ES2639137B1 - Procedimiento enzimático para conferir a la madera y productos derivados resistencia frente a agentes de origen biótico - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento enzimático para conferir a la madera y derivados de la misma resistencia frente a agentes bióticos. La invención consiste en el atrapamiento de un protector hidrosoluble en el entramado formado por lignina Kraft sobre la superficie de la madera y derivados gracias a la acción de enzimas de tipo lacasa. Es recomendable que los materiales a tratar se sometan a una etapa previa de acondicionamiento. A continuación, estos se impregnan con una mezcla formado por las disoluciones de lacasa, protector hidrosoluble y lignina Kraft mediante los métodos convencionales de impregnación química industriales (pulverización, pincelado, inmersión, autoclave, etc) para finalmente realizar un secado de los mismos. Como ventaja, disminuye la lixiviación del protector y los productos finales tratados pueden colocarse en escenarios de riesgo de alta humidificación con un menor impacto para el medioambiente y la salud humana.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento enzimatico para conferir a la madera y productos derivados resistencia frente a agentes de origen biotico.

Sector de la tecnica

La presente invention se refiere a un procedimiento enzimatico cuyo objetivo es conferir a la madera y productos derivados resistencia frente a agentes biologicos capaces de deteriorarlos tales como bacterias, algas, hongos, insectos y xilofagos marinos. Su aplicacion pertenece, por tanto, al sector maderero y dentro del mismo, al ambito de la proteccion de la madera y derivados frente a agentes biologicos.

Antecedentes de la invencion

La madera es un material no homogeneo, formado por celulas especializadas en tejidos y destinados principalmente a la realization de las funciones de transporte, soporte y almacenaje cuando esta en el arbol" (Rodriguez Barreal, J.A.; 1998, Patologla de la madera, Ed. Mundi-Prensa). Por derivados de la madera se entienden los productos que no se obtienen directamente del corte de los troncos, sino a partir de virutas, laminas o fibras de madera. Entre ellos estarlan las maderas prefabricadas (tableros) y los materiales celulosicos (papel, carton y afines). Para el caso de la madera maciza y de las maderas prefabricadas, dado su uso estructural, existe un gran interes en asegurar su buen estado a lo largo de su vida util.

La madera presenta una durabilidad natural, es decir, una resistencia inherente frente al ataque de organismos destructores, y que varla mucho de unas especies a otras. Sin embargo, las caracterlsticas medioambientales del lugar en donde se coloque, daran lugar a diferentes "clases de riesgo" para la madera. Estas "clases de riesgo" se han definido en funcion del grado de humedad existente en el lugar de ubicacion y se recogen en la norma europea EN-335: 1992. Estas "clases de riesgo" estan vinculadas, ademas, a la exigencia o no de aplicar un tratamiento protector a la madera. Para el caso de escenarios con riesgo de alto grado de humedad, y en funcion de la durabilidad natural de la madera, se hace necesario un tratamiento protector. Una vez tratada, la madera adquiere una nueva durabilidad en funcion de la impregnabilidad de la misma (segun norma europea EN-350-2: 1995) y la penetration y retention del protector (segun norma europea EN-351-1: 2008). Estos tratamientos que incrementan la vida util de la madera, entranan una gran importancia, en primer lugar, para evitar graves perdidas economicas y, en segundo lugar, porque contribuyen a incrementar la confianza de la sociedad en el uso de los materiales madereros.

A dla de hoy, son los tratamientos de impregnation qulmica los mas efectivos y economicamente viables. Historicamente, los protectores hidrosolubles se han empleado ampliamente para proteger la madera. Se trata de disoluciones acuosas de sales minerales que pueden incluir coadyuvantes (compuestos que confieren otras propiedades ademas de las protectoras tales como propiedades retardantes, antifotodegradantes o fijadoras de los compuestos activos a la madera). La concentration del principio activo varla en funcion del grado de protection deseado y su naturaleza. Entre ellas nos encontramos con sales de arsenico, cobre, zinc, mercurio, boro y cromo. El cobre es uno de los mas empleados, ya que es efectivo frente a hongos de la podredumbre blanda, para la cual pocas formulaciones son efectivas. El arseniato de cobre cromado (CCA) ha representado una excelente solution gracias a su eficacia frente a hongos, alto grado de fijacion y amplio espectro biologico (incluyendo hongos tolerantes al cobre). Sin embargo, en el ano 2004 la Agencia de Proteccion Ambiental (EPA) de los Estados Unidos empezo

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a restringir su uso para aplicaciones residenciales por consideraciones toxicologicas. Desde entonces, en el sector de la protection de la madera se han invertido grandes esfuerzos en la busqueda de protectores alternativos, menos daninos para el medioambiente y la salud humana; y con una baja lixiviacion. Recientemente, destacan las formulaciones de cobre micronizado y sus aplicaciones, las cuales han dado lugar a un gran numero de patentes (US2014234648 A1; US2009223408 A1; US2008286380 A1; US2013017271 A1; SG171470 A1; US 7632567 B1). Se trata de formulaciones en las que pequenas partlculas de compuestos de cobre se dispersan en un disolvente portador y que consiguen excelentes penetraciones en la madera. Estas partlculas se cree se fijan a la madera con una fuerte union, limitandose as! su lixiviado y han demostrado una buena eficacia para tratar la madera (Freeman, M.H. el al., 2008, Forest Prod. J. 58(11): 6-27). No obstante, existen autores que sostienen que la seguridad de estos protectores, al igual que su modo de action, no es suficientemente clara y claman la necesidad de una evaluation de su impacto en el medioambiente y la salud humana (Civardi C. et al., 2015, Environmental Pollution 200: 126-132).

Por otro lado, en los ultimos anos se ha abogado por la implementation de tratamientos acordes con la "Qulmica verde" lo cual supone el empleo de procesos mas limpios y sostenibles. En concreto, la biotecnologla ha permitido desarrollar un gran numero de aplicaciones industriales basadas en este concepto. En particular, los tratamientos enzimaticos se han incorporado a muchas aplicaciones para la modification de materiales lignocelulosicos, siendo las lacasas las enzimas mas ampliamente usadas (Widsten P. et al., 2008, Enzyme Microb Tech 42: 293-307; Kalia S. et al., 2014, J Molec Catal B 102: 48-58). Cabe destacar el trabajo de Silva et al. (2001, React Funct Polym 71: 713-720) en el que se logro conferir propiedades antimicrobianas y antioxidantes a fibras de lino mediante funcionalizacion con enzima lacasa. Analogamente, Oriol et al. (2015, Cellulose, 22: 2375-2390) han desarrollado un procedimiento para dotar a la celulosa de capacidad antioxidante mediante productos modificados enzimaticamente. Ademas, existen diversas patentes basadas en los mencionados procesos enzimaticos. Se ha empleado grafting (o injerto) enzimatico para desarrollar filtros de celulosa (KR101300076 B1), para conferir propiedades hidrofobas a materiales de madera (ES2525363 A1), conferir propiedades ignlfugas a paja de malz (CN102975270 B) o fabricar papel con encolado interno (WO2011009979 A1), entre otros.

Las lacasas son enzimas que permiten oxidar sustratos fenolicos y anclarlos de modo estable a la madera, ya que la propia lignina de la madera posee grupos fenolicos que pueden actuar como puntos de anclaje (Fernandez-Fernandez M. et al., 2014, Wood Sci Tech, 1: 151-160). La lignina es un pollmero presente en la pared celular de plantas vasculares y algunas algas. A continuation, se muestra la estructura propuesta para la lignina por Adler (1977, Wood Sci Technol, 11: 169-21):

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imagen1

Su estructura, compleja y heterogenea, se compone de subestructuras con un peso molecular de aproximadamente 10000 uma, interconectadas entre si.

La lignina se encuentra de modo natural en la madera pero, ademas, supone un problema en la industria de la pasta de papel, ya que se genera como subproducto en ingentes cantidades. En la produccion de pasta de papel el proceso dominante actualmente es el proceso Kraft, que permite convertir madera en pasta de celulosa gracias al empleo de hidroxido de sodio y sulfuro de sodio. Simultaneamente, se genera un subproducto, el licor negro, que contiene una elevada concentration de ligninas residuales. Estas ultimas se caracterizan por tener una estructura muy degradada debido al proceso Kraft. La mayorla de las industrias de papel que emplean el mencionado proceso emplean el licor negro para producir energla a traves de su combustion y suplir las necesidades energeticas de la propia industria. No obstante, esos subproductos podrlan emplearse para generar productos de alto valor anadido. Por ello, en el marco de una "Qulmica verde" se podrlan extraer compuestos de interes del licor negro, tales como las ligninas, y revalorizarlos.

Hasta el momento, el empleo de lignina en la formulation de otros compuestos no ha alcanzado un gran exito debido a las limitaciones de los productos obtenidos. Sin embargo, el interes por valorizar este residuo y reducir su impacto ambiental no ha cesado y el desarrollo de materiales basados en lignina ocupa una de las mayores preocupaciones dentro del sector forestal. En efecto, se han desarrollado patentes de pollmeros que contienen lignina o bien composiciones incluyendo pollmeros de lignina (US2015368546 A1). Las ligninas Kraft, ademas, han demostrado su utilidad para la formation de microcapsulas por medio de ultrasonidos con la capacidad de transportar y liberar moleculas hidrofobicas (Tortera et al., 2004, Biomacromolecules, 15, 1634-1643). Por otro lado, existen estudios preliminares que han demostrado que la propia lignina podrla ser un potencial agente para la protection de la madera (Chirkova J., 2010, Holfzforschung, 65: 497-502).

Las estrategias enzimaticas, a pesar de su potencialidad, han sido empleadas en escasas aplicaciones dentro del sector de la proteccion de la madera. Destaca la aportacion de Raitto et al. (2004, Holzforschung, 58: 440-445), la cual ha demostrado la efectividad de esta estrategia para unir establemente fenoles (vanilina y acido tanico) a la madera y, de este modo, protegerla frente a hongos. La misma estrategia, pero para potenciar las propiedades antibacterianas, ha sido empleada para funcionalizar

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materiales lignocelulosicos con taninos (Widsten et al., 2010, Process Biochem, 45: 10721081), procedimiento que, ademas, se ha patentado (EP2199046 A1). Finalmente, cabe mencionar la patente NZ505242 (A) que engloba un metodo para tratar la madera con compuestos metalicos y lignina basado en la oxidacion y/o macromolecularizacion de la lignina o derivados de la misma. En esta, se utiliza una estrategia basada en el empleo agentes alcalinizantes, cuya accion esta catalizada por fenal-oxidantes y acelerada mediante calentamiento a temperaturas en un rango de 20-300°C. A pesar de su potencialidad y ventajas. la aplicacion industrial hasta el momento de estas estrategias es baja a causa de sus condiciones operacionales. En consecuencia, para la protection de la madera se precisan nuevas metodologlas mas eficientes, sencillas y de facil aplicacion a nivel industrial.

Explication de la invention

La presente invencion se refiere a un procedimiento basado en la utilization de enzimas de tipo lacasa y que representa un tratamiento protector preventivo para la madera y productos derivados que se podra aplicar antes o despues de su puesta en servicio para evitar que sean atacados por agentes biologicos capaces de deteriorarlos. Dado que la humedad serla uno de los factores clave en el desarrollo de los mencionados agentes. se ha considerado un escenario de riesgo de humidification, es decir, el correspondiente a un uso de la madera correspondiente a una "clase de riesgo" 3 o superior segun la norma EN-335:1992. El presente procedimiento se basa en el empleo de lignina Kraft en conjuncion con lacasa para crear in situ una red tridimensional polimerica en la que, simultaneamente, se encapsularlan protectores hidrosolubles, de modo que resistan al lixiviado. En particular, estos protectores hidrosolubles comprenden disoluciones acuosas de sales minerales que pueden contener arsenico, cobre, cinc, boro o cromo o mezclas de las mismas.

Los materiales a tratar se deben someter a una etapa previa de acondicionamiento, dicho acondicionamiento es un paso previo y recomendado para obtener los mejores resultados en el tratamiento realizado con el presente procedimiento. No obstante, en funcion de las condiciones del material de partida, implicara una serie de fases. A continuation, se describe el protocolo completo de tareas que variara en funcion del material de partida a tratar:

a) Cuando se trata de una pieza de madera maciza procedente directamente de un tronco comprende diferentes operaciones de mecanizado asl como secado antes del tratamiento de proteccion y/o impregnation, en concreto, consiste en las siguientes etapas:

1) Descortezado y tronzado. La ausencia de corteza es deseable ya que esta repercute negativamente al actuar de barrera flsica a la penetration del tratamiento y dificultar el posterior secado.

2) Incisionado superficial. En el caso de maderas de baja permeabilidad, se aconseja la realizacion de un incisionado superficial para conseguir un mayor grado de penetracion del tratamiento protector.

3) Corte a medida para obtener las dimensiones finales. Para un tratamiento efectivo, se recomienda como ultima premisa, que la madera a tratar tenga las dimensiones finales deseadas antes del tratamiento de proteccion por impregnacion. En el caso de madera, las probetas tendran las mismas dimensiones que la manufactura final.

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4) Secado. La madera tendra, preferiblemente, un contenido de humedad inferior al 16-18%, de modo que no exista agua libre en los lumenes celulares y los compuestos activos puedan penetrar correctamente en la fase de impregnation. Con estos contenidos de humedad se minimizan ademas los riesgos de ataques de organismos xilofagos durante su almacenamiento. El secado se puede realizar al aire (secado natural) hasta alcanzar una humedad de equilibrio con la exterior del aire; mediante un secado artificial empleando tecnicas convencionales tales como el secado por inmersion, al vaclo, por vaporization o por bomba de calor, o bien, se puede llevar a cabo un secado mixto combinando el secado natural y el secado artificial.

b) Para el caso de derivados de madera, el acondicionamiento se limita al secado de los materiales lignocelulosicos de partida para obtener una humedad inferior al 18%, previamente a la obtencion de los derivados deseados. Ademas, seran los materiales lignocelulosicos de partida los que seran tratados previamente a su procesado para la obtencion del producto deseado (tableros, carton, etc).

A continuation, estos se impregnan con una mezcla compuesta por las disoluciones acuosas de lacasa, la disolucion del protector hidrosoluble y la disolucion de lignina Kraft.

Finalmente, los materiales impregnados se someten a un secado final a temperatura ambiente para fijar los principios activos gracias a la actividad oxidante del oxlgeno y para eliminar el agua introducida. No obstante, si las circunstancias lo requieren se puede realizar otro tipo de secado, tal y como se ha descrito anteriormente para la etapa de acondicionamiento.

La presente invention difiere, por su simplicidad, de otras metodologlas enzimaticas que involucran metales y ligninas tales como la descrita en la patente NZ505242 (A) en la que se emplean reactivos alcalinizantes y reacciones aceleradas por temperatura. Por el contrario, el presente procedimiento opera a pH moderados (entre 4-8) y no emplea reactivos alcalinazantes. Estos implican una basificacion del medio de reaction, con el consecuente riesgo de deterioro en la madera a tratar. Ademas, pH superiores a 8 impiden que un tratamiento basado en enzimas lacasas sea efectivo debido a la perdida de actividad y/o desnaturalizacion de la enzima. La utilization de disoluciones alcalinas en el tratamiento de la madera puede provocar una alteration de la misma y favorecer la disolucion de la lignina y de la hemicelulosa. Por otro lado, el presente procedimiento emplea enzimas lacasas y por ello las reacciones seran catalizadas por oxlgeno y no requieren temperaturas elevadas. Finalmente, el presente procedimiento se basa en el empleo de ligninas Kraft, cuya particular estructura, permite una mayor eficiencia en el proceso enzimatico respecto a otro tipo de estructuras. De este modo, se reducen el numero de etapas y reactivos empleados con respecto a invenciones previas. Asimismo, el presente procedimiento es compatible con los procesos convencionales de impregnacion industriales gracias a sus condiciones operacionales y permite la valorization de un residuo de la industria papelera.

Del procedimiento descrito, se desprenden dos ventajas principales en su uso como protector de la madera:

- Se disminuye el lavado o lixiviacion de las sales metalicas presentes en la formulation del protector hidrosoluble al medio circundante, disminuyendose asi el riesgo para la salud humana y el impacto medioambiental.

- El tratamiento resulta efectivo para proteger la madera y productos derivados durante un perlodo de tiempo superior y en ambientes adversos.

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En una realization particular, como enzima para llevar a cabo el procedimiento

enzimatico se emplean enzimas del tipo lacasas, EC 1. 10. 3. 2, enzimas pertenecientes al grupo de las oxidasas de cobre azul, capaces de iniciar una reaction radicalaria en la cual sustratos con potenciales redox inferiores a 1V (ligninas, principalmente, en la presente invention) seran oxidados con la subsecuente reduction de oxlgeno molecular a agua. Dado que las reacciones transcurren en fase acuosa, el propio oxlgeno disuelto en la disolucion sera el responsable de promover la reaction enzimatica. Sin embargo, se ha reportado que el aporte de oxigeno externo en reacciones mediadas por lacasas reduce el tiempo de incubation (Ortner et al, 2015, Process Biochemistry 50, 1277-1283).

En una realizacion particular, como protectores hidrosolubles se pueden emplear

disoluciones acuosas conteniendo compuestos metalicos que puedan ser atrapados en la red tridimensional polimerica de lignina Kraft. Preferentemente se utilizaran disoluciones acuosas de sales metalicas que pueden contener arsenico, cobre, cinc, boro o cromo y/o mezclas de las mismas.

En una realization particular, se empleara lignina Kraft procedente del licor negro obtenido como residuo en el proceso Kraft para llevar a cabo el atrapamiento del

protector hidrosoluble. Este licor es de pH alcalino y por ello, contiene ligninas solubles,

que podran ser obtenidas por precipitation de las mismas mediante acidification. Las ligninas empleadas en el presente procedimiento pueden tener diferentes orlgenes. Pueden proceder directamente de la industria o haber sido modificadas qulmicamente. Estas son generadas en grandes cantidades en la industria papelera y su empleo conllevarla as! la revalorization de un residuo. Ademas, su estructura altamente degradada y concentration fenolica (Fernandez-Costas et al., 2014, Biomass and Bioenergy: 63, 156-166) la convierten en un sustrato muy apropiado para la aplicacion del presente procedimiento.

La lignina Kraft podra tener un tamano polimerico muy variable en funcion de su origen y, en consecuencia, una solubilidad tambien muy variable. Por ello, aunque se recomienda trabajar con altas concentraciones de lignina Kraft para conseguir un mayor entramado que atrape las sales metalicas, en muchos casos, sera la propia solubilidad de la lignina Kraft la que marque la maxima concentracion posible susceptible de ser utilizada en el presente procedimiento.

La mezcla acuosa de las disoluciones de protector hidrosoluble, lacasa y lignina Kraft se realiza de modo previo a la etapa de impregnacion. De este modo, la reaccion enzimatica comienza a actuar justo en el momento previo al contacto con la madera. Una vez se adicione la mezcla a la madera o productos derivados a tratar, comenzara a desarrollarse el entramado tridimensional en el que los principios activos del protector hidrosoluble quedaran atrapados en el entramado polimerico de lignina Kraft y, de manera simultanea, se producira el entrecruzamiento con la propia lignina presente en la madera. El propio oxlgeno disuelto en la mezcla sera el responsable del desarrollo de la reaction, sin embargo, tal y como se ha comentado previamente, se podrla adicionar de modo externo con el fin de disminuir el tiempo de impregnacion.

La impregnation se desarrolla a temperaturas que no pueden superar los 70°C, ya que a temperaturas superiores, la actividad enzimatica de las lacasas se verla ya gravemente afectada y, en consecuencia, el entrecruzamiento de la lignina Kraft y su union a la madera.

Las condiciones operacionales del presente procedimiento son suaves y, ademas, compatibles con los metodos convencionales de aplicacion de tratamientos qulmicos de la madera, tanto tratamientos superficiales (pincelado, pulverizado, inmersion breve)

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como tratamientos en profundidad convencionales, sin necesidad de su adaptation. Por otro lado, la formulation propuesta es de base acuosa, por lo que es de facil manejo y baja peligrosidad para los operarios.

Finalmente, una vez la madera se encuentre impregnada, se permitira una fase de secado para finalizar las reacciones enzimaticas. En una aplicacion particular, el secado se realiza por uno de los metodos convencionales (secado natural, artificial o mixto) hasta alcanzar un valor de humedad igual o inferior al 18%. Este proceso conlleva no solo la retirada del agua procedente del medio de reaction, sino que ademas constituye una manera de incrementar la concentration de oxigeno sobre la interfase llquida de reaccion. Este ultimo factor es clave dado que se ha demostrado la importancia de aportar oxigeno a las reacciones mediadas por lacasas para asegurar la completa oxidation de diferentes tipos de ligninas (Ortner et al., 2015, Process Biochemistry: 50, 1277-1283).

En otro aspecto, la invention descrita se refiere al uso del tratamiento y procedimiento anteriormente descritos para la protection de la madera y derivados frente a agentes bioticos tales como bacterias, algas, hongos, insectos y xilofagos marinos.

Breve descripcion de los dibujos

La descripcion se complementa con un juego de dibujos de caracter ilustrativo y no limitativo, donde se ha representado lo siguiente:

Figura 1. Diagrama esquematico simplificado del procedimiento enzimatico para conferir a la madera resistencia frente a agentes de origen biotico basado en un metodo de impregnation a vaclo. Una probeta de madera seca se somete a vaclo para eliminar el aire contenido en su estructura interna en la camara de tratamiento (a). A continuation, y bajo vaclo, se introduce la mezcla de disolucion de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa (b). Esta mezcla se prepara previamente a la impregnacion. Tras el periodo de impregnacion, la camara de tratamiento torna a presion atmosferica para finalmente escurrir la probeta y dejarla secar al aire (c).

Figura 2. Concentracion de cobre total lixiviada tras someter probetas de madera de Pinus sylvestris tratadas, durante 14 dlas de inmersion en agua con 7 cambios de agua. El tratamiento convencional representa una impregnacion acuosa con CuCI2 25 mM, mientras que en el tratamiento enzimatico se ha empleado la misma concentracion de cobre pero adicionando ademas, la disolucion de lignina Kraft (20% en peso seco) y enzima lacasa (50 U/g de madera seca).

Realization preferente de la invencion

Procedimiento para conferir a la madera y productos derivados de la madera resistencia frente a agentes de origen biotico junto con una alta fijacion de los compuestos activos caracterizado por comprender el atrapamiento de protectores hidrosolubles en una red polimerica de lignina Kraft unida a la madera empleando un mecanismo enzimatico siguiendo las siguientes etapas:

a) Acondicionamiento del material para el tratamiento, paso previo recomendado que consiste en el pre-tratamiento normal de la madera antes de cualquier proceso de impregnacion qulmica que incluye etapas de limpieza, mecanizado (descortezado, incisionado, corte a medida) y secado.

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b) Preparation previa de las disoluciones individuales de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa.

c) Impregnation de la madera que comprende la adicion simultanea de la mezcla de las disoluciones de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa.

d) Secado de las muestras impregnadas.

Como paso previo a la impregnation, se prepararan por separado las disoluciones de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa.

La disolucion de lignina Kraft se preparara en una disolucion tamponada en un intervalo de pH de 4-8 y con una concentration que puede variar entre un 1 y un 40% de lignina referido a base de madera o material lignocelulosico de partida secos.

En el caso de la disolucion de protector hidrosoluble se emplearan disoluciones que contengan sales metalicas que incluyan en su composition arsenico, cobre, cinc, boro o cromo y/o mezclas de las mismas. La concentration de las mismas dependera de la madera tratada, el grado de proteccion que se desee obtener y el metodo empleado para la impregnation (superficial o en profundidad). No obstante, las muestras tratadas deberan superar, una vez finalizado el tratamiento, los criterios de aceptabilidad de la norma europea EN-599: 2009+A1:2013. Se este modo, se identificarla la cantidad minima eficaz de producto en g/m2 para tratamientos superficiales y en kg/m3 para tratamientos en profundidad.

La impregnation tiene lugar a temperatura ambiente o temperaturas que no superen los 70°C y se puede llevar a cabo mediante las metodologlas convencionales de modo superficial tales como pincelado, pulverizado, inmersion breve; o en profundidad tales como inmersion prolongada, inmersion caliente y frla o tratamientos con autoclave.

La dosis de lacasa, varla en funcion de la tipologla del tratamiento. En tratamientos superficiales tales como pincelado o pulverizado se adicionaran actividades enzimaticas de 0.1-50 U/mL de medio de reaction. En cambio, en tratamientos en profundidad de la madera y productos derivados, estos se impregnaran inmersos en el medio de reaction y se emplearan actividades enzimaticas de 1-100 U/g de madera o material lignocelulosico secos. Se define una unidad de actividad enzimatica (U) como la cantidad de enzima que oxida un 1 pmol de 2,2'-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-acido sultanico (ABTS) por minuto. La actividad enzimatica se determina espectrofotometricamente monitorizando la oxidation del ABTS como sustrato (£436=29300 M-1 cm-1) a pH 7 (tampon fosfato, 0.1 M). La disolucion de enzima lacasa puede ser el propio preparado comercial. En caso de requerirse una menor actividad, o por facilidad de trabajo, se puede trabajar con diluciones del preparado comercial. En este ultimo caso sera necesario diluir la enzima en un medio tamponado a pH 4-8. La reaccion enzimatica de polimerizacion de ligninas Kraft, tal y como se ha mencionado previamente, puede ser acelerada por la presencia de oxlgeno. No obstante, para el presente procedimiento no es estrictamente necesario un aporte externo.

Si la aplicacion se realiza mediante pincelado suele requerir 3 manos (permitiendo un secado entre ellas) para alcanzar penetraciones similares al pulverizado. En cuanto a la inmersion breve, esta conlleva una inmersion de los materiales a tratar de un perlodo que puede durar varios segundos hasta un maximo de 10 minutos. En estos tratamientos superficiales se alcanzan penetraciones maximas de 3 mm en madera, por ello, para mayores penetraciones se emplearan tratamientos en profundidad. En cambio si se emplea tratamientos en profundidad se emplearan tiempos de impregnation de 10

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minutos como mlnimo y que pueden llegar hasta 24 horas, en funcion del volumen de material a tratar y la impregnabilidad de la especie maderera.

Con la intencion de mostrar la presente invention de un modo ilustrativo aunque en ningun modo limitante, se aporta el siguiente ejemplo practico de la invencion propuesta:

En primer lugar, se lleva a cabo el acondicionamiento de los materiales. Madera de Pinus sylvestris y Fagus sylvatica fue descortezada y se selecciono una section correspondiente a la albura, que despues se sometio a secado hasta alcanzar una humedad del18%. Finalmente, se cortaron bloques de dimensiones 30 x 10 x 5 mm3.

A continuation se llevo a cabo el proceso de impregnation siguiendo un protocolo modificado del estandar europeo EN 113: 1997. Las probetas con una humedad inferior al 18% se introdujeron en la camara de impregnacion y se aplico un vaclo de 0.7 kPa durante 15 min (Fig. 1.a). A continuacion, se prepara la mezcla de disolucion de lignina Kraft, la disolucion de protector hidrosoluble y la disolucion enzimatica con la concentration requerida. Se mezclaron la disolucion de lignina Kraft al 20% respecto al peso de madera seca, la disolucion de CuCl2 25 mM y 50 U de enzima por g de madera seca. La disolucion de lignina Kraft se ha mantenido a un pH 7 empleando un tampon fosfato al 0.1 M. Despues, bajo vaclo, se introdujo la anterior mezcla y se llevo a cabo la impregnacion durante 10 minutos (Fig. 1.b). Finalmente, las probetas se han dejado secar al aire a temperatura ambiente y durante 24 horas para finalizar el tratamiento (Fig. 1.c).

Un lote de las muestras tratadas se ha sometido a un envejecimiento acelerado segun la norma europea EN-84: 1997 (pero con 7 cambios de agua) con el objetivo de evaluar la lixiviacion del cobre a lo largo del tiempo. Este estudio de lixiviacion permitira demostrar la efectividad del tratamiento en la fijacion de la sal metalica a la madera. Las retenciones de cobre obtenidas en las probetas de P. sylvestris para ambos tratamientos: enzimatico con lignina Kraft (propuesto en la presente invencion) y convencional, se muestran en la siguiente tabla:

TRATAMIENTO

[Cu] (mg/kg) [Cu] (mg/kg)

(tras la impregnacion)

(tras el envejecimiento)

Convencional

2670 1560

Enzimatico con lignina Kraft

2470 1600

Se han encontrado retenciones ligeramente superiores para el tratamiento convencional, no obstante, tras el lavado los valores son incluso inferiores al tratamiento con el presente procedimiento. En consecuencia, en el tratamiento convencional el cobre se ha lixiviado en mayor medida y ha pasado al medio acuoso circundante. La Fig. 2 refleja que las maderas de P. sylvestris tratadas mediante el presente procedimiento enzimatico presentan desde el primer momento, un menor lixiviado del cobre con respecto a un tratamiento convencional con una sal metalica de cobre. Como ventajas, se obtiene una disminucion de la lixiviacion y, por tanto, un menor impacto ambiental del tratamiento junto con un aumento de la vida util de la madera tratada.

Ademas, los especlmenes de madera de P. sylvestris y F. sylvatica se han testado frente al ataque fungico de Coniophora puteana y Trametes versicolor, respectivamente, durante a semanas y se ha analizado su perdida de masa para evaluar la eficacia del tratamiento. Tambien, se ha realizado un control de probetas sin tratar para asegurar la

virulencia de las cepas. Los resultados obtenidos aparecen reflejados en la siguiente tabla:

TRATAMIENTO

N* Perdida de Masa (%) (C. puteana) N* Perdida de Masa (%) (T. versicoloi)

Control de virulencia

35 31 (9) 21 20(4)

Convencional

9 9(5) 5 7(3)

Enzimatico con lignina Kraft

9 11(4) 5 3(3)

*Numero de replicas

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Entre parentesis se han indicado las desviaciones estandar. El control de virulencia supera el 20%, por lo que el ensayo es aceptable segun la norma EN-113: 1997. Los valores similares obtenidos en cuanto a perdida de masa para el tratamiento propuesto y el tratamiento de cobre acuoso muestran la viabilidad del tratamiento propuesto y la 10 bioaccesibilidad del cobre para el hongo, a pesar de su mayor resistencia al lixiviado.

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   REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para conferir a la madera y productos derivados de la madera resistencia frente a agentes de origen biotico caracterizado por comprender el atrapamiento de un protector hidrosoluble en una red polimerica de lignina Kraft que se une a la madera empleando un mecanismo enzimatico siguiendo las siguientes etapas:

   a) Acondicionamiento previo del material comprendera operaciones de limpieza, mecanizado (descortezado, incisionado, corte a medida) y secado que variara segun el tipo de madera.

   b) Preparation previa de las disoluciones de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa por separado.

   c) Impregnation de la madera que comprende la adicion simultanea de una mezcla con la disolucion de lignina Kraft, protector hidrosoluble y lacasa a temperatura ambiente.

   d) Secado de las muestras impregnadas mediante metodos convencionales (secado natural, artificial o mixto) hasta alcanzar un valor de humedad igual o inferior al 18%.
2. 2. Procedimiento segun reivindicacion 1, caracterizado porque la disolucion de protector hidrosoluble a preparar segun la etapa b) contenga sales metalicas que incluyan en su composition arsenico, cobre, cinc, boro o cromo y/o mezclas de las mismas, y en una concentration adecuada a la clase de uso y tipo de madera y que permita superar los criterios de aceptabilidad de la norma europea EN-599: 2009+A1:2013.
3. 3. Procedimiento segun reivindicacion 1, caracterizado porque la disolucion de lignina a preparar segun la etapa b), se lleva a cabo en disolucion tamponada a un pH comprendido entre 4-8 y concentracion comprendida entre 1-40% por g madera o material lignocelulosico seco.
4. 4. Procedimiento segun reivindicacion 1, caracterizado porque la disolucion de lacasa segun la etapa b), se puede emplear de modo directo del preparado comercial o diluida en una disolucion tamponada a pH entre 4-8.
5. 5. Procedimiento segun reivindicacion 1, caracterizado porque la etapa e) de impregnacion se puede llevar a cabo de modo superficial (pincelado, pulverizado, inmersion breve) o en profundidad (inmersion prolongada, inmersion caliente y frla o tratamientos con autoclave).
6. 6. Procedimiento segun reivindicaciones 1 y 5, caracterizado porque la etapa e) de impregnacion puede tener una duracion inferior a 10 minutos para los tratamientos superficiales y una duration comprendida entre 10 min - 24 horas para el caso de tratamientos en profundidad, en funcion del metodo de impregnacion seleccionado, especie de madera y dimensiones de la misma.
7. 7. Procedimiento segun reivindicaciones 1 y 4 a 6, caracterizado porque para el caso de impregnacion mediante pulverizado y pincelado se preparara una disolucion de lacasa con una actividad enzimatica comprendida entre 0.1-50 U/mL.
8. 8. Procedimiento segun reivindicaciones 1 y 4 a 6 caracterizado porque cuando se empleen metodos de impregnacion en profundidad se preparara una disolucion de lacasa

   con una actividad enzimatica comprendida entre 1-100 U/g de madera o material lignocelulosicos secos.
9. 9. Procedimiento segun reivindicaciones 1 y 5 a 8, caracterizado porque la temperatura 5 en la etapa e) no superara los 70°C.
10. 10. Procedimiento segun reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el mecanismo enzimatico es acelerado y/o potenciado por oxlgeno.

    10 11. Uso del procedimiento descrito segun reivindicaciones 1 a 10, como tratamiento

    protector de la madera y derivados frente a agentes bioticos tales como bacterias, algas, hongos, insectos y xilofagos marinos.