ES2636768T3 - Terapia contra un cáncer con un parvovirus en combinación con un inhibidor de Bcl-2 - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica, que contiene (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de Bcl-2, en la que el parvovirus es H-1 (H-1PV) o un parvovirus emparentado de roedor, que se escoge entre LUIII, el virus diminuto de ratón (MMV), 5 el parvovirus de ratón (MPV), el virus diminuto de rata (RMV), el parvovirus de rata (RPV) o el virus de rata (RV).

Description

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DESCRIPCION

Terapia contra un cancer con un parvovirus en combinacion con un inhibidor de Bcl-2

El presente invento se refiere a una composicion farmaceutica que comprende (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de Bcl-2 y a la utilizacion de tal composicion para el tratamiento de un cancer, p.ej. de un tumor solido.

El cancer es la segunda causa principal de mortalidad en todo el mundo. Se ha estimado que a la mitad de los hombres y un tercio de las mujeres se les diagnosticara una cierta forma de cancer durante su penodo de vida. Ademas, puesto que el cancer es predominantemente una enfermedad de la vejez, se ha predicho que el numero de muertes por cancer en todo el mundo va a aumentar a aproximadamente un 45 % desde 2007 hasta 2030 (de 7,9 millones a 11,5 millones de muertes) debido a la proporcion aumentada de personas ancianas (estimaciones de la OMS, en 2008). El cancer es tambien la enfermedad mas costosa. Las ultimas estimaciones del National Cancer Institute (Instituto Nacional de un cancer) mostraron que el coste economico global de un cancer en los EE.UU. en 2007 fue de 226,8 milmillones de dolares, y a no ser que se desarrollen unas intervenciones preventivas mas exitosas, una deteccion temprana y unos tratamientos mas eficientes, se espera que durante las dos proximas decadas aumente adicionalmente esta carga economica, que de por sf ya es enorme. A pesar de que se han hecho unos significativos progresos en la prevencion, la deteccion, el diagnostico y el tratamiento de muchas formas de cancer, que son testimoniadas por un aumento del porcentaje de supervivientes al cancer despues de 5 anos en los EE.UU. y en Europa a lo largo de los ultimos treinta anos, ciertos tipos de tumores, tales como el pancreatico, el hepatico, el pulmonar y el cerebral, siguen huerfanos de unos tratamientos eficaces, lo que plantea la necesidad de desarrollar nuevas opciones terapeuticas. Los virus oncoltticos, que aprovechan ciertas vulnerabilidades espedficas de un cancer para matar a las celulas cancerosas mientras que preservan las celulas normales, estan surgiendo rapidamente expansion como unas herramientas prometedoras para combatir un cancer (Breitbach y colaboradores, 2011; Russell y colaboradores, 2012). No menos de doce diferentes virus oncolfticos estan siendo sometidos actualmente a ensayos clmicos de fases I-III contra diversas malignidades (Russell y colaboradores, 2012), los cuales son utilizados por sf solos o en combinacion con otros agentes anticancerosos. Entre ellos, el parvovirus oncolftico de rata H-1PV esta siendo evaluado en este momento en cuanto a la seguridad y a las primeras senales de eficacia en un ensayo clmico de fase I/IIa en unos pacientes que tienen un glioblastoma multiforme recurrente (GBM) (Geletneky y colaboradores, 2012).

El H-1PV es una pequena partmula (con alrededor de 25 nm de diametro) icosaedrica no envuelta, que contiene un genoma de ADN monocatenario de 5,1 kb de longitud (Cotmore & Tattersall, 2007). La organizacion genomica del H-1PV se compone de dos unidades de transcripcion que estan bajo el control de dos promotores, el promotor temprano P4 y el promotor tardm P38. El P4 regula la expresion del gen que codifica las protemas no estructurales (NS, acronimo del ingles "non-structural") (NS1 y NS2), y el P38 regula el gen que codifica las protemas capsidas (VP) (VP1), VP2, VP3) (Cotmore & Tattersall, 2007). El virus se multiplica preferentemente en las celulas cancerosas que se dividen rapidamente. Esta selectividad oncologica no esta basada en una mejor captacion del virus por las celulas cancerosas, sino que se debe mas bien al hecho de que las celulas cancerosas sobreexpresan ciertos factores tales como ciclina A, E2F o CREB/ATF que se requieren para la replicacion de un ADN vmco. Asimismo, las celulas cancerosas son frecuentemente deficientes en su capacidad para establecer una eficaz respuesta inmunitaria antivmca, que favorece la multiplicacion de los virus (Nuesch y colaboradores, 2012). Se sabe que el virus activa multiples rutas de muerte celular. Dependiendo del tipo de celulas y de las condiciones de crecimiento, el H-1PV puede inducir una apoptosis (Hristov y colaboradores, 2010; Ohshima y colaboradores, 1998; Rayet y colaboradores, 1998; Ueno y colaboradores, 2001), una necrosis (Ran y colaboradores, 1999), o una muerte celular dependiente de la catepsina B (Di Piazza y colaboradores, 2007). El virus era capaz de inducir una oncolisis incluso en unas celulas de cancer resistentes al TRAIL (acronimo del ingles "Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis Inducing Ligand", ligando inductor de apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral), cisplatino, incluso cuando la Bcl-2 se sobreexpresaba (di Piazza y colaboradores., 2007). Los ultimos resultados sugieren que Bcl-2 no es un modulador negativo de la citotoxicidad del parvovirus. La terapia de un cancer que utiliza un parvovirus y su combinacion con una quimioterapia o con un inhibidor de HDAC se han descrito recientemente (en los documentos de solicitudes de patentes internacionales WO 2009/083232 A1, WO 2011/113600 A1).

La protema no estructural principal NS1 es el regulador dominante de la replicacion del ADN vmco, de la expresion de los genes vmcos y de la citotoxicidad. La expresion de NS1 por sf sola, de manera similar a la del virus entero, es suficiente para inducir una interrupcion del ciclo celular, una apoptosis y una lisis celular mediando acumulacion de unas especies reactivas de oxfgeno y el dano causado al ADN (Hristov y colaboradores, 2010). Como resultado de sus actividades oncolfticas, se ha mostrado que el virus posee unas propiedades oncosupresoras, que se han demostrado en cierto numero de modelos con animales, los cuales han establecido la base para el lanzamiento del ensayo clmico contra el GBM (Geletneky y colaboradores, 2012).

Sin embargo, dentro del marco de la terapia de un cancer, tal como se ha observado tambien con otros agentes anticancerosos, existe un cierto riesgo de que algunas celulas cancerosas puedan ser resistentes o que adquieran una resistencia frente a la citotoxicidad del H1PV dando lugar a un recidivo del tumor. Por lo tanto, subsiste una necesidad de encontrar un diseno racional de una terapia combinada, que incluya al H1-PV y a otros agentes

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anticancerosos, que se complementen mutuamente y aumenten sus efectos terapeuticos individuales, sin aumentar unos efectos secundarios indeseados para los tejidos normales.

Por lo tanto, es un objeto del presente invento poner a disposicion unos medios para una terapia mejorada basada en un parvovirus.

De acuerdo con el invento, este objetivo se consigue mediante los objetos definidos en las reivindicaciones.

En el estudio que dio como resultado el presente invento se planteo la cuestion de si los inhibidores de Bcl-2 ABT- 637 o ABT-199 se sinergizan con el H-1PV para matar a las celulas cancerosas. Se puso de manifiesto que unas dosis sub-letales de ABT-737 (y ABT-199) potencian la actividad oncolftica del H-1PV de un modo sinergico en 25 linajes de celulas humanas derivadas de una amplia gama de tumores solidos, tales como los gliomas (n=11), los carcinomas pancreaticos (n=3), los carcinomas cervicales (n=3), y los canceres de pulmon (n=3), cabeza y cuello (n=3), mama (n=1) y colon (n=1), mientras que se conserva el perfil de seguridad del virus para las celulas primarias normales no transformadas. Sorprendentemente, se observaron tambien unos fuertes efectos sinergicos en unos linajes de celulas de cancer que son notoriamente resistentes frente a la citotoxicidad de los parvovirus. De manera remarcable, el tratamiento conjunto con H-1PV/ABT-737 era asimismo eficaz contra unos cultivos de celulas madre que desencadenan tumores, las cuales se derivan de los canceres cerebral y cervical (n=5). En unos linajes de celulas derivados de un glioma, que habfan sido tratados conjuntamente con H-1PV/ABT-737, se pudo demostrar tambien una induccion aumentada de una apoptosis caracterizada por una permeabilizacion de la membrana mitocondrial (MMP, acronimo de "mitochondrial membrane permilization") y una activacion de las caspasas 3 y 7.

Una respuesta modificada a las senales apopticas es un sello distintivo de un cancer (Hanahan & Weinberg, 2011). Una apoptosis tiene lugar a traves de la activacion de dos diferentes rutas, que sin embargo se cruzan: la ruta extrmseca, que es iniciada por unos ligandos pro-apopticos tales como Apo2/TRAIL, que activan a los receptores superficiales de la muerte celular, y la ruta intrmseca, que es activada por unas senales intracelulares de estres, y que dan lugar a una permeabilizacion de la membrana mitocondrial exterior (MMP) seguida por una liberacion de citocromo C desde las mitocondrias al citosol, y finalmente a una activacion de las caspasas. Los miembros de la familia del linfoma 2 de celulas B (BCl-2) desempenan un cometido decisivo en la regulacion de una apoptosis mediante el control de la integridad de la membrana mitocondrial exterior (Youle & Strasser, 2008). Hasta ahora han sido identificados veinticinco miembros de la familia de protemas Bcl-2. Dependiendo de su efecto sobre la ruta apoptotica y del numero de los dominios de homologfa de Bcl-2, ellos se subdividen en las protemas anti-apoptoticas (Bcl-2, BcI-Xl, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-1), las protemas pro-apoptoticas que contienen solo el dominio BH3 (Bim, Bad, Bid, Bik etc.) y las protemas pro-apoptoticas similares a Bax ((Bax, Bak y Bok) (Bajwa y colaboradores, 2012). El equilibrio entre las protemas pro-apoptoticas y las anti-apoptoticas determina el destino de una celula. Si el numero de las protemas pro-apoptoticas no puede ser neutralizado por las protemas anti-apoptoticas, las Bak y Bax se oligomerizan y forman poros de gran conductancia en la membrana de las mitocondrias, dando como resultado la induccion de una apoptosis. Frecuentemente, las protemas anti-apoptoticas Bcl-2 son sobreexpresadas en diversos tipos de cancer, que incluyen el linfoma, los canceres de pulmon e Imgado, un cancer colorrectal y los canceres de ovario, prostata, cerebro y mama (Andersen y colaboradores, 2005), y ellas estan asociadas frecuentemente con el inicio de un tumor, y con la progresion y la resistencia a los medicamentos quimioterapeuticos convencionales (Bajwa y colaboradores, 2012). Por lo tanto, se han diorigido muchos esfuerzos a intentar antagonizar la actividad de estas protemas anti-apoptoticas. Una de estas estrategias es la utilizacion de ciertas moleculas selectivas pequenas tales como los mimeticos de BH3 ABT-737 y ABT-199.

Al igual que las protemas que solo contienen el dominio BH3, los mimeticos de BH3 inhiben a miembros anti- apoptoticos de la familia de Bcl-2 mediando fijacion a su surco hidrofobo (Cragg y colaboradores, 2009). La liberacion de las protemas activadoras, que solo contienen el dominio BH3, induce la activacion de Bax y Bak, y desencadena una apoptosis. El mimetico de BH3 ABT-737 fue descubierto por Oltersdorf y colaboradores. El se fija con una alta afinidad (Ki < 1 nM) a Bcl-2, BcI-Xl y Bcl-w (Oltersdorf y colaboradores, 2005), y desplaza a una protema que solo contiene el dominio BH3, tal como la BIM de Bcl-2 (Del Gaizo Moore y colaboradores, 2007). Se demostro in vitro que el induce una apoptosis como un agente unico en celulas de leucemia y linfoma, en linajes de celulas derivados del mieloma multiple y de un cancer pulmonar de celulas pequenas (Vogler y colaboradores, 2009). El tratamiento con ABT-737 condujo a una regresion completa de un carcinoma pulmonar de celulas pequenas en modelos de ratones con un xenotrasplante (Oltersdorf y colaboradores, 2005). Adicionalmente, se demostro que ABT-737 aumenta sinergicamente la citotoxicidad del medicamento contra un cancer paclitaxel en un carcinoma pulmonar de celulas pequenas (Oltersdorf y colaboradores, 2005) asf como la de vincristina y etoposido en celulas de glioblastoma (Tagscherer y colaboradores, 2008). Las celulas mononucleares no malignas procedentes de sangre periferica (PMBCs, acronimo de "peripheral blood mononuclear cells") no son sensibles frente a ABT-737, puesto que se determino que la concentracion eficaz semimaxima (EC50) era de mas que 1.000 nM (Del Gaizo Moore y colaboradores, 2007). Actualmente, el ABT-263 un derivado de ABT-737, que esta a disposicion por via oral, esta siendo investigado en ensayos clmicos de fase II frente a malignidades linfoides, al linfoma no de Hodgkin, a la leucemia linfoide cronica, el linfoma folicular, el linfoma de celulas del manto y el linfoma de celulas T perifericas (ClinicalTrials.gov). Sin embargo, la preocupacion sobre la trombocitopenia ha limitado la introduccion de ABT-737 y ABT-263 en ensayos clmicos de leucemias agudas, a pesar de su fuerte actividad anticancerosa. Esto se debe muy probablemente a una toxicidad sobre una diana, que resulta de la dependencia de

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las plaquetas con respecto de BCL-Xl (Davids & Letai, 2012). Recientemente, Souers y colaboradores han generado el inhibidor de Bcl-2 ABT-199, que es altamente selectivo, mediante modificacion de ABT-263, un analogo de ABT- 737, que esta estrechamente emparentado y que esta disponible por via oral. El ABT-199 se fija a Bcl-2 selectivamente, con una alta afinidad (Ki < 0,01 nM), pero no a BcI-Xl (Ki = 48 nM) ni a Bcl-w (Ki = 245 nM) (Souers y colaboradores, 2013). En estudios in vivo, se puso de manifiesto que el inhibe el crecimiento de tumores en varios modelos de xenotrasplantes de tumores hematologicos humanos, y en contraste con el ABT-737, el protege a las plaquetas humanas con menos efectos secundarios (Souers y colaboradores, 2013). Recientemente, se ha informado que un tratamiento con un inhibidor de Bcl-2 sensibiliza a unos linajes de celulas derivados de una leucemia linfocftica cronica (CLL) a una oncolisis por el virus de estomatitis vesicular (VSV), y que se puede superar la resistencia a una apoptosis (Samuel y colaboradores., 2010; Samuel y colaboradores, 2013).

Ademas, el documento WO 2009/083232 A1 describe una composicion farmaceutica que contiene (a) un parvovirus y (b) un agente quimioterapeutico, y la utilizacion de tal composicion para el tratamiento de un cancer, p.ej. de un tumor cerebral o pancreatico. Unos agentes quimioterapeuticos preferidos son gemcitabina y temozolodina.

Por otra parte, el documento WO 2011/113600 A1 se orienta a una composicion farmaceutica, que contiene (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de la histona desacetilasa (HDACI), y la utilizacion de esta composicion para el tratamiento de un cancer, p.ej. de tumores cerebrales, de un carcinoma cervical o de un carcinoma pancreatico. Unos HDACI preferidos son butirato de sodio (NaB), tricostatina A (TSA), acido valproico (VPA) o suberoflanilida de acido hidroxamico (SAHA).

Breve descripcion de los dibujos

Figura 1: El ABT-737 aumenta la citotoxicidad inducida por H-1PV contra linajes de celulas de glioma humano de una manera sinergica

Ensayos de LDH. La citotoxicidad de un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 se evaluo en 11 linajes de celulas de glioma (a-k) (el nombre de los linajes de celulas se indica en la parte superior de los diagramas). Se sembraron 4.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con las concentraciones indicadas de H-1PV (MOI: pfu/celula) y/o ABT-737 (ABT). 72 horas despues de la infeccion, la lisis celular se analizo mediante un ensayo de lDh tal como se describe en la seccion de materiales y metodos. Las columnas representan los valores promedios de 3 repeticiones con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 2: El ABT-737 aumenta la citotoxicidad inducida por H-1PV contra linajes de celulas humanas procedentes de de varias entidades tumorales de una manera sinergica

Ensayos de LDH. La citotoxicidad de un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 se evaluo en linajes de celulas de 3 adenocarcinomas ductales pancreaticos (a-c), 3 carcinomas cervicales (d-f), 3 carcinomas pulmonares (g-i), 3 carcinomas de cabeza y cuello de celulas escamosas (j-1), un carcinoma colorrectal de colon (m) y un cancer de mama (n) (los nombres de los linajes de celulas se han indicado en la parte superior de los diagramas). Se sembraron 4.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con H-1PV (MOI: pfu/celula) y/o ABT-737 (ABT) con las concentraciones indicadas. 72 horas despues de la infeccion, la lisis celular se analizo mediante un ensayo de LDH tal como se describe en la seccion de materiales y metodos. Las columnas representan los valores promedios de 3 repeticiones con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 3: El ABT-737 aumenta la citotoxicidad inducida por H-1PV contra celulas madre cancerosas (CSC, acronimo de "cancer stem cells") de una manera sinergica

Ensayos de LDH. El tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 se ensayo contra unas CSCs aisladas a partir de tumores de glioblastoma multiforme (GBM) (a-c) y de linajes de celulas cancerosas derivadas de un paciente con un GBM (U87, d) y un carcinoma cervical (HeLa, e). Se sembraron 10.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con las concentraciones indicadas de H-1PV (MOI: pfu/celula) y/o ABT-737 (ABT). 72 horas despues de la infeccion, la lisis celular se analizo mediante un ensayo de LDH tal como se describe en la seccion de materiales y metodos. Las columnas representan los valores promedios de 3 repeticiones con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 4: Los ABT-737 y H-1PV no son nocivos para celulas primarias normales en las condiciones de tratamiento del presente invento

El perfil de seguridad de un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 se evaluo en astrocitos humanos (a), fibroblastos orales primarios (POF, b), melanocitos (c) y fibroblastos de prepucio humano (HFF, d). Se sembraron 4.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con las concentraciones indicadas de H-1PV (MOI: pfu/celula) y/o 40 pM de ABT-737 (ABT). 96 horas despues de la infeccion, se analizo la lisis celular mediante un ensayo de LDH tal como se describe en la seccion de materiales y metodos. Las columnas representan los valores promedios de 3 repeticiones con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 5: El ABT-737 aumenta una apoptosis inducida por H-1PV de una manera sinergica

La incidencia de la fragmentacion del ADN (poblacion celular sub-G1) en respuesta a un tratamiento se evaluo mediante tincion con yoduro de propidio y citometna de flujo en ocho linajes de celulas de glioma humano (a-h). Se sembraron 2,5x105 celulas/pocillo (o 6,25x104 celulas/pocillo para NCH37 y NCH125) en placas de 6 pocillos, y

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despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con las concentraciones indicadas de H-1PV y/o ABT-737 (ABT). A las 48-96 horas despues de la infeccion, las celulas se tineron y se analizaron tal como se ha descrito en la seccion de materiales y metodos. Los histogramas representativos se muestran en el panel superior. El grafico en el panel inferior muestra los resultados de un experimento tipico realizado por triplicado. Las columnas representan los valores promedios con barras de desviacion tfpica relativa (panel inferior).

Figura 6: Los ABT-737 y H-1PV inducen una permeabilizacion de la membrana mitocondrial (MMP)

El efecto de un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 sobre la MMP (un sello distintivo de una apoptosis) se evaluo mediante tincion con Rojo de Mitotracker y citometna de flujo en cuatro linajes de celulas de gliomas humanos (a-d). Se sembraron 2,5x105 celulas/pocillo (o 6,25x104 celulas/pocillo para NCH125) en placas de 6 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con H-1PV y/o ABT-737 en las concentraciones indicadas. A las 48-96 horas despues de la infeccion, las celulas se tineron con rojo de Mitotracker, se cosecharon y se analizaron mediante citometna de flujo. El porcentaje de celulas con una MMP se determino mediando utilizacion del software CellQuest. En el panel superior se muestran los histogramas representativos para cada condicion. En el panel inferior se muestran los resultados de un experimento tfpico realizado por triplicado. Las columnas representan los valores promedios con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 7: Los ABT-737 y H-1PV inducen una apoptosis a traves de las caspasas 3/7

La induccion de una apoptosis se evaluo mediante un analisis de las caspasas activas 3 y 7 (las formas clivadas, en ingles "cleaved") en ocho linajes de celulas de glioma humano mediante utilizacion del reactivo CellEvent® Caspase- 3/7 Green Detection Reagent (a-h). Se sembraron 4.000 celulas/pocillo en portaobjetos de microscopio de 10 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con H-1PV y/o ABT-737 en las las concentraciones indicadas. 48 horas despues de la infeccion, las celulas se tineron con CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection Reagent y se fijaron. Los nucleos se visualizaron mediante tincion con DAPI. La senal de fluorescencia se detecto mediante microscopfa mediando utilizacion del canal azul y verde con un aumento de 20 x. Se muestran unas imagenes representativas.

Figura 8: El ABT-199 potencia una oncolisis inducida por H-1PV

Ensayo de LDH: La eficacia de ABT-737 y ABT-199 en combinacion con H-1PV se comparo en el linaje de celulas de gliobastoma humano U138. Se sembraron 4.000 celulas/pocillo en placas de 96 pocillos, y despues de 24 horas, estas se trataron o no se trataron con H-1PV y/o ABT-737 y/o ABT-199 en las concentraciones indicadas. 72 horas despues de la infeccion, se midio el porcentaje de las celulas que se sometfan a lisis mediante el ensayo de LDH. Las columnas representan los valores promedios de 3 repeticiones con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 9: Un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 conduce a una regresion completa de los xenotrasplantes de Asp-1

5x106 celulas AsPC-1 se inyectaron por via subcutanea en el costado derecho de 5 ratas hembra desnudas de 5 semanas de edad. Despues de 1 semana (cuando los tumores alcanzaron un volumen de 200-400 mm3), los animales que teman un tumor se distribuyeron al azar en cuatro grupos (n=8). Los grupos fueron tratados o bien con una PBS (testigo), ABT-737 (50 mg/kg, administrado cada dos dfas durante los primeros 14 dfas), H-1PV (en una dosis total de 2,5x108 pfu/animal), fraccionada en 4 administraciones por via intratumoral), o con una combinacion de ambos agentes. El volumen de los tumores se midio con un calibrador digital en los dfas indicados y se calculo de acuerdo con la formula: volumen (cm3) = anchura2 x longitud/2. Las ratas se sacrificaron cuando la masa de los tumores habfa alcanzado 4.000 mm3, en atencion a las reglamentaciones de bienestar de los animales. Los datos mostrados representan los valores promedios con barras de desviacion tfpica relativa.

Figura 10: Estructura de ABT-737

Fig. 11: Estructura de ABT-199

El presente invento pone a disposicion una composicion farmaceutica que contiene (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de Bcl-2. De manera preferida, en esta composicion farmaceutica el parvovirus y el inhibidor de Bcl-2 estan presentes en una dosis eficaz, y estan combinados con un vehfculo farmaceuticamente aceptable. Se entiende que el concepto de "farmaceuticamente aceptable" comprende cualquier vehfculo, que no interfiere con la efectividad de la actividad biologica de los ingredientes activos y que no es toxico para el paciente al que se le administran estos. Ejemplos de unos vehfculos farmaceuticos apropiados son bien conocidos dentro del estado de la tecnica e incluyen unas soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite y agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones esteriles, etc. Tales vehfculos pueden ser formulados mediante metodos convencionales y pueden ser administrados al sujeto en una dosis eficaz.

El concepto de "parvovirus" comprende generalmente el tipo silvestre o unos derivados modificados de este, que son competentes en la replicacion, asf como unos virus relacionados con este o unos vectores basados en tales virus o derivados. Los parvovirus, sus derivados, etc., asf como unas celulas que se pueden utilizar para producir activamente los parvovirus y que son determinables facilmente dentro de experiencia de la tecnica.

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El concepto de "una dosis eficaz" se refiere a unas cantidades de los ingredientes activos que son suficientes para afectar el desarrollo y la gravedad de la enfermedad, dando lugar a la reduccion o remision de tal patolog^a. Una "dosis eficaz" que es util para el tratamiento y/o la prevencion de estas enfermedades o trastornos puede ser determinada mediando utilizacion de unos metodos conocidos para un experto en la especialidad.

Unos adicionales vehmulos farmaceuticamente compatibles pueden incluir unos geles, unos materiales de matriz bioabsorbibles, unos elementos de implantacion que contienen el agente terapeutico, o cualquier otro vehmulo, medio(s) o material(es) de entrega o suministro apropiados.

La administracion de los compuestos se puede efectuar por diversas vfas, p.ej. mediante una administracion por via intravenosa, intraperitoneal, subcutanea, intramuscular, topica, intratumoral o intradermal. La via de la administracion depende, por supuesto, del tipo de la terapia y del tipo de los compuestos que estan contenidos en la composicion farmaceutica. El regimen de dosificacion del parvovirus y del inhibidor de Bcl-2 puede ser determinado facilmente dentro del estado de la tecnica por el medico responsable basandose en los datos de un paciente, en observaciones y otros factores clmicos, que incluyen por ejemplo el tamano del paciente, el area de la superficie corporal, la edad, el sexo, el parvovirus concreto, el inhibidor concreto, etc., que han de ser administrados, el penodo de tiempo y la via de administracion, el tipo del tumor y sus caractensticas, el estado de salud general del paciente, y de otras terapias medicamentosas a las que es sometido el paciente.

Si el parvovirus, en la combinacion con unos inhibidores de Bcl-2 de acuerdo con el invento, comprende unas partfculas vmcas infecciosas que son capaces de penetrar a traves de la barrera hematoencefalica, el tratamiento se puede realizar, o por lo menos se puede iniciar, mediante una inyeccion intravenosa del virus. Sin embargo, una via preferida de administracion es la administracion intratumoral.

Puesto que un tratamiento intravenoso a largo plazo es susceptible de volverse ineficaz como resultado de la formacion de anticuerpos neutralizadores para el virus, se pueden adoptar diversos modos de administracion despues de un regimen inicial de administracion por via intravenosa de los virus, o en el transcurso de todo el tratamiento parvovmco se pueden utilizar alternativamente diferentes tecnicas de administracion tales como p.ej. la administracion intracraneal o intratumoral del virus.

Como otra tecnica espedfica de administracion, el parvovirus (un virus, un vector y/o un agente celular) se pueden administrar al paciente desde una fuente implantada dentro del paciente, Por ejemplo, un cateter, p.ej. uno de silicona o de otro material biocompatible, puede ser conectado con un pequeno reservorio subcutaneo (un reservorio de Rickham), que habfa sido instalado en el paciente durante la extirpacion de un tumor o mediante un procedimiento separado, para permitir que la composicion del parvovirus pueda ser inyectada localmente en diversos momentos sin ninguna intervencion quirurgica adicional. El parvovirus o unos vectores derivados de este puede(n) ser inyectado(s) en el tumor mediante unas tecnicas quirurgicas estereotacticas o mediante unas tecnicas de direccion por neuronavegacion.

La administracion del parvovirus se puede realizar tambien mediante una infusion continua de partmulas vmcas o de unos lfquidos que contienen partfculas vmcas a traves de unos cateteres implantados a bajas velocidades de flujo mediando utilizacion de unos apropiados sistemas de bombeo, p.ej. unas bombas peristalticas de infusion o unas bombas de entrega mejorada por conveccion (CED, acronimo de "convection enhanced delivery").

Todavfa otro metodo para la administracion de la composicion del parvovirus es a partir de un artfculo implantado construido y dispuesto para dispensar el parvovirus al tejido canceroso deseado. Por ejemplo, se pueden emplear unas obleas que han sido impregnadas con el parvovirus, por ejemplo, con el parvovirus H-1, en donde la oblea se fija a los bordes de la cavidad de reseccion despues de haber concluido la extirpacion quirurgica de un tumor. En esta intervencion terapeutica se pueden emplear multiples obleas. Unas celulas que producen activamente el parvovirus, p.ej. el parvovirus H-1, o unos vectores basados en H-1, se pueden inyectar en el tumor o en la cavidad tumoral despues de haber extrafdo el tumor.

La terapia combinada de acuerdo con el invento es provechosa para el tratamiento terapeutico de un cancer, en particular (pero no exclusivamente) de un tumor cerebral, carcinoma pancreatico, carcinoma cervical, cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello, cancer de mama o cancer de colon, y puede mejorar significativamente el pronostico de tales enfermedades. Ella tambien puede permitir la utilizacion clmica de los virus y/o del/de los inhibidor(es) de bcl-2 a unas dosis terapeuticas mas bajas, preservando o incluso aumentando la eficacia contra un cancer con un simultaneo aumento de la seguridad y reduciendo y/o evitando los efectos secundarios. En vista del fuerte efecto sinergico entre el parvovirus y el inhibidor de Bcl-2 es posible prever la reduccion de las dosis terapeuticas, por ejemplo, a la mitad o un tercio de las dosis anteriormente utilizadas de los componentes individuales conservan el efecto terapeutico deseado. En vista de las dosis reducidas se pueden reducir o incluso evitar los (graves) efectos secundarios.

Una infeccion con un parvovirus tiene por efecto la aniquilacion de las celulas tumorales pero no dana a las celulas normales, y tal infeccion se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante una utilizacion intracerebral de un parvovirus apropiado, por ejemplo, del parvovirus H-1, o de un virus relacionado con este o de unos vectores basados en tales

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virus, para efectuar una terapia espedfica para tumores sin efectos neurologicos desfavorables ni otros efectos secundarios.

El presente invento se refiere tambien a la utilizacion de (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de Bcl-2 para la preparacion de una(s) composicion (composiciones) farmaceutica(s) para el tratamiento de un cancer.

El modo de la administracion de (a) y (b) puede ser simultaneo o secuencial, realizandose que, de manera preferida, (a) y (b) se administran secuencialmente (o por separado). Esto significa que (a) y (b) pueden ser puestos a disposicion en una forma de dosificacion de una sola unidad para poder ser ingeridos conjuntamente o como unas entidades separadas (p.ej. en unos recipientes separados) para ser administrados simultaneamente o en diferentes momentos. Esta diferencia cronologica puede ser de entre 1 hora y 1 semana, de manera preferida de entre 12 horas y 3 dfas. Por anadidura, es posible administrar el parvovirus por otra via de administracion distinta de la del inhibidor de Bcl-2. En este contexto, puede ser ventajoso administrar o bien el parvovirus o el inhibidor de Bcl-2 por via intratumoral, y el otro por via sistemica u oral. En una forma de realizacion particularmente preferida, el parvovirus se administra por via intratumoral y el inhibidor de Bcl-2 por via intravenosa u oral.

En una forma de realizacion preferida del presente invento, la combinacion de los agentes se utiliza para el tratamiento de tumores solidos. Ejemplos de ellos son un tumor cerebral, un carcinoma pancreatico, un carcinoma cervical, un cancer de pulmon, un cancer de cabeza y cuello, un cancer de mama y un cancer de colon. En una forma de realizacion preferida, estos tumores son resistentes a la toxicidad del parvovirus. Una ventaja especial de la composicion farmaceutica del presente invento consiste en que incluso unas celulas madre iniciadoras de cancer pueden ser tratadas con exito.

De acuerdo con el presente invento, el parvovirus de la composicion incluye el parvovirus H-1 (H-1PV) o un parvovirus relacionado con este, seleccionado entre LuIII, el virus diminuto de raton (MMV, acronimo de "mouse minute virus"), el parvovirus de raton (MPV, acronimo de "mouse parvovirus"), el virus diminuto de rata (RMV, acronimo de "rat minute virus"), el parvovirus de rata (RPV, acronimo de "rat parvovirus") o el virus de rata (RV, acronimo de "rat virus).

Los pacientes que pueden ser tratados con la combinacion de agentes de acuerdo con el invento incluyen seres humanos asf como tambien animales no humanos. Ejemplos de los citados en ultimo lugar incluyen, sin estar limitados a ellos, unas animales tales como vacas, ovejas, cerdos, caballos, perros y gatos.

Unos inhibidores de Bcl-2 que son utiles para los propositos del presente invento incluyen a todos los compuestos que (a) aumentan el potencial anticancengeno de los parvovirus, de manera preferida sin provocar efectos secundarios para celulas normales, y (b) inhiben a las protemas anti-apoptoticas tales como Bcl-2, BcI-Xl, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-1 pBcl-2 y/ unos compuestos mimeticos de las protemas pro-apoptoticas que solo contienen el dominio BH3 (bim, Bad, Bid, Bik, etc.) o las protemas pro-apoptoticas similares a Bax (Bax, Bak, Bok). La administracion de un inhibidor de Bcl-2 se puede llevar a cabo de diversas maneras (vease mas arriba), incluyendo la sistemica, por las vfas parenteral y enteral. De manera preferida, el parvovirus y el inhibidor de Bcl-2 se administran como unos compuestos separados. Por lo tanto, es posible realizar el tratamiento concomitante con los dos agentes.

Ejemplos de unos inhibidores de Bcl-2 que son apropiados para la terapia combinada incluyen a ABT-263, mesilato de obatoclax (GX15070), TW-37, HA14-1, apogosipolona (ApoG2), BAM7, sabutoclax, AT101 y BM-1074. Se prefiere en particular la utilizacion de un inhibidor mimetico ce BH3 de molecula pequena, de manera preferida ABT- 737 (obtenible de Selleck Chemicals LLC, Houston, TX; Fig. 10) y ABT-199 (obtenible de Active Biochemicals, Maplewood, NJ; Fig. 11).

Los siguientes Ejemplos explican el invento mas detalladamente.

Ejemplo 1

Materiales y metodos

(A) Linajes de celulas y cultivo

Los linajes de celulas derivados de glioblastomas humanos U373, U251, T98G, A172 y U87 fueron donados amablemente por la Dr. Iris Augustin (DKFZ, Heidelberg, Alemania). LosU138 y U343 fueron puestos a disposicion por el Tumorbank (DKFZ, Heidelberg, Alemania). Los linajes de celulas derivados de gliobastomas NCH89, NCH82, NCH125 y el linaje de celulas derivado de glicosarcoma NCH37 fueron producidos y caracterizados en el Departament of Neurosurgery (Departamento de Neurocirurgia) (Heidelberg, Alemania). Los linajes de celulas de carcinoma cervical (CC) HeLA y SiHa fueron puestos a disposicion amablemente por el catedratico Dr. Angel Alonso (DKFZ, Heidelberg, Alemania). El linaje de celulas derivado de CC CaSki y los linajes de celulas derivados de adenocarcinoma ductal pancreatico (PDAC, acronimo de "pancreactic ductal adenocarcinoma") MIA PaCa-2, T3M-4 y AsPC-1 fueron adquiridos de la ATCC (LGC Standards GmBH, Wesel, Alemania). Los linajes de celulas de carcinoma de cabeza y cuello de celulas esponjosas (HNSCC, acronimo de "head and neck squamous cell

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carcinoma") HNC97, Cal27, 211MC y los fibroblastos orales primarios humanos (POF, acronimo de "primary oral fibroplast"), y los fibroblastos de prepucio humano (HFF, acronimo de "human foreskin fibroblasts) fueron donados amablemente por el Dr. Massimo Tommasino (IARC, Lyon, Francia). Los linajes de celulas de cancer de pulmon (LC, acronimo de "lung cancer") EKVX, Hop92, H322M, el linaje de celulas de carcinoma colorrectal de colon HCT- 116 y el linaje de celulas de cancer de mama Hs578T fueron aquiridos del National Cancer Institute (NCI) (Bethesda, MD). Los linajes de celulas derivados de gliomas LN229, LN308 y los linajes de celulas iniciadoras de gliomas (GIC, acronimo de "glioma-initiating cell") T269, S24 y T325 fueron puestos a disposicion amablemente por el catedratico W. Wick (Department of Neurooncology, University of Heidelberg, Alemania).

Las celulas U-87 similares a celulas madres fueron aisladas del linaje de celulas U87 tal como lo han descrito Yu y colaboradores, 2008). Unos esferoides fueron generados a partir del linaje de celulas HeLa de acuerdo con el metodo descrito por Chen y colaboradores (Chen y colaboradores, 2011). Unos melanocitos humanos fueron adquiridos de Invitrogen (Carlsbad, CA) y unos astrocitos lo fueron de ScienCell Research Laboratories (San Diego, CA).

Los linajes de celulas derivados de gliomas fueron cultivados en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM acronimo de "Dulbecco Eagle's modified medium") con una alta concentracion de glucosa (Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Alemania). Los linajes de celulas HeLa, CaSki, SiHa, AsPC-1, HNC-97, 211MC, Cal27 y HFF fueron cultivados en un DMEM (SIGMA-Aldrich, Munich, Alemania). Los T3M-4, MIA PaCa-2, H322M, HOP-92, EKVX, HCT-116 y Hs578T fueron cultivados en el medio del Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI, Invitrogen, Karlsruhe, Alemania). Todos los medios fueron suplementados con 10 % de suero bovino fetal desactivado termicamente (FBS, PAA, Colbe, Alemania) y L-glutamina 2 mM (Gibco). Exceptuando las celulas de gliomas, los medios conternan adicionalmente 100 U/ml de penicilina (Gibco) y 100 pg/ml de estreptomicina (Gibco) y 20 ng/ml del factor de crecimiento de fibroblastos humanos (FGF-2, acronimo de "fibroblast growth factor") y 20 ng/ml del factor de crecimiento epidermico (EGF, acronimo de "epidermal growth factor) (Biochrom AG, Berlin, Alemania). Celulas HELA esferoides fueron cultivadas en un medio Quantum 263 exento de suero (Biochrom AG), suplementado con 10 ng/ml de FGF-2 y 10 ng/ml de EGF. Los melanocitos se cultivaron en el medio 254 con el suplemento de crecimiento de melanocitos humanos (HMGS, acronimo de "Human Melanocyte Growth Supplement") (Invitrogen, Darmstadt, Germany). Los astrocitos se cultivaron en el medio para astrocitos (Gibco). Los POF se cultivaron en un DMEM sin L-glutamina ni rojo de fenol. Todas las celulas se cultivaron a 37°C, con 5 % de CO2, una humedad de 95 %, y se controlaron rutinariamente en cuanto a una contaminacion con micoplasmas.

(B) Produccion de virus

El H-1PV de tipo silvestre fue producido en celulas NB324K por Barbara Leuchs y fue purificado en gradientes de iodixanol tal como se ha descrito previamente (Wrzesinski y colaboradores, 2003). Los tttulos de virus se determinaron mediante ensayos con calvas (Daeffler y colaboradores, 2003). El H-1PV fue tratado con UV con una dosis total de 50 ml/cm2 tal como ha sido descrito por Morita y colaboradores (Morita y colaboradores, 2003).

(C) Ensayo de la lactato deshidrogenasa (LDH)

La citotoxicidad de un H-1PV se evaluo mediante cuantificacion de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), la cual es liberada a partir de las celulas debido a la perdida de la integridad de la membrana (lisis). El ensayo se realizo mediando utilizacion del estuche CytoTox 96® Non-Radioactive Cytotoxicity Assay Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Heidelberg, Alemania).

Las celulas se sembraron en placas de 96 pocillos usualmente con una densidad de 4.000 celulas/pocillo en 50 pl de su respectivo medio de cultivo suplementado con 10 % de FBS. Tomando en cuenta las diferentes velocidades de crecimiento de algunos linajes de celulas, se sembraron 2.000 celulas para las celulas T3M-4 y HeLA y 10.000 celulas para los cultivos de celulas madre cancerosas. Despues de 24 horas, se anadieron a las celulas 50 pl de un medio exento de FBS con o sin H-1PV y/o ABT-737 (Selleck Chemicals LLC, Houston, TX) en las concentraciones indicadas en la Tabla 1.

Tabla 1: Linajes de celulas

Origen del tumor

Linajes de celulas H-1PV (MOI) ABT-737 (pM)

Cerebro Glioblastoma

U373 25, 50, 75, 100 2,5

LN308 1, 2,5, 10, 25 0,1

U251 5, 10, 25, 50 2,5

T98G 1, 5, 10, 25 1

U138 1, 2,5, 5, 10 0,5

U343 1, 2,5, 5, 10 2,5

A172 2,5, 5, 10, 20 1,25

LN229 1, 2,5, 10, 25 0,1

U87 1, 2,5, 5, 10 5

NCH125 1, 2,5, 5, 10 1

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Origen del tumor

Linajes de celulas H-1PV (MOI) ABT-737 (pM)

Gliosarcoma

NCH37 1, 2,5, 5, 10 1

Celulas madre iniciadoras

T269 1, 2,5, 5, 10 0,1

de glioma

S24 1, 5, 10, 25 0,1

T325 1, 2,5, 5, 10 0,1

U87 (madre) 1, 2,5, 5, 10 1

Pancreas

MIA PaCa-2 0,5, 1, 5, 10 2,5

T3M-4 5, 10, 25, 50 0,625

AsPC-I 25, 50, 100, 200 0,625

Cervix

HeLa 0,1, 0,5, 0,75, 1

CaSki 1 1, 2,5, 5, 10 0,3125

Celulas similares a celulas

SiHa 1, 2,5, 5, 10 0,625

madre

HeLa (madre) 0,005, 0,01, 0,05, 0,1 1

Pulmon

H322M 1, 5, 10, 20 0,5

HOP92 1, 2,5, 5, 7,5 0,5

EKVX 1, 2,5, 5, 7,5 0,5

Cabeza y cuello

HNC97 1, 2,5, 5, 10 1,25

211MC 5, 10, 20, 40 1,25

Cal27 10, 25, 50, 100 2,5

Colon

HCT-116 5, 10, 25, 50 2,5

Mama

Hs578T 0,5, 1, 2,5, 5 0,1

Melanocitos, astrocitos, HFF y POF fueron infectados con H-1PV con la alta multiplicidad de infeccion (MOI, unidad formadora de placas (pfu) por celula) de 50 a 100 pfu/cell en presencia o ausencia de 40 pM de ABT-737. El ensayo de LDH se llevo a cabo tal como se ha expuesto mas arriba con la excepcion de un prolongado penodo de tiempo de incubacion de 96 horas en lugar de 72 horas despues de la infeccion.

Para una comparacion directa de la eficacia de ABT-737 y ABT-199, el linaje de celulas de glioblastoma U138 fue infectado con H-1PV con una MOI de 5 a 10 pfu/celula y fue tratado o no con 0,5 pM de ABT-737 o ABT-199 (Active Biochemicals, Maplewood, NJ).

Para cada condicion ensayada se prepararon 7 replicas, 3 de las cuales se utilizaron para calcular la lisis celular total en presencia de un detergente. Una lmea de la placa se dejo sin celulas para realizar el calculo del fondo. Despues de 72 horas a 37°C, las celulas se procesaron para el ensayo de LDH tal como se ha descrito precedentemente (El- Andaloussi y colaboradores, 2012).

En resumen, por cada pocillo se anadieron 10 pl de un tampon de lisis 10x [9% (v/v) de Triton X-100 (AppliChem, Darmstadt, Alemania) en una solucion salina tamponada con fosfato (PBS, acronimo de "phosphate buffered saline")] en tres lmeas de la placa, que sirvio como un testigo de 100 % de lisis celular. A las otras lmeas se les anadieron 10 pl de PBS. Cuando la lisis celular se hubo completado, se transfirieron 30 pl del material sobrenadante de cada pocillo a una placa fresca de 96 pocillos. A cada pocillo se anadieron 30 pl de la mezcla de substratos puesta a disposicion por el estuche. La placa se protegio frente a la luz y se incubo a la temperatura ambiente durante 30 min antes de que la reaccion fuese interrumpida mediando adicion de 30 pl de la solucion de interrupcion puesta a disposicion por el estuche. Se midio la absorbancia a una longitud de onda de 492 nm mediando utilizacion del Multiscan ELISA Reader. La cantidad de color que se forma por la conversion de la sal de tetrazolio en un producto de formazano de color rojo es proporcional al numero de las celulas lisadas. Para cada condicion nosotros calculamos el promedio de los tres pocillos incubados (A) o no incubados (B) con un tampon de lisis. El valor promedio medido en los pocillos sin celulas (fondo) se resto de los valores obtenidos en los pocillos con las celulas. El porcentaje de lisis total se calculo mediando utilizacion la siguiente formula:

Lisis celular [%] = (A - fondo) / (B - fondo) x 100

(D) Determinacion de la poblacion apoptotica sub-G1 mediante citometria de flujo

Se llevo a cabo una tincion con yoduro de propidio con el fin de detectar celulas apoptoticas despues de un tratamiento. El colorante se intercala en el ADN, en donde puede ser medido mediante una citometna de flujo. La emision de fluorescencia es proporcional al contenido de ADN en las celulas. Las celulas apoptoticas son caracterizadas mediante una fragmentacion del ADN nuclear y pueden ser identificadas mediante una menor emision de fluorescencia (la poblacion de celulas apoptoticas sub-G1) (Riccardi & Nicoletti, 2006).

Se sembraron celulas de glioma (U373, U251, U138, U343, A172, NCH37, U87, NCH125) en placas de 6 pocillos con la densidad de 2,5x 105 celulas/pocillo en 3 ml de un medio de cultivo con la excepcion de las celulas NCH37 y NH125 que fueron sembradas con una densidad de 6,25 x 104 celulas/pocillo. 24 horas despues de la siembra, las

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celulas fueron infectadas o no con H-1PV con una MOI de 0,5 - 7,5 pfu/celula y/o fueron tratadas con 0,25 - 5 pM de ABT-737. Los H-1PV y ABT-737 fueron diluidos en un DMEM con 10% de FbS, y se anadio un volumen final de 200 pl a los pocillos. Todas las condiciones se ensayaron por triplicado.

Despues de 48 (U251, U138, A172, U87, NCH125), 72 (U373) o 96 (U343, NCH37) horas desde la infeccion, los materiales sobrenadantes y las celulas (cosechadas mediante tripsinizacion) se recogieron y lavaron con una PBS. Despues de haber centrifugado, el sedimento de celulas se resuspendio en 500 pl de una PBS y las celulas se fijaron con 4,5 ml de etanol al 70 % enfriado con hielo, que se anadio gota a gota. Las celulas se almacenaron entonces a -20°C durante 24 h. Antes de la tincion, las celulas se centrifugaron y se lavaron una vez con una PBS. Luego, las celulas se resuspendieron en 1 ml de una solucion de tincion del ADN, que contema 20 pg/ml de yoduro de propidio (Sigma-Aldrich) y 200 pg/ml de ARNasa (Promega) y se incubaron durante 30 minutos a la temperatura ambiente en la oscuridad. La suspension de celulas se filtro en una red de nilon, y se midio en un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA). Se incluyeron un mmimo de 20.000 sucesos y se analizaron con el programa logico CellQuest Software (BD Biosciences). El yoduro de propidio se detecto en el canal FL-2. Las celulas no tratadas se utilizaron para establecer el umbral para la fraccion de celulas apoptoticas, puesto que ellas muestran la emision de fluorescencia de las celulas no apoptoticas viables. El porcentaje de la poblacion de sub-G1 se determino en cada muestra y se calculo el valor promedio a partir de los triplicados.

(E) Evaluacion de la permeabilizacion de la membrana mitocondrial (MMP)

El colorante fluorescente MitoTracker® Red CMXRos (Molecular Probes, Invitrogen, Darmstadt, Alemania), que tine a las mitocondrias en las celulas vivientes se utilizo para medir el cambio en la MMP. Debido a la formacion de poros en la membrana mitocondrial, las celulas apoptoticas no pueden retener el colorante y muestran una mas baja senal de fluorescencia en el analisis por citometna de flujo.

Unas celulas de glioma se sembraron en placas de 6 pocillos en una densidad de 2,5 x 105 celulas/pocillo en 3 ml de un medio de cultivo con la excepcion de las celulas NCH125, que se sembraron en una densidad de 6,25 x 104 celulas/pocillo. Despues de 24 horas, las celulas fueron infectadas o no con H-1PV con una MOI de 2,5 pfu/celula (U343 y NCH125) o de 5 pfu/celula (U373) o de 7,5 pfu/celula (U138) y fueron tratadas o no con ABT-737 en una concentracion de 0,5 pM (U373, U138, U343) o 1 pM (NCH125), o fueron tratadas concomitantemente con ambos agentes. Despues de 48 (U138, NCH125) o 72 (U373) o 96 (U343) horas de incubacion, se reemplazo el medio con 1 ml de una solucion para tincion de las mitocondrias que contiene el colorante MitoTracker® Red CMXRos (200nM) en DMEM sin suplementos. Despues de haber tenido durante 1 hora a 37°C, se cosecharon las celulas por tripsinizacion, se lavaron una vez con una PBS y finalmente se resuspendieron en una PBS. La suspension de celulas se analizo con un FACSCalibur (BD Biosciences). Se incluyeron un mmimo de 10.000 sucesos y se analizaron con el programa logico CellQuest Software (BD Biosciences). El porcentaje de las celulas que se se sometieron a una MMP se calculo a partir de tres replicas.

(F) Deteccion de las formas activadas de las caspasas clivadas 3/7

El clivaje de las caspasas-3/7 (un sello distintivo de una apoptosis) despues de un tratamiento con H-1PV y ABT-737 fue analizado mediando utilizacion del reactivo CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection Reagent (Invitrogen, Darmstadt, Alemania). La activacion de la caspasa 3 o 7 en las celulas apoptoticas conduce a un clivaje de una secuencia peptfdica del reactivo, que libera un colorante que se fija a los acidos nucleicos. Cuando el colorante se fija al ADN, este hecho da lugar a una senal de fluorescencia verde que puede ser detectada por microscopfa de fluorescencia.

Las celulas fueron sembradas en una densidad de 4.000 celulas/pocillo en portaobjetos para microscopio de 10 pocillos. Despues de 24 horas, las celulas fueron infectadas con H-1PV con una MOI de 1 pfu/celula (NCH37 y NCH125) o de 5 pfu/celula (U373, U251, U138, A172, U87) o de 10 pfu/celula (U343), en presencia o ausencia de 0,25 pM de ABT-737 (U373) o 1 pM (NCH37, NCH125) o 1,25 pM (A172) o 2,5 pM (U251, U138, U343, U87). Las celulas no tratadas fueron utilizadas como un testigo. Despues de 24 horas, las celulas fueron tenidas con 10 pM del reactivo CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection Reagent durante 30 min. Las celulas fueron lavadas entonces con una PBS y fueron fijadas con paraformaldetndo al 4 % (PFA). Una solucion de DAPI comercial para la tincion de nucleos ((Vector Laboratories, Lorrach, Alemania) fue anadida a las celulas. Despues de haber lavado con una PBS, las celulas fueron montadas con un cubreobjetos y analizadas mediante un microscopio de fluorescencia (Keyence, Neu-Isenburg, Alemania) mediando utilizacion de los canales azul y verde a un aumento de 20 x.

Ejemplo 2

El ABT-737 potencia la actividad oncolitica de H-1PV de una manera sinergica

Es conocido el hecho de que el H-1PV puede infectar a unos linajes de celulas cancerosas humanas de diferentes tejidos y que desarrolla unas actividades citotoxicas. Sin embargo, no todos los linajes de celulas responden en el mismo nivel a la citotoxicidad del virus, siendo algunos linajes de celulas muy sensibles al virus mientras que otros son casi resistentes (El-Andaloussi y colaboradores, 2012). Por lo tanto, sena extremadamente importante encontrar otros agentes anticancerosos que pudiesen cooperar con el H-1PV en la aniquilacion de las celulas cancerosas con

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una simultanea conservacion del excelente perfil de seguridad del virus. Puesto que la celula cancerosa manifiesta frecuentemente ciertos defectos en las rutas de muerte de la celula, p.ej. una sobreexpresion de los miembros anti- apoptoticos de la familia de Bcl-2 tales como Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-w y Mcl-1, nosotros planteamos la hipotesis de que estos defectos pueden contribuir a una resistencia frente a la citotoxicidad de H-1PV, y examinamos si la utilizacion del inhibidor de Bcl-2 ABT-737 en combinacion con H-1PV puede restaurar la muerte apoptotica de la celula en las celulas cancerosas y si dan como resultado unos efectos terapeuticos mejorados.

Primero, se evaluo un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 contra unos gliomas humanos. A este efecto se utilizo un conjunto de once linajes de celulas cancerosas humanas, diez de ellas aisladas de pacientes con un GBM (U373, LN308, U251, T98G, U138, U343, A172, LN229, U87, NCH125), y una de ellas aislada de un paciente con gliosarcoma (NCH37). Las celulas se cultivaron en placas de 96 pocillos y se analizo la lisis de las celulas inducida por H-1PV en presencia o ausencia de ABT-737 mediante unos ensayos de LDH (acerca de las condiciones experimentales veanse la Tabla 1 y el Ejemplo 1). En todos los linajes de celulas ensayados se observo una aniquilacion de las celulas dependiente de la dosis del virus. Sin embargo, los linajes de celulas variaron en cuanto a su susceptibilidad frente a la infeccion vmca, realizandose que ciertos linajes de celulas tales como U373, LN308, U251, T98G y U138 eran altamente resistentes frente a la citotoxicidad del virus y manifestaban unos menores efectos citotoxicos, incluso cuando eran infectados con una alta multiplicidad de infeccion vmca (MOI, pfu/celula) (con una aniquilacion de celulas < 25 % cuando fueron infectadas con H-1PV con una MOI = 10) (Fig. 1a-e) y otros, tales como U343, A172 y LN229, mostraron un fenotipo intermedio (con un 25-50 % de aniquilacion de celulas) (Fig. 1 f-h) y otros, tales como NCH37, U87 y NCH125 fueron sensibles frente a la citotoxicidad del virus (mas de un 50 % de aniquilacion de celulas (Fig. 1 i-k). El ABT-737 a solas en las dosificaciones utilizadas no tema aparentemente ninguna citotoxicidad para las celulas, exceptuando a las de glioma U87, en cuyo caso se observaron unos modestos efectos citotoxicos (Fig. 1). Es digno de mencion el hecho de que estas cantidades de ABT-737 eran suficientes para aumentar una oncolisis por H1-PV en todos los linajes de celulas ensayados de una manera sinergica estadfsticamente significativa, aumentando en muchos casos la citotoxicidad vmca en mas de un 100-200 %. Es importante que incluso unos linajes de celulas menos sensibles tales como U343 (con un aumento de 4,7 veces en la aniquilacion de celulas inducida por H-1PV cuando las celulas eran infectadas con H-1PV con una MOI = 10 en presencia de ABT-737), U138 (con un aumento de 3,5 veces) y LN308 (con un aumento de 3,2 veces) se volvieron susceptibles a los efectos citotoxicos de los virus y fueron aniquiladas eficientemente en presencia de ABT-737 (Fig. 1).

Segundo, se investigo si el tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-737 era tambien eficiente para aniquilar a las celulas cancerosas de otras entidades tumorales. Para los ensayos de LDH se escogieron los siguientes 14 linajes de celulas cancerosas humanas: MIA PaCa-2, T3M-4 y AsPC-1 de adenocarcinoma pancreatico ductal (PDAC), HeLa, CaSki y SiHa de carcinoma cervical (CC), H322M, HOP92 y EKVX de carcinoma de pulmon (LC), y HNC97, 211MC y Cal27 de carcinoma de celulas esponjosas de cabeza y cuello (HNSCC), HCT-116 de carcinoma de colon y Hs5787 de cancer de mama. De acuerdo con los resultados obtenidos con los linajes de celulas de glioma, el H-1PV estimulado por ABT- 737 inducfa una oncolisis de una manera sinergica en todos los linajes ensayados de celulas cancerosas, independientemente de su origen (Fig. 2).

Las celulas madre cancerosas (CSC) son muy probablemente responsables del mantenimiento del tumor, de su agresividad y recurrencia. Por lo tanto, en una tercera etapa se evaluo la capacidad de un tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-73 para lisar unas CSC aisladas a partir de tumores frescos (GBM T269, S24 y T325) y de linajes de celulas cancerosas derivadas de un paciente con un GBM (U87) y un CC (HeLa). Los CSCs se propagaron como unas esferas de tumores antes de que se infectasen con H-1PV en combinacion o no con ABT-737. El H-1PV era capaz de infectar eficientemente a los diferentes cultivos de CSC (datos no mostrados). Por lo tanto, en este caso, el ABT-737 aumentaba la citotoxicidad de H-1PV (Fig. 3).

Finalmente, se ensayo si el tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-73 era seguro para las celulas primarias humanas normales. Unos fibroblastos primarios normales (orales y del prepucio), melanocitos y astrocitos fueron infectados con H1-PV en combinacion o no con ABT-737, y luego fueron sometidos a unos ensayos de MTT (supervivencia celular) (datos no mostrados) y de LDH (lisis celular). Incluso si el virus y ABT-737 fueron utilizados en altas concentraciones (MOI 100 y 40 pM, respectivamente) y durante un penodo de tiempo mas largo (96 en lugar de 72 horas) no se observo la citotoxicidad masiva, que se habfa observado contra las celulas cancerosas. Estos resultados proporcionan una importante evidencia de que estos dos agentes combinados no son daninos para las celulas primarias normales (Fig. 4).

En conclusion, estos resultados muestran por primera vez que la utilizacion combinada de H-1PV y del inhibidor de Bcl-2 ABT-737 puede ser un enfoque valido contra un cancer.

Ejemplo 3

El tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-73 induce una apoptosis a traves de una permeabilizacion de la membrana mitocondrial y una activacion de las caspasas

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El ABT-737 bloquea la actividad de las moleculas Bcl-2 anti-apoptoticas restableciendo una apoptosis en las celulas cancerosas (Cragg y colaboradores, 2009). No obstante, para ejercer unos efectos citopaticos, el medicamento tiene que ser utilizado en unas concentraciones mas altas que las que se utilizaron en anteriores experimented (Tagscherer y colaboradores, 2008). Por otra parte, se sabe que el H-1PV puede inducir multiples programas de muerte celular que van desde una apoptosis hasta una necrosis por muerte celular mediada por catepsina (Nuesch y colaboradores, 2012). La capacidad del H-1PV para inducir una apoptosis en presencia o ausencia de ABT-737 se comprobo en una seleccion de ocho linajes de celulas de glioma (U373, U25l, U138, U343, A172, NCH37, U87, NCH125), mediante la evaluacion de la presencia de fragmentacion del ADN mediante un analisis por citometna de flujo (deteccion de la poblacion celular sub-G1). Unas celulas no tratadas o tratadas con ABT-737, infectadas o no con H-1PV fueron cosechadas y tenidas con yoduro de propidio. En las concentraciones utilizadas en los experimentos, los tratamientos individuales con ABT-737 y H-1PV no fueron capaces de inducir eficazmente una apoptosis. Por el contrario, cuando los dos agentes fueron utilizados en combinacion, estos eran muy eficaces para desencadenar una apoptosis tal como se deduce del fuerte aumento de la poblacion de sub-G1 observado en todos los linajes de celulas analizados (un aumento de 4,7 veces en U251, 3,8 veces en U343, 3,4 veces en U373 y NCH125, 2,8 veces en U87, 2,1 veces en U138, 1,9 veces en A172 y 1,8 veces en NCH37, cuando se comparo el tratamiento individual con H-1PV con la combinacion de H-1PV/ABT-737 (Fig. 5).

Las mitocondrias desempenan un cometido decisivo en la ruta apoptotica intnnseca y la permeabilizacion de la membrana mitocondrial (MMP) es un sello distintivo de una apoptosis. La MMP es controlada principalmente por los miembros de la familia de Bcl-2. Se planteo la cuestion acerca de si o bien una apoptosis inducida por H-1PV/ABT- 737 abarca la activacion de la ruta apoptotica mitocondrial. Los linajes de celulas U373, U138, U343 y NCH125 fueron infectados o no con H-1PV en presencia y ausencia de ABT-737. Despues de 48-96 horas, las celulas se tineron con rojo MitoTracker y ellas se analizaron por citometna de flujo en cuanto a una MMP (Fig. 6). Mientras el tratamiento individual con aBT-737 no tema casi ningun efecto sobre la MMP, y la infeccion con H-1PV a solas estaba asociada solo con una ligera MMP, el tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-73 aumento espectacularmente la MMP (con un aumento de 2 veces en U373, 2,1 veces en U138, 3,6 veces en U343 y 3,4 veces en NCH125 cuando se comparaba el tratamiento individual con H-1PV con la combinacion de H-1PV/ ABT-737), lo que indica la participacion de las mitocondrias en una apoptosis inducida por el tratamiento concomitante.

Luego se investigo el cometido de las caspasas 3 y 7 en una apoptosis inducida por H-1PV/ABT-737. Unas celulas de glioma, que habfan sido previamente analizadas por analisis de FACS en cuanto a la presencia de la poblacion celular apoptotica sub-G1, se tineron con el reactivo CellEvent® Caspase-3/7 Green Detection Reagent, el cual detecta las formas activas de las caspasas efectoras 3 y 7. De acuerdo con los resultados previos, se observo un fuerte aumento de una apoptosis en todos los ocho linajes de celulas de glioma tratados concomitantemente con H- 1PV/ABT-737 (Fig. 7).

Ejemplo 4

El ABT-199 aumenta la actividad oncolftica de H-1PV, si bien menos eficazmente que el ABT-737

El ABT-199 es un inhibidor mas espedfico y potente que el ABT-737 frente al Bcl-2, pero en contraste con el ABT- 737, no es capaz de actuar sobre la BcI-Xl ni la Bcl-w (Souers y colaboradores, 2013). En este experimento, se investigo si el ABT-199 es tambien capaz de aumentar la actividad oncolftica del H-1PV. El experimento con LDH se llevo a cabo mediando utilizacion del linaje de celulas de glioblastoma humano U138. Las celulas fueron infectadas o no con el H-1PV y se cultivaron en presencia o ausencia del ABT-737 o ABT-199. Tal como se ha encontrado precedentemente, el ABT-737 aumentaba la citotoxicidad del H-1PV de una manera sinergica con un aumento de 3,8 veces en comparacion con el tratamiento con el virus a solas (con una MOI de 5). El ABT-199 era tambien capaz de aumentar la actividad citotoxica del virus si bien en una extension menor que el ABT-737 (con un aumento de 1,7 veces) (Fig. 8). La diferencia en la potenciacion de la citotoxicidad de H-1PV puede deberse al hecho de que las celulas U138, adicionalmente a la Bcl-2, expresan tambien unos altos niveles de las protemas anti-apoptoticas Bcl- Xl y Bcl-w, que son tambien dianas del ABT-737 pero no del ABT-199. No obstante, la utilizacion del ABT-199 en combinacion con el virus puede ser considerada como valiosa a la vista del superior perfil de seguridad, especialmente en unos canceres que expresan bajos niveles de BcI-Xl y Bcl-w.

Ejemplo 5

El tratamiento concomitante con H-1PV/ABT-73 erradica tumores establecidos

Con el fin de validar el sinergismo de H-1PV/ABT-737 in vivo, los autores del invento utilizaron el modelo de rata desnuda con el xenotrasplante AsPC-1 de carcinoma de pancreas humano [Li y colaboradores, 2013]. H-1PV y ABT- 737 a solas, en las dosis utilizadas, no pudieron tener ningun efecto terapeutico significativo (las ratas fueron sacrificadas cuando los tumores alcanzaron un tamano maximo tolerable de 4.000 mm3). En contraposicion a esto, el tratamiento combinado dio lugar a un fuerte efecto sinergico que condujo a una completa y duradera remision del

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tumor en todos los animales tratados concomitantemente (Fig. 9). En ninguno de los animales tratados se documentaron una perdida de peso ni otros efectos secundarios adversos.

En conclusion, los resultados de los ejemplos anteriores muestran por primera vez que la utilizacion combinada de un parvovirus (p.ej. H-1PV) y de un inhibidor de Bcl-2 (p.ej. ABT-737) puede constituir un enfoque valido contra un cancer, en particular en los gliomas y los carcinomas pancreaticos.

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   REIVINDICACIONES

   1. Una composicion farmaceutica, que contiene (a) un parvovirus y (b) un inhibidor de Bcl-2, en la que el parvovirus es H-1 (H-1PV) o un parvovirus emparentado de roedor, que se escoge entre LUIII, el virus diminuto de raton (MMV), el parvovirus de raton (MPV), el virus diminuto de rata (rMv), el parvovirus de rata (RPV) o el virus de rata (RV).
2. 2. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 1, que contiene (a) el parvovirus y (b) el inhibidor de Bcl-2 como unos elementos separados.
3. 3. Una composicion farmaceutica de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que el inhibidor de Bcl-2 es ABT-737 o ABT-199.
4. 4. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 tal como se han definido en las reivindicaciones 1 hasta 3 para la utilizacion en un procedimiento para la terapia de un cancer.
5. 5. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 para la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 4, caracterizados por que el parvovirus y el inhibidor de Bcl-2 se administran consecutivamente.
6. 6. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 para la utilizacion de acuerdo con la reivindicacion 4 o 5, caracterizados por que el aprovechamiento se efectua para el tratamiento de tumores solidos y/o de celulas madre iniciadoras de tumores.
7. 7. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 para la utilizacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 hasta 6, caracterizados por que el empleo se efectua utilizacion para el tratamiento de unos tumores, que son resistentes frente a la citotoxicidad del parvovirus.
8. 8. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 para la utilizacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 hasta 7, caracterizados por que el tumor es un tumor cerebral, un carcinoma de pancreas, un carcinoma de cuello uterino, un cancer de pulmon, un cancer de cabeza y cuello, un cancer de mama o un cancer de intestinos.
9. 9. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 para la utilizacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 hasta 8, caracterizados por que la utilizacion se efectua para el tratamiento de un glioma o de un glioblastoma multiforme recidivante.
10. 10. Un parvovirus y un inhibidor de Bcl-2 tal como se han definido en una de las reivindicaciones 1 hasta 3 para la utilizacion de acuerdo con una de las reivindicaciones 4 hasta 9, caracterizado por que el parvovirus y/o el inhibidor de Bcl-2 se han de administrar mediante una administracion intratumoral.