ES2639588A2

ES2639588A2 - Uso de una sal de tungsteno (VI) para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético

Info

Publication number: ES2639588A2
Application number: ES201631132A
Authority: ES
Inventors: Ignacio CANALS ALMAZÁN; Agnès ARBAT BUGIÉ
Original assignee: Oxolife SL
Current assignee: Oxolife SL
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2017-10-27
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: ES2639588B1; ES2639588R1

Abstract

Uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la elaboración de un medicamento para favorecer la fertilidad y la reproducción normal en un mamífero hembra no diabético.

Description

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Uso de una sal de tungsteno (VI) para favorecer la fertilidad y la reproduction normal en un

mamifero hembra no diabetico

La presente invention se refiere al uso de sales de tungsteno (VI) para la preparation de un medicamento, en especial para favorecer la fertilidad y la reproduccion normal en un mamifero hembra no diabetico.

ESTADO DE LA TECNICA

La fertilidad en mamiferos es un proceso multietapico que de forma natural no es totalmente eficiente. Factores como la edad, los habitos alimenticios o el estilo de vida, entre otros, modulan el exito de este proceso. Asi, se conoce por ejemplo que la tasa de embarazo en mujeres de 20 a 24 anos es de aproximadamente el 86%, mientras que en mujeres de 35 a 32 anos decae hasta un 50% [Management of the Infertile Woman por Helen A. Carcio; The Fertility Sourcebook por M. Sara Rosenthal, ASAS Summary of FAIR 2012]. Otros factores, como el sobrepeso o el bajo peso, tambien son responsables de retrasos en la consecution de un embarazo de forma natural o incluso de la imposibilidad de su consecucion [Fertil Steril 2013;100:631-7]. Se estima que aproximadamente un 66% de las parejas no conciben de forma natural durante los 3 primeros meses de relaciones sexuales sin proteccion. Esta cifra disminuye hasta el 15% de las parejas durante el decurso del primer ano de relaciones sexuales no protegidas. Infertilidad se define (WHO, ASRM, NICE) como la incapacidad de concebir tras 12 meses de relaciones sexuales regulares no protegidas. Tambien se ha acunado, especialmente en Europa, el termino “subfertilidad” para definir a aquellas parejas con alguna forma o grado de fertilidad reducida, que conlleva un retraso en la conception [Gnoth C et al Definition and prevalence of subfertility and infertility Human reproduction 2005;20(5):1144-1147].

Las principales causas de infertilidad entre las mujeres incluyen disfunciones ovulatorias, patologias del tracto reproductivo, reduction en la calidad de los oocitos y la depletion folicular inherente al envejecimiento. Sin embargo, tambien existe un porcentaje considerable de mujeres con infertilidad inexplicada, tambien denominada infertilidad idiopatica, de la que una de las posibles causas esta relacionada con deficiencias en el proceso de implantacion.

El desarrollo folicular, la ovulation, la migration del ovulo inmaduro (oocito), asi como la posterior concepcion e implantation del cigoto en la pared uterina se encuentra regulado por secreciones hormonales de ciertos organos endocrinos como por ejemplo la hipofisis, el

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hipotalamo y la glandula tiroides. Entre las multiples causas biologicas de la infertilidad en la mujer se pueden destacar tambien las causas ligadas a desordenes de los estimulos hormonales que regulan todo este proceso.

Se conocen diferentes tratamientos para la infertilidad femenina entre los que se encuentran la administration de medicamentos para tratar problemas hormonales que conllevan alteraciones de la ovulation. Asimismo se han postulado algunos efectos beneficiosos con numerosos tratamientos en base a la ingesta de suplementos vitammicos, especialmente vitamina B, vitamina C, vitamina E y acido folico, suplementos minerales como sales o complejos de hierro, zinc, o selenio, acidos grasos esenciales (omega 3), asi como extractos de plantas tales como Sauzgatillo (Vitex agnus chastus), Damiana, regaliz, flor de Trebol Rojo, Baya de Agnocasto, Cohosh Negro, Dong Quai (Angelica sinensis), Name o Camote Silvestre (Dioscorea villosa), Raiz de Unicornio Falso, te verde, Ortigas (Urtica dioica), Avena salvaje (Avena sativa), Diente de leon (Taraxacum officinale), etc. aunque para ninguno de estos tratamientos se ha podido demostrar claramente su eficacia.

El porcentaje de embarazos conseguidos mediante los tratamientos mencionados anteriormente presentan limitaciones. Asi, por ejemplo, se ha observado que el tratamiento de mujeres cuya ovulacion es irregular o ausente mediante la administracion de citrato de clomifeno, un farmaco de la familia de los estilbenos, permite la restauracion de la ovulacion en un porcentaje elevado, pero la tasa de embarazo continua siendo baja, aproximadamente igual o inferior al 50%.

Los tratamientos de fecundation in vitro son muy efectivos en la etapa de fecundation del oocito. Sin embargo, la tasa de implantation de los embriones en la pared uterina es baja. Esto promueve las transferencias multiples de embriones por cada ciclo de fecundacion in vitro, con la consecuencia de un porcentaje mayor de embarazos multiples considerados de riesgo.

Por ultimo, es conocido que las alteraciones metabolicas como la diabetes o la obesidad conllevan una limitation de la fertilidad. Se conoce que la recuperation parcial o total de la glucemia, la insulinemia y/o el peso corporal de ratones hembra diabeticos u obesos con la funcion reproductora danada, comporta una mejora de la fertilidad.

Diferentes tratamientos farmacologicos, como la metformina o sales de tungsteno (VI), o incluso cambios en el estilo de vida, han demostrado mejorar la diabetes o alteraciones en la

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insulina, como por ejemplo la deficiencia o la resistencia a la insulina, consiguiendo recuperar la funcion reproductora total o parcialmente, cuando la infertilidad es debida a la diabetes o alteraciones en la insulina.

En el caso concreto del tungstato sodico, se conoce que ratas con diabetes e insulinopenia inducida por la inyeccion de estreptozotocina, recuperan parcialmente los niveles de insulina circulantes tras un tratamiento prolongado (10 semanas) con tungstato sodico como consecuencia de revertir parcialmente la diabetes. Posteriormente, cuando las ratas hembras parcialmente recuperadas de la diabetes se aparean con machos sanos, se observa que, de forma paralela a la recuperacion parcial de la diabetes, han recuperado parcialmente su capacidad reproductora. En particular, se observa que el porcentaje de partos con respecto al numero de raspados positivos en los ratones hembras que hadan sido parcialmente recuperadas de la diabetes tras un tratamiento con tungstato sodico aumenta hasta el 66%, porcentaje inferior a las hembras que no padedan diabetes donde el porcentaje es del 100%. (cf. J. Ballester y colaboradores, "Tungstate administration improves the sexual and reproductive function in female rats with streptozotocin-induced diabetes", Human Reproduction, 2007, vol. 22, pp. 2128-2135). No obstante, no se observo ni postulo efecto alguno de las sales de tungsteno (VI) en animales hembra no diabeticos.

El tungsteno se encuentra en cantidades traza en animales y plantas. Por ejemplo, en plantas se han descrito contenidos hasta un maximo de 100 mg/kg [Gbaruko B.C. & Igwe J.C. Global Tungsten: Occurrence, Chemistry, Environmental and Health Exposure Issues. Journal of Environmental Research 2007;1(1):27-32].

En vista de todo lo anterior, a pesar de la intensa investigation y los avances la comprension y manejo del proceso reproductivo de los mamiferos y de los humanos en particular, todavia numerosas parejas no se benefician de las diferentes aproximaciones disponibles en la actualidad para incrementar la fertilidad por serles ineficaces. Por lo tanto, todavia hay una necesidad de encontrar nuevas alternativas para la mejora de la eficiencia reproductiva natural y/o el tratamiento de infertilidad femenina que den una mayor eficacia.

RESUMEN DE LA INVENCION

Se ha encontrado ahora que la administration de una sal de tungsteno (VI), o un solvato de dicha sal es efectiva para favorecer la fertilidad y la reproduction normal en un mamifero hembra no diabetico. A pesar de que era conocido que el tungstato sodico puede revertir parcialmente las alteraciones en la funcion reproductora en ratones hembras diabeticas

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debido a que produce una normalization de los niveles de glucosa en sangre, no se ha descrito ni se ha sugerido que el tungstato sodico puede tener un efecto sobre la funcion del sistema reproductor femenino en mam^feros hembra no diabeticas, favoreciendo la fertilidad y la reproduction normal.

Por lo tanto, un primer aspecto de la presente invention se refiere al uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la preparation de un medicamento para favorecer la fertilidad y la reproduccion normal en un mamifero hembra no diabetico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Tal y como indicado anteriormente, de acuerdo con un primer aspecto la presente invencion se refiere al uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la preparacion de un medicamento para favorecer y/o contribuir a la fertilidad y la reproduccion normales en un mamifero hembra no diabetico.

El termino "favorecer la fertilidad y la reproduccion normal” o "contribuir a la fertilidad y la reproduccion normal” se refiere a una contribution a la fertilidad y reproduccion normales, o mejorar la fertilidad y la reproduccion normal (reduciendo los tiempos para lograr un embarazo), entendiendo por "fertilidad y reproduccion normales” un estado de fertilidad en el cual se logra, siguiendo las definiciones proporcionadas previamente:

* en una situation de subfertilidad: un embarazo en un periodo de 12 meses de relaciones sexuales regulares y no protegidas; y

* en una situacion de infertilidad: un embarazo tras un periodo 12 meses de relaciones sexuales regulares y no protegidas. Se incluyen aqu la necesidad de restaurar y/o potenciar la ovulation, mejorar la calidad del oocito y del embrion, aumentar la implantation del cigoto en la pared uterina, regular una alteration del eje hipotalamico-hipofisario-ovarico, incluyendo smdrome de ovario poliquistico, smdrome metabolico, hiperprolactinemia, endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis multiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cirrosis, artritis reumatoide, celiaquia, fallo renal cronico, causas idiopaticas y desordenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia.

El mamifero hembra en el marco de la presente invencion puede ser cualquier mamifero, incluyendo, pero no limitado a, humanos, ratones, ratas, conejos, perros, gatos, cobayas, hamsteres, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, etc.

De acuerdo con una realization particular, el mamifero hembra es humano.

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De acuerdo con una realization particular mas, la dosis maxima diaria sera de 1000 mg/kgMa; de acuerdo con realizaciones particulares adicionales, la administration se realizaria en dosis de al menos 0,001 mg/kgMa, de al menos 0,01 mg/kgMa, de al menos 0,1 mg/kgMa, de al menos 0,5 mg/kgMa, de al menos 1 mg/kgMa, de al menos 10 mg/kgMa, de al menos 25 mg/kgMa, de al menos 50 mg/kgMa, de al menos 100 mg/kg/dia, de al menos 200 mg/kg/dia, de al menos 300 mg/kg/dia , de al menos 400 mg/kg/dia , de al menos 500 mg/kg/dia, de al menos 600 mg/kg/dia, de al menos 700 mg/kg/dia, de al menos 800 mg/kg/dia o de al menos 900 mg/kg/dia.

En general, la sal de tungsteno comprende un anion de tungsteno (VI) y un cation dieteticamente o farmaceuticamente aceptable. Preferiblemente, el cation es un cation alcalino o alcalinoterreo. Mas preferiblemente, el cation se selecciona entre el grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio, calcio y zinc. Segun una realizacion particular, la sal de tungsteno (VI) es la sal sodica de tungsteno (VI).

Por su parte, el anion de tungsteno (VI) se selecciona preferiblemente del listado que consiste en WO42-, HWO4-, W2O72- y HW2O7-. Preferiblemente, el anion es WO42-.

De acuerdo con una realizacion particular, la sal esta en forma de solvato; preferiblemente, el solvato es el hidrato, mas concretamente el dihidrato.

Todas las caracteristicas enumeradas de manera individual para diferentes elementos de la invention pueden ser combinadas entre si, quedando todas las combinaciones posibles incluidas en el alcance de la presente invencion. Asi por ejemplo, segun una realizacion preferida, el solvato de la sal de tungsteno (VI) es el dihidrato y el cation es un cation sodico. Al igual, el resto de combinaciones posibles tambien se pretende esten incluidas en el alcance de la presente invencion.

De acuerdo con una realizacion particular, el mamifero hembra no diabetico se selecciona del grupo que consiste en mamiferos hembra que necesitan restaurar y/o potenciar la ovulation, mejorar la calidad del oocito y del embrion, aumentar la implantation del cigoto en la pared uterina, regular una alteration del eje hipotalamico-hipofisario-ovarico, incluyendo smdrome de ovario poliquistico, smdrome metabolico, hiperprolactinemia, endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis multiple, artritis reumatoide, lupus eritematoso, cirrosis, artritis reumatoide, celiaquia, fallo renal cronico, causas idiopaticas y desordenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia.

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De acuerdo con otra realization particular, el mam^fero hembra no diabetico se selecciona del grupo que consiste en mamiferos hembra que presentan insulinresistencia (tambien conocida como resistencia a la insulina o resistencia insulmica); la insulinresistencia, cuando se presenta junto con una hiperglicemia, puede conducir al desarrollo de diabetes, no obstante la insulinresistencia sola no conduce a un estado diabetico. Preferiblemente, los mamiferos hembra que presentan insulinresistencia se seleccionan del grupo que consiste en hembras mamiferos que presentan una o mas de las siguientes condiciones: Obesidad o sobrepeso, Smdrome metabolico, Prediabetes, Smdrome del ovario poliqwstico, Hipertension, Enfermedad coronaria, Hiperlipidemias o dislipemia, Hipertiroidismo, Hiperparatiroidismo, Hiperleptinemia o resistencia a la leptina, Sedentarismo, Desordenes alimentarios, Smdrome de la apnea obstructiva del sueno, Malnutrition fetal, Smdrome de Prader Willi, Smdrome de Rabson-Mendenhall, Esteatosis hepatica, Leprechaunism, Patologias asociadas al exceso de secretion de glucocorticoides (p.ej acromegalia), insulinresistencia causada por tratamientos farmacologicos (p.ej glucocorticoides, diureticos tiazidicos , betabloqueantes), Estres o Menarqwa Precoz [Egas Bejar, Daniela et.al Insulinorresistencia / Insulin resistance. Medicina (Guayaquil);10(2):159-166, abr. 2005; Graves,Thomas K. WHY ISN’T THIS INSULIN WORKING? Western Veterinary Conference 2013 (SA113); Ximena Gaete V. Adelanto de la pubertad en Chile y el mundo. Rev Chil Pediatr 77 (5); 456-465, 2006; Leszek Szablewski Glucose Homeostasis and Insulin Resistance (eISBN: 978-1-60805-) Bentham e-books], Muchas de estas indicaciones se ha descrito que no estan relacionadas con la infertilidad, incluyendo la prediabetes [Acta Diab. Latina 4, 507, 1967].

A continuation se incluyen una serie de ejemplos ilustrativos, no limitativos de la presente invencion.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1. DESCRIPCION DEL MODELO ANIMAL (RATONES HEMBRAS IRS2 -/-)

El modelo de raton empleado para determinar la actividad de sales de tungsteno (VI) para favorecer la fertilidad y la reproduction normales, es el raton IRS2-/-, un knock-out del gen Irs2 [Burks y colaboradores, "IRS-2 pathways integrate female reproduction and energy homeostasis", Nature, 2000, vol. 407, pp. 377-382], La deletion del gen Irs2 se traduce en un claro dimorfismo sexual en relation a la fertilidad y al metabolismo de los carbohidratos. Los machos de este modelo presentan resistencia a la insulina y una severa hiperglicemia iniciada desde edades tempranas. Por contra, en edades tempranas, las hembras se mantienen relativamente euglicemicas y desarrollan una ligera insulin-resistencia, que se

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mantiene hasta edades avanzadas (4-5 meses). Las hembras IRS2-/'en edades tempranas, alrededor de 10 semanas de edad, muestran un bajo desarrollo folicular y una anovulacion persistente, acompanada de la ausencia del ciclo estral en la mayoria de los ratones. La tasa de embarazos de los ratones hembra IRS2-/'es del 9% frente a una tasa del 100% en ratones hembra IRS'"1 (IRS-2+/+ wild type). Dado que en estas edades las hembras se mantienen euglicemicas y que unicamente desarrollan una ligera insulin-resistencia, la profunda alteracion en la fertilidad, no es una consecuencia directa de las anomalias en el metabolismo de la glucosa.

EJEMPLO 2. ESTUDIO DE OVULACION, IMPLANTACION Y EMBARAZO

A. Animales

10 ratones hembra IRS2"/-de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

6 ratones macho "wild-type" (IRS2"*) de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

Los ratones hembras y machos se estabularon por separado en condiciones normales, es decir ciclo luz/oscuridad 12h y temperatura y humedad controladas. Los animales se alimentaron a voluntad (tambien denominado ad libitum) con dieta de pienso estandar.

B. Metodo

Fase de pre-tratamiento

Tras un periodo de aclimatacion, los ratones hembra IRS2-/-se estabularon en grupos de 4-6 ratones/jaula. Durante la fase de pre-tratamiento (2 semanas), a los animales se les administro el agua de bebida sin sal de tungstato.

Fase de tratamiento

El tungstato sodico fue administrado en el agua de bebida (ad libitum) mediante una solucion de 2 mg/ml de tungstato sodico dihidrato (comercializado por Carlo Erba) en agua destilada tras la fase de pre-tratamiento (dia 0 de tratamiento) y hasta 4 semanas antes del sacrificio de los animales. La dosis diaria de tungstato sodico ingerida por los ratones fue aproximadamente de 180 mg/kg de peso corporal.

Cruce

Tras las tres primeras semanas de tratamiento, los ratones hembra IRS2"/-se estabularon en jaulas por parejas junto a un raton macho IRS2w de forma continua.

Los ratones se observaron diariamente en busca de signos de embarazo o parto.

Tras 4 semanas se intercambiaron los machos entre las jaulas y se mantuvieron durante 4 semanas mas.

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La administration de tungstato se mantuvo durante las 8 semanas en las que machos y hembras se estabularon conjuntamente. Tras estas 8 semanas se retiro el tratamiento y se mantuvo la estabulacion conjunta de machos y hembras durante 4 semanas adicionales.

Sacrificio

Transcurrido este periodo, las hembras fueron sacrificadas y biopsiadas en busca de indicios de embarazo.

C. Resultados

Resultados del Estudio de ovulation

Durante el periodo de pre-tratamiento y durante las 3 primeras semanas de tratamiento se realizaron frotis vaginales a 6 ratones hembras elegidos al azar en los dias -8; -5; -2; -1; 7; 8; 14; 15 y 22, para determinar la fase del ciclo estral en que se encontraban.

Se introdujo en la vagina de los ratones entre 1 y 2 ml de solution salina con una pipeta pasteur. Con la misma pipeta se recogio el exudado vaginal y se extendio en un portaobjetos. Una vez secado al aire, se fijo y se tino con la tecnica de Papanicolau.

La tecnica de Papanicolau comprende realizar la tincion de los frotis vaginales fijados en el portaobjetos de la siguiente manera:

-10 inmersiones en alcohol 50 % v/v;

- Sumergir en solucion de hematoxilina de Harris durante 3 minutos;

- Enjuagar con agua corriente;

-10 inmersiones en Alcohol Acido (1% Ac. Clorhidrico);

- Enjuagar con agua corriente;

-10 inmersiones en Alcohol 95 % v/v;

- Sumergir en solucion OG-6 durante 30 segundos;

-10 inmersiones en alcohol 96 % v/v;

- Sumergir en solucion de eosina durante 1 minuto;

-10 inmersiones en alcohol 96 % v/v;

-10 inmersiones en alcohol 86 % v/v; y

- 10 inmersiones en xilol

Las preparaciones se analizaron por personal entrenado y utilizando una codificacion y a ciego simple para eliminar el sesgo del observador.

Las muestras se identificaron en las siguientes fases: diestro, proestro, estro, metaestro, anestro o no evaluable. La ciclicidad de las cuatro fases en periodos de 4 a 6 dias, son indicadores de un ciclo estral normal, mientras que la ausencia de esta ciclicidad y la persistencia en fases anestro, diestro o proestro son indicadores de la ausencia del ciclo 5 estral.

De los 10 ratones hembra sometidos a estudio, en la Tabla 1 se resumen las fases del ciclo estral de los frotis vaginales realizadas a 6 de estos ratones hembras IRS2-/-.

10 Tabla 1

N°: Tiempo (dias)

Raton: -8 -5 -2 -1 7 8 14 15 22

72: A A P D E E-M E E A

898: D D P P E E E-M M M

926: D D P P E-M E-M D E P

928: D-P D P P E E E-M M A

942: A D P P E E-M E-M A D

972: D D P M M D D

Las fases del ciclo estral son las siguientes: A: Anestro; D: diestro; P: Proestro; E: Estro; y M: metaestro.

15 Las fases del ciclo estral encontrados en los frotis vaginales de los ratones hembras IRS2-/- de la Tabla 1 muestran que durante el periodo de pre-tratamiento todos los ratones se encontraban en fase proestro (P) o diestro (D), es decir en ausencia de ciclo estral.

Mientras que tras el inicio de la administration de tungstato, se observa que los ratones 2 0 hembras IRS2-/" se encuentran en fases tardias del ciclo estral, estro (E) y metaestro(M), lo que es indicador de la recuperacion del ciclo estral normal.

Estos resultados indican que la administration de una sal de tungsteno (VI) permite la recuperation rapida (al septimo dia de tratamiento) del ciclo estral en ratones hembra infertiles IRS2-/- no diabeticas en el 100% de ratones analizados.

5 Resultados del Estudio de implantation y embarazo

Transcurrido el periodo de cruce del metodo del apartado B, las hembras fueron sacrificadas y se llevaron a cabo biopsias en busca de indicios de embarazo.

En la tabla 2 se resume la edad en el momento del tratamiento, si hubo embarazo y el 10 numero de embriones por hembra.

Tabla 2

N° Raton: Edad (meses) al inicio del Embarazo Numero de embriones Implantados o crlas nacidas

tratamiento: cruce

72: 10 12 SI 1 cria

942: 10 12 SI 8 crias

928: 10 12 SI 7 embriones

931: 10 12 SI 3 crias

898: 10 12 SI 7 embriones

900: 10 12 NO -

921: 10 12 SI 6 embriones

926: 10 12 SI 8 crias

972: 8 10 NO -

973: 8 10 SI 7 embriones

Los resultados de la Tabla 2 muestran que mientras que la tasa de embarazo de los ratones 15 hembra IRS2-/- sin tratar es del 9%, la tasa de embarazo de los ratones hembra IRS2-/- tratados con tungstato se incrementa hasta el 80%.

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Ademas, estos resultados tambien muestran que la media de crias/embriones implantados por raton hembra embarazo es de aproximadamente 5, numero que se puede considerar comparable al numero de crias de un raton hembra.

Asi, los resultados de las Tablas 1 y 2 demuestran que una sal de tungsteno (VI) es un tratamiento eficaz para la recuperacion de la ovulacion y/o el aumento de la implantacion del oocito. Asi, la administration de una sal de tungsteno (VI) tal y como se define en la presente invention es eficaz para el tratamiento de la infertilidad en mamiferos hembras no diabeticos.

EJEMPLO 3. ESTUDIO DE GLUCEMIA Y PESO CORPORAL

A. Animales

6 ratones hembra IRS2-/-de edades comprendidas entre 6 y 8 semanas.

Los ratones hembras se estabularon en condiciones normales, es decir ciclo luz/oscuridad 12h y temperatura y humedad controladas. Los animales se alimentaron a voluntad (tambien denominado ad libitum) con dieta de pienso estandar.

B. Metodo

Fase de tratamiento

Tras un periodo de aclimatacion, el tungstato sodico fue administrado en el agua de bebida (ad libitum) mediante una solution de 2 mg/ml de tungstato sodico dihidrato (comercializado por Carlo Erba) en agua destilada tras la fase de pre-tratamiento (dia 0 de tratamiento) y durante 12 dias.

C. Resultados

En los dias 0, 2, 5, 7, 9 y 12 del periodo de tratamiento se monitorizo el peso corporal, y tras las 6 horas de ayuno de cada uno de los dias mencionados anteriormente se determino la glucosa en sangre, mediante la extraction de sangre de la vena caudal y con un sensor de glucosa (AccuTrend glucose sensor Roche. Mannheim, Germany).

En la tabla 3 se resumen los niveles de glucemia expresados en mg/dl, y en la tabla 4 se resume el peso corporal de los ratones en estudio expresada en gramos.

Tabla 3

Glucemias (mg/dl): R1327 R1345 R1347 R1354 R1376 R1381 Promedio

Dla 0: 146 129 115 126 141 112 128,17

Dia 2: 136 128 118 110 105 107 117,33

Dia 5: 125 142 114 111 137 105 122,33

Dla 7: 140 110 106 89 133 135 118,83

Dia 9: 125 153 109 108 131 125 125,17

Dia 12: 136 116 111 86 123 141 118,83

Tabla 4

Peso corporal (g): 1327 1345 1347 1354 1376 1381 Promedio

Dla 0: 22,7 15,33 18,21 16,5 13,99 15,45 17,03

Dia 2: 22,9 14,84 18,98 17,01 14,18 16,04 17,33

Dia 5: 22,61 14,89 18,2 16,61 13,79 15,72 16,97

Dla 7: 22,42 15,07 17,81 16,35 13,74 15,66 16,84

Dia 9: 22,85 15,56 17,9 16,89 14,5 16,39 17,35

Dia 12: 23,15 15,91 18,24 17,19 14,92 16,89 17,72

Los resultados de la Tabla 3 y 4 muestran que durante la administracion de tungstato sodico 5 no se observan variaciones en el peso corporal ni en la glucemia en los primeros 12 dias de tratamiento, el mismo periodo durante el cual a partir del 7 dia de tratamiento ya se consigue restablecer la ovulacion en los ratones hembras ensayados (cf. Tabla 1).

Asi, los resultados de las Tablas 1 a 4 demuestran que una sal de tungsteno (VI) es un 10 tratamiento eficaz para la recuperacion de la ovulacion y/o el aumento de la implantacion del oocito, de manera independiente de cambios en el peso corporal y cambios en el metabolismo de los carbohidratos. Asi, se demuestra que la administracion de una sal de tungsteno (VI) tal y como se define en la presente invencion o una composition que contiene tal sal de tungsteno (VI) tiene un efecto directo sobre el sistema reproductor femenino y por 15 lo tanto es eficaz para favorecer la fertilidad y la reproduction normal en mamiferos hembra no diabeticos.

EJEMPLO 4. ESTUDIO DE LA ADHERENCIA EMBRIONARIA EN EL ENDOMETRIO

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A. Modelo

Para determinar el efecto del tungstato sodico sobre la receptividad endometrial, se utilizo un modelo de adhesion embrionaria humano-humano "in vitro”, compuesto de la lmea celular endometrial HEC1-A y la lmea celular de trofoectodermo humano JEG-3.

La lmea JEG-3, lmea celular que simula las celulas del trofoectodermo de un embrion humano, son celulas que se crecen en monocapa en el laboratorio, usando placas de baja adherencia, son capaces de formar esferoides que simulan al embrion humano; esta es una de las lmeas celulares mas usadas para realizar ensayos de adhesion embrionaria in vitro

B. Metodo

Las lmeas celulares se adquirieron comercialmente (American Type Culture Collection (ATCC); Rockville, MD, USA) para realizar los experimentos de adherencia embrionaria en el endometrio. Se descongelaron y expandieron durante 4 pases para disponer de suficientes celulas para realizar todos los ensayos.

Las celulas HEC1-A se plantaron en placas de 24 pocillos y cultivaron con medio de cultivo McCoy 5A, suplementado con 10% suero fetal bovino y 0,1% de antibioticos (fungizona y penicilina), hasta llegar a una confluencia del 90%. Tras alcanzar la confluencia se anadio al medio de cultivo tungstato sodico, a una concentration final de 10^M, asi como Withaferrin A (como control, compuesto que evita la adhesion embrionaria) o medio de cultivo (datos de adhesion basal), sin ningun componente adicional, durante 24 horas.

Las celulas JEG-3 se plantaron en placas de baja adhesividad con medio de cultivo ‘Eagle’s minimal essential medium’ (EMEM), suplementado con 10% suero fetal bovino y 0,1% de antibioticos (fungizona y penicilina). 24 horas antes del ensayo de adhesion se realizo la formation de los esferoides trofoblasticos JEG-3 a partir de este cultivo. Para ello, se suspendieron en un Erlenmeyer en agitation celulas JEG-3 en el medio previamente descrito a una concentracion de 6x105 celulas/6ml. Los esferoides resultantes se recogieron para el ensayo de adhesion.

Para el ensayo de adhesion, tras 24h de cultivo de las celulas HEC-1A con con medio de cultivo anadiendo tungstato sodico, Withaferrin A o sin adicionar ningun tratamiento, se cambio el medio de cultivo por medio de cultivo fresco sin tratamientos en estudio. Se anadieron los esferoides de trofoectodermo sobre la monocapa de celulas HEC-1A, colocando de 6 a 10 esferoides por pocillo. La adhesion de los esferoides se midio a los 60 minutos, contabilizando como esferoide no adherido aquel que se encontraba flotando en el

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medio de cultivo y esferoide adherido el que no se encontraba flotando. El examen se realizo con un microscopio invertido (Nikon Diaphot 300; Nikon Corp., Tokyo, Japan). El ensayo se realizo por triplicado.

C. Resultados

Los resultados obtenidos estan recogidos en la tabla 5. Se observo un mayor porcentaje de adhesion embrionaria en las condiciones en las que las lmeas HEC-1A fueron tratadas con el tungstato sodico frente a aquellas en las que no lo estuvo. No se observa ninguna adhesion en las celulas tratadas con el control negativo (C-) Withaferrin A.

Tabla 5

: Tasas Absolutas de Adhesion

: Expl Exp2 Exp3 Media

Adhesion Basal: 12% 48% 31% 30%

Tungstato sodico 10 |aM: 31% 65% 35% 44%

Withaferrin A (C-): 0% 0% 0% 0%

COMPOSICIONES PARTICULARES DE LA INVENCION

A continuation se preparan composiciones segun la invention, a modo ilustrativo. En ningun caso deben ser interpretadas como limitantes del alcance de la invencion.

EJEMPLO 5

Se preparan comprimidos recubiertos con la siguiente composition:

Celulosa microcristalina PH200 (Diluyente/deslizante) 250,00 mg Sflice coloidal anhidra (Deslizante/adsorbente) 3,00 mg Estearato de magnesio (Lubrificante) 5,00 mg Talco (Lubrificante) 7,00 mg

Opadry® blanco (Opadry® y-1-7000 White)(*) (Pelicula de recubrimiento) 8,00 mg Tungstato sodico dihidratado 200,00 mg

(*) Mezcla de hidroxipropilmetilcelulosa, polietilenglicol 6000 y dioxido de titanio (E-171) EJEMPLO 6

Se preparan comprimidos efervescentes con la siguiente composicion:

Sorbitol, aspartamo, sucralosa y xilitol (edulcorantes) 0,025mg por cada 10 mg

Carbonato calcico 0,350mg por cada 10 mg

Acido dtrico (acidulante) 0,650mg por cada 10 mg

Carbonato acido de sodio (corrector de la acidez) 0,350mg por cada 10 mg

Aroma de naranja 0,25mg por cada 10 mg Sal de tungsteno

Ejemplo 7

5 Se preparan capsulas de gelatina con la siguiente composition: Nifedipina 6 mg Goma de xantano 5 mg Sabor de naranja 0,3 mg Acido dtrico 0,4 mg 10 Gelucire 44/14 90 mg

Celulosa microcristalina PH10 (Diluyente) 92,00 mg/capsula Tungstato sodico dihidratado 100,00 mg/capsula

Claims

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REIVINDICACIONES

1. Uso de una sal de tungsteno (VI) o un solvato de la misma, para la elaboration de un medicamento para favorecer la fertilidad y la reproduction normal en un mamifero hembra no diabetico.
2. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun la reivindicacion 1, donde la administration de dicha sal se realiza en una dosis diaria de al menos 0,001 mg hasta una maxima de 1000 mg de sal de tungsteno (VI) por cada kg de peso corporal del mamifero hembra.
3. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 y

2, donde el mamifero es humano.
4. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

3, donde dicha sal comprende un anion de tungsteno (VI) y un cation dieteticamente o farmaceuticamente aceptable.
5. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

4, donde el cation es un cation alcalino o alcalinoterreo.
6. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

5, caracterizada porque el cation se selecciona entre el grupo que consiste en sodio, potasio, magnesio, calcio y zinc.
7. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun la reivindicacion 6, caracterizada porque es el cation es sodio.
8. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el anion de tungsteno (VI) se selecciona de los iones WO42-, HWO4-, W2O72- y HW2O7-.
9. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun la reivindicacion 8, caracterizada porque el anion es WO42-.
10. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el solvato es el dihidrato.
11. El uso de una sal de tungsteno (VI) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el mamifero femenino no diabetico se selecciona del grupo de mamiferos que necesitan restaurar y/o potenciar la ovulacion, mejorar la calidad del oocito y del embrion, aumentar la implantacion del cigoto en la pared uterina, regular una 5 alteracion del eje hipotalamico-hipofisario, incluyendo smdrome de ovario

poliqwstico, smdrome metabolico, hiperprolactinemia, endometriosis, hipotiroidismo, esclerosis multiple, lupus eritematoso, cirrosis, artritis reumatoide, celiaqwa, fallo renal cronico, causas idiopaticas y desordenes alimentarios, tales como anorexia nerviosa y bulimia.

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