamentedeterminado pelo sexo. Algumas mulheres, por exemplo, durante ou após amenopausa, mudem de um padrão de deposição gordura ginóide para umpadrão de deposição de gordura andróide. Os métodos aqui descritos podemtambém servir no tratamento de outros distúrbios associados com adistribuição de gordura, tais como lipodistrofia e obesidade. Os métodosdescritos aqui podem ser usados para acelerar o retorno a uma condição degordura normal em seguida a uma ou muitas gravidezes, para parar oudiminuir o efeito anti-lipolítico da insulina em indivíduo sofrendo do tipo dediabetes II, ou para favorecer o uso de lipídeos durante uma sessão detreinamento.

Os métodos descritos aqui podem ser usados sozinhos ou emcombinação com outras técnicas conhecidas para aumentar a lipólise. Porexemplo, os métodos podem ser usados em combinação com medicamentospara induzir a lipólise, tais como agonistas de receptor β-adrenérgico, ououtros medicamentos tais como metilxantinas (cafeína ou teofilina) ousuplementos estrogênicos. Os métodos poderiam também ser usados emassociação com um regime de exercício com o objetivo de diminuir apercentagem de gordura. Tal regime de exercício pode incluir mas não élimitado a treinamento cardiovascular e treinamento de peso (p. ex., construirmassa muscular e/ou melhorar resistência muscular). Os métodos poderiamtambém ser usados em associação com uma dieta com o objetivo de baixar apercentagem de gordura e/ou peso total (p. ex., uma dieta de baixocarboidrato, uma dieta de baixa gordura). Os métodos poderiam também serusados em associação com outros meios estéticos/cosméticos com o objetivode reduzir a aparência da gordura (p. ex., creme anti-celulite, drenagemlinfática etc). Os métodos poderiam ser ainda usados em associação combebidas eletrolíticas (tais como Gatoraid™, Ultimate replenisher™, etc.) quemodificariam o teor de eletrólito de um tecido, assim modulando o efeito dosmétodos da presente invenção. Os métodos da presente invenção poderiamtambém ser seguidos com um programa de exercício a que um pacienteaderiria para melhorar o metabolismo, livrando-se da gordura assim liberadapelo método da presente invenção.

A corrente elétrica descrita aqui pode também ser usada paraaumentar a lipólise em uma célula. Diferentes formas de realização dacorrente elétrica foram descritas acima. A corrente elétrica usada aqui podetambém preservar a viabilidade de uma célula. A corrente elétrica pode seraplicada, por exemplo, em adipócitos ou em áreas contendo tecidos adiposos(diferentes formas de realização dos adipócitos e dos tecidos adiposos foramdescritas acima). A corrente elétrica pode também ser adequada para seraplicada a um mamífero e ainda a um humano.

A presente invenção também compreende embalagenscompreendendo meios para aplicar a corrente elétrica e instruções para seuuso no aumento da lipólise. Diferentes formas de realização das correnteselétricas e dos usos foram descritas acima.

A presente invenção será mais prontamente entendida porreferência aos seguintes exemplos, que são dados para ilustrar a invenção emvez de limitar seu escopo.

EXEMPLO I

Preparação de adipócito para estímulo e medição da lipólise

Material e Métodos

Amostras de tecidos. Tecidos adiposos foram obtidos de 11mulheres pré-menopausadas, com a idade sob 45, que estavam sofrendolipossucção ou uma cirurgia estética na região supra-ilíaca.

Isolamento do adipócito. Os tecidos adiposos foram primeirocolocados em tampão de Krebs e transportados para o laboratório.Fragmentos de tecido adiposo fresco foram então incubados em uma soluçãotipo II de colagenase (reconstituída em tampão Krebs, 5 mg de colagenase porgrama de tecido; Sigma) por 30 minutos a 37°C sob agitação (100 rpm) emuma atmosfera controlada (95% O2, 5% CO2) (Rodbell, 1964). Após operíodo de incubação, a suspensão celular foi filtrada através de uma malhade náilon de 250 μπι e separada da fração estromal e vascular por flotação. Osadipócitos recuperados foram então lavados três vezes com 5 ml de tampãoKrebs (pré-aquecido a 37°C, sem colagenase) para remover qualquer traço dacolagenase. Para a última lavagem, a concentração de adipócitos foi ajustadaa 500 células/5 μΐ. Os adipócitos foram contados utilizando-se umhemacitômetro Neubauer utilizando-se corante azul tripano. Somente osadipócitos contendo uma definida gotícula de lipídeo foram considerados parafins apresentados aqui. A concentração celular foi então ajustada entre 500 e1000 adipócitos/50 μΐ. A técnica de isolamento de adipócitos descrita aquipossibilita o estudo da estrutura celular, íon celular e transferência dealimento e a regulação hormonal da lipólise.

Estimulação Elétrica. A suspensão de células foi colocadaentre dois elétrodos de borracha de carbono. Os elétrodos têm a largura de 4,7e 1,4 cm de largura. Eles foram colocados 8 cm separados em uma placa dePetri. Os elétrodos foram projetados de modo que, quando a placa de Petrifosse fechada, eles contatassem o fundo da cápsula.

Um gerador de energia (tal como K0406, 0-30 Vdc, 50 mA, ouGrass S80, adaptado para seguir em tempo real a variação de corrente eimpedância, a fim de ser capaz de preferivelmente manter a corrente constanteno nível da célula), foi usado para rigorosamente controlar a corrente. Emtodas as experimentações realizadas, impulsos de onda quadrada, durando 500ms, seguidos por um período não-estimulatório de 500 ms (correspondendo auma freqüência de 1 Hz), foram usados. A intensidade da corrente foi de 4, 8ou 20 mA. A intensidade da corrente foi rigorosamente monitorada com umamperímetro (tal como FLUKE 179) no lado do ânodo. Os impulsos forammonitorados com um osciloscópio (Tektronix™ TDS 2022, osciloscópio dearmazenagem digital, USA).

As células foram eletricamente estimuladas por 30 minutos emum banho de água agitada (40 rpm) a 37°C. As células não submetidas àcorrente elétrica foram usadas como células de controle (p. ex., BASAL) ouestimuladas com isoproterenol (SIGMA: ISO, IO"4 M).

A resistência ao longo de um elétrodo de certa forma variaentre 30 e 60 ohms. A resistência da solução é estimada a cerca de 10 ohms.

Esta diferença de resistências possibilita a formação de um campo elétricoque cobre a inteira superfície da placa de Petri. Em razão de a resistência dasolução ser menor do que a resistência dos elétrodos e em razão de a soluçãoser agitada durante o inteiro período de estimulação, pensa-se que osadipócitos sejam uniformemente estimulados.

Avaliação da lipólise. Em razão de os ácidos graxos livrespoderem ser reesterificados dentro do adipócito, enquanto o glicerol não, alipólise foi avaliada medindo-se a liberação do glicerol. O glicerol foiindiretamente medido avaliando-se a formação de NADH produzido durantesua transformação enzimática. O NADH foi medido usando-se umespectrofotômetro (Pharmacia LKB-Novaspec) em um comprimento de ondade 340 nm. Os resultados são expostos como μιηοΐ de glicerol liberado porIO6 adipócitos por 30 minutos.

Avaliação da viabilidade celular. A viabilidade celular foiavaliada contando-se as células viáveis usando-se um hematocitômetroNeubauer e o corante azul tripano. A viabilidade celular foi avaliada antes daestimulação elétrica (0 min.) e após estimulação elétrica (30 min, 60 min ou90 min).

Análise estatística. Os experimentos foram realizados emtriplicata. As células obteníveis de onzE (11) indivíduos foram usadas para ocontrole (BASAL), estimulação de isoproterenol (ISO) e condições de 4 mA.Células de quatro (4) indivíduos foram usadas para a condição de 8 mA e desete (7) indivíduos para a condição de 20 mA. O média e desvio padrão foramcalculados.

EXEMPLO II

Lipólise de adipócito obtida em seguida à estimulação elétricaResultados

Os adipócitos foram isolados e eletricamente estimuladoscomo descrito no Exemplo 1. A Tabela 1 resume os resultados obtidos.

Tabela 1

Análise estatística dos dados obtidos (μΜ de glicerol)

<table>table see original document page 16</column></row><table>

Os resultados apresentados aqui mostram que a lipólise doadipócito foi aumentada 2,6 vezes quando os adipócitos foram estimuladoscom isoproterenol, em comparação com os valores de controle (BASAL, p.ex., nenhum tratamento). Em uma concentração de IO"4 Μ, o isoproterenol ésabido estimular os receptores β-adrenérgicos, estimular a lipólise e facilitar aliberação de glicerol.

Como mostrado na Fig. 1, uma estimulação elétrica dom umacorrente de 4 mA aumentou a lipólise dos adipócitos 1,6 vezes acima dosvalores basais (p < 0,001). A lipólise medida para a condição de isoproterenol(ISO) é significativamente mais elevada do que a lipólise medida para acondição de controle (BASAL). A lipólise medida para a condição 4 mA ésignificativamente mais elevada do que a lipólise medida para a condição decontrole (BASAL), porém não é significativamente diferente da lipólisemedida para a condição de isoproterenol (ISO). A estimulação da lipóliseinduzida pela corrente de 4 mA não é estatisticamente diferente da induzidapela administração de isoproterenol.EXEMPLO III

Lipólise de adipócitos obtida em seguida à estimulação elétrica bifásica

Foi testado se a estimulação elétrica bifásica pode induzirlipólise nos adipócitos.

4 mulheres entre a idade de 40 - 52 anos foram usadas comoindivíduos. O tecido adiposo foi obtido de áreas supra-ilíacas através delipossucção.

E descrito que o isoproterenol (ISO) aumentou a lipólise deadipócitos em 15%, isto é, em um nível não significativo (Fig. 2). Estes dadossão muito importantes, uma vez que claramente mostram que as 4 mulheressão resistentes a gordura solta através da estimulação do receptor β-adrenérgico, que é conhecida como o principal caminho de estimulação dalipólise de adipócitos. Por outro lado, a estimulação bifásica de 6 mAsignificativamente (através de procedimentos de teste T repetidos) aumentoua lipólise em 2,3 vezes em relação à basal, assim neutralizando a resistênciaβ-adrenérgica dos adipócitos, observada com ISO. Além disso, o estímulobifásico de 4 mA aumentou a lipólise basal em l,8x, assim em um nívelinferior do que o da estimulação de 6 mA.

Estes dados confirmam que uma estimulação elétrica bifásicapode produzir com sucesso a perdas de gordura no tecido adiposo.

EXEMPLO IV

Lipólise de adipócito obtida em seguida à estimulação elétrica monofásica

Em correlação com a presente invenção, a estimulaçãomonofásica na lipólise de adipócitos em humanos foi também media.

E revelado que estimulações de 2 mA e 6 mA monofásicasaumentaram a lipólise basal em menos do que 15% (Fig. 3). Este nível deestimulação não aparece significativamente através de procedimentos de testeT repetidos.

Estes dados confirmam que, no caso de estimulaçõesmonofásicas, uma corrente entre 2 mA e 6 mA e, preferivelmente, 4 mA, teveum sucesso significativo no aumento da lipólise de adipócito.

EXEMPLO V

Viabilidade celular em seguida a estimulação elétrica de adipócito

A viabilidade celular foi determinada usando-se duasmaneiras: primeira através de corante azul tripano, que consiste de contarsomente células que estão mostrando sua membrana colorida por tripanoazul, enquanto as células com seu colorido citosol foram consideradascomo não viáveis; segunda, as células foram estimuladas por ISO apósterem sido eletricamente estimuladas por 30 min. Assim, se a estimulaçãoelétrica afetasse o metabolismo das células, sua resposta a ISO seriadiminuída.

Para o estudo monofásico, a estimulação de 2 mA e 4 mA nãotiveram nenhum efeito sobre a contagem celular e a estimulação ISO dalipólise foi normal. Entretanto, a estimulação de 6 mA mostrou uma pequenadiminuição das contagens celulares, porém a estimulação ISO foi tambémnormal.

Em seguida à estimulação bifásica, as estimulações de 4 mA e6 mA não tiveram efeito sobre a contagem celular e a estimulação ISO dalipólise de adipócito foi normal.

Os dados apoiam o fato de que as estimulações monofásicas a2 mA e 4 mA, bem como as estimulações bifásicas a 4 mA e 6 mA nãoafetam a viabilidade celular.

Além disso, deve-se levar em consideração que, no presenteestudo, as células foram isoladas do tecido humano e, assim, muitíssimo maisfrágeis do que in situ. É assim razoável considerar para uma pessoa hábil naarte que a presente estimulação elétrica (monofásica 2 mA e 4 mA; bifásica 4mA e 6 mA) não tem efeito sobre a viabilidade das células, se aplicada invivo.EXEMPLO VI

Fluxo de corrente atravessante

Em correlação com a presente invenção, um pré-teste de medir aeficácia da corrente fluindo através da pele foi avaliado. Estimulação elétricatranscutânea muscular foi conduzida. O objetivo foi avaliar a perda de amplitudeda corrente fluindo através da pele. Além disso, a medição da intensidade deperda de corrente, devida à resistência da pele, foi também avaliada.

Uma corrente de 4 mA com uma corrente monofásica de 500ms foi usada. Nenhuma dor foi observada no paciente, assim a corrente não éestimuladora das fibras nervosas, responsáveis pela sensação de dor. Foitambém observado que uma aplicação de uma corrente de 4 mA resulta emcontração muscular, assim recrutamento de fibras motoras.

Conseqüentemente, uma pessoa hábil na arte reconheceria que uma grandemaioria da corrente escoou através da barreira cutânea e dos adipócitos, a fimde alcançar as fibras musculares e produzir uma contração muscular. Pelomenos 3,8 mA dos 4 mA fluíram através da pele eficientemente.

Conseqüentemente, 95% da estimulação de corrente aplicada fluiu através dabarreira cutânea. Além disso, a onda de estimulação quadrada não foi afetada,uma vez que os alfa-motorneurônios foram estimulados. Os alfa-motorneurônios são despolarizados eficientemente pela onda de estimulaçãoquadrada. Observação no osciloscópio mostrou que somente uma suavedeformação da onda foi observada. Uma pequena curvatura da onda foiobservada, que é associada com a capacitância da pele.

Estes dados demonstram que 95% da estimulação de correnteaplicada fluíram através da barreira cutânea e que a onda de estimulação podeser considerada como uma onda quadrada fisiologicamente.

EXEMPLO VII

Microdiálise in vivo

Em correlação com a presente invenção, a microdiálise in vivofoi testada. A microdiálise é uma técnica que permite estimular o tecidoadiposo in vivo.

Em resumo, uma é necessário implantar uma sonda dentro dostecidos adiposos, que será locada dentro do espaço intersticial, onde umequilíbrio será alcançado entre o fluido intersticial e a solução fisiológicacirculando dentro da sonda. Quando este equilíbrio for alcançado, a sondapode capturar moléculas liberadas das células.

Os resultados são obtidos em concentrações reais expressas emmicro molar (μΜ) de glicerol, a fim de obterem-se medições válidas delipólise. Três condições experimentais foram testadas: (1) BASAL (atividadede lipólise normal, sem qualquer estimulação); (2) estimulação elétrica decorrente bifásica de 6 mA; (3) estimulação elétrica de corrente bifásica de 7,6 mA.

O indivíduo usado no presente estudo foi uma mulher com aidade de 45 anos (pesando 166 libras (75 kg) e medindo 5 pés (1,72 m) e asonda foi implantada no tecido adiposo abdominal. A estimulação bifásica de6 mA foi aplicada por 30 min, bem como a estimulação bifásica de 7,6 mA. Éprimeiro importante citar que foi observado que o campo elétrico estavaatravessando a parede de pele e estava alcançando o tecido adiposo. Osresultados obtidos confirmam esta afirmação.

A Tabela 2 e Fig. 4 descreve um curso de tempo de concentraçõesde glicerol medido durante o experimento (medições a cada 10 minutos).

Tabela 2

<table>table see original document page 20</column></row><table>Os resultados obtidos são representados na Tabela 3 e Fig. 5.

Tabela 3

Tabela resumo apresentando as concentrações médias (μΜ)com os desvios padrão (S.D.) e mudanças percentuais relativas ásconcentrações de linha de referência médias

Concentrações em microM de glicerol

<table>table see original document page 21</column></row><table>

Estes resultados demonstram que a estimulação elétrica de 6mA produziu lipólise significativamente estimulada em um nível de 54% maiselevado do que o valor basal normal (Fig. 6). A estimulação elétrica de 7,6mA não produziu lipólise significativa. Estes resultados, obtidos in vivo emum indivíduo vivo humano, valida os resultados encontrados in vitro.

Estes dados demonstram a correlação entre dados in vitroobtidos e a capacidade da presente invenção de aumentar a lipólise das célulasadiposas in vivo.

Sem desejarmos ficar presos a qualquer teoria específica, estesresultados sugerem que a corrente elétrica aplicada às células modifica opotencial de suas membranas, provavelmente pela inativação (p. ex.,fechamento) dos canais de potássio acionados por voltagem. Em retorno, aacumulação do potássio intracelular poderia ativar os caminhos lipolíticossem ativar os receptores β-adrenérgicos.

Embora a invenção tenha sido descrita com relação a suas formasde realização específicas, deve ser entendido que é capaz de mais modificações eeste pedido é destinado a cobrir quaisquer variações, usos ou adaptações dainvenção, seguindo, em geral, os princípios da invenção e incluindo tais desviosda presente descrição que se situem dentro da prática conhecida ou costumeira daarte a que a invenção pertence e como possa ser aplicada aos aspectos essenciaisaqui antes expostos, e como segue no escopo das reivindicações anexas.

Claims (52)

1. Método para aumentar a lipólise em uma célula de umindivíduo, caracterizado pelo fato de compreender aplicar uma correnteelétrica a dita célula, em que dita célula permanece substancialmente viávelem seguida a dita aplicação.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser bifásica.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser monofásica.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica no nível celular ser de cercade 2 mA a cerca de 6 mA.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser de cerca de 4 mA.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a-5, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica provocar despolarização damembrana de dita célula.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelofato de dita despolarização causar uma alteração da atividade de um canal deíon em dita célula.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de dita despolarização causar uma diminuição da atividade de um canalde íon em dita célula.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelofato de dito canal de íon ser um de uma família de canal de íons selecionadado grupo consistindo de EAG, KCNQ, SK, slo e Kv.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de o canal de íons ser selecionado do grupo consistindo de eag, erg,elk, KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5, Kvl, Kv2, Kv3, Kv4,Kv5, Kv6, Kv7, Kv8 e Kv9.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizadopelo fato de dito canal de íon ser um canal de potássio.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de dita célula ser um adipócito.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de dito indivíduo ser um mamífero.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de dito mamífero ser um humano.

15. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizadopelo fato de dito adipócito ser localizado em um tecido subcutâneo, um tecidoadiposo visceral ou um tecido intramuscular.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizadopelo fato de dito tecido subcutâneo ser localizado em uma região selecionadado grupo consistindo de braço, joelho, panturrilha, abdome, coxa, nádegas equadris.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1a 16, caracterizado pelo fato de dito aumento de lipólise ser de pelo menos 1,5vezes com respeito ao nível de lipólise em uma célula de controle.

18. Uso de uma corrente elétrica para aumentar a lipólise emuma célula, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica substancialmentepreservar a viabilidade de dita célula.

19. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser bifásica.

20. Uso de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser monofásica.

21. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a-20, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica no nível celular ser decerca de 2 mA a cerca de 6 mA.

22. Uso de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelofato de dita corrente elétrica ser de cerca de 4 mA.

23. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica causar uma despolarizaçãoda membrana de dita célula.

24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de dita despolarização causar uma alteração na atividade de um canal deíon em dita célula.

25. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelofato de dita despolarização causar uma diminuição da atividade de um canalde íon em dita célula.

26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de dito canal de íon ser um de uma família de canal de íon selecionada dogrupo EAG, KCNQ, SK, slo e Kv.

27. Uso de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelofato de o canal de íon ser selecionado do grupo consistindo de eag, erg, elk,KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5, Kvl, Kv2, Kv3, Kv4, Kv5,Kv6, Kv7, Kv8 e Kv9.

28. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelofato de dito canal de íon ser um canal de potássio.

29. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 28, caracterizado pelo fato de dita célula ser um adipócito.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 29, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica ser adequada paraadministração a um mamífero.

31. Uso de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelofato de dito mamífero ser um humano.

32. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 31, caracterizado pelo fato de dita corrente elétrica ser adequada paraadministração a um tecido subcutâneo, um tecido adiposo visceral ou umtecido intramuscular.

33. Uso de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelofato de dito tecido subcutâneo ser localizado em uma região selecionada dogrupo consistindo de braço, joelho, panturrilha, abdome, coxa, nádegas equadris.

34. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a-33, caracterizado pelo fato de dito aumento de lipólise ser pelo menos de 1,5vezes com respeito ao nível de lipólise de uma célula de controle.

35. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a-34, caracterizado pelo fato de ser para tratar um distúrbio associado comdistribuição de gordura.

36. Uso de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelofato de dito distúrbio associado com a distribuição de gordura ser selecionadodo grupo consistindo de lipodistrofia e obesidade.

37. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a-36, caracterizado pelo fato de ser ainda associado com outro tratamentoselecionado do grupo consistindo de um regime de exercício, uma dieta,meios estéticos/cosméticos e bebidas eletrolíticas.

38. Embalagem, caracterizada pelo fato de compreender:(i) meio para aplicar uma corrente elétrica; e(ii) instruções para utilizar ditos meios no aumento da lipóliseem uma célula;em que dita corrente elétrica substancialmente preserva aviabilidade de dita célula.

39. Embalagem de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem o uso de umacorrente elétrica de cerca de 2 mA a cerca de 6 mA.

40. Embalagem de acordo com a reivindicação 39,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem o uso de umacorrente elétrica de cerca de 4 mA.

41. Embalagem de acordo com a reivindicação 38,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem que dita correnteelétrica causa uma despolarização da membrana de dita célula.

42. Embalagem de acordo com a reivindicação 41,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem que ditadespolarização causa uma alteração da atividade de um canal de íon de ditacélula.

43. Embalagem de acordo com a reivindicação 42,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem que ditadespolarização causa uma diminuição da atividade de um canal de íon de ditacélula.

44. Embalagem de acordo com a reivindicação 43,caracterizada pelo fato de dito canal de íon ser um de uma família de canaisselecionada do grupo consistindo de EAG, KCNQ, SK, slo e Kv.

45. Embalagem de acordo com a reivindicação 44,caracterizada pelo fato de o canal de íon ser selecionado do grupo consistindode eag, erg, elk, KCNQ1, KCNQ2, KCNQ3, KCNQ4, KCNQ5, Kvl, Kv2,Kv3, Kv4, Kv5, Kv6, Kv7, Kv8 e Kv9.

46. Embalagem de acordo com a reivindicação 43,caracterizada pelo fato de dito canal de íon ser um canal de potássio.

47. Embalagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações 38 a 46, caracterizada pelo fato de dita célula ser um adipócito.

48. Embalagem de acordo com a reivindicação 47,caracterizada pelo fato de ditas instruções especificarem que dito adipócito élocalizado em um mamífero.

49. Embalagem de acordo com a reivindicação 48,caracterizada pelo fato de dito mamífero ser um humano.

50. Embalagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações 38 a 49, caracterizada pelo fato de ditas instruçõesespecificarem que dito adipócito é localizado em um tecido subcutâneo, umtecido adiposo visceral ou um tecido intramuscular.

51. Embalagem de acordo com a reivindicação 50,caracterizada pelo fato de dito tecido subcutâneo ser localizado em umaregião selecionada do grupo consistindo de braço, joelho, panturrilha,abdome, coxa, nádegas e quadris.

52. Embalagem de acordo com qualquer uma dasreivindicações 38 a 51, caracterizada pelo fato de ditas instruçõesespecificarem que o aumento da lipólise é de pelo menos 1,5 vezes comrespeito ao nível de lipólise de uma célula de controle.