ES2639552T3 - Método para mejorar el rendimiento de azúcares fermentables al usar una proteína de envuelta de esporas de Bacillus (COTA) - Google Patents

Método para mejorar el rendimiento de azúcares fermentables al usar una proteína de envuelta de esporas de Bacillus (COTA) Download PDF

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Abstract

Método para producir un azúcar fermentable a partir de un material lignocelulósico en el que el material lignocelulósico se pone en contacto con una a lacasa y una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa, bien simultáneamente o bien de un modo secuencialmente diferido, en el que la lacasa es la proteína de envuelta de esporas de Bacillus CotA.

Description

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DESCRIPCION
Metodo para mejorar el rendimiento de azucares fermentables al usar una protema de envuelta de esporas de Bacillus (COTA)
Campo de la invencion
La invencion se refiere a procedimientos para la conversion de biomasa en carbohidratos, azucares fermentables importantes. Proporciona metodos para incrementar el rendimiento de la digestion enzimatica de una biomasa, en particular en los casos en los que la celulosa se convierte en azucares, usando una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa y una lacasa, que es la protema de envuelta de esporas de Bacillus CotA.
Antecedentes de la invencion
La celulosa y la lignina de las plantas estan entre las fuentes de carbono renovables mas destacadas. Estas moleculas estan comprendidas en las plantas como estructuras de lignocelulosa; fibras de polfmeros celulosicos enmaranadas en una red de polfmeros de lignina. La lignocelulosa esta compuesta principalmente por celulosa, hemicelulosa y lignina. La lignina puede constituir hasta 25% de la biomasa lignocelulosica. Para la produccion de azucares fermentables, especies herbaceas Miscanthus, virutas de madera y los subproductos del mantenimiento ce cesped y arboles son algunos de los materiales lignocelulosicos mas populares. El rastrojo de mafz, Panicum virgatum (pasto varilla) y Miscanthus son los principales materiales de biomasa que se estudian actualmente, debido a su alta productividad por hectarea. Sin embargo, la celulosa esta contenida en casi todas las plantas, arboles y arbustos naturales de crecimiento libre, en prados, bosques y campos de todo el mundo sin esfuerzo agncola o coste necesarios para hacerlos crecer.
La fraccion celulosica de diversas lignocelulosas es una estructura uniforme que consiste en unidades de glucosa con enlaces (3-1,4. Sin embargo, la biodegradabilidad de la celulosa puede variar entre plantas, dependiendo de la fuerza de la asociacion de la celulosa con otros compuestos vegetales. La composicion y la proporcion de la hemicelulosa y la lignina dependen mucho de la naturaleza del material. Hay mas lignina en las maderas blandas (por ejemplo, picea) que en las maderas duras (por ejemplo, sauce) o los residuos agncolas (por ejemplo, paja de trigo o bagazo de cana de azucar), lo que convierte a la madera blanda en un material particularmente estimulante para la produccion de etanol. El principal componente de la hemicelulosa de madera dura y residuos agncolas es el xilano, mientras que el de la madera blanda es principalmente manano.
Existen esencialmente dos modos de producir etanol a partir de celulosa. En primer lugar, existen procedimientos de celulolisis que consisten en la hidrolisis de materiales lignocelulosicos a veces pretratados, usando enzimas para romper la celulosa compleja en azucares simples tales como glucosa, seguido por fermentacion y destilacion. En segundo lugar, tambien existe una gasificacion que transforma la materia prima lignocelulosica en monoxido de carbono e hidrogeno gaseosos. A continuacion, estos gases se pueden convertir en etanol mediante fermentacion o catalisis qmmica.
El procedimiento que implica la celulolisis se puede dividir tfpicamente en varios pasos: en primer lugar, puede haber una fase de "pretratamiento" para hacer al un material lignocelulosico tal como madera o paja mas propenso a la hidrolisis. Una etapa de hidrolisis (la celulolisis real), para romper las moleculas en azucares seguida por la separacion de la solucion sacarica de los materiales residuales, principalmente lignina, seguido por la fermentacion microbiana de la solucion sacarica y la destilacion para producir alcohol puro aproximadamente al 95%.
Aunque la lignocelulosa es la fuente de material vegetal mas abundante, su sensibilidad se ha visto reducida por su estructura ngida. Como resultado, se necesita un pretratamiento eficaz para liberar la celulosa de la junta de lignina y su estructura cristalina a fin de hacer accesible a una etapa de hidrolisis posterior. Hasta ahora, la mayona de los pretratamientos se realizan a traves de medios ffsicos o qrnmicos.
El pretratamiento ffsico a menudo se denomina reduccion del tamano para reducir el tamano ffsico de la biomasa. El pretratamiento qrnmico es para retirar barreras qrnmicas de modo que las enzimas puedan tener acceso a la celulosa para la destruccion enzimatica.
Hasta la fecha, tecnicas de pretratamiento disponibles incluyen hidrolisis acida, explosion de vapor de agua, expansion de fibras con amomaco, Organosolve, pretratamiento al sulfito para vencer la resistencia de la lignocelulosa, oxidacion humeda alcalina y pretratamiento con ozono.
En el pretratamiento catalizado por acido, la mayor parte de la hemicelulosa se degrada, y la celulosa tiene que ser hidrolizada mediante el uso de celulasas, mientras que en el pretratamiento catalizado por alcali, parte de la lignina se retira y, ademas de las celulasas, tambien son necesarias hemicelulasas para hidrolizar los polisacaridos restantes.
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La hidrolisis completa de celulosa y hemicelulosa requiere un coctel de enzimas bien disenado que consiste en endoglucanasas, celobiohidrolasas, p-glucosidasas, xilanasas, mananasas y diversas enzimas que actuan sobre las cadenas laterales de xilanos y mananos.
Debido a la estructura resistente de las lignocelulosas, se puede requerir una etapa de pretratamiento antes de la hidrolisis enzimatica a fin de hacer a la celulosa mas accesible a las enzimas. A pesar de las investigaciones anteriores, la mayona de los procedimientos de tratamiento no son eficaces cuando se aplican a materias primas con alto contenido de lignina, tales como biomasa de bosques. La presente invencion trata este problema.
Sumario de la invencion
Se ha encontrado que una protema de envuelta de esporas de Bacillus subtilis denominada CotA podna mejorar mucho el rendimiento de la digestion enzimatica de material lignocelulosico. La invencion se refiere con eso a un metodo para producir un azucar fermentable a partir de un material lignocelulosico en donde el material lignocelulosico se pone en contacto con una lacasa y una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa bien simultaneamente o bien de un modo secuencialmente diferido, en donde la lacasa es la protema de envuelta de esporas de Bacillus CotA.
Tambien se proporciona en la presente un acido nucleico aislado que codifica una protema util en el metodo anterior, teniendo la protema actividad de lacasa y una secuencia de aminoacidos primaria que es al menos 93% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2, documento WO 2013/038062)). La descripcion tambien proporciona un polipeptido aislado que tiene actividad de lacasa codificado por una secuencia de ADN aislada como la descrita anteriormente o un polipeptido aislado que tiene actividad de lacasa con una secuencia de aminoacidos primaria que es al menos 93% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2).
Descripcion detallada de la invencion
Se ha encontrado sorprendentemente que el rendimiento de un procedimiento enzimatico para producir azucares fermentables a partir de material lignocelulosico se puede mejorar mucho cuando una protema de envuelta de esporas de Bacillus denominada CotA se anade al material lignocelulosico junto o de un modo secuencialmente diferido con una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa. En una serie de experimentos, se pudo mostrar que esta protema CotA superaba a otras lacasas, tanto de origen bacteriano como fungico.
Furtado y cols., Protein Engineering, Design and Selection 26: 15 - 23 (2013) describen una enzima bifuncional recombinante creada al fusionar dos enzimas de Bacillus subtilis: la beta-1,3-1,4 glucanasa (EC 3.2.1.73) y una lacasa Cot A (EC 1.10.3.2). La enzima de fusion mostraba actividad tanto de lacasa como de glucanasa. Sin embargo, solamente se podfa mostrar una mejora en la liberacion de azucares desde bagazo de cana de azucar molido cuando se anadfa ABTS a la mezcla de reaccion.
Moilanen y cols., Enzyme and Microbial Technology 49 (2011) 492-498 divulga el uso de enzimas modificadoras de lignina tales como lacasas junto con celulasas a fin de modificar o retirar parcialmente lignina de la biomasa. Ejemplifica el uso de lacasa de Cerrena unicolor PM170798 (FBCC 387) y una lacasa procedente de Trametes hirsuta VTT D-443. Cerrena y Trametes son ambas especies del reino de Fungi.
De ah que la descripcion proporcione un metodo para producir un azucar fermentable a partir de un material lignocelulosico en el que el material lignocelulosico se incuba con una lacasa y una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa, bien simultaneamente o bien de un modo secuencialmente diferido, en donde la lacasa es la protema de envuelta de esporas de Bacillus CotA.
Ejemplos de un material lignocelulosico que se puede tratar ventajosamente con los metodos que se describen en la presente incluyen materiales que comprenden rastrojos de mafz, cultivos bioenergeticos, residuos agncolas, residuos solidos municipales, residuos solidos industriales, residuos de jardines, residuos madereros y forestales, cana de azucar, pasto varilla, paja de trigo, heno, cebada, paja de cebada, paja de arroz, hierbas, papel residual, fango o subproductos procedentes de la fabricacion de papel, grano de mafz, mazorcas de mafz, cascaras de mafz, trigo, bagazo de cana de azucar, sorgo, soja, arboles, ramas, virutas de madera, serrm y cualquier combinacion de los mismos.
Tambien se proporciona en la presente un metodo como el descrito anteriormente en el que el material lignocelulosico se selecciona del grupo que consiste en rastrojos de mafz, cultivos bioenergeticos, residuos agncolas, residuos solidos municipales, residuos solidos industriales, residuos de jardines, residuos madereros y forestales, cana de azucar, pasto varilla, paja de trigo, heno, cebada, paja de cebada, paja de arroz, hierbas, papel residual, fango o subproductos procedentes de la fabricacion de papel, grano de mafz, mazorcas de mafz, cascaras
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de ir^z, trigo, paja de trigo, heno, paja de arroz, bagazo de cana de azucar, sorgo, soja, arboles, ramas, virutas de madera, sernn y combinaciones de los mismos.
El termino material lignocelulosico se refiere a un material que comprende (1) celulosa, hemicelulosa o una combinacion y (2) lignina. A lo largo de esta divulgacion se entiende que celulosa se puede referir a celulosa, hemicelulosa una combinacion de las mismas. Celulasa se puede referir a celulasa, hemicelulasa o una combinacion de las mismas.
Tambien se ha encontrado que se podna mejorar la accion de una multitud de enzimas degradadoras de celulosa.
Se proporciona en la presente un metodo como el descrito anteriormente, en el que la mezcla de enzimas degradadoras de celulosa se selecciona del grupo que consiste en celulasa; hemicelulasa; endoglucanasas [beta] 14 (E.C. 3.2.1.4), exoglucanasas [beta] 1-4 (E.C. 3.2.1.9.1), [beta]-glucosidasas (E.C. 3.2.1.2.1), endoxilanasa y combinaciones de las mismas.
Las enzimas degradadoras de celulosa se conocen en la tecnica y estan disponibles comercialmente.
TM TM
Habitualmente, se ofrecen en preparaciones combinadas, por ejemplo, preparaciones CELLIC CTEC3 o CTEC2 (de Novozymes, Dinamarca) que son composiciones de enzimas que comprenden celulasas, [beta]-glucosidasas y
TM TM
hemicelulasa; o CELLIC HTEC3 o HTEC2 (tambien de Novozymes, Dinamarca) que es una composicion de enzimas que comprende endoxilanasa y celulasa.
En un metodo alternativo la lacasa CotA se anade al material lignocelulosico junto con o antes de las enzimas degradadoras de celulosa. En otra alternativa, el metodo se puede emplear para incrementar el rendimiento de azucares fermentables obtenidos a partir de lignocelulosa con un alto contenido de lignina.
En ciertos procedimientos, la temperatura de la biomasa o el material lignocelulosico que se va a tratar puede estar por encima de la temperatura de inactivacion de las enzimas. Puesto que una temperatura alta puede inactivar las enzimas al desnaturalizar su cadena de aminoacidos, las enzimas se pueden anadir ventajosamente a la biomasa en un punto por debajo de la temperatura de inactivacion de las enzimas. Las enzimas se pueden anadir dentro del intervalo o los intervalos de temperatura funcionales o a la temperatura o las temperaturas optimas de la enzima. Para ahorrar energfa, las enzimas se pueden anadir despues de que la biomasa se haya enfriado hasta la temperatura de inactivacion y de que el proceso enzimatico este suficientemente completado antes de que la temperatura haya cafdo por debajo de la temperatura funcional optima de la enzima. Naturalmente, tambien es una opcion mantener una temperatura deseada al enfriar o calentar la biomasa o el material lignocelulosico. Anadir un lfquido de dilucion, tal como agua a una cierta temperatura, se puede usar para enfriar la biomasa.
En un metodo alternativo, el procedimiento de pretratamiento de enzimas se puede realizar a una temperatura espedfica tal como, por ejemplo, a de 30 grados C a 60 grados C; de 40 grados C a 55 grados C; o de 45 grados C a 50 grados C, o a temperatura ambiente o inferior.
El contacto de la biomasa con las enzimas se puede realizar durante un penodo de tiempo de hasta un dfa. Aunque son posibles digestiones enzimaticas mas prolongadas, se puede usar un penodo de tiempo mas corto tal como 60 minutos, 10 horas, 20 horas, 30 horas, 40 horas, 60 horas o 72 horas o cualquier tiempo menor que estos valores o cualquier tiempo entre cualquiera de dos de estos valores por razones practicas o economicas. En otro metodo alternativo, las digestiones enzimaticas pueden llevar 50, 100, 150 o 200 horas o cualquier tiempo menor que estos valores o cualquier tiempo entre cualquiera de dos de estos valores. Vease, p. ej., la seccion de ejemplos. En una alternativa, un penodo de contacto enzimatico preferido es aproximadamente 3 dfas o menos.
En un metodo como el descrito en la presente, el material lignocelulosico se puede pretratar ventajosamente. El termino "pretratado", segun se usa en la presente, se refiere a un tratamiento que se produce antes del tratamiento enzimatico, bien lacasas o bien enzimas degradadoras de celulosa o ambas. El pretratamiento puede consistir en un tratamiento con vapor de agua, de modo que el tratamiento con vapor de agua acido diluido o un tratamiento de explosion de vapor de agua se aplique a la biomasa o el material lignocelulosico. Uno de los fines del tratamiento con vapor de agua es despolimerizar la lignina en la biomasa hasta un grado suficiente para permitir que una enzima o mezcla de enzimas convierta la celulosa y la hemicelulosa de la biomasa en azucares menos complejos en una etapa posterior.
Las lacasas (EC 1.10.3.2) son enzimas que tienen una amplia distribucion taxonomica y pertenecen al grupo de las multicobre oxidasas. Las lacasas son catalizadores ecologicos que usan oxfgeno molecular procedente del aire para oxidar diversos compuestos fenolicos y no fenolicos relacionados con la lignina asf como contaminantes medioambientales muy resistentes, y producen agua como el unico producto secundario. Estos catalizadores "verdes" naturales se usan para diversas aplicaciones industriales incluyendo la detoxificacion de efluentes industriales, principalmente procedentes de las industrias del papel y la pasta papelera, textil y petroqmmica, el uso como agente de biorremediacion para depurar herbicidas, plaguicidas u ciertos explosivos en el suelo. Las lacasas tambien se usan como agentes depuradoras para ciertos sistemas de purificacion de agua. Ademas, su capacidad parar retirar sustancias xenobioticas y producir productos polimericos las convierte en una herramienta util con propositos de biorremediacion.
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Las lacasas fueron descubiertas originalmente en los hongos, son particularmente muy estudiadas en hongos de putrefaccion blanca y hongos de putrefaccion parda. Mas tarde, las lacasas tambien se encontraron en plantas y bacterias. Las lacasas tienen una amplia especificidad para sustratos; aunque diferentes lacasas puedan tener preferencias para el sustrato algo diferentes. La principal caractenstica de la enzima lacasa es su potencial redox, y, segun este parametro todas las lacasas se pueden dividir en tres grupos (vease, por ejemplo, Morozova, O. V., Shumakovich, G. P., Gorbacheva, M. a., Shleev, S. V., & Yaropolov, a. I. (2007). "Blue" lacasas. Biochemistry (Moscu), 72(10), 1136-1150. doi:10.1134/S0006297907100112): lacasas de potencial redox alto (0,7-0,8 V), lacasas de potencial redox medio (0,4-0,7 V) y lacasas de potencial redox bajo(<0,4V). Se cree que un potencial redox bajo limita el alcance de sustratos que la enzima puede oxidar, y viceversa. Todas las lacasas de potencial redox alto y la parte superior de las lacasas de potencial redox medio son lacasas fungicas. La aplicacion industrial de las lacasas se basa principalmente si no totalmente en las lacasas fungicas.
CotA es una lacasa bacteriana y es un componente de las capas externas de la endospora de bacillus. Es una protema de 65 kDa codificada por el gen cotA (Martins, O., Soares, M., Pereira, M. M., Teixeira, M., Costa, T., Jones, G. H., & Henriques, A. O. (2002). Molecular and Biochemical Characterization of a Highly Stable Bacterial Laccase That Occurs as a Structural Component of the Bacillus subtilis Endospore Coat. Biochemistry, 277(21), 18849 - 18859. doi:10.1074/jbc.M200827200). CotA pertenece a un grupo diverso de multicobre oxidasas "azules" que incluye las lacasas. Esta protema muestra alta termoestabilidad y resistencia a diversos elementos nocivos segun las capacidades de supervivencia de la endospora. Se ha presentado que el potencial redox de esta protema es de alrededor de 0,5 mV, lo que la situa en el intervalo de las lacasas de potencial redox medio.
En cuanto a la estructura primaria, las lacasas son diversas. En muchos casos las lacasas pueden no tener en absoluto una homologfa de secuencia significativa con todos los otros miembros de la multicobre oxidasas.
Las lacasas CotA representan un grupo bastante compacto y bien definido de secuencias. Se realizo una busqueda por Blast de las secuencias procedentes del banco de datos de protemas
(
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch &SHOW_DEFAULTS=on&LINK_LOC=blasthome) que tienen homologfa con secuencias preferidas de esta solicitud de patente denominadas protema COT1 (SEQ ID N°: 1) y protema COT2 (SEQ ID N°: 2).
Esta busqueda revelo un grupo muy compacto de secuencias que muestran entre 98% y 91% de identidad con la secuencia de COT2. Otro grupo de secuencias consistfa exclusivamente en lacasas de la envuelta de esporas de la especie Bacillus, que teman una identidad entre 78% y 82% con la secuencia de COT1.
El documento CN102154150 divulga una lacasa WN01 de Bacillus subtilis (CGMCC N° 4265), su secuencia nucleotidica (SEQ ID N°: 1) y su secuencia de aminoacidos (SEQ ID N°: 2). La SEQ ID N°: 2 del documento CN 102154150 es 97% identica con COT1 de la presente solicitud (SEQ ID N°: 1) y 99% identica con COT2 de la presente solicitud (SEQ ID N°: 2).
En el grupo de secuencias con una identidad de 60% o mas, todas las secuencias eran protemas de envuelta de esporas procedentes de la especie Bacillus, productos de los genes CotA correspondientes.
El alineamiento de la lacasa COTA, GenBank: BAA22774.1 con lacasa fungica de Trametes versicolor (GenBank: CAA77015) usando la fuente de "2 secuencias Blast" en lmea (
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins&PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE_T YPE=BlastSearch&BLAST_SPEC=blast2seq) muestra que solo 54% de la longitud de la secuencia se podfa alinear con una identidad en la seccion alineada de 22%. El alineamiento de COT2 (SEQ ID N°: 2, una enzima CotA preferida) con otra lacasa bacteriana - CuEO de E.coli (zip_03034325.1) mostraba 29% de identidad. De modo que se puede decir que la lacasa CotA no tiene identidad u homologfa significativas con otras lacasas.
Para los propositos de esta invencion, CotA se define en la presente como una protema aislada con actividad de lacasa con una estructura de aminoacidos primaria que es al menos 60% identica a la secuencia segun SEQ ID N°: 2. Preferiblemente, CotA tiene una estructura primaria que es al menos 60% identica a la secuencia segun SEQ ID N°: 2, tal como al menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o incluso 100%.
La descripcion tambien proporciona enzimas y metodos para su uso. De ah que la descripcion tambien proporcione un metodo como el descrito anteriormente en el que la lacasa CotA lacasa tiene una estructura de aminoacidos primaria que es al menos 60% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2). En una mejora adicional del metodo, la lacasa CotA es COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SeQ ID N°: 2).
La descripcion tambien proporciona un acido nucleico aislado que codifica una protema que tiene actividad de lacasa y una secuencia de aminoacidos primaria que es al menos 93% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2).
La descripcion tambien proporciona un polipeptido aislado que tiene actividad de lacasa codificado por una secuencia de ADN aislada como la descrita anteriormente. La descripcion tambien proporciona un polipeptido aislado que tiene actividad de lacasa con una secuencia de aminoacidos primaria que es al menos 60% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2).
5 Leyenda para la figura
Figura 1 Efecto de lacasas sobre el rendimiento de azucares reductores a partir de biomasa lignocelulosica. La hidrolisis enzimatica del material lignocelulosico (carton corrugado viejo) se realizo usando un coctel de celulasas comercial para aplicaciones de biocombustible bajo condiciones recomendadas, con o sin lacasas. Las lacasas se anadieron (segun se indica) a la concentracion 1 ukat/g (60 unidades/g) de sustancia seca, directamente a las 10 mezclas de hidrolisis junto con celulasas. Se usaron las siguientes lacasas: "Lacasa fungica 1" procedente de Trametes versicolor, "lacasa fungica 2" procedente de Pleurotus ostreatus, y protema de envuelta de esporas "CotA" procedente de Bacillus subtilis. Los rendimientos de azucares reductores se determinaron mediante el metodo de DNS. El rendimiento de la reaccion de control sin lacasa ("celulasa") se tomo como 100% y se calcularon los rendimientos relativos para las muestras correspondientes que conteman lacasas.
15 Ejemplos
Ejemplo 1: Efecto de diferentes lacasas sobre el rendimiento de azucares a partir de la hidrolisis enzimatica de un sustrato lignocelulosico.
Trozos de carton corrugado viejo se sometieron a hidrolisis enzimatica. Se llevaron a cabo experimentos en paralelo en los que la hidrolisis de celulosa se realizo en ausencia de lacasa o en presencia de una de las tres lacasas:
20 (1) Protema de envuelta de esporas procedente de Bacillus subtilis CotA (COT2 (SEQ ID N°: 2, expresada
recombinantemente en E. coli), (2) lacasa fungica disponible comercialmente de de hongos de podredumbre blanca Trametes versicolor (disponible de Sigma-Aldrich), y (3) lacasa procedente del hongos de podredumbre blanca Pleurotus ostreatus expresada recombinantemente en la levadura Saccharomyces cerevisiae (Piscitelli, A., Giardina, P., Mazzoni, C., & Sannia, G. (2005). Recombinant expression of Pleurotus ostreatus laccases in Kluyveromyces 25 lactis and Saccharomyces cerevisiae. Applied microbiology and biotechnology, 69(4), 428-39. doi:10.1007/s00253- 005-0004-z).
Los trozos de carton corrugado viejo se pretrataron con NaOH al 0,5% con 15% de consistencia (consistencia significa porcentaje de materia seca en la suspension, p/v) durante 1 h a 90 grados Celcius, a continuacion el material se lavo con agua, se seco y se sometio a hidrolisis enzimatica con 5% de consistencia en acido succmico 30 100 mM (pH 5,0).
La hidrolisis enzimatica de la celulosa se llevo a cabo usando coctel de celulasas disponible comercialmente para aplicaciones de biocombustible, CMAX (Alternafuel) de Diadick usando la concentracion de celulasas recomendada por el fabricante.
35
Todas las lacasas se usaron en una concentracion de 1 microkatal/g (60 unidades/g de materia prima seca. Un se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 mol de sustrato (ABTS) en 1 s. Una unidad catalftica se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 micromol de sustrato (ABTS) en 1 min) y anadidas directamente a la reaccion de hidrolisis.
40
La hidrolisis se llevo a cabo a 60 grados Celsius durante 72 h. Despues de la hidrolisis, los niveles de azucares reductores se determinaron mediante el metodo del acido dinitrosalidlico (metodo del DNS, Sadasivam S., Manickam A., "Carbohydrates" en Biochemical methods, New Age Internatioal Ltd Publishers, 2a edicion, 2005, p.6).
45 Los resultados se muestran en la figura 1. Se observo un gran incremento en el rendimiento cuando el material lignocelulosico se incubaba simultaneamente con CotA y las enzimas celulasa. Se alcanzaba un incremento de aproximadamente 250% en comparacion con celulasas combinadas con hongos de podredumbre blanca Trametes versicolor o lacasa procedente de hongos de podredumbre blanca Pleurotus ostreatus. Se obteman resultados muy similares cuando el tratamiento con lacasas se realizaba antes del tratamiento con celulasas.
50 Ejemplo 2: Hidrolisis enzimatica de diversas materias primas lignocelulosicas
La hidrolisis enzimatica de diversas materias primas lignocelulosicas se llevo a cabo a fin de evaluar el efecto del tratamiento con lacasa CotA sobre el rendimiento de azucares (Tabla 1).
Se usaron los siguientes sustratos lignocelulosicos:
5
10
15
20
25
30
35
Paja de trigo explosionada con vapor de agua: la explosion de vapor de agua se realizo en un instrumento de explosion de vapor de agua a 200 grados Celsius durante 2,5 min, la suspension despues de la explosion de vapor de agua se lavo con agua y se seco. Carton corrugado viejo se trato con NaOH al 0,5% con 15% de consistencia durante 1 h a 90 grados Celsius, a continuacion el material se lavo con agua y se seco. La pasta papelera de eucalipto es pasta papelera (fibras de madera) obtenida mediante formacion qmmica de pasta papelera (formacion de pasta papelera kraft) y recogida despues de la etapa de blanqueo. Son fibras de celulosa practicamente puras con pequenos vestigios de lignina. La pasta papelera soplada de madera blanda (picea) y la pasta papelera soplada de madera dura (abedul) son pastas papeleras (fibras de madera) obtenidas mediante formacion qmmica de pasta papelera (formacion de pasta papelera kraft) recogida antes de la etapa de blanqueo procedente del deposito de soplado que seca la pasta papelera despues de la coccion qmmica. Estas pastas papeleras contienen aproximadamente 3% de lignina y 97% de celulosa. La pasta papelera de pino es pasta papelera obtenida a partir de pino mediante un procedimiento termomecanico de formacion de pasta papelera, se recogio antes del blanqueo y contiene aproximadamente 25% de lignina y 75% de celulosa.
La hidrolisis enzimatica de la celulosa se llevo a cabo usando un coctel de celulasas disponible comercialmente para aplicaciones de biocombustibles, CMAX (Alternafuel) de Diadick. Los sustratos lignocelulosicos secados que se describen anteriormente se sometieron a hidrolisis enzimatica con 5% de consistencia en acido succmico l00 mM (pH 5,0) usando la concentracion de celulasas recomendada por el fabricante. La lacasa CotA (cuando se indique) se anadio a las reacciones de hidrolisis a una concentracion 1 microkatal/g de materia prima seca (que corresponde a 60 unidades/g. Un katal se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 mol de sustrato (ABTS) en 1 s, una unidad catalttica se define como la cantidad de enzima necesaria para convertir 1 micromol de sustrato (ABTS) en 1 min). La hidrolisis se llevo a cabo a 60 grados Celsius durante 72 h.
Despues de la hidrolisis, los niveles de azucares reductores se determinaron mediante el metodo del acido dinitrosalidlico (metodo del DNS, Sadasivam, 2005). Los resultados se muestran en la tabla 1.
Se conclma que los rendimientos de la celulasa se mejoraban mucho al anadir una lacasa CotA a la mezcla de reaccion, independientemente de la fuente de la lignocelulosa.
Se encontro notablemente que una biomasa que virtualmente no contema lignina o no contema lignina en absoluto (tal como pasta papelera de eucalipto) tambien podfa servir como un sustrato en un metodo como el descrito en la presente. Incluso con esos materiales, el rendimiento de la celulosa se mejoraba notablemente cuando se usaba una lacasa CotA en combinacion con la celulasa. Como se muestra en la tabla 1, el rendimiento a partir de pasta papelera de eucalipto se incrementaba con 157% hasta un rendimiento que era 92% del rendimiento teorico.
Tabla 1 Mejora del rendimiento de azucares con lacasa CotA.
Material lignocelulosico
Celulasa [mg de azucar/gramo de materia prima) Celulasa + lacasa CotA [mg de azucar/gramo de materia prima) Mejora del rendimiento Rendimiento teorico [mg de azucar/gramo de materia prima) Porcentaje del rendimiento teorico
Paja de trigo explosionada con vapor de agua
433 556 128% 650 85%
Carton corrugado viejo (OCC)
83 214 259% 690 31%
Pasta papelera de pino
219 532 243% 750 71%
Pasta papelera de eucalipto
586 922 157% 1000 92%
Pasta papelera soplada (madera blanda)
429 840 196% 970 86%
Pasta papelera soplada (madera dura)
542 950 175% 970 98%

Claims (7)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo para producir un azucar fermentable a partir de un material lignocelulosico en el que el material lignocelulosico se pone en contacto con una a lacasa y una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa, bien simultaneamente o bien de un modo secuencialmente diferido, en el que la lacasa es la protema de envuelta de esporas de Bacillus CotA.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que el material lignocelulosico se selecciona del grupo que consiste en rastrojos de mafz, cultivos bioenergeticos, residuos agncolas, residuos solidos municipales, residuos solidos industriales, residuos de jardines, residuos madereros y forestales, cana de azucar, pasto varilla, paja de trigo, heno, cebada, paja de cebada, paja de arroz, hierbas, papel residual, fango o subproductos procedentes de la fabricacion de papel, grano de mafz, mazorcas de mafz, cascaras de mafz, trigo, bagazo de cana de azucar, sorgo, soja, arboles, ramas, virutas de madera, serrm y cualquier combinacion de los mismos.
  3. 3. Metodo segun las reivindicaciones 1 o 2, en el que la mezcla de enzimas degradadoras de celulosa consiste en una combinacion de enzimas seleccionadas del grupo que consiste en celulasa; hemicelulasa; endoglucanasas [beta] 1-4 (E.C. 3.2.1.4), exoglucanasas [beta] 1-4 (E.C. 3.2.1.9.1), [beta]-glucosidasas (E.C. 3.2.1.2.1) y endoxilanasa.
  4. 4. Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el material lignocelulosico se pretrata antes de que el material se ponga en contacto con una lacasa y una mezcla de enzimas degradadoras de celulosa.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que el pretratamiento consiste en una etapa de explosion de vapor de agua.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que la lacasa CotA tiene una estructura de aminoacidos primaria que es al menos 60% identica a la secuencia de COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2).
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 6, en el que CotA es COT1 (SEQ ID N°: 1) o COT2 (SEQ ID N°: 2).
    imagen1
    Figura 1
    Rendimiento de azucares (% de ref)
    350
    I 1—1
    300
    250
    200
    150
    100
    Celulasa
    Celulasa + Lacasa fungica 1
    Celulasa + Lacasa fungica 2
    Celulasa + COTA
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