ES2625829T3 - Conjugados y sus usos en la obtención de imágenes moleculares - Google Patents
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Abstract
Un compuesto bifuncional o una molécula bifuncional para uso en un método in vivo de diagnóstico por imagen molecular, en donde (i) el compuesto bifuncional se representa por la fórmula:**Fórmula** o sales del mismo; en la que una de X e Y es C>=O y la otra es NR; en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6; en la que R1 es un grupo quelante capaz de quelar un radionúclido y se selecciona entre:**Fórmula** en las que R, R2, R3 y R4 son independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido; B es un grupo enlazador para enlazar el grupo quelante con el grupo reactivo, y se representa por la fórmula:**Fórmula** en la que Q se selecciona independientemente entre un grupo que consiste en -NR5-, -C(O)NR5-, - C(O)O-, - NR5C(O)NR5-, -NR5C(S)NR5- y -O-, cada R5 es independientemente hidrógeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido, cada q y s se seleccionan independientemente de 0 a 6 y cada r se selecciona independientemente de 1 a 6; A* es un grupo reactivo reaccionado que se acopla a T, siendo T un grupo diana capaz de unirse a una diana de interés en el sujeto; y en el que (ii) la molécula bifuncional comprende un compuesto bifuncional como se ha definido anteriormente y un radionúclido unido a través de un grupo quelante del compuesto bifuncional; y el método comprende las etapas de: (a) administrar al sujeto el compuesto bifuncional o la molécula bifuncional para que el compuesto bifuncional o la molécula bifuncional se unan a la diana de interés; y (b) donde se ha administrado un compuesto bifuncional, administrar al sujeto además una composición de sonda de formación de imágenes que comprende un radionúclido, de manera que el grupo quelante R1 del compuesto bifuncional quela el radionúclido en la diana de interés; y (c) detectar el radionúclido para la imagen de la diana de interés en el sistema biológico.
Description
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DESCRIPCION
Conjugados y sus usos en la obtencion de imagenes moleculares Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a compuestos bifuncionales, y en particular, a compuestos para su uso en la obtencion de imagenes moleculares y terapia.
Los compuestos pueden conjugarse en un grupo de direccionamiento, de modo que los compuestos se dirigen a las celulas o tejidos especificos en un sujeto.
Antecedentes de la invencion
La obtencion de imagenes moleculares puede definirse como la cartografia tridimensional de procesos moleculares in vivo, tales como la expresion genica, el flujo sanguineo, los cambios fisiologicos (pH, [O2], etc.), respuestas inmunitarias, y transito celular. Puede usarse para detectar y diagnosticar una enfermedad, seleccionar los tratamientos optimos y monitorizar los efectos de los tratamientos para obtener una lectura inicial de eficacia. En principio, se pueden usar un numero de diferentes tecnologias para la obtencion de imagenes moleculares, entre las que se incluyen la tomografia por emision de positrones (TEP), la tomografia por emision de foton unico (TEFU), y la obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) u opticas (IO). Estan surgiendo combinaciones de estas modalidades para proporcionar aplicaciones clinicas mejoradas, por ejemplo, TEP/TC y TEFU/TC ("obtencion de imagenes multimodal").
La obtencion de imagenes por radionuclidos con TEP y TEFU tiene la ventaja de caracterizarse por una sensibilidad extremadamente alta y por la administracion de pequenas cantidades de agentes de contraste (por ejemplo, picomoles in vivo), que no perturban los procesos moleculares in vivo. Ademas, los principios de direccionamiento para la obtencion de imagenes por radionuclidos pueden aplicarse tambien en el suministro dirigido de la terapia por radionuclidos. Normalmente el isotopo que se usa como radionuclido en la obtencion de imagenes moleculares se incorpora a una molecula para producir un radiomarcador que es farmaceuticamente aceptable para el sujeto. Se han desarrollado varios radiomarcadores con un abanico de propiedades. Por ejemplo, la fluorodesoxiglucosa (18F) es un derivado de glucosa marcado que se usa frecuentemente en la obtencion de imagenes moleculares con tEp.
El documento WO 2009/021947 describe quelantes tripodales para su uso como agentes de contraste de las IRM. Se describen los grupos quelantes de la hidroxipiridinona con un grupo R hidrofilo. El grupo hidrofilo se requiere para ayudar a disolver el quelante. Ademas, el quelante puede acoplarse a moleculas mas grandes, tales como un dendrimero, para aumentar la relatividad del agente de contraste de las IRM. Ferguson et al., Microbes and Infection 12 (2010) 287-294, describen un quelante de hierro hexadentado para su uso en la restriccion del crecimiento de los intramacrofagos de la Mycobacterium avium.
Chaves et al., Journal of Inorganic Biochemistry 105 (2011) 31-38, describen un complejo de galio con una trihidroxipiridinona tripodal para la obtencion de imagenes diagnosticas nucleares potenciales. Santos, Coordination Chemistry Reviews 252 (2008) 1213-1224 describe los desarrollos recientes en la aplicacion clinica de las 3-hidroxi- 4-piridinonas. Burgess y Rangel, Advances in Inorganic Chemistry 60 (2008) 167-243, describen las hidroxipiranonas, las hidroxipiridinonas, y sus complejos.
Zhou et al., J. Med. Chem 49 (2006) 4171-4182 describen los dendrimeros de union al hierro para su uso en el tratamiento de la hemocromatosis.
Sumario de la invencion
Puede ser complicado preparar radiomarcadores con restos funcionales sensibles. Por ejemplo, la incorporacion de radioisotopos al radiomarcador puede implicar la produccion de temperaturas elevadas que alterarian la estructura proteinica. Puede ser deseable incluir restos funcionales sensibles en los radiomarcadores, de modo que existe una necesidad de proporcionar radiomarcadores que puedan prepararse en condiciones moderadas. Como resultado, pueden producirse conjugados de obtencion de imagenes con una funcionalidad mejorada y con propiedades de obtencion de imagenes moleculares tambien mejoradas.
Actualmente, el 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N”,N'”-acido tetraacetico (DOTA) es un quelante habitual del galio-68 (y de otros radioisotopos metalicos, tales como el Ga-67, In-111, Cu-64, Lu-177, Y-90) usados en la obtencion de imagenes moleculares y en la terapia por radionuclidos dirigida. Sin embargo, DOTA tiene un amplio tiempo de radiomarcaje de en torno a 30 minutos (relativo a la semivida del 68Ga ~ 68 minutos). Ademas, la quelacion del galio mediante derivados de DOTA suele requerir una alta temperatura de marcaje de aproximadamente 95 °C. Los presentes inventores han hallado moleculas bifuncionales que son capaces de quelar rapidamente radionuclidos a temperatura ambiente, conservando al mismo tiempo una estabilidad adecuada o incluso mejorada hacia la disociacion en el medio biologico. Ademas de la parte quelante metalica, las moleculas bifuncionales tienen una parte reactiva que acopla la molecula bifuncional a un resto funcional, tal como el grupo de direccionamiento que puede dirigirse hacia, por ejemplo, las celulas, tejidos o moleculas biologicas del cuerpo.
En su version mas general, la presente invencion proporciona moleculas bifuncionales para la obtencion de imagenes moleculares que tienen una parte quelante tris(hidroxipiridinona) hexadentada tripodal que se acopla a un radionuclido o una marca de imagen y una funcionalidad reactiva que se acoplan a un grupo de direccionamiento o a 5 un vehiculo de suministro para suministrar un farmaco, toxina u otra molecula, de modo que la distribucion in vivo y/o la ubicacion final del grupo de direccionamiento o del vehiculo de suministro pueden monitorizarse.
En consecuencia, en un primer aspecto, la presente invencion proporciona un compuesto bifuncional para su uso en un metodo in vivo de obtencion de imagenes de diagnostico molecular en el que el compuesto bifuncional se 10 representa por la formula:
o sales del mismo;
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en la que uno de X e Y es C=O y la otra es NR;
en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;
20 en la que R1 es un grupo quelante capaz de quelar un radionuclido y se selecciona entre:
en la que R, R2, R3 y R4 son independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido;
25
B es un grupo enlazador para enlazar el grupo quelante con el grupo reactivo, en el que se representa por la formula:
30
en la que Q se selecciona independientemente entre un grupo que consiste en -NR5-, -C(O)NR5-, -C(O)O-, - NR5C(O)NR5-, -NR5C(S)NR5- y -O-, cada R5 es independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido, cada q y s se seleccionan independientemente de 0 a 6 y cada r se selecciona independientemente de 1 a 6;
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A* es un grupo reactivo reaccionado que se acopla a T, siendo T un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto;
en el que el metodo comprende las etapas de:
40
(a) administrar el compuesto bifuncional al sujeto para que el compuesto bifuncional se una a la diana de interes; y
(b) administrar ademas una composicion de sonda de obtencion de imagenes que comprende un radionuclido al sujeto, de manera que el grupo quelante R1 del compuesto bifuncional quelate el radionuclido en la diana de
45 interes; y
(c) detectar el radionuclido para la imagen de la diana de interes en el sistema biologico.
El compuesto bifuncional del primer aspecto puede hacer circular el sistema biologico a una ubicacion dirigida. Despues, cuando el radionuclido se introduce en el sujeto, el radionuclido puede pasar rapidamente a traves del 50 sistema y quelar con el compuesto bifuncional. De este modo, el radionuclido puede fijarse en un lugar de interes
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dentro de un corto espacio de tiempo de ser introducido en el sistema biologico de manera que se maximice la eficacia del radionuclido.
La presente invencion tambien proporciona una molecula bifuncional para su uso en un metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular, la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional como se ha definido anteriormente y un radionuclido unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional; y el metodo comprende las etapas de:
(a) administrar a la molecula bifuncional al sujeto para que el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional se una a la diana de interes; y
(b) detectar el radionuclido para la imagen de la diana de interes en el sistema biologico.
Preferentemente s se selecciona independientemente de 0 a 6, cada r se selecciona independientemente de 1 a 6 y q se selecciona de 1 a 6.
Preferentemente el metodo de obtencion de imagenes moleculares es PET o SPET.
La presente invencion tambien proporciona un compuesto bifuncional o molecula bifuncional para uso en un metodo de terapia con radionuclidos, en el que el compuesto bifuncional se representa por la formula:
o sales del mismo;
en la que uno de X e Y es C=O y la otra es NR;
en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;
en la que R1 es un grupo quelante capaz de quelar un radionuclido y se selecciona entre:
en la que R, R2, R3 y R4 son independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido; B es un grupo enlazador para enlazar el grupo quelante con el grupo reactivo, y se representa por la formula:
en la que Q se selecciona independientemente entre un grupo que consiste en -NR5-, -C(O)NR5-, -C(O)O-,- NR5C(O)NR5-, -NR5C(S)NR5- y -O-, cada R5 es independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido, cada q y s se seleccionan independientemente de 0 a 6 y cada r se selecciona independientemente de 1 a 6;
A* es un grupo reactivo reaccionado que se acopla a T, siendo T un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto;
y en el que la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional como se ha definido anteriormente y un radionuclido capaz de suministrar radioterapia a la diana de interes y unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional; y el metodo comprende las etapas de:
(a) administrar el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional al sujeto para que el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional se una a la diana de interes; y
(b) en el que se ha administrado un compuesto bifuncional, administrar ademas una composicion al sujeto, la composicion que comprende un radionuclido capaz de administrar radioterapia al blanco de interes, de manera que el grupo quelante R1 del compuesto bifuncional quelate el radionuclido en la diana de interes.
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En otro aspecto, la presente invencion proporciona un precursor de compuesto bifuncional, un compuesto bifuncional o una molecula bifuncional, en el que:
(a) el precursor del compuesto bifuncional se representa por la formula:
o sales del mismo; En la que:
(i) X es NR e Y es C=O, m se selecciona de 0 a 6, y p se selecciona de 1 a 6; o
(ii) Y es NR y X es C=O, y m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;
en el que R1 y B son como se han definido anteriormente;
A es un grupo reactivo para acoplamiento a un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto; (b) el compuesto bifuncional se representa por la formula:
o sales del mismo;
En la que:
(i) X es C=O e Y es NR, m se selecciona de 0 a 6, y p se selecciona de 1 a 6; o
(ii) Y es NR y X es C=O, y m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;
en la que R1, B y A* son como se han definido anteriormente; y
(c) la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional y un radionuclido unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional, en el que el compuesto bifuncional de la molecula bifuncional se representa por la formula:
o sales del mismo;
en la que uno de X e Y es C=O y la otra es NR;
en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;
en la que R1, B, A* y T son como se han definido anteriormente.
A es un grupo reactivo para el acoplamiento a un resto biologico, un grupo diana, una proteina, un polipeptido o un vehiculo de suministro.
Los compuestos conjugados bifuncionales proporcionan una porcion quelatante de tris(hidroxipiridinona)hexadentada tripodal que es capaz de quelar radionuclidos metalicos en un tiempo muy corto (del orden de 5 min o menos) y es capaz de hacerlo a temperatura ambiente en agua alrededor de las concentraciones fisiologicas PH. La porcion reactiva se une a la porcion quelante y permite que la molecula bifuncional se conjugue con un grupo diana u otro vehiculo, tales como un polipeptido u otro vehiculo, farmaco o nanoparticula. El marcaje de temperatura rapida y baja del grupo quelante permite que la molecula bifuncional se acople tanto a un radionuclido con una vida media corta, tal como 68Ga (T1/2 = 68 minutos) a traves de la porcion quelante y a un grupo diana sensible a la temperatura, tal como un polipeptido que puede desnaturalizarse a temperaturas de radiomarcaje superiores a la temperatura del cuerpo.
La eficacia de la reaccion de quelacion tambien permite el marcaje a una concentracion de vehiculo de suministro muy baja. De este modo, una proporcion significativa del vehiculo de administracion se marca radiactivamente con el radionuclido y, como resultado, conduce a una actividad especifica muy alta. De este modo, la molecula bifuncional proporciona un excelente precursor para un conjugado de radiomarcaje.
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Preferentemente el grupo reactivo A es el grupo funcional reactivo con protemas. El grupo reactivo con protemas puede reaccionar con protemas o protemas o peptidos modificados u otros vehiculos derivatizados para este fin. Preferentemente el grupo reactivo con la protema es un grupo maleimida, un aldehido, un ester, o un reactivo "click", tal como un grupo alquino, azida, alqueno, hidrazina, derivado de hidrazina, alcoxiamina, derivado de alcoxiamina, aminoxi o tiol. Los grupos maleimida, aldehido y ester reaccionan eficazmente con residuos peptidicos que contienen tiol o amina (cisteina, lisina) y asi se puede formar facilmente un conjugado. Otros grupos funcionales bio- ortogonales pueden manipularse en peptidos y protemas con el proposito de conjugarlos con grupos alquino, azida, alqueno, hidrazina, aminoxi o tiol.
Preferentemente R1 es
Preferentemente R2, R3 y R4 son independientemente H o CH3. Se prefiere tener sustituyentes relativamente pequenos en el anillo heterociclico de manera que los sustituyentes no obstaculicen estericamente el sitio de quelacion del grupo quelante y de manera que el quelante no se vuelva demasiado lipofilo. Asi en realizaciones preferidas, R2, R3 y R4 son H. Sin embargo, uno o mas sustituyentes metilo en el grupo heterociclico pueden usarse para adaptar la solubilidad y/o la hidrofobicidad de la molecula. Por consiguiente uno o mas de R2, R3 y R4 pueden ser CH3.
Preferentemente m es 2 o 3. Preferentemente p es 0 o 1. Mas preferentemente cuando m es 2, p es 1 o cuando m es 3, p es 0. Esto da una longitud de brazo tripodal al grupo quelante Ri de 5 atomos (m + p = 3 mas X e Y). Cuando la longitud del brazo es de 5 atomos, el grupo tripodal es adecuado para quelar radionuclidos, tal como galio.
El grupo enlazador B conecta la porcion quelante tripodal y la funcionalidad reactiva (y por ejemplo el grupo de orientacion o vehiculo portador cuando se conjuga). El grupo enlazante puede adaptarse variando los grupos Q, q, r y/o s para variar, por ejemplo, la longitud del enlazador.
El grupo enlazador puede estar dispuesto en cualquier direccion de manera que A o el carbono cuaternario (unido a cada brazo que tiene un grupo quelante) o ambos pueden unirse a Q. En realizaciones preferidas, B esta dispuesto de manera que el compuesto bifuncional se representa por la formula:
El ordenamiento de los atomos en el grupo funcional representado por Q no esta limitado. En otras palabras, cuando Q es un grupo amida, el orden del grupo desde la porcion quelante hacia la funcionalidad reactiva puede ser -NR5- despues -C (O) - o viceversa.
Preferentemente al menos una Q es una amida (-C(O)NR5-). Preferentemente q es 1, r es 2 y/o s es 1. Mas preferentemente q es 1, r es 2 y s es 1. Preferentemente R5 es hidrogeno.
Preferentemente B se representa por una de las siguientes formulas:
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en las que r se selecciona de 1 a 6 y s se selecciona de 0 a 6. Preferentemente r es 2 y/o s es 2. En realizaciones preferidas, el compuesto bifuncional se representa por la siguiente formula:
en la que A, s, m, X, Y, n y R1 son como se definen en el presente documento.
En realizaciones preferidas, en radionuclido es un isotopo de tecnecio, renio, cobre, cobalto, galio, itrio, lutecio u otro lantanido, indio, circonio, escandio. Mas preferentemente el radionuclido es Tc-99m, Re-186, Re-188, Co-57, In-111, Cu-60, Cu-61, Cu-62, Cu-64, Cu-67, Tc-94m, Ga-68, Ga-67, Ga-66, Y-90, Y-86, Sc-44, Sc-47, Fe-52, Sn-117m, Tb- 149, Gd-153, Ho-166, Lu-177, Zr-89, Bi-213 o Co-55 y preferentemente el radionuclido es galio y lo mas preferentemente Ga-68 o Ga-67.
Preferentemente, el grupo de direccionamiento es un miembro de un par de union especifico que es capaz de unirse a un companero de union en la diana de interes. Mas preferentemente, el grupo de direccionamiento y la diana de interes son un receptor y un ligando, o un anticuerpo y un antigeno, o una sonda metabolica, por ejemplo, transportador de glucosa/glucosa, hipoxia/resto responsable de la hipoxia, o mineral oseo/bifosfonato o avidina (o estreptavidina o una proteina relacionada) y biotina (o un derivado de la biotina), o ARN y ARN antisentido.
Preferentemente, el grupo de direccionamiento es un peptido, una proteina, un anticuerpo, aptamero o ligando de molecula pequena que es capaz de unirse a un companero de union en la diana de interes. Mas preferentemente, el grupo de direccionamiento es un polipeptido capaz de unirse a la fosfatidilserina (PS), de modo que puede emplearse la composicion de conjugado bifuncional en los estudios de obtencion de imagenes de la apoptosis o muerte celular. Mas preferentemente, el grupo de direccionamiento incluye anexina V y el dominio C2 de una sinaptotagmina, un peptido de TIMP-2, CEA, RGD, un peptido de direccionamiento al receptor de la somatostatina, bombesina, gastrina o un peptido de direccionamiento a VCAM.
Preferentemente, la diana de interes es una diana molecular in vivo. Mas preferentemente, la diana de interes es un ligando o receptor expresado en celulas o tejido enfermos (cuya abundancia u ocupacion del ligando ha de determinarse), un antigeno de superficie celular asociado a un estado patologico, marcadores tumorales, tales como el marcador especifico del cancer o un marcador especifico de tejido o un marcador de un proceso normal que esta regulado al alza o a la baja en un estado patologico. Preferentemente, la diana de interes es una ubicacion, un organo, un tipo de tejido o propiedad fisiologica en un sujeto que se somete a la obtencion de imagenes moleculares.
El grupo A reactivo puede estar presente para acoplarse a un vehiculo de suministro. Un vehiculo de suministro, tal y como se define en el presente documento, es una estructura molecular que porta una molecula funcional, tal como un farmaco de molecula pequena o toxina con el fin de suministrar la molecula funcional, por ejemplo, a un sistema biologico. La molecula funcional puede estar contenida en el interior de o unida a una superficie del vehiculo de suministro. La molecula funcional normalmente esta asociada de manera reversible al vehiculo de suministro, de modo que la molecula funcional puede liberarse en una ubicacion determinada en el sistema biologico. Muchos de estos vehiculos de suministro se conocen en la materia. Preferentemente, el vehiculo de suministro es una nanoparticula o liposoma. Las moleculas funcionales, tales como las sustancias farmaceuticas, pueden estar unidas a la superficie de las nanoparticulas o estar contenidas en el interior de los liposomas.
De este modo, cuando los compuestos bifuncionales de la presente invention se acoplan al vehiculo de suministro y se quela un radionuclido mediante el grupo R1 quelante, el paso de un farmaco (portado por el vehiculo de
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suministro) a traves de un sujeto, puede monitorizarse mediante la obtencion de imagenes por radionuclidos.
El grupo reactivo puede estar presente para acoplarse (ademas de a un resto biologico, un grupo de direccionamiento, una proteina, un polipeptido o un vehiculo de suministro) a una marca de obtencion de imagenes secundaria. Preferentemente, la marca de obtencion de imagenes secundaria es una marca optica, una marca paramagnetica, tal como un SPIO, o un punto cuantico. Mas preferentemente, la marca de obtencion de etiquetas es un marca paramagnetica que es un agente de contraste de IRM con una sonda paramagnetica. Como alternativa, la marca de obtencion de imagenes es una marca optica que es una molecula organica o complejo metalico con propiedades fluorescentes o luminiscentes. La marca puede, por ejemplo, en el caso de una marca optica o marca paramagnetica, permitir que se use el compuesto bifuncional en la obtencion de imagenes multimodales.
El grupo A reactivo puede acoplarse a otros restos biologicos, grupos de direccionamiento, proteinas, polipeptidos o vehiculos de suministro. Por ejemplo, el compuesto bifuncional puede acoplar el radionuclido a un grupo de direccionamiento para dirigir celulas especificas en un sujeto y un liposoma que contiene una sustancia farmaceutica. De este modo, el suministro del farmaco dirigido puede monitorizarse durante su paso por el sistema biologico.
El metodo de la obtencion de imagenes molecular puede incluir la introduccion del compuesto bifuncional (o conjugado del mismo) en un sistema biologico (por ejemplo, un sujeto) ya sea antes de introducir el radionuclido en el sistema biologico (es decir, predireccionamiento) o despues de que el radionuclido se haya quelado a la parte quelante del compuesto bifuncional (es decir, preensamblado).
Cuando el compuesto bifuncional (o conjugado) se introduce en el sistema biologico antes que el radionuclido, el compuesto bifuncional puede circular por el sistema biologico hasta una ubicacion preferente o dirigida. Despues, cuando se introduce el radionuclido, este puede pasar rapidamente por el sistema y quelarse a la molecula bifuncional (o conjugado). De este modo, el radionuclido puede unirse en una ubicacion de interes al poco tiempo de haber sido introducido en el sistema biologico, de modo que se maximiza la eficacia del radionuclido.
Cuando el radionuclido se quela al compuesto bifuncional (o conjugado) antes de introducirlo en el sistema biologico, el compuesto bifuncional puede usarse para monitorizar el paso del compuesto bifuncional o del conjugado que tiene un resto biologico, un grupo de direccionamiento, una proteina, un polipeptido, un vehiculo transportador o una marca de obtencion de imagenes secundaria adherido al compuesto a traves del sistema biologico.
Preferentemente, el resto biologico, el grupo de direccionamiento, la proteina, el polipeptido o vehiculo de suministro estan unidos al compuesto bifuncional para formar un conjugado de compuesto bifuncional antes de la introduccion de la composicion del compuesto bifuncional al sistema biologico o sujeto.
Preferentemente, el sistema biologico es un sujeto que se somete al diagnostico o terapia de una enfermedad o afeccion. La terapia puede ser terapia por radionuclidos. En particular, la terapia puede ser un tratamiento contra el cancer que usa el radionuclido o un agente quimioterapeutico asociado a la molecula bifuncional, por ejemplo, a traves del vehiculo de suministro al que esta adherido. Preferentemente, la molecula bifuncional esta asociada a o unida a un agente terapeutico. Como alternativa, el sujeto puede ser un sujeto en el que se esta evaluando la biodistribucion de la molecula de direccionamiento o del vehiculo de suministro.
En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un kit para su uso en un metodo de diagnostico in vivo por obtencion de imagenes moleculares o para su uso en un metodo de terapia por radionuclidos, comprendiendo el kit: una composicion de compuesto bifuncional que tiene un compuesto bifuncional; y una composicion que comprende un radionuclido tal y como se ha descrito en el presente documento.
Tal y como se describe en terminos generales en el presente documento, existe un kit para su uso en un metodo de obtencion de imagenes molecular o terapia que comprende: una composicion de molecula bifuncional que tiene un compuesto bifuncional como se describe en el presente documento; y un resto biologico, un grupo de direccionamiento, una proteina, un polipeptido o un vehiculo de suministro que se acopla a la molecula bifuncional. El kit tambien puede incluir una composicion de obtencion de imagenes que comprende un radionuclido como se describe en el presente documento.
Tal y como se describe en terminos generales en el presente documento, existe un metodo de obtencion de imagenes moleculares de una diana de interes en un sistema biologico, comprendiendo el metodo:
a) administrar a un sujeto una composicion que comprende un compuesto bifuncional tal como se describe en el presente documento, en el que el compuesto esta ligado a un resto biologico, un grupo de direccionamiento, una proteina, un polipeptido o un vehiculo de suministro a traves del grupo A reactivo;
b) administrar al sujeto un compuesto de obtencion de imagenes que comprende un radionuclido, en el que el grupo R1 quelante del compuesto bifuncional es capaz de quelar el radionuclido; y
c) detectar el radionuclido para obtener una imagen de la diana de interes en el sistema biologico.
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Tal y como se describe en terminos generales en el presente documento, existe un metodo de obtencion de imagenes moleculares de una diana de interes o paso de interes en un sistema biologico, comprendiendo el metodo:
a) quelar un radionuclido a la molecula bifuncional a traves del grupo quelante como se describe en el presente documento, en el que el compuesto esta ligado a un resto biologico, un grupo de direccionamiento, una proteina, un polipeptido o un vehiculo de suministro a traves del grupo A reactivo, para formar un compuesto de molecula bifuncional marcada;
b) administrar a un sujeto un compuesto que comprende el compuesto bifuncional marcado; y
c) detectar el radionuclido para obtener una imagen de la diana o paso de interes en el sistema biologico.
Preferentemente, el radionuclido es un radionuclido capaz de suministrar radioterapia a la diana de interes. Preferentemente, el radionuclido es Cu-67, Re-186, Re-188, Y-90, Lu-177, Sc-47 o Bi-213.
Las caracteristicas preferentes y opcionales de un cualquier aspecto pueden aplicarse a cualquier otro aspecto. En particular, las caracteristicas preferentes de los compuestos bifuncionales se aplican al metodo de obtencion de imagenes moleculares y viceversa.
A continuacion, se describiran las realizaciones de la presente invencion a modo de ejemplo y en relacion con las figuras que acompanan.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1 - Muestra el rendimiento del radiomarcaje de la parte quelante CP256 con 67Ga tras 5 minutos a temperatura ambiente en comparacion con el rendimiento del radiomarcaje de DOTA con 67Ga tras 40 minutos a 80 °C.
Figura 2 - Muestra los perfiles de elucion de 67Ga-CP256 a partir de una columna de PD10 para soluciones radiomarcadas a 2,27 |jM (A) y 0,227 |jM (B) de CP256 tras la incubacion con apotransferrina, en comparacion con 67Ga-citrato (C).
Figura 3 - Muestra la retencion del 67Ga-citrato, 67Ga-CP2 56, 67Ga-DOTA y 67Ga-DTPA a 30 kDa con filtros MWCO, tras la incubacion con apotransferrina.
Figura 4 - Muestra el perfil de elucion radioactivo, usando un cartucho de exclusion por tamano PD10, del C2Ac y C2Ac-(7) tras 15 minutos de incubacion con galio-68 en una solucion tamponada de acetato; y Figura 5 - El conjugado marcado con 68Ga mostro una union especifica dependiente del calcio a la fosfatidilserina (PS) en un ensayo de union de eritrocitos.
Figura 6 - Muestra un escaner TEP de un raton 90 minutos despues de la administration de a) C2Ac-(7)-68Ga y b) 68Ga no quelado "libre".
Figura 7 - La radiocromatografia de exclusion por tamano (columna PD10) que muestra la quelacion del 68Ga en CP256 en suero: a) control, cloruro de 68Ga en suero; b) control, realizado con el complejo 68Ga-CP256 incubado con suero; c) control, 68Ga incubado en solution tamponada; y d) muestra experimental, cloruro de 68Ga anadido a suero al que se habia anadido CP256 (23 jM o mas).
Figura 8 - El perfil de cromatografia de exclusion por tamano PD10 de 111In tras la incubacion de 111In-acetato y 111In-CP256 en suero, en comparacion con 111In-CP256 en solucion tamponada.
Figura 9 - La biodistribucion de 67Ga-CP256-SER4 (grupo 1), 67Ga-citrato 5 minutos despues de la inyeccion de SER4 (grupo 2), y 67Ga-citrato 5 minutos despues de la inyeccion de CP256-SER4 (grupo 3), en ratones de tipo silvestre (parte superior) o en ratones nuligenicos a la sialoadhesina (parte inferior).
Figura 10 - La biodistribucion de 68Ga-CP256-SER4 (grupo 1), 68Ga-acetato inyectado 1 hora despues de la inyeccion de SER4 (grupo 2), y acetato de 68Ga inyectado 1 hora despues de la inyeccion de CP256-SER4 (grupo 3), en ratones de tipo silvestre.
Figura 11 - Figura 11A (izquierda): escaner TEP/TC (proyeccion de intensidad maxima) de un raton del grupo 3 que muestra el direccionamiento previo usando CP256-SER4: ratones de 8 semanas de vida C57B1/6 inyectados con CP256-SER4 seguido de acetato de Ga-68, que muestran la absorcion del higado/bazo. Imagen tomada 1,5 horas despues de la inyeccion. Figura 11B (derecha): para la comparacion, a los ratones se les inyecto solamente Ga-68-acetato, mostrando la retencion en la sangre y la acumulacion en las articulaciones.
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Descripcion detallada
A: Direccionamiento hacia el sitio de interes
Cuando el compuesto bifuncional se acopla a una molecula de direccionamiento, un amplio abanico de grupos de direccionamiento principales puede ligarse a los compuestos bifuncionales para dirigir los compuestos bifuncionales con el grupo quelante hacia diferentes dianas de interes en el sistema biologico en cuestion.
En un aspecto, la diana de interes comprendera un elemento de un par de union especifico que es capaz de unirse especificamente al grupo de direccionamiento principal en el sistema, de modo que seran elementos de un par de moleculas que tienen una especificidad particular para cada uno y que, en condiciones normales, se unen entre si antes que unirse a otras moleculas. Entre los ejemplos de pares de union especificos que se conocen bien en la materia se incluyen, por ejemplo, receptores y ligandos, enzimas y sustratos, anticuerpos y antigenos. De este modo, los grupos de direccionamiento principales pueden ser peptidos, proteinas u otras moleculas biologicas, tales como aptameros, o ligandos de molecula pequena, que se unen a dianas moleculares in vivo especificas. Entre las clases de dianas de interes se incluyen ligandos o receptores o transportadores expresados en celulas o tejido enfermo, en un antigeno de superficie celular asociado a estados patologicos, o marcadores tumorales, por ejemplo, marcadores especificos del cancer o marcadores especificos de tejido.
Un grupo de grupos de direccionamiento principales es un grupo de polipeptidos capaces de unirse a la fosfatidilserina (PS), de modo que los conjugados moleculares bifuncionales de la presente invention pueden emplearse en los estudios de obtencion de imagenes de la apoptosis o muerte celular. Entre los ejemplos de tales polipeptidos se incluyen la anexina V y el dominio C2 de una sinaptotagmina. Los polipeptidos que comprenden uno o mas dominios C2 se conocen bien en la materia. Aunque algunos polipeptidos solo tienen un dominio C2, otros tienen dos o mas dominios C2, y los dominios se describen por lo general adhiriendo una letra (en orden alfabetico) al extremo del nombre (por ejemplo, C2A, C2B, y asi sucesivamente). Para una proteina que solo contiene un dominio C2, el dominio se denomina simplemente dominio C2. Aunque los ejemplos de a continuation usan el dominio C2A de la sinaptotagmina I de rata, podrian emplearse otros dominios C2 que sean capaces de unirse al PS, por ejemplo, un dominio C2A de una sinaptotagmina de otra especie. Entre otros ejemplos de proteinas que contienen un dominio C2 se incluyen, pero no estan limitados a la sinaptotagmina 1-13, los miembros de la familia de la proteina quinasa C de las quinasas serina/treonina, la fosfolipasa A2, la fosfolipasa 51, los cofactores en la cascada de coagulation que incluyen los factores V y VIII, y los miembros de la familia Copine. Las sinaptotagminas humanas incluyen la sinaptotagmina 1-7, 12 y 13.
Otras proteinas que pueden emplearse en la presente invencion incluyen los polipeptidos capaces de unirse especificamente a marcadores que se expresan mediante celulas cancerosas, posibilitando de este modo que puedan obtenerse imagenes de las celulas cancerosas usando los bioconjugados. A modo de ejemplo, la presente invencion puede emplear un anticuerpo anti-CD33, o un fragmento del mismo, para obtener imagenes de las celulas cancerosas que expresan el CD33, tales como las celulas del linaje mielomonocitico y las celulas de la leucemia, vease Emberson et al., J. Immunol. Methods. 305(2):135-51, 2005. Otro ejemplo es el uso de un inhibidor de tejido de las metaloproteinasas (TIMP), tales como TIMP-2, para la obtencion de imagenes de la expresion de la metaloproteinasa de matriz, puesto que la expresion de las metaloproteinasas esta implicada en los procesos metastasicos, vease Emberson et al., Bioconjug Chem. 12(6): 964-71, 2001. Otro ejemplo de un polipeptido que puede usarse para hacer conjugados segun la presente invencion es el receptor de complemento de tipo 2 (CR2). Los anticuerpos capaces de unirse a la glucoproteina del antigeno carcinoembrionario (CEA) pueden usarse tambien como grupos de direccionamiento principales, ya que los miembros de esta familia de glucoproteinas se expresan en celulas de cancer colorrectal, celulas de cancer gastrico, celulas de cancer pancreatico, celulas de cancer de pulmon, celulas de cancer medular tiroideo y celulas de cancer de mama.
Otro ejemplo puede aprovechar la afinidad o la secuencia peptidica arginina-glicina-acido aspartico (RGD) para la integrina avp3 expresada de manera elevada en el endotelio de los tejidos que se someten a la angiogenesis, como puede observarse normalmente en los tumores, la placa aterosclerotica y en la reparation de tejido enfermo, tal como el miocardio infartado, ligando un derivado del peptido RGD al compuesto bifuncional mediante un grupo A reactivo adecuado.
Otro ejemplo puede aprovechar la afinidad del peptido Octeotride u otro analogo relacionado de la somatostatina, que puede unirse al receptor de la somatostatina expresado de manera elevada en la superficie de las celulas cancerigenas, por ejemplo, en los tumores carcinoides, en el carcinoma medular tiroideo y en otros tumores neuroendocrinos, ligando un peptido analogo de la somatostatina al compuesto bifuncional mediante un grupo A reactivo adecuado.
Otro ejemplo puede aprovechar la afinidad de los anticuerpos a las celulas de adhesion celular. Un ejemplo es la afinidad del anticuerpo monoclonal, SER 4, a la molecula de adhesion a los macrofagos, la sialoadhesina. La sialoadhesina se halla sobre la superficie de los macrofagos, y por ejemplo, en grandes cantidades sobre los macrofagos del bazo, higado, ganglios linfaticos, medula osea, colon y pulmones.
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El experto en la materia sera capaz de usar otros grupos de direccionamiento, tales como la bombesina, gastrina o el peptido de direccionamiento a VCAM.
Preferentemente, el grupo de direccionamiento principal puede ligarse al compuesto bifuncional como conjugado que tiene un grupo funcional para unirse al compuesto bifuncional y el grupo reactivo para ligarse al grupo de direccionamiento principal. Para los expertos en la materia, sera evidente que existen varias posibilidades de conseguir esto mismo. A modo de ejemplo, en una realization, puede emplearse un grupo reactivo para el ligamiento especifico del sitio al grupo de direccionamiento principal, por ejemplo, un grupo maleimido para el ligamiento especifico del sitio a los grupos tiol en una biomolecula tal como un peptido, polipeptido o anticuerpo. El grupo maleimido puede entonces ligarse especificamente al sitio en un grupo tiol, por ejemplo, de un residuo de cisteina incorporado especificamente al sitio en el peptido o proteina para tal fin. En otro ejemplo, el grupo reactivo en el quelante bifuncional seria un grupo aldehido o cetona capaz de reaccionar especificamente en el sitio con una proteina o peptido al que se ha incorporado especificamente en el sitio una hidracina o grupo similarmente reactivo (por ejemplo, usando un derivado del acido hidracinonicotinico) para formar una hidrazona o ligamiento similar.
En algunos casos, el grupo de direccionamiento principal puede comprender un polipeptido o proteina adecuados, o un fragmento o dominio de los mismos. En consecuencia, aunque que por comodidad los metodos del presente documento se describen por lo general con referencia a los "polipeptidos", tambien deberian incluirse secuencias mas cortas de aminoacidos (por ejemplo, de 3 a 10 aminoacidos de longitud a 30, 40 o 50 aminoacidos de longitud), en ocasiones denominadas en la materia como peptidos. El termino tambien deberia incluir polipeptidos que tienen una estructura secundaria, terciaria o cuaternaria, generalmente denominada como proteinas, asi como proteinas multidominio. En algunas realizaciones, y en los ejemplos proporcionados mas adelante, los polipeptidos usados como grupos de direccionamiento principales son dominios proteicos. Los "dominios proteicos" son fragmentos de una proteina de longitud completa que tiene la habilidad de conservar la estructura independientemente de la proteina de longitud completa, formando normalmente una estructura tridimensional estable y plegada. Muchas proteinas consisten en varios dominios proteicos estructurales y es comun hallar un dominio particular en un abanico de proteinas relacionadas. Los dominios proteicos varian en longitud desde entre aproximadamente 25 aminoacidos hasta 500 aminoacidos de longitud, o desde 50 aminoacidos hasta 250 aminoacidos, o desde 75 aminoacidos hasta 150 aminoacidos.
En la presente invention, donde el polipeptido es un anticuerpo, este termino describe una inmunoglobulina tanto natural o producida parcial o totalmente de manera sintetica. El termino tambien engloba cualquier polipeptido o proteina que comprende el dominio de union al antigeno de un anticuerpo; fragmentos de anticuerpo que comprenden un dominio de union al antigeno, tales como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos. Es posible tomar los anticuerpos monoclonales y otros y usar tecnicas de la tecnologia del ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moleculas quimericas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Tales tecnicas pueden implicar la introduction de ADN que codifique la region variable de la inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de un anticuerpo a las regiones constantes, o a las regiones constantes mas las regiones marco conservadas, de una inmunoglobulina diferente. Vease, por ejemplo, los documentos EP 0 184 187 A, GB 2,188,638 A o EP 0 239 400 A.
Los anticuerpos pueden modificarse de varias formas, y el termino "molecula de anticuerpo" deberia interpretarse como que engloba cualquier elemento o sustancia de union especifica que tiene un dominio de union al antigeno de anticuerpo con la especificidad requerida. De este modo, el presente termino engloba los fragmentos y derivados de anticuerpo, incluyendo cualquier polipeptido que comprenda un dominio de union a la imnunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintetica. Por lo tanto, se incluyen las moleculas quimericas que comprenden un dominio de union a la inmunoglobulina, o equivalente, fusionadas a otro polipeptido. La donation y expresion de los anticuerpos quimericos se describe en los documentos EP 0 120 694 A y EP 0 125 023 A. Se ha mostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la funcion de antigenos de union. Entre los ejemplos de fragmentos de union estan: i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un unico anticuerpo; iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341, 544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; v) regiones CDR aisladas; vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados; vii) moleculas Fv monocatenarias (scFv), en las que se ligan un dominio VH y un dominio VL mediante un enlazador peptidico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de union de antigeno (Bird et al., Science, 242; 423-426, 1988; Huston et al, PNAS USA, 85: 5879-5883, 1988); viii) dimeros de Fv monocatenario biespecificos (PCT/US92/09965) y ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecificos creados mediante fusion genica (WO 94/13804; Holliger et al., P.N.A.S. EE.UU., 90: 6444-6448, 1993). Las moleculas de Fv, scFv o de diacuerpos pueden estabilizarse mediante la incorporation de puentes de disulfuro que ligan los dominios VH y VL (Reiter et al., Nature Biotech, 14: 1239-1245, 1996). Tambien pueden crearse minicuerpos que comprenden un scFv unido al dominio CH3 (Hu et al., Cancer Res., 56: 3055-3061, 1996).
Los aficuerpos tambien pueden usarse como el grupo de direccionamiento principal. Los aficuerpos son pequenas proteinas de afinidad elevada que pueden unirse especificamente a un gran numero de proteinas o peptidos de direccionamiento. Los aficuerpos imitan a los anticuerpos monoclonales en muchos aspectos y se clasifican como mimeticos de anticuerpos. La selection de aficuerpos no deberia limitarse ya que en la materia se conocen muchos
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aficuerpos, tales como el aficuerpo anti-TNF-a no conjugado. El aficuerpo anti-TNF-a no conjugado puede producirse en la E. coli y se dirige al factor de necrosis tumoral a de la citocina humana, TNF-a. El TNF-a es una citocina inflamatoria pleiotropica. La citocina se produce mediante varios tipos de celulas, pero especialmente mediante macrofagos. Actua como mediador clave en la respuesta inmunitaria inflamatoria local y tiene otras funciones reguladoras inmunitarias. El TNF-a es una proteina de fase aguda que inicia una cascada de citocinas y aumenta la permeabilidad vascular, atrayendo de este modo macrofagos y neutrofilos hacia un sitio de infeccion. Por lo tanto, el TNF-a es una diana importante para la inflamacion en las lesiones ateroscleroticas y las inflamaciones.
Cada compuesto bifuncional puede ligarse a una pluralidad de grupos de direccionamiento principales, aumentando de este modo: a) la afinidad de los grupos de direccionamiento principales para la diana de interes conforme la afinidad total aumenta como el producto de afinidad de cada grupo de direccionamiento para la diana y/o b) la velocidad de union a la diana, es decir, la probabilidad de union consecuente de cada encuentro in vivo entre la diana y el grupo de direccionamiento principal.
B: Sondas de obtencion de imagenes - Las sondas de obtencion de imagenes que son capaces de unirse a los compuestos bifuncionales comprenden un radionuclido (unido mediante el grupo quelante).
Las sondas de obtencion de imagenes (radioisotopos metalicos) empleadas de conformidad con la presente invention tienen la propiedad de unirse a la parte quelante de los compuestos bifuncionales ya sea in vitro o in vivo, ya sea en los enfoques predirigidos o preensamblados. Una posibilidad para conseguir esto es usar radionuclidos que tengan una afinidad de union intrinseca de la parte quelante de los compuestos bifuncionales. A modo de ejemplo, el 68Ga3+ es capaz de unirse a los grupos de hidroxipiridinona de la parte quelante y pueden usarse en las tecnicas de obtencion de imagenes TEP.
Las sondas de radionuclidos usadas de conformidad con la presente invencion pueden emplear un abanico de diferentes radionuclidos dependiendo de la aplicacion para la que estan destinadas las sondas. Entre los ejemplos de radionuclidos que pueden formar parte de las sondas de la presente invencion se incluyen los radionuclidos de tecnecio, renio, cobre, cobalto, galio, itrio, lutecio, indio, circonio, escandio, concretamente Tc-99m, Ga-67, In-111 (TEFU), Cu-64, Cu-60, Cu-61, Cu-62, Tc-94m, Ga-68, Co-55, Zr-89, Sc-44 (TEP), Cu-67, Re-186, Re-188, Y-90, Lu- 177, Sc-47 o Bi-213 (terapia por radionuclidos). La presente invencion puede emplear radionuclidos individuales o en combinacion.
El radionuclido puede tener cualquier forma, tal como un solvato, hidrato, sal o quelato debil. Los solvatos, hidratos, sales y quelatos debiles de radionuclidos se conocen en la materia. Cuando el radionuclido ha de administrarse a un sujeto en una composition de radionuclido (por ejemplo, cuando el compuesto bifuncional se quela al radionuclido en el sujeto tras la administration), el radionuclido deberia estar en una forma farmaceuticamente aceptable.
Por ejemplo, el radionuclido puede ser una sal de citrato o acetato del ion metalico.
La presente invencion puede tambien implicar el uso de marcas de obtencion de imagenes secundarias, tales como una marca optica o una marca paramagnetica (a traves del grupo A reactivo) que puede ligarse a o asociarse a los compuestos bifuncionales, por ejemplo, para posibilitar llevar a cabo la obtencion de imagenes multimodal. Entre los ejemplos de sondas opticas se incluyen fluoroforos tales como la fluoresceina y moleculas y complejos luminiscentes tales como los complejos de lantanido y los conjugados de tricarbonilrenio-quinolinato. La posibilidad de incorporar sondas opticas, asi como radionuclidos y agentes de contraste RM proporciona la oportunidad de combinar modalidades para mejorar el diagnostico y la detection, por ejemplo, la ubicacion de la enfermedad a nivel corporal total puede identificarse mediante el escaneo de todo el cuerpo con TEP o TCEFU mientras puede detectarse visualmente el mismo marcador durante la cirugia para ayudar en la identification del tejido enfermo. De manera similar, la obtencion de imagenes combinada de tEp y Rm puede proporcionar la ventaja de una alta sensibilidad (TEP, TEFU), cuantificacion de la senal (TEP) y resolution anatomica (RM) y la medicion del microentorno (RM con mejora de contraste).
C: Qumica de la conjugacion
Los compuestos bifuncionales de la presente invencion pueden usar un abanico de diferentes quimicas y tecnicas para ligar el resto biologico, el grupo de direccionamiento, la marca, la proteina o el polipeptido a los compuestos bifuncionales y/o para la introduction de otros grupos y propiedades en los compuestos bifuncionales de la presente invencion.
De este modo, en la presente invencion, el grupo reactivo proporciona una forma para acoplar el grupo dirigido al compuesto bifuncional, por ejemplo, cuando el grupo reactivo es un grupo maleimido (para unirse a la cadena lateral de tiol de la cisteina en la secuencia proteica/peptidica).
Usos de la presente invencion
Los compuestos bifuncionales de la presente invencion pueden usarse para la obtencion de imagenes moleculares de enfermedades, tales como cancer, enfermedades cardiovasculares, enfermedades inmunitarias y condiciones
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asociadas, tales como un transplante, inflamacion, seguimiento de leucocitos, seguimiento de celulas madre, alergia e infeccion. Los compuestos bifuncionales tambien pueden emplearse en la terapia por radionuclidos para tratar el cancer y la artritis.
Las aplicaciones de los compuestos bifuncionales y los radionulidos de la presente invencion incluyen un amplio abanico de aplicaciones de obtencion de imagenes y espectroscopicas que pueden emplear el radionuclido y/u otra marca, por ejemplo, en estudios de obtencion de imagenes multimodales. Tal como se describe en el presente documento, los compuestos bifuncionales son particularmente utiles para las aplicaciones de obtencion de imagenes in vivo, tales como la obtencion de imagenes de muerte celular, por ejemplo, usando compuestos bifuncionales para la deteccion de la apoptosis. Esto podria ser util en un numero de diferentes aplicaciones medicas o de investigacion, por ejemplo, en los campos de la oncologia (por ejemplo, para monitorizar la respuesta a la quimioterapia), la medicina cardiovascular (por ejemplo, para obtener imagenes del miocardio danado tras un infarto de miocardio) o de rechazo de injertos (por ejemplo, para obtener imagenes del rechazo del aloinjerto cardiaco).
La presente invencion es particularmente relevante para las tecnicas de obtencion de imagenes de la medicina nuclear, tales como la tomografia por emision de foton unico (TEFU), una tecnica de obtencion de imagenes que detecta los rayos gamma emitidos por parte de un radionuclido para producir una imagen tridimensional de la distribucion del radionuclido en una muestra o sujeto, y la tomografia por emision de positrones (TEP), una tecnica de obtencion de imagenes que proporciona imagenes tridimensionales detectando pares de rayos gamma emitidos indirectamente por parte de un radionuclido emisor de positrones introducido en una muestra o sujeto. A modo de ejemplo, los estudios TEFU pueden llevarse a cabo usando In-111 y los estudios TEP usando Ga-68. El experto en la materia, sin embargo, sera consciente de que pueden emplearse otros radionuclidos para TEFU y TEP en la presente invencion. En general, la presente invencion puede emplearse para la tomografia por emision de positrones (TEP), la tomografia por emision de foton unico (TEFU), la obtencion de imagenes opticas (IO) y/o la obtencion de imagenes por resonancia magnetica (IRM) mediante la seleccion apropiada de una sonda de obtencion de imagenes, o para la terapia por radionulidos mediante la seleccion del radionuclido apropiado (por ejemplo, Y-90, Lu- 177).
Los compuestos bifuncionales de la presente invencion pueden usarse en metodos de obtencion de imagenes bifuncionales, en los que la informacion o las imagenes proceden de dos tecnicas diferentes, ya sea mediante la deteccion de la sonda de obtencion de imagenes posible de detectar usando dos tecnicas diferentes, o mediante la provision de una segunda marca en el sitio del sistema biologico donde se localizan los compuestos bifuncionales, mas convenientemente, mediante el ligamiento o la asociacion de la segunda marca con los compuestos bifuncionales, tal y como se ha explicado con detalle anteriormente. Los estudios multimodales se registraran conjuntamente, y pueden suponer la obtencion simultanea de imagenes con dos modalidades o puede ser necesario llevarlos a cabo en dos etapas, pero generalmente emplearan la misma muestra, de modo que puede compararse la informacion espacial obtenida usando las dos tecnicas. Entre los ejemplos de obtencion de imagenes multimodal se incluyen TEP/TC, TEFU/TC, TEP/RM y TEFU/RM.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Sintesis del quelante CP256 (Compuesto 52)
Los esteres de tris terc-butilo 61 y 62 se sintetizaron mediante los siguientes metodos bibliograficos establecidos (G. R. Newkome, R. K. Behera, C. N. Moorefield and G. R. Baker, J Org Chem, 1991,56, 7162-7167).
Smtesis de 52. Materiales y metodos: (a) Tritos B, Acrilato de terc-nutilo, DME, 70 °C; (b) T-1 Ni Raney, H2. 25 °C. EtOH; (c) CH3COCL Et3N, CH2Cl2, 0-25 °C, (d) HCOOH; (e) 60, DCCI, HoBt, DMF 25 °C; (f) Pd/C, H2, HCl, 5 CH3OH, 25 °C.
Se produjo nitro tripod 61 por la reaccion de nitrometano y acrilato de terc-butilo en presencia de hidroxido de benciltrimetilamonio y la recristalizacion a partir de etanol con un rendimiento del 57 %. Despues, el grupo nitro de 61 se redujo a una amina para formar 62 mediante la hidrogenacion con un catalizador T-1 de niquel Raney,5 que se 10 preparo especialmente a partir de una aleacion de mquel/aluminio. La acetilacion de 62 con cloruro de acetilo y purificacion por cromatografia en columna dio 63 con un rendimiento del 72 %. Despues, los grupos terc-butilo se retiraron con acido formico y el producto, el compuesto 64 se recristalizo en etanol/eter de petroleo con un rendimiento del 93 %.
15 La conjugacion de los restos bidentados con la estructura tridimensional y posterior desproteccion para crear 52 se muestra de manera esquematica anteriormente. Se hizo reaccionar 1 equivalente de tri-acido 64 con 3,6 equivalentes del compuesto bidentado 60 en una reaccion de acoplamiento con DCCI and HOBt en DMF. Despues de la retirada del disolvente, el ligando hexadentado protegido 65 se purifico por cromatografia en columna con un rendimiento del 50 %. Los grupos protectores bencilo se retiraron por hidrogenacion catalitica (Pd/C) en una solucion 20 acida (HCl) de metanol. Despues de la retirada del catalizador, la sal tris HCl de 52 se precipito en metanol/dietileter y se seco al vacio, dando como resultado 0,4 g (74 %) de 52 en forma de un solido de color blanco.
Detalles experimentales
25 Todos los productos quimicos se adquirieron de Sigma Aldrich y Acros Organics y eran de grado reactivo o mejor.
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Los disolventes se adquirieron de Fisher Scientific, Sigma Aldrich y VWR. Los disolventes de RMN se adquirieron de GOSS Scientific y los tubos de RMN se fabricaron por Wilmad. Las placas de TLC (gel de silice 60 UV254 sobre soporte de alumina) y gel de silice para cromatografia en columna se adquirieron de Merck.
Las muestras se secaron en un horno de vacio (Gallenkamp, evaluadas a < 250 °C) conectado a una bomba de vacio (BOC- Edwards.) Las muestras se hidrogenaron en un hidrogenador Parr (temperatura ambiente) a 275,79 KPa (40 psi) con agitacion automatica. Los espectros de infrarrojos se adquirieron en un espectro Perkin Elmer un FTIR usando discos KBr. El programa informatico usado se llamaba "Spectrum."
Los espectros de RMN 1H se adquirieron en un iman Ultra-shield de 400 MHz (Bruker) y con el programa informatico XWin-NMR. Los espectros se analizaron en un programa informatico MestReNova version 5.3 (Mestrelab Research). Las muestras de espectrometria de masas se sometieron al Centro de Espectrometria de Masas EPSRC, Swansea o la instalacion de la Espectrometria de Masas, King's College, Londres. Las muestras en EPSRC se realizaron en un espectrometro de masas cuadrupolar Waters ZQ4000 (IEN), un espectrometro de masas de doble focalizacion Finnigan MAT 95 XP de alta resolucion (EI, CI) o un espectrometro de masas de cuadrupolos Quattro II de Micromass (EI). Las muestras en el King's College se realizaron en un espectrometro de masas de trampas termicas Thermofisher LcQ DECA XP.
Las distribuciones isotopicas se calcularon usando la Calculadora de Peso Molecular version 6.46. Los datos del grafico resultante se extrajeron y procesaron en Microsoft Excel 2003.
2-Clorometil-5-hidroxipiran-4(1H)-ona (acdido clorokojico) (54)
Se anadieron 50 g de acido kojico (350 mmol, 1 equiv.) a 220 ml de cloruro de tionilo con agitacion. El recipiente de reaccion se enfrio con hielo y la mezcla se agito durante 1 hora hasta que se hubo formado una suspension de color amarillo brillante. La mezcla se filtro al vacio para dar un solido en bruto de color blanco despues de lavarse con eter de petroleo. Este solido se recristalizo en agua caliente para dar 40 g de cristales de color blanquecino con un rendimiento del 71 %.
RMN 1H (DMSO-ds) o 9,2 (s, 1H 3-OH) 8,1 (s, 1H 2-H) 6,5 (s, 1H 5-H) 4,6 (s, 2H 6-CH2-Cl) 2-Metil-5-hidroxipiran-4(1H)-ona (Allomaltol) (55)
Se anadieron 20 g de acido clorokojico (54) (125 mmol, 1 equiv.) a 100 ml de agua destilada y se agito a 50 °C. Se anadio lentamente polvo de cinc (17 g) a la solucion y la temperatura se incremento a 70 °C. Se anadieron gota a gota 40 ml de HCl concentrado en la mezcla en agitacion lentamente durante un periodo de 90 minutos. Durante este tiempo, el acido clorokojico se disolvio. Despues de agitar durante un adicional de 3 horas a 70-80 °C, la solucion, ahora de color negro pardo se filtro en caliente para retirar cualquier solido. Despues de un periodo de refrigeracion, el producto se extrajo con 5 porciones X 70 ml de CH2Cl2. La solucion se seco (Na2SO4) y el disolvente se retiro al vacio. EL solido en bruto se recristalizo en isopropanol caliente, dando como resultado 8,63 g de cristales de color beis con un rendimiento del 55 %.
RMN 1H (DMSO-ds) o 9,0 (s, 1H 2-H) 8,0 (s, 1H 3-OH) 6,2 (s, 1H 5-H) 2,2 (s, 3H 6-CH3)
2-Hidroximetil-3-hidroxi-6-metil-piran-4(1 H)-ona (56)
Se anadieron 3 g de allomaltol (55) (23,8 mmol, 1 equiv.) a una solucion en agitacion de 1,05 g de NaOH en 25 ml agua destilada. Se anadieron gota a gota 2,2 ml de una solucion al 37 % de formaldehido durante 10 minutos. La
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solucion se agito durante un adicional de 18 horas a temperatura ambiente. El pH se ajusto a 1 con HCl concentrado momento en el cual se formo un precipitado de color blanco. Para permitir la precipitacion completa, la solucion se enfrio a 4 °C durante 24 horas. El solido se filtro y se lavo con eter dietilico fno y se seco al vado dando como resultado 2,92 g de un solido de color blanco con un rendimiento del 78 %.
RMN 1H (DMSO-ds) o 8,8 (s, 1H 3-OH) 6,2 (s, 1H 5-H) 4,3 (s, 2H 2-CH2-OH) 2,2 (s, 3H 6-CH3)
2-Hidroximetil-3-benciloxi-6-metil-piran-4(1 H)-ona (57)
O
A 60 ml de CH3OH se le anadieron 10 g de 56 (64 mmol, 1 equiv.) y la solucion se calento a reflujo. Una solucion de 2,82 g de NaOH (70 mmol, 1,1 equiv.) en 6 ml H2O se anadio lentamente a la solucion de reflujo. Se gotearon lentamente 12,05 g de bromuro de bencilo (70 mmol, 1,1 equiv.) en la solucion de reflujo durante 30 minutos. La solucion se calento a reflujo durante un adicional de 16 horas. El disolvente se retiro al vacio y el residuo se recogio en 180 ml de CH2Cl2. El NaBr insoluble se retiro por filtracion. La capa organica se lavo con dos porciones de 100 ml de NAOH acuoso al 5 % y despues con 2 porciones X 100 ml de agua, se seco (Na2SO4) y se evaporo para dejar un aceite de color claro. El aceite se recristalizo en CH2Cl2 y eter de petroleo para dar 9,8 g de un solido de color blanco con un rendimiento del 62 %. m/z 247 (M+H)+ [ES+]
RMN 1H (CDCl3) o 7,25 (m, 5H 3-O-CH2-Bnz) 6,1 (s, 1H 5-H) 5,1 (s, 2H 3-O-CH2-Bnz) 4,2 (m, 2H 2-CH2-OH) 2,15 (s, 3H 6-CH3)
1,6-Dimetil-2-hidroximetil-3-benciloxipiridin-4(1 H)-ona (58)
Se anadieron 4,92 g de 57 (20 mmol, 1 equiv.) a 60 ml de CH2Cl2 con agitacion. Se anadieron 3,4 g de 3,4-dihidro-2- H-pirano (42,5 mmol, 2,2 equiv.) seguido de 60 mg de acido p-toluenosulfonico como un catalizador. Despues de agitar durante 3 horas la mezcla se anadio a un embudo de separation y se lavo con 2 X 40 ml Na2CO3 (5 %) seguido de 2 X 40 ml de agua destilada. La capa organica se seco (Na2SO4) y se evaporo para dar un aceite de color amarillo, que se disolvio de nuevo en 20 ml de EtOH. Se anadieron 200 ml de NH2CH3 (40 %, acuoso) y la mezcla se agito a 70 °C durante 18 horas. El disolvente se retiro al vacio y el aceite resultante se disolvio de nuevo en 40 ml de EtOH. Se anadieron 2 ml de HCl concentrado (37 %) y la solucion se calento a reflujo durante 4 horas. El disolvente se retiro al vacio y se anadieron 100 ml de agua destilada al residuo. La solucion se lavo con 2 X 50 ml de eter dietilico. Despues, el pH de la fase acuosa se ajusto a 9 con NaOH acuoso 10 N. La solucion se anadio a un embudo de separacion y se extrajo con 4 X 100 ml de CH2Ch. La capa organica se seco con Na2SO4 anhidro y el disolvente se retiro para dar un solido en bruto de color pardo, que se recristalizo en CH3OH y eter dietilico para dar 2,8 g de cristales de color blanco con un rendimiento del 54 %. m/z 260 (M+H)+ [ES+]
RMN 1H (DMSO) o 7,3-7,5 (m, 5H 3-O-CH2-Bnz) 6,15 (s, 1H 5-H) 5,4 (m, 1H 2-CH2-OH) 5,0 (s, 2H 3-O-CH2-Bnz) 4,5 (m, 2H 2-CH2-OH) 3,58 (s, 3H 6-CH3) 2,28 (s, 3H 1-N-CH3)
1,6-Dimetil-2-ftalimidometil-3-benciloxipiridin-4(1 H)-ona (59)
Se anadieron 8,6 g de trifenilfosfina (32 mmol, 1,2 equiv.) y 4,8 g de ftalimida (32 mmol, 1,2 equiv.) a una suspension agitada de 58 (7 g, 27 mmol, 1 equiv.) en 150 ml de THF a 0 °C. Se anadieron gota a gota 6,47 g de azodicarboxilato
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de diisopropilo [DIAD] (32 mmol, 1,2 equiv.) durante 30 minutos. La solucion se dejo calentar a temperatura ambiente y se agito durante un adicional de 17 horas, tiempo despues del cual la solucion se filtro. El solido se lavo con THF frio para dar 9,92 g de un solido amorfo de color blanco con un rendimiento del 95 %.
RMN 1H (CDCl3) a 7,65 (m, 4H 2-CH2-Ftalimida) 7,15 (m, 5H 3-O-CH2-Bnz) 6,25 (s, 1H 5-H) 5,35 (s, 2H 3-O- CH2- Bnz) 4,75 (s, 2H 2-CH2-Ftalimida) 3,5 (s, 3H I-N-CH3) 2,1 (s, 3H 6-CH3)
1,6-Dimetil-2-aminometil-3-benciloxipiridin-4(1 H)-ona (60)
Se disolvieron 10 g de 59 (26 mmol, 1 equiv.) en 100 ml de EtOH. Se anadieron 17 ml de N2H4 (acuoso al 5,5 %) y la solucion se calento a reflujo durante 3 horas. El 59 no se disolvio completamente hasta que el reflujo habia comenzado. La solucion se dejo enfriar, momento en el cual se solidifico. Se anadio agua y el pH se ajusto a 1 con HCl conc. Despues de enfriarse durante una noche a 4 °C, la solucion se filtro. El pH del filtrado se ajusto a 14 con NaOH 10 N y se extrajo con 5 X 100 ml de CH2Ch. Los extractos se combinaron y se secaron sobre Na2SO4. El disolvente se retiro al vacio para dar 6,2 g de un solido de color blanco con un rendimiento del 92 %. m/z 259 (M+H)+ [ES+]
RMN 1H (CDCb) a 7,25 (m, 5H 3-O-CH2-Bnz) 6,35 (s, 1H 5-H) 5,25 (s, 2H 3-O-CH2-Bnz) 3,7 (s, 2H 2-CH2-NH2) 3,6 (s, 3H 1-N-CH3) 2,3 (s, 3H 6-CH3)
4-Nitro-4-[2-(terc-butoxicarbonil)etil]-heptanodioato de di-terc-butilo (61)
Se anadieron 1,53 g de nitrometano (25 mmol, 1 equiv.) a 10 ml 1,2-dimetoxietano (DME). Se anadieron 0,25 ml de hidroxido de benciltrimetilamonio (Triton B) y la solucion se calento a 70 °C. Se anadieron 9,93 g de acrilato de terc- butilo (77,5 mmol, 3,1 equiv.) en porciones de 1 ml junto con otras 2 porciones X 0,25 ml de Triton B para mantener la temperatura 70-80 °C. Despues de la adicion completa de los reactivos, la solucion se calento a 70 °C durante una hora adicional. El disolvente se retiro al vacio y el residuo se volvio a disolver en 60 ml de CHCb y se coloco en un embudo de separacion. La capa organica se lavo con 20 ml de HCl (acuoso al 10 %) seguido de 3 X 20 ml de una solucion de NaCl conc. La capa organica se seco con Na2SO4, se filtro y el disolvente se retiro al vacio. El producto en bruto se recristalizo en EtOH caliente, se filtro y se lavo con EtOH enfriado con hielo para dar 6,4 g de cristales de color blanco con un rendimiento del 57 %. m/z 463 (M+NH4)+ [CI]
RMN 1H (CDCb) a 2,2 (s, 12H [CH2-CH2-COO-tbu]3) 1,45 (s, 27H [CH2-CH2-COO-tbu]3)
IR (KBr) 2975s (CH2), 1723s (C=O), 1536s (NO2) cm-1
Catalizador T-1 de mquel Raney
A un matraz de fondo redondo de tres bocas de 1 l se le anadieron 600 ml de una solucion al 10 % de NaOH seguido de 40 g de aleacion de Niquel-Aluminio. La solucion se agito con una barra de agitacion magnetica y se calento a una temperatura de 90 - 95 °C. Despues de 40 minutos de calentamiento, el niquel comenzo a adherirse al agitador magnetico, impidiendo el proceso de agitacion. En este punto, la agitacion se continuo manualmente con una varilla de vidrio. El calentamiento se interrumpio despues de una hora y el niquel se dejo sedimentar. Una vez que el catalizador de niquel se habia sedimentado y la solucion se habia enfriado, el sobrenadante se decanto y se descargo. El catalizador se lavo con 3 X 200 ml de agua destilada y 5 X 50 ml de etanol. Se tomo precaucion para asegurar que el catalizador se cubrio con liquido y no se expuso al aire durante las etapas de lavado. Despues, el catalizador se almaceno en un refrigerador a 4 °C en 50 ml de etanol.
5
10
15
20
25
30
35
40
4-Ammo-4-[2-(ferc-butoxicarboml)etil]-heptanodioato de di-terc-butilo (62)
Se disolvieron 5 g de 61 (11,24 mmol, 1 equiv.) en 100 ml de EtOH. Se anadieron 4 g de catalizador T-1 de mquel Raney.
La solucion se hidrogeno a 275,79 KPa (40 psi) (temperatura ambiente) durante 7 dias. Durante este periodo, le presion de H2 se mantuvo a 275,79 KPa (40 psi) y la reaccion se detuvo una vez que la presion dejo de reducirse aun mas. El 61 no se disolvio completamente al principio, sino que se hizo durante el periodo de hidrogenacion. La solucion se filtro a traves de celite y el disolvente se retiro al vacio para dar 4,5 g de un aceite con rendimiento cuantitativo, que se solidifico tras un periodo de reposo durante unos pocos dias. m/z 416 o (M+H)+ [ES+]
RMN 1H (CDCl3) o 2,2 (m, 6H [CH2-CH2-COO-tbu]3) 1,6 o (m, 6H [CH2-CH2-COO-tbu]3) 1,45 (s, 27H (CH2-CH2-COO- tbu]3)
IR (KBr) 3376s (NH2) 2978s (CH2), 1730s (C=O) cm-1
Ester di-ferc-butilico del acido 4-acetilamino-4-(2-ferc-butoxicarbonil-etil)-heptanodioico (63)
A 5 ml de CH2CE se le anadieron 1 g de triester 62 (2,4 mmol, 1 equiv.) y 0,3 g de trietilamina (2,9 mmol, 1,2 equiv.) La solucion se enfrio a 0 °C con un bano de hielo y se anadieron gota a gota 0,23 g de cloruro de acetilo (2,9 mmol, 1,2 equiv.). La solucion se agito durante un adicional de 4 horas y se dejo calentar lentamente a temperatura ambiente. La solucion se vertio en un embudo de separacion y se lavo con 2 X 15 ml HCl (acuoso al 5 %) y NaCl concentrado 1 X 15 ml. La solucion se seco sobre Na2SO4 y el disolvente se retiro al vacio. El residuo se disolvio en EtOAc minimo y se cargo en una columna de silice, en la que se purifico por cromatografia en columna con EtOAc y hexano (1: 1) para dar 0,79 g de un solido de color blanco con un rendimiento del 72 %. m/z 458 (M+H)+ 475 (M+NH4)+ [ES+]
RMN 1H (DMSO-ds) o 7,2 (s, 1H [CONH]) 2,0 (m, 6H [CH2-CH2-COO-tbu]3) 1,8 (s, 3H [CH3-CO]) 1,7 (m, 6H [CH2- CH2-COO-tbu]3) 1,35 (s, 27H [CH2-CH2-COO-tbu]3)
Acido 4-acetilamino-4-(2-carboxi-etil)-heptanodioico (64)
Se anadieron 1,5 g de triester 63 (3,28 mmol) a 20 ml de acido formico (96 %) y se agito durante 4 horas. Despues de este tiempo, el acido formico se retiro mediante destilacion azeotropica con 5 porciones X 20 ml de tolueno. El residuo en bruto se recristalizo en EtOH y eter de petroleo para dar 0,9 g de cristales de color blanquecino con un rendimiento del 93 %. m/z 290 (M+H)+ [ES+]
RMN 1H (DMSO-ds) o 12 (s, 3H [CH2-COOH]) 7,2 (s, 1H [N-H]) 2,1 (m, 6H [CH2-CH2-COOHK 1,8 (m, 6H [CH2-CH2-
5
10
15
20
25
30
35
COO- tbu]3) 1,7 (s, 3H [CH3-CO])
bis-[(3-Benciloxi-1,6-dimetil-4-oxo-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-amida] del acido 4-acetilamino-4-{2-[(3- benciloxi-1,6-dimetil-4-oxo-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-carbamoil]-etil)-heptanodioic (65)
A 10 ml de DMF anhidra en un matraz de fondo redondo de 100 ml se le anadieron 0,4 g de 64 (1,38 mmol, 1 equiv.) 1,29 g de 60 (4,98 mmol, 3,6 equiv.) 0,67 g de HOBt (4,98 mmol, 3,6 equiv.) y 1,03 g de DCCI (4,98 mmol, 3,6 equiv.) La mezcla se agito durante 48 horas a temperatura ambiente en una atmosfera de N2. La solucion se filtro para retirar el DCU precipitado. La DMF se retiro al vado. El residuo se disolvio en metanol y se purifico por cromatografia en columna (gel de silice) con una fase movil 4:1 de CHCb/CH3OH. Las fracciones se combinaron, se secaron (Na2SO4) y el disolvente se retiro al vado para dar 0,7 g de un solido de color blanco con un rendimiento del 50 %.
m/z 1010 (M+H)+ 1032 (M+Na)+ [ES+]
RMN 1H (DMSO-ds) o 8 (t, 3H [CONH]) 7,3 (m, 15H [CH2-Bnz]) 7,15 (s, 1H [CONH]) 6,2 (s, 3H [5-H piridinona]) 5,05 (s, 6H [CH2-Bnz]) 4,3 (d, 6H [CONH-CH2-piridinona]) 3,35 (s, 9H [6-CH3 piridinona]) 2,2 (s, 9H [N-CH3 piridinona]) 2,0 (m, 6H [CH2-CH2-CONH-piridinona]) 1,75 (m, 6H [CH2-CH2-CONH-piridinona]) 1,7 (s, 3H [CH3-CONH-tripod])
sal tris clorhidrato de bis-[(3-hidroxi-1,6-dimetil-4-oxo-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-amida] del acido 4- acetilamino-4-{2-[(3-hidroxi-1,6-dimetil-4-oxo-1,4-dihidro-piridin-2-ilmetil)-carbamoil]-etil)-heptanodioico
(52) (CP256)
Se disolvieron 0,64 g de 65 (0,63 mmol, 1 equiv.) en 40 ml de CH3OH en un matraz de hidrogenacion de paredes gruesas. Se anadieron 2,3 ml de HCl (1,25 M en CH3OH) a la solucion. Se anadieron 0,2 g de catalizador de Pd/C y la solucion se hidrogeno durante 18 horas (temperatura ambiente, 275,79 KPa (40 psi)). El matraz se retiro con cuidado y la solucion se filtro para retirar el Pd/C. El disolvente se retiro al vado. El residuo se disolvio de nuevo en metanol minimo. El producto (52) se precipito con eter dietilico. Una vez que el precipitado se habia sedimentado, el sobrenadante se retiro y el precipitado se lavo con eter dietilico frio. El proceso se repitio 3 veces y el disolvente se retiro al vado para dar 0,4 g de la sal tris clorhidrato de 52 en forma de un solido de color blanco con un rendimiento del 74 %. m/z 740,4 (M+H)+ 370,7 (M+2H)2+
RMN 1H (DMSO-ds) o 8,8 (t, 3H [CONH]) 7,25 (s, 1H [CONH]) 7,1 (s, 3H [5-H piridinona]) 4,5 (d, 6H [CONH- CH2- piridinona]) 3,8 (s, 9h [6-CH3 piridinona]) 2,55 (s, 9H [N-CH3 piridinona]) 2,1 (m, 6H [CH2-CH2-CONH-piridinona]) 1,8 (m, 6H (CH2-CH2-CONH-piridinona]) 1,7 (s, 3H [CH3-CONH-tripod])
Ejemplo 2 - Caracterizacion de los complejos de galio y hierro del procedimiento de marcaje CP256 y Ga-67
La formation de los complejos Ga-CP256 y Fe-CP256 es evidente a partir de los datos espectrales de masa mostrados en la Tabla 1 y la Tabla 2. Se detecto la forma protonada de cada complejo y la distribution isotopica del espectro de masas coincide con los valores calculados registrados en la tabla 1. El complejo Ga-CP256 tiene dos especies moleculares para (M + H)+, a m/z 806 y m/z 808, debido a que el galio tiene dos isotopos estables con 5 masas atomicas de 69 y 71. No se encontro evidencia de complejos Ga- CP256 con relaciones Ga:ligando distintas de 1:1.
Los datos del espectro de masas para el complejo Fe-CP256 coinciden con las distribuciones isotopicas predichas.
10 Formulas moleculares y masas isotopicas
CP256: C36 H49 N7 O10 (M = 739,3541)
Ga-CP256: C36 H46 N7 O10 Ga (m = 805,2562)
Fe-CP256: C36 H46 N7 O10 [56Fe] (M = 792,2656)
Tabla 1. Resumen de los resultados CL-EM
- Muestra
- Tiempo de retencion de CL (min) Especies m/z (calculado) m/z (encontrado)
- CP256
- 5,1 (M + H)+ 740,3614 740,3631
- (M + 2H)2+ 370,6843 370,6865
- Ga-CP256
- 5,3 (M + H)+ 806,2635 806,2636
- (M + Na)+ 828,2454 828,2448
- (M + 2H)2+ 403,6354 403,6367
- (M + H + Na)2+ 414,6263 414,6266
- (M + 2Na)2+ 425,6173 425,6180
- Fe-CP256
- 5,4 (M + H)+ 793,2728 793,2733
- (M + Na)+ 815,2548 815,2545
- (M + 2H)2+ 397,1401 397,1401
- (M + H + Na)2+ 408,1310 408,1316
- (M + 2Na)2+ 419,1220 419,1230
15 El radiomarcaje CP256 con Ga-67 dio un producto cuya HPLC mostro un unico pico radiactivo con un tiempo de elucion identico al del complejo Ga-CP256 "frio".
Tabla 2. Distribuciones isotopicas calculadas y experimentales de Ga-CP256 y Fe-CP256 y el ligando CP256.
- Distribucion isotopica para (C36H46N7OioGa + H)+
- m/z: Calculada/(encontrada)
- % de abundancia relativa: Calculada/(encontrada)
- 806,2635/ (806,2635)
- 100,00/(100,00)
- 807,2635/ (807,2655)
- 42,59/(41,73)
- 808,2635/ (808,2634)
- 77,28/(76,99)
- 809,2635/ (809,2653)
- 30,34/(29,20)
- 810,2635/ (810,2670)
- 7,56/(7,36)
- Distribucion isotopica para (C36H46N7O10 Fe + H)+
- m/z: Calculada/(encontrada)
- % de abundancia relativa: Calculada/(encontrada)
- 791,2775/ (791,2779)
- 6,33/(5,47)
- 792,2775/ (792,2768)
- 2,69/(2,92)
- 793,2775/ (793,2741)
- 100,00/(100,00)
- 794,2775/ (794,2765)
- 49,72/(42,20)
- 795,2775/ (795,2782)
- 12,14/(10,88)
- Distribucion isotopica para (C36H49N7O10 + 2H)2+
- m/z: Calculada/(encontrada)
- % de abundancia relativa: Calculada/(encontrada)
- 370,6843/(370,6858)
- 100,00/(100,00)
- 371,1843/(371,1869)
- 42,64/(51,38)
- 371,6843/(371,6887)
- 10,93/(14,26)
20 Detalles experimentales Preparation de complejos
Ga-CP256
Se disolvio 1 mg de CP256 en 1 ml de metanol para dar una concentracion de ligando de 1,18 mM (basado en el 25 aducto de tris HCl de CP256 con RMM de 848). Esta solution se anadio a 0,3 mg de Ga(NO3)3 anhidro (RMM 255) para dar una estequiometria metal a ligando de 1: 1 a una concentration de 1,18 mM.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Fe-CP256
El complejo Fe3+ se produjo en un procedimiento analogo al complejo Ga3+, pero como Fe(NO3)3.9H2O (RMM = 386) como la fuente de metal.
Analisis de la muestra
Las muestras se analizaron por CL-EM. El sistema HPLC fue un sistema Agilent 1200 con desgasificador, bomba cuaternaria, Detector de longitud de onda variable UV-visible y un autoamplificador. El espectrometro de masas fue un Agilent 6520 Accurate-Mass Q-TOF CL/EM. Las muestras se adquirieron usando el programa informatico de adquisicion de estacion de trabajo Agilent Masshunter y los datos se analizaron usando el programa informatico de analisis cualitativo Agilent Masshunter. La columna de HPLC usada fue una columna Agilent Zorbax SB cartucho C18 (2,1 mm X 30 mm, 3,5 |jm.) El caudal del eluyente era de 0,5 ml/min y la fase movil era un gradiente usando reactivos de grado de espectrometria de masas: A = H2O + acido formico al 0,1 % (Fluka, 34673) y B = metanol + acido formico al 0,1 %(Fluka, 34671). El gradiente se da en la Tabla 3. Los espectros se adquirieron usando ionizacion por electronebulizacion en modo positivo usando correccion de masa de referencia con hexakis(1H,1H,3H-etrafluoropropoxi)fosfazina (Ci8Hi8SN3O6P3F24, m/z = 922,0098 [M + H]+). Las distribuciones isotopicas se calcularon usando la Calculadora de Peso Molecular version 6.46.
Tabla 3. Gradiente para el analisis de CL-EM de CP256 y los complejos Fe3+ y Ga3+.
- Tiempo (min)
- A (%) B (%)
- 0
- 95 5
- 1
- 95 5
- 10
- 5 95
- 20
- 5 95
- 23
- 95 5
- 30
- 95 5
HPLC de muestras radiomarcadas
Analisis de HPLC
Los analisis de HPLC se realizaron con un detector FC3600 y una sonda detectora y conectada en serie. El sistema HPLC, fue un Agilent 1200 series con bomba cuadruple, desgasificador, detector de UV y un inyector de jeringa manual. La columna de HPLC usada para todos los analisis fue un Agilent Eclipse XDB-C18 (5 jm, 4,6 mm X 150 mm) con una columna de proteccion. El programa informatico analitico usado para radio-TLC y radio-HPLC fue Laura (Lablogic). Todos los reactivos generales y consumibles se adquirieron de Sigma-Aldrich o de Fisher Scientific. La solucion67Ga-citrato para inyeccion se obtuvo de Mallinkrodt Medical, 74 MBq/ml (fecha de ref.; contiene citrato sodico 6,5 mM, NaCl 135 mM, alcohol bencilico al 0,9 %).
Procedimiento de radiomarcaje para analisis HPLC
Se preparo una solucion madre de 1 mg/ml de CP256 en tampon PBS en un tubo de microcentrifugado de plastico de 1 ml. Se prepararon soluciones de radiomarcaje anadiendo una alicuota de 10 jl de la solucion madre a 90 jl de tampon de marcado en un tubo de microcentrifugado de plastico para dar una concentracion de ligando total de 0,1 jl/ml en 100 jl. Esta solucion se radiomarco anadiendo 10 jl de 67Ga-citrato. Las condiciones de radiomarcaje se muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Condiciones de radiomarcaje para CP256 con 61Ga
- LIGANDO
- TAMPON DE TEMPERATURA DE TIEMPO DE uG™D'oD(M) ph MEDIDO
- MARCAJE
- MARCAJE
- MARCAJE
- CP256
- PBS 25 °C 1 min 1,18 X 10-4 6,6
fase movil de HPLC
Gradiente lineal de B al 10 % a 0 minutos hasta B al 90 % a 15 minutos. (A = TFA al 0,1 % en H2O, B = TFA al 0,1 % en Metanol). El caudal fue de 1 ml/min.
Inyeccion de muestra de HPLC
Se inyectaron manualmente 20 jl de la muestra en la HPLC usando una jeringuilla de HPLC de 25 jl.
Ejemplo 3 - Eficacia de marcaje CP256 con datos Ga-67
Los resultados de radiomarcaje en la tabla 5, medidos por Cromatografia de Capa Delgada (TLC) muestran que los
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
radiomarcadores CP256 con 67Ga a temperatura ambiente a concentraciones menores que DOTA se hacen a temperatura elevada, con radiomarcaje al 100 % a una concentracion tan baja como 10 |jM mientras que el rendimiento de radiomarcaje para DOTA a 10 jM es solo el 35 %. Estos resultados se muestran graficamente en la figura 1.
Tabla 5. Rendimientos de radiomarcaje de 61Ga-CP256 y 67Ga-DOTA. Calculado para analisis TLC.
- CONCENTRACION DE LIGANDO
- RADIOINDICADOR CP256 RENDIMIENTO DE MARCAJE DOTA
- 1 mM
- 100 100
- 100 jM
- 100 100
- 10 jM
- 100 35
- 1 jM
- 84 0
- 100 nM
- 0 0
- 10 nM
- 0 0
Detalles experimentales
Todos los reactivos generales y consumibles se adquirieron de Sigma-Aldrich o de Fisher Scientific. Los productos quimicos y consumibles especializados se adquirieron como sigue a continuacion: Solucion tampon de acetato pH 4,6 (Sigma Aldrich 31048-1L); Solucion 67Ga-citrato para inyeccion (Mallinkrodt Medical) 74 MBq/ml (fecha de ref.; contiene citrato sodico 6,5 mM, NaCl 135 mM, alcohol bencilico al 0,9 %); placas de vidrio de TLC (gel de s^lice 60, F254, 2 50 mm X 750 mm) (Merck); tiras ITLC-SG (Pall Sciences).
Procedimiento para manchar y ejecutar placas de TLC
Las placas de TLC de silice y las tiras de ITLC-SG se mancharon con 1 jl de complejo radiomarcado en el origen, que se marco a 5 mm a lapiz. Se dejaron secar las manchas sobre placas de TLC de gel de silice, pero no para las tiras de ITLC-SG. Las placas se colocaron en una camara de revelado (botella de muestra de 100 ml de cuello ancho) rellena con una profundidad de 3 mm de la fase movil. Las fases estacionarias y las fases moviles se enumeran en la tabla 8. La placa de TLC se desarrollo hasta que el frente de disolvente habia alcanzado una distancia de hasta 65 mm. Las placas se retiraron de la camara de revelado y se secaron en un horno ajustado a 80 °C. Los rendimientos radioquimicos se determinaron usando el programa informatico Laura o el programa informatico de imagenes instantaneas.
Los analisis de TLC y ITLC se llevaron a cabo en un escaner de TLC Mini-Scan con detector FC3600 y una sonda detectora y. El programa informatico analitico usado fue Laura (Lablogic). Las muestras radiactivas se contaron durante 10 segundos (ventana 101-110) en un contador Gamma Compugamma 1282 (LKB Wallac) usando el programa informatico Ultroterm. El calibrador de dosis utilizado para medir la radiactividad en las muestras fue un CRC-25R (Capintec). La autorradiografia electronica se realizo en un programa informatico de Imagen Instantanea Packard con Imagen version 2.05. La mezcla gaseosa fue isobutano al 1 %, dioxido de carbono al 2,5 % y argon al 96,5 % (Air products).
Procedimiento de radiomarcaje para la determinacion del rendimiento radioauimico por analisis TLC
Se prepararon soluciones madre de 1,25 mM de cada ligando en el tampon de marcaje apropiado, como se enumera en la tabla 6.
La solucion madre se diluyo 10 veces mediante adicion sucesiva del tampon de radiomarcaje para crear soluciones adicionales con concentraciones de ligando de 125 jM, 12,5 jM, 1,25 jM, 125 nM y 12,5 nM. Se anadieron ochenta microlitros de cada solucion a un tubo de microcentrifugado de plastico y se radiomarco con 20 jl de 67Ga-citrato (1,5 MBq) para producir soluciones radiomarcadas con concentraciones finales de ligando de 1 mM, 100 jM, 10 jM, 1 jM y 100 nM. Se uso un bloque de calentador metalico (que contenia aceite en los pocillos) para calentar la solucion 67Ga-DOTA. Las condiciones de radiomarcaje se muestran en la tabla 6.
Tabla 6. Condiciones de radiomarcaje para cada ligando. Las concentraciones finales de cada ligando en la mezcla _______________de marcaje fueron de 1 mM, 100 jM, 10 jM, 1 jM, 100 nM y 10 nM._______________
- LIGANDO
- TAMPON DE MARCAJE TEMPERATURA DE MARCAJE TIEMPO DE MARCAJE pH MEDIDO
- DOTA
- Acetato 80 °C 45 min 4,6
- CP256
- PBS 25 °C 1 min 6,6
Ejemplo 4 - CP256 marcado con Ga-67 - estabilidad cinetica
Estabilidad de 67Ga-CP256 en apo-transferrina mediante exclusion por tamano de PD10
La Figura 2 muestra los perfiles de elucion de 67Ga-CP256 de una columna PD10 para soluciones radiomarcadas a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
100 jM (A) y 10 |jM (B) de CP256. despues de la dilucion e incubacion en apo-transferrina, las concentraciones de CP256 en estas soluciones fueron 227 jM y 2,27 nM, respectivamente. Despues de 4 horas de incubacion en apo- transferrina, el perfil es el mismo que el de la incubacion en el tampon de referencia, indicando que no hay union de 67Ga a transferrina o perdida de 67Ga del ligando, para cualquiera de las soluciones de 2,27 jM o 227 nM.
Estabilidad radiofarmaceutica usando filtros de MWCO de 30 kDa
Como se muestra en la tabla 7 y en la figura 3, la union residual de todos los indicadores radiomarcados a la membrana filtrante fue baja (< 5%). El setenta y tres por ciento de la radiactividad de la incubacion de 67Ga-citrato en apo-transferrina se asocio con el filtro MWCO despues de 4 horas. El metodo MWCO tambien mostro una transquelacion despreciable de 67Ga a apo-transferrina (< 1 %) en las soluciones 67Ga-CP256 y 67Ga-DOTA durante el periodo de incubacion de 4 horas. En el caso de la solucion CP256 100 jM (2,27 jM en apo-transferrina) la union de fondo de la incubacion en el tampon de referencia fue mayor en 1 %. 67Ga-DTPA mostro cierta disociacion durante el periodo de incubacion de 4 horas, con un 10 % de union extra de la radiactividad en esta solucion al filtro cuando se compara con la solucion en el tampon de referencia.
Tabla 7. Union de 67Ga-citrato, 67Ga-CP2 56, 67Ga-DOTA y 67Ga-DTPA a filtros de MWCO de 30 kDa.
- INDICADOR
- % DE RADIOACTIVIDAD UNIDA AL FILTRO DE MWCO EN LA INCUBACION DE APO-TRANSFERRINA DE TAMPON DE REFERENCIA, DESPUES DE 4 HORAS
- 67Ga-CITRATO
- 1,7 ± 0,5 73,0 ± 4,1
- 67Ga-CP256 (10 jM)
- 3,5 ± 1,3 3,9 ± 0,8
- 67Ga-CP256 (100 jM)
- 9,9 ± 0,5 3,8 ± 0,5
- 67Ga-DOTA
- 1,5 ± 1,7 2,6 ± 0,8
- 67Ga-DTPA
- 1,5 ± 0,6 11,4 ± 1,4
Detalles experimentales
Los productos quimicos y consumibles especializados se adquirieron como sigue a continuacion: apo-transferrina humana (Sigma Aldrich T5391-10MG); filtros de MWCO 30 kDa Sartorius Vivaspin 500 (Fisher Scientific FDP-875- 025B); columnas PD10 (GE Healthcare 17-0851-01); espectrofotometria UV de apo-transferrina se realizo en un espectrofotometro Cary UV con el programa informatico Cary WinUV. La longitud de onda se ajusto a 280 nm.
Tabla 8. Detalles de fases moviles y fases estacionarias usadas para el control de calidad TLC e ITLC de 67Ga-CP2 ______________________________56, 67Ga-DOTA y 67Ga-DTPA.______________________________
- RADIOINDICADOR
- FASE MOVIL FASE ESTACIONARIA
- 67Ga-CP256
- Metanol/acido citrico (0,5 M)/formiato amonico (10 % en peso, v) [40/20/40] Gel de Silice
- 67Ga-DOTA
- Citrato sodico (ac.) [0,3 M] Gel de Silice
- 67Ga-DTPA
- Metanol/acido citrico (0,5 M)/formiato amonico (10 % en peso, v) [40/20/40] Gel de Silice
- Metanol/acido acetico (0,5 M) formiato amonico (10 % en peso, v) [40/20/40] Gel de Silice
- Acido acetico [0,5 M] Gel de Silice
- 9/1 /0,1 metanol/acido acetico glacial/citrato sodico [0,3 M] ITLC-SG
- Citrato sodico [0,1 M] ITLC-SG
Preparacion de la solucion de referencia 67Ga-citrato
Una solucion de referencia de 67Ga-citrato se produjo mediante la incubacion de 20 jl 67Ga-citrato en 200 jl PBS. Esta solucion se incubo a 37 °C en un bloque de calentamiento metalico y se retiraron las muestras para su analisis de la misma manera que para la incubacion en suero.
Preparacion de la solucion de apo-transferrina
Se preparo tampon TRIS-HCl 50 mM (pH 7,5) por dilucion de una solucion madre 1 M. Se anadio bicarbonato sodico a una concentracion de 25 mM. Se preparo una solucion de apo-transferrina de 2,5 mg/ml (32 jM) en este tampon.
Preparacion de 67Ga-indicadores
Las soluciones de todos los indicadores se radiomarcaban a una concentracion de 100 jM. Tambien se preparo una solucion CP256 10 jM. Vease la tabla 9 para las condiciones de radiomarcaje.
Se anadio una alicuota de 10 jl de cada indicador radiomarcado a 30 jl de un tampon apropiado para neutralizar el pH entre 7 y 7,5. Este tampon fue TRIS-HCl 2 M (pH 7,5) en el caso de aquellos indicadores marcados en el tampon
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de acetato. Para las preparaciones de 67Ga-CP256 y 67Ga-citrato el tampon fue PBS. Los detalles pueden verse en la Tabla 9.
Tabla 9. Condiciones de radiomarcaje del indicador.
- LIGANDO
- CONC. DE LIGANDO DESPUES DEL RADIOMARCAJE TAMPON DE RADIOMARCAJE TAMPON DE DILUCION CONC. DE LIGANDO FINAL
- DOTA
- 100 jM Acetato TRIS 25 jM
- DTPA
- 100 jM Acetato TRIS 25 jM
- CP256
- 100 jM PBS PBS 25 jM
- 10 jM PBS PBS 2,5 jM
Incubacion de indicador en Apo-Transferrina
La solucion de Apo-transferrina (200 |jl) en un tubo de microcentrifugada de plastico se incubo a 37 °C en un bloque de calentamiento metalico. A esta se le anadieron 20 jl de cada indicador neutralizado por pH. Tambien se incubaron 20 jl de cada indicador en un tampon de referencia (que no contenia apo-transferrina) de TRIS-HCl 50 mM que contenia bicarbonato sodico 25 mM.
Incubacion del Indicador en el Tampon de Referencia
La solucion TRIS-HCl 50 mM (200 jl, que no contenia apo-transferrina) se incubo en un bloque de calentamiento a 37 °C. Se anadio el indicador ajustado al pH apropiado (20 jl) a la incubacion. Se tomaron alicuotas a intervalos apropiados para el analisis.
Filtracion en gel usando una columna PD10.
Incubaciones de Apo-transferrina
El equilibrado y la elucion de las columnas PD10 se realizo con bicarbonato sodico 25 mM anadido al tampon de elucion de PBS. Los perfiles de elucion estandar de 67Ga-citrato, 67Ga-CP2 56, 67Ga-DOTA y 67Ga-DTPA se determinaron anadiendo 20 jl de cada indicador que se habia incubado en el tampon de referencia (TRIS-HCl 50 mM que contenia bicarbonato sodico 25 mM) y eluyendo las columnas como se ha descrito anteriormente.
Para calcular el porcentaje de actividad eluida total por cada fraccion de 0,5 ml
La radiactividad total eluida para cada columna se calculo sumando los recuentos para cada una de las 30 fracciones. La actividad eluida para cada fraccion se calculo entonces mediante la siguiente ecuacion:
Recuento por fraccion__________x 100
Total recuentos (para un total de 30 fracciones)
Perfil de elucion UV de Apo-transferrina de una columna de filtracion en gel PD10
El perfil de elucion de Transferencia desde una columna PD10 se determino por espectrofotometria UV. Se cargo apo-transferrina (no radioactiva, 500 jl de la solucion de 2,5 mg/ml) sobre una columna PD10, eluyendo con tampon PBS y se recogieron fracciones de 0,5 ml. Las muestras se cargaron en una cubeta de cuarzo de 1 ml y se diluyeron hasta 0,9 ml con un extra de 0,4 ml de PBS. La absorbancia se determino a 280 nm con PBS como una referencia convencional.
Determinacion de la estabilidad del indicador usando filtros de microcentrifugado MWCO de 30 kDa
Se aplico PBS (100 jl, que contenia bicarbonato 25 mM) a la seccion superior (seccion del filtro) del tubo. Se anadio la solucion de incubacion (5 jl) para cada indicador (despues de 4 horas) y se centrifugo el tubo en una microcentrifugadora a 10000 g durante 8 minutos. Se aplicaron otros 100 jl de PBS para lavar y se centrifugo de nuevo el tubo a 10000 g durante otros 8 minutos. La seccion de filtro del tubo se retiro y se conto separadamente del tubo en un contador gamma. El porcentaje de union de la radiactividad al filtro MWCO se calculo usando la siguiente ecuacion:
Recuentos de la seccion del filtro___________________________x 100
Recuentos de la seccion del filtro+ recuentos de la seccion del tubo
El analisis se realizo por triplicado despues de 4 horas para las incubaciones de apo-transferrina. El analisis se realizo 6 veces (6 tubos) para las incubaciones en el tampon de referencia TRIS-HCl 50 mM. Los valores medios se tomaron como se ha descrito anteriormente.
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Ejemplo 5 - Sintesis de conjugados de CP256-maleimida
Sintesis de quelante hexadentado unido a maleimida 7. a) anhndrido maleico/DMF; b) DCC/NHS/DMF; c) 4/DMF; d) BCI3/DCM; e) Et3N/DCM.
Detalles experimental
La sintesis del compuesto 4 se ha indicado previamente (Zhou T. et al., J Med Chem. 2006, 49, 4171-4182).
Sintesis de 3-maleimidopropanoato de succinimido 3
Una solucion de p-alanina (1,8 g, 20 mmol) y anhidrido maleico (2 g, 20 mmol) en DMF (30 ml) se agito a temperatura ambiente durante 3 h. Despues de que el solido se disolviese completamente, se anadieron N- hidroxisuccinimida (NHS; 2,3 g, 20 mmol) y diciclohexilcarbodiimida (DCC; 4,6 g, 24 mmol) en la solucion y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante una noche. La solucion se filtro y el precipitado se lavo con agua (100 ml) y diclorometano (100 ml). El filtrado se recogio y la capa organica se lavo con NaHCO3 al 5 % 3x50 ml y una vez con salmuera. La capa organica se seco con Na2SO4 y el diclorometano se retiro a presion reducida para obtener un solido de color blanco (55 %). Este solido no necesita purificacion adicional y puede usarse directamente para la siguiente etapa de acoplamiento. RMN 1H (CDCb, 400 MHz): 5 2,82 (s, 4H, dos succinimido-CH2), 3,02 (t, J=7,0 Hz, 2H, COCH2), 3,94 (t, J=7,0 Hz, 2H, NCH2), 6,74 (s, 2H, dos CH).
Sintesis del compuesto 5
El acido activado 3 (6 mmol) y la amina 4 (5 mmol) en DMF anhidra (50 ml) se agito a temperatura ambiente durante un dia. El disolvente se retiro a presion reducida y el residuo se purifico sobre una columna de gel de silice usando cloroformo:metanol (8:2) como eluyente para proporcionar una espuma de color blanco (81 %). RMN 1H (CDCb, 400 MHz): 5 2,05 (s a, 6H, CH2), 2,15 (s, 9H, CH3), 2,23 (s a, 2H, CH2), 2,29 (s a, 6H, CH2), 2,41 (t, J=6,6 Hz, 2H, CH2), 3,32 (s a, 2H, CH2), 3,36 (s, 9H, CH3), 3,73 (t, J=6. Hz, 2H, CH2), 4,35 (s, 6H, CH2), 4,87 (s, 6H, CH2), 6,10 (s, 3H, CH), 6,65 (s, 2H, CH), 6,76 (s a, 1H, Nh), 7,23-7,30 (m, 15H, ArH), 7,72 (s a, 3H, NH). RMN 13C (CDCb, 100 MHz): 20,81 (CH3), 30,70 (CH2), 31,71 (CH2), 34,43 (CH2), 34,62 (CH2), 34,82 (CH2), 36,31 (CH3), 36,68 (CH2), 57,99, 73,42 (CH2), 118,25 (CH), 128,30 (CH), 128,52 (CH), 128,58 (CH), 134,23 (CH), 136,97, 141,05, 146,35, 148,04, 170,43, 170,66, 171,70, 173,10, 173,23. IEN-EM: 1190,40 (M+1)+
Sintesis del compuesto 6
Al compuesto de proteccion de bencilo 5 en DCM anhidro en N2 se le anadio tricloruro de boro (12 equiv.) en un bano de hielo y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante 2 dias. El exceso de BCb se inactivo anadiendo MeOH seguido de 1 ml de acido clorhidrico concentrado. La mezcla se evaporo para obtener un solido de color pardo, que se disolvio en metanol y se precipito con la adicion de acetona. Este procedimiento se repitio tres veces para proporcionar un solido de color blanco (72 %). RMN 1H (DMSO-d6, 400 MHz): 5 1,75-1,84 (m, 6h, CH2), 2,082,13 (m, 6H, (CH2), 2,21 (t, J=7,1 Hz, 2H, CH2), 2,32 (t, J=7,5 Hz, 2H, CH2), 2,57 (s, 9H, CH2), 2,85 (dd, J=4,1, 8,3 Hz, 1H, un H de CH2 maleico), 3,16 (c, J=6,5 Hz, 2H, CH2), 3,34 (dd, J=8,5, 18,3Hz, 1H, un H de CH2 maleico), 3,58 (t, J=7,5 Hz, 2H, CH2), 3,89 (s, 9H, CH3), 4,57 (d, J=5,0 Hz, 6H, CH2), 4,99 (dd, J = 4,1/8,5 Hz, 1H de CH maleico), 7,28 (s, 3H, CH), 7,30 (s a, 1H, NH), 8,09 (t, J=5,6 Hz, 1H, NH), 8,92 (t, J=5,1 Hz, 3H, NH). RMN 13C (DMSO-ds, 100
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MHz): 5 20,56 (CH3), 29,26, (CH2), 29,98 (CH2), 32,67 (CH2), 34,71 (CH2), 35,27 (CH2), 35,58 (CH2), 35,83 (CH2), 39,00 (CH2), 39,05 (CH3), 49,82 (CH), 56,79, 112,73 (CH), 139,90, 142,69, 148,55, 159,59, 169,12, 170,08, 173,18, 173,36, 173,44. IEN-EM: 956,27 (M+1)+. HRMS: Calc. para C44H59CIN9O13 (M+1)+, 956,3921; Encontrado, 956,3953.
Smtesis del compuesto 7
Al compuesto 6 (20 mg) en DCM (20 ml) se le anadio Et3N en exceso y la mezcla se agito a temperatura ambiente durante una noche. Despues de la evaporacion para retirar el disolvente, el residuo se cargo en una columna de extraccion en fase solida disolviendo en 1 ml de solucion de acido formico al 0,1 %. La columna se lavo en primer lugar con acido formico al 0,1 % (10 ml) para retirar la sal de clorhidrato de trietilamina, seguido de elucion de metanol (10 ml). La fraccion de la solucion de metanol se concentro y se seco mediante horno de vacio para dar un polvo blanco (80 %). RMN 1H (CD3OD, 400 MHz): 5 1,94-2,03 (m, 6H, CH2), 2,20-2,29 (m, 6H, CH2), 2,32 (t, J=6,3 Hz, 2H, CH2), 2,38 (s, 9H, CH3), 2,42 (t, J=7,0 Hz, 2H, CH2), 3,31 (c, J=6,7 Hz, 2H, CH2), 3,66 (s, 9H, CH2), 3,69 (t, J=7,1Hz, 2H, CH2), 4,58 (s, 6H, CH2), 5,25 (s, 3H, NH), 6,29 (s, 3H, CH), 6,81 (s, 2H, CH). RMN 13C (CD3OD, 100 MHz): 5 21,03 (CH3), 30,11, (CH2), 31,48 (CH2), 35,43 (CH2), 35,69 (CH2), 36,02 (CH2), 37,21 (CH3), 37,49 (CH2), 59,17, 63,70 (CH2), 114,58 (CH), 129,59, 132,25, 135,57 (CH), 147,38, 148,87, 171,12, 172,26, 172,98, 173,33, 175,89. IEN-EM: 920,33 (M+1)+. HRMS: Calc. para C44H58N9O13 (M+1)+, 920,4154; Encontrado, 920,4146.
Ejemplo 6 - Coniuaacion de CP256-clorosuccinimida (6) o CP256-maleimida (7) con oroteina C2Ac
C2A es una pequena proteina que reconoce la fosfatidilserina mostrada en las celulas sometidas a apoptosis. Se ha disenado con un residuo de cisteina para facilitar el marcaje especifico del sitio con agentes reactivos con tiol (vease Tavare R, Torres Martin de Rosales R, Blower PJ, Mullen GED. Efficient site-specific radiolabeling of a modified C2A domain of synaptotagmin I with [99mTc(CO)3]+. a new radiopharmaceutical for imaging cell death. Bioconjugate Chem 2009; 20:2071-2081). La proteina manipulada resultante (C2Ac) se conjugo con CP256 usando 6 o 7. El mismo producto se obtuvo para ambas reacciones de conjugacion.
El peso molecular medio de C2Ac es 14997 y por lo tanto se esperaba que el conjugado C2Ac- (7) tuviera un peso molecular medio de 15918,44. El peso molecular medio encontrado fue 15970,85, que corresponde al conjugado C2Ac-(7) con un atomo de hierro adicional y sin 3 atomos de hidrogeno.
Detalles experimental
Se trato C2Ac (2 mg en una solucion de 2 mg/ml) con un exceso molar de 3:1 de quelante hexadentato de clorosuccinimida (6) o quelante de maleimida-hexadentato (7) durante 4 horas a temperatura ambiente. La mezcla se purifico usando una columna PD-10 previamente equilibrada con PBS que se habia almacenado sobre Chelex y se analizo mediante CL-EM.
Eiemolo 7 - Marcaie de conjugado de proteina C2Ac con 68Ga y datos funcionales sobre proteina marcada
El conjugado C2Ac- (7) se marco radiactivamente con 68Ga de acuerdo con el metodo descrito en el presente documento. La Figura 4 muestra un alto grado de quelacion despues de solo 15 minutos de incubacion con 68Ga en tampon acetato. El conjugado marcado con 68Ga mostro una union dependiente del calcio especifica a la fosfatidilserina (PS) en un ensayo de union a globulos rojos (vease la Fig. 5).
Detalles experimentales
Se preparo 68Ga sin quelar en tampon, como sigue a continuacion. El generador se eluyo con 2 ml de HCl 0,1 M para dar el eluato de 68Ga 25 MBq. Se anadieron 1,5 ml de acido clorhidrico conc. (36 %) a la elucion para dar una concentracion final de HCl 4 M para formar anion de tetracloruro de galio y la solucion paso a traves de una columna de intercambio anionico (SAX SPEC, Chromafix 30-PS- HCO3, 45 mg, Macherey-Nagel, Alemania), atrapando toda la actividad. La columna se lavo despues con 250 |jl de NaCl 5 M y la actividad se eluyo con 300 |jl de agua destilada y el eluato (pH <1, ~70 MBq) se tampono anadiendo 5 jl de NaOH 1 M y 30 jl de tampon de acetato amonico 1 M, pH 6, elevando el pH a 7. Despues se anadieron 100 jl de PBS, pH 6.
Se anadieron 200 jl de la solucion de 68Ga preconcentrada y tamponada a 100 jg (en 100 jl) del conjugado quelante C2Ac-(7). A intervalos de 5 minutos, se pusieron 2 jl de la mezcla sobre ITLC-SG y el cromatograma desarrollado usando tampon citrato 0,1 M como fase movil.
La union de C2Ac-(7) radiomarcado a PS sobre globulos rojos (RBC) se realizo de acuerdo con un metodo de la bibliografia (vease Tait, J. F., Gibson, D. F., y Smith, C. (2004) Measurement of the affinity and cooperativity of annexin V- membrane binding under conditions of low membrane occupancy. Anal. Biochem.329, 112-119). Se obtuvo una preparacion comercial de RBC humano conservado de Beckman-Coulter (High Wycombe, RU). Las titulaciones de calcio de RBC se realizaron en un tampon de HEPES-sodio 50 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, NaN3 3 mM, con 1 mg/ml de BSA como proteina portadora. Las reacciones se prepararon con C2AcH 1 nM marcado con 68Ga y calcio; Despues se anadio RBC y la reaccion (1 ml) se incubo durante 8 min a TA.
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Despues, las celulas se centrifugaron (3 min a 7500 RCF), el sobrenadante se retiro y las celulas se volvieron a suspender en 1 ml de tampon de ensayo que contenia la misma concentracion de calcio utilizada durante la etapa de incubacion. Las celulas se centrifugaron de nuevo, el sobrenadante se retiro y el microgranulo se volvio a suspender en 0,7 ml de tampon de ensayo mas acido etilendiaminotetraacetico (EDTA) 10 mM para liberar C2Ac-(7) marcado con 68Ga unido de manera dependiente del calcio. Despues de la centrifugacion para retirar el RBC, se midio el C2Ac-(7) marcado liberado en el sobrenadante usando un contador gamma. El CE50 se calculo como se describe en la bibliografia usando la ecuacion Y = [Ca]N/([Ca]N + EC50N) en la que Y = B/Bmax, B es la cantidad observada de proteina radiomarcada unida a una concentracion dada de calcio y Bmax es la concentracion de proteina radiomarcada unida a concentraciones saturadas de calcio.
El ajuste de la curva se realizo usando una curva no lineal ajustada por una rutina basada en el algoritmo de Levenberg-Marquardt usando Kaleidagraph (Synergy Software, Reading, Estados Unidos).
Ejemplo 8 - escaneado TEP y biodistribucion en ratones con coniuaado de 68Ga-C2Ac
En las figuras 6a y 6b se muestran las imagenes TEP tomadas 1,5 horas tras la inyeccion en ratones del conjugado de 68Ga-C2Ac-(7) y el 68Ga no quelado ("libre"), respectivamente. La presencia de 68Ga se muestra con areas en blanco claro en la imagen. La inyeccion del conjugado de 68Ga-C2Ac-(7) mostro la rapida eliminacion de la radioactividad en la sangre y los tejidos, con una absorcion casi exclusiva en el rinon y una pequena cantidad de actividad excretada al bazo (figura 6a). Esto se diferencia de las imagenes obtenidas con la inyeccion de 68Ga "libre", en las que se vio como la actividad se iba eliminando lentamente de la sangre hasta predominantemente remodelar el hueso (figura 6b).
Tabla 10 - porcentaje de radioactividad inyectada por gramo en los tejidos de raton 90 minutos despues de la
inyeccion del conjugado de 68Ga-C2Ac-(7).
- Media (n=4) Desv. std
- Bazo
- 0,46 0,11
- Estomago
- 0,77 0,31
- Intestino
- 0,42 0,06
- Intestino ciego
- 0,34 0,05
- Higado
- 0,94 0,15
- Sangre
- 0,33 0,18
- Rinones
- 155,29 27,21
- Timo
- 0,27 0,09
- Corazon
- 0,47 0,15
- Pulmones
- 0,63 0,15
- Musculo
- 0,39 0,23
- Femur (I)
- 0,40 0,10
- Rabo
- 0,85 0,29
Detalles experimentales
El conjugado de 68Ga marcado con C2Ac-(7) se sintetizo tal y como se ha descrito anteriormente. El 68Ga no quelado en la solucion tamponada se preparo usando el metodo de preconcentracion (y la solucion tamponada a 7 pH) descrito en el ejemplo 7. Se realizo el analisis de CCF (cromatografia en capa fina). No se detecto precipitado de hidroxido de galio en el momento de la inyeccion. Las soluciones para la inyeccion se filtraron a traves de un filtro de 0,22 |jm y se inyectaron en las venas del rabo de los ratones hembra C57B/6 (n=4, 10 10 MBq en 100 |jl para cada animal). Los escaneres TEP/TC se adquirieron 90 minutos despues de la inyeccion usando un escaner NanoPET/CT (Bioscan, Paris, Francia) con un tiempo de adquisicion TEP de 1800 s, proportion de coincidencia: 1-3. Reconstruction de imagenes: OSEM con SSRB 2D LOR, ventana de energia: 400-600 keV, filtro: punto de corte Ramlak 1, numero de repeticiones/subconjuntos: 8/6. Los animales se sacrificaron en 90 minutos y los organos explantados se contaron en un contador gamma para determinar la biodistribucion.
Ejemplo 9 - Marcaie del CP256 con 68Ga en suero
La figura 7 muestra la radiocromatografia de exclusion por tamano (columna PD10) de la quelacion del 68Ga por el CP256 en suero y los experimentos de control que muestran el cloruro de 68Ga incubado en suero; el complejo de 68Ga-CP256-(7) preformado incubado con suero y el 69Ga incubado en solucion tamponada.
Como medicion de la eficacia de la quelacion del 68Ga con CP256, y para demostrar la viabilidad del enfoque de predireccionamiento descrito anteriormente, el marcaje se llevo a cabo en suero, presentando de esta forma el proceso de quelacion una exposition a la transferrina en suero. La adicion del cloruro de 68Ga en una mezcla de CP256 y suero proporciono un cromatograma por exclusion de tamano similar al de 6BGa-CP256 cuando la
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concentracion de la muestra de CP256 era de 23 |jM o mas, mientras que solo la adicion de 68Ga al suero proporciono un cromatograma coherente con una mezcla de complejo de 68Ga-transferrina y galio "libre". Esto muestra que el CP256 compite eficazmente con la transferrina en suero. Ademas, si el 68Ga se equilibraba primero con suero, y despues se anadia el CP256, voMa a observarse un cromatograma similar al de 68Ga-CP256, mostrando que el CP256 es capaz de extraer el 68Ga del complejo 68Ga-transferrina. La precipitacion de etanol y los experimentos de CCFI (cromatografia en capa fina instantanea) confirmaron que en el suero que contenia CP256 no existia union a la proteina cuantificable ni 68Ga libre detectable. Todo el 68Ga permanecio al principio en la CCFI de los sobrenadantes. Estas observaciones sugieren que los conjugados de 68Ga y CP256 podrian usarse en un modo de "predireccionamiento" novedoso in vivo, en el que se administra un conjugado de CP256 dirigido y se permite que se fije a una diana, seguido de la inyeccion de 68Ga para localizar el CP256 predirigido.
Detalles experimentales
Se usaron dos tecnicas diferentes de radiomarcaje. En el metodo 1, 100 jl de quelato (CP-256, 2,35 mM, 1,17 mM, 589 pM, 117 jM, 23 jM y 11,7 jM; pH 7-7,5 en una solucion tamponada de pBS/bicarbonato) se mezclaron con 300 jl de suero humano. Tras 10-15 minutos, se anadieron 20 jl de eluato de 68Ga y la solucion se incubo a 37 °C en un tubo de plastico. En el segundo metodo, se anadieron 20 jl de solucion de 68Ga a los 300 jl de suero de sangre humana. Tras 15-20 minutos, se anadieron 100 jl de quelato (Cp-256). En cada momento, se aplicaron 50 jl de la solucion de incubacion a la parte superior de la columna PD-10 y la columna con PBS se eluyo recogiendo fracciones de 0,5 ml. Las fracciones se contaron en un contador gamma (contador gamma automatico 31480 Wizard de Perkin Elmer, 10 segundos por muestra). La solucion incubada tambien se analizo con precipitacion de etanol, contando las pellas y el sobrenadante tras la centrifugacion para determinar la union del 68Ga a la proteina, y los sobrenadantes centrifugados se analizaron mediante CCFI-GS (cromatografia en capa fina instantanea-gel de silice) con citrato de sodio 0,1 M como fase movil. En estas condiciones, el 68Ga "libre" migra con el frente del disolvente (Rf=1) y el 68Ga-CP256 permanece en el origen (Rf=0).
Ejemplo 10 - Marcaje del CP256 con Hl-In
El cloruro-111In formo un complejo con el CP256 (589 jM) a aproximadamente 90 % de rendimiento tras 5 minutos, como se determino en el CCFl-Gs (HSA). El complejo mostro <2 % de liberacion de In-111 o union a las proteinas de suero cuando se incubo en suero humano durante 2 horas, como se determino mediante la cromatografia por exclusion de tamano PD10 (figura 8).
Detalles experimentales
Se anadieron 50 jl de solucion tamponada de alicuota de acetato (pH=6) en el vial que contenia 111 InCl3 (7MBq, Mallinckrodt Medical) en HCL. Se preparo una solucion de 589 jM de CP256 disolviendo 0,5 mg de CP256 en 1 ml de PBS. Se mezclaron 100 jl del alicuota de esta solucion de CP256 con 50 jl de la solucion de 111In. Tras la incubacion durante 5 minutos, la especiacion de 111In se analizo usando tiras de CCFI-GS que habian sido saturadas anteriormente con albumina de suero humano (HSA) y se secaron. Los cromatogramas se desarrollaron con agua, etanol y amoniaco en un intervalo de 5:2:1. En estas condiciones el 111In sigue en el origen mientras que el 111In- CP256 se mueve hacia el frente del disolvente.
Ejemplo 11 - Obtencion de imaaenes in vivo del conjugado del anticuerpo-CP256 mediante el modo de predireccionamiento con 67Ga
Un anticuerpo de IgG monoclonal, SER4, frente a un antigeno de sialoadhesina expresado por los macrofagos proinflamatorios, se conjugo con CP256-maleimido (7), reduciendo en primer lugar los enlaces de disulfuro de anticuerpos con 2-mercaptoetanol, y despues tratando los grupos triol formados de este modo con CP256-maleimido (7) para proporcionar CP256-SER4.
La biodistribucion tipica en los ratones del SER4 marcado con 99mTc (datos no publicados), observada anteriormente, refleja la rapida eliminacion de la circulacion, con una absorcion predominantemente en el bazo y, en cierta medida, tambien en el higado.
El CP256-SER4 se marco con 67Ga para proporcionar 67Ga-CP256-SER4. A los grupos de ratones de tipo silvestre se les inyecto, o bien 67Ga-CP256-SER4 directamente marcado (grupo 1), o bien SER4 (no conjugado) y 5 minutos despues 67Ga-citrato (grupo 2) o CP256-SER4 seguido de 67Ga-citrato.
Los mismos experimentos se realizaron tambien usando ratones nuligenicos a la sialoadhesina. Todos los animales se sacrificaron despues de 3 horas y se determino la biodistribucion de la radioactividad.
Los resultados se muestran en la figura 9. Para cada organo, los datos de biodistribucion del grupo 1 se muestran en la columna de la izquierda, los datos de biodistribucion del grupo 2 se muestran en la columna del centro, y los datos de biodistribucion del grupo 3 se muestra en la columna de la derecha.
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El grupo 1 mostro un direccionamiento fuerte del 67Ga-CP256-SER4 hacia el bazo (36 % Dl/g), mientras que el grupo 2 mostro una absorcion muy baja del 67Ga-citrato en el bazo (4 % DI/g). Por otra parte, el grupo 3 mostro que la preinyeccion de CP256-SER4 era capaz de aumentar la absorcion de 67Ga-citrato del bazo de 4 % Dl/g a 10 % Dl/g, sugiriendo que el 67Ga siguio la ubicacion del conjugado de anticuerpo en un grado importante.
El grupo 1 tambien mostro una actividad elevada del 67Ga-CP256-SER4 en la sangre circulante (31 % Dl/g), mientras que el 67Ga-citrato (grupo 2) no lo hizo (7 % Dl/g). La preadministracion de CP256-SER4 (grupo 3) aumento la retencion de sangre del 7 % al 16 % Dl/g. Los ratones nuligenicos no mostraron el comportamiento de direccionamiento del bazo, consistente con este patron asociado a la expresion de la sialoadhesina. Estos experimentos demuestran la viabilidad de la obtencion de imagenes de bioconjugados no marcados predirigidos de Cp256 mediante inyecciones tardias de 67Ga-citrato.
Detalles experimentales
Para la conjugacion de CP256 al SER4: A 2 mg (5 mg/ml) del anticuerpo SER4 en una solucion salina tamponada con fosfato se anadieron 25 pl de EDTA 50 mM. La solucion resultante se dejo a temperatura ambiente durante 1 hora para quelar los iones metalicos presentes en la solucion.
Se lavo entonces el anticuerpo mediante centrifugacion a 3000 rpm durante 3 x 15 minutos en un tubo de ultracentrifugacion Vivaspin2 50.000 mwco. El anticuerpo se resuspendio entre las etapas de centrifugacion y se ajusto el volumen a 2 ml mediante la adicion de solucion tamponada de fosfato sin metal 0,1 M, pH 7. El anticuerpo concentrado y lavado se recogio en aproximadamente 300 pl de solucion tamponada de fosfato 0,1 M.
Para la reduccion del anticuerpo, se diluyo 2-mercaptoetanol (5 pl) hasta 20 pl en una solucion tamponada de fosfato 0,1 M, pH 7. Se anadieron 3,8 pl (exceso de 1000 en veces) del 2-mercaptoetanol diluido al anticuerpo, y se permitio que la reduccion continuase durante 30 minutos a temperatura ambiente.
El volumen se ajusto a 1 ml por adicion de solucion tamponada de fosfato 0,1 M y se retiro aplicando el anticuerpo reducido a una columna por exclusion de tamano desechable (PD10). Las fracciones que contenian el anticuerpo reducido se combinaron y se anadio inmediatamente CP256-maleimido (0,77 mg disueltos en 8 pl de DMSO, exceso de 40 en veces). La reaccion de la conjugacion se calento a 37 °C durante 30 minutos. El anticuerpo del conjugado se lavo despues usando un tubo de ultracentrifugacion Vivaspin2 50.000 mwco como anteriormente, pero usando una solucion tamponada de acetato de amonio 0,1 M, pH 6 para eliminar el ligando en exceso. El anticuerpo de CP256 concentrado se recogio en una solucion tamponada de acetato de amonio 0,1 M, pH 6.
El radiomarcaje del 67Galio se realizo mediante la adicion de 45 pl de 67Ga-citrato (0,6-0,75 MBq) a 90 pl (90 pg) de CP256-SER4. Se permitio que continuara el radiomarcaje durante 10 minutos antes de la dilucion a 350 pl con solucion salina tamponada de fosfato. Se prepararon inyecciones que contenian 25 pg de anticuerpo marcado. El analisis del anticuerpo radiomarcado se realizo mediante HPLC de exclusion por tamano usando solucion tamponada de fosfato 0,1 M que contenia 2 mM de EDTA, ya que la fase movil que aseguraba el buen radiomarcaje se habia conseguido antes de la inyeccion en animales.
A los grupos de ratones de tipo silvestre (C57B1/6, machos de 8-10 semanas de vida, n=2 a 3 por grupo) se les inyecto, o bien 67Ga-CP256-SER4 directamente marcado (grupo 1), o bien SER4 (no conjugado) y 5 minutos despues 67Ga-citrato (grupo 2) o CP256-SER4 seguido de 67Ga-citrato. La actividad del 67Ga y la cantidad del anticuerpo usada en cada caso fue equivalente. Los mismos experimentos se realizaron tambien usando ratones nuligenicos (KO a la sialoadhesina, C57Bl/6, machos de 8-10 semanas de vida, n=2 a 3 por grupo). Todos los animales se sacrificaron tras 3 horas y se determino la biodistribucion de la radioactividad explantando los tejidos y pesandolos y contandolos.
Ejemplo 12 - Obtencion de imagenes in vivo del conjugado del anticuerpo-CP256 mediante el modo de predireccionamiento con 68Ga.
El SER4, conjugado con CP256-malemido (7) tal y como se describio en el ejemplo 11, se marco con 68Ga, tal y como se describio anteriormente en el ejemplo 7, para proporcionar 68Ga-CP256-SER4. En tres ocasiones distintas, a los grupos de raton de tipo silvestre (C57B1/6, machos de 8-10 semanas de vida, n=2 a 3 por grupo) se les inyecto, o bien 68Ga-CP256-SER4 directamente marcado (grupo 1), o bien SER4 (no conjugado) y 1 hora despues 68Ga-acetato (grupo 2) o CP256-SER4 seguido 1 hora despues de 68Ga-acetato (grupo 3).
Todos los animales se sacrificaron 1,5 horas despues de la inyeccion de 68Ga y se determino la biodistribucion de la radioactividad. Los resultados se muestran en la figura 10. Para cada organo, los datos de biodistribucion del grupo 2 se muestran en la columna de la izquierda, los datos de biodistribucion del grupo 3 se muestran en la columna del centro, y los datos de biodistribucion del grupo 1 se muestran en la columna de la derecha.
El grupo 1 mostro un direccionamiento fuerte del 68Ga-CP256-SER4 hacia el bazo (20-50% Dl/g en los tres experimentos), mientras que el grupo 2 mostro una absorcion muy baja del 68Ga-acetato en el bazo (2-5% Dl/g). Por
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otra parte, el grupo 3 mostro que la preinyeccion de CP256-SER4 era capaz de aumentar la absorcion de 68Ga- acetato del bazo de 2-5% DI/g a 17-40% DI/g, sugiriendo que el 68Ga siguio la ubicacion del conjugado de anticuerpo en un grado importante. Estos experimentos demuestran la viabilidad de la obtencion de imagenes de bioconjugados no marcados predirigidos de CP256 mediante inyecciones ta^as de 68Ga-acetato.
Se muestra la imagen NanoPET/CT de un raton del grupo 3 en la figura 11A. Se obtuvo la imagen del raton usando el metodo de predireccionamiento de la invencion, usando CP256-SER4: C57Bl/6 de 8 semanas de vida inyectados con CP256-SER4 seguido de Ga-68-acetato. La figura muestra la absorcion dirigida del higado/bazo. Por comparacion, solo se muestra en la figura 11B un raton inyectado con Ga-68-acetato, mostrando la retencion en la sangre y la acumulacion en las articulaciones.
Detalles experimentales
El anticuerpo se conjugo con CP256 como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 11. Para el radiomarcaje, se eluyo el 68Ga de un generador de 68Ge/®8Ga y se concentro como se describe en el ejemplo 7 para proporcionar 68Ga-acetato. A los 150 jl (105 |jg) de CP256- SER4 se anadieron 150 jl 68Ga-acetato (16 MBq). Se permitio que continuase la reaccion del radiomarcaje durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se prepararon inyecciones que contenian 35 jg del anticuerpo radiomarcado. El analisis del anticuerpo radiomarcado se llevo a cabo tal y como se describe en el ejemplo 11.
A los grupos de raton de tipo silvestre (C57B1/6, machos de 8-10 semanas de vida, n=2 a 3 por grupo) se les inyecto, o bien 68Ga-CP256-SER4 directamente marcado (grupo 1), o bien SER4 (no conjugado) y 1 hora despues 68Ga-acetato (grupo 2) o CP256-SER4 seguido de 68Ga-acetato. La actividad del 68Ga y la cantidad del anticuerpo usada en cada caso fue equivalente. Todos los animales se sacrificaron tras 2-3 horas y se determino la biodistribucion de la radioactividad explantando los tejidos y pesandolos y contandolos. Se escaneo un animal de cada grupo usando un escaner NanoPET/CT (Bioscan). Los escaneres se iniciaron inmediatamente tras la inyeccion de 68Ga-acetato o 68Ga-CP256-SER4 y continuaron durante 1,5 horas.
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Claims (17)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Un compuesto bifuncional o una molecula bifuncional para uso en un metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular, en donde(i) el compuesto bifuncional se representa por la formula:
imagen1 o sales del mismo;en la que una de X e Y es C=O y la otra es NR;en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;en la que R1 es un grupo quelante capaz de quelar un radionuclido y se selecciona entre:imagen2 en las que R, R2, R3 y R4 son independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido; B es un grupo enlazador para enlazar el grupo quelante con el grupo reactivo, y se representa por la formula:imagen3 en la que Q se selecciona independientemente entre un grupo que consiste en -NR5-, -C(O)NR5-, - C(O)O-, - NR5C(O)NR5-, -NR5C(S)NR5- y -O-, cada R5 es independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido, cada q y s se seleccionan independientemente de 0 a 6 y cada r se selecciona independientemente de 1 a 6;A* es un grupo reactivo reaccionado que se acopla a T, siendo T un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto;y en el que(ii) la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional como se ha definido anteriormente y un radionuclido unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional;y el metodo comprende las etapas de:(a) administrar al sujeto el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para que el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional se unan a la diana de interes; y(b) donde se ha administrado un compuesto bifuncional, administrar al sujeto ademas una composicion de sonda de formacion de imagenes que comprende un radionuclido, de manera que el grupo quelante R1 del compuesto bifuncional quela el radionuclido en la diana de interes; y(c) detectar el radionuclido para la imagen de la diana de interes en el sistema biologico. - 2. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el metodo in vivo de la obtencion de imagenes moleculares es PET o SPET.
- 3. Un compuesto bifuncional o una molecula bifuncional para uso en un metodo de terapia con radionuclidos, endonde el compuesto bifuncional se representa por la formula:51015202530354045
imagen4 o sales del mismo;en la que una de X e Y es C=O y la otra es NR;en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;en la que R1 es un grupo quelante capaz de quelar un radionuclido y se selecciona entre:imagen5 en la que R, R2, R3 y R4 son independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido; B es un grupo enlazador para enlazar el grupo quelante con el grupo reactivo y se representa por la formula:imagen6 en la que Q se selecciona independientemente de entre un grupo que consiste en -NR5-, -C(O)NR5-, - C(O)O-, - NR5C(O)NR5-, -NR5C(S)NR5- y -O-, cada R5 es independientemente hidrogeno o un grupo alquilo C1-7 opcionalmente sustituido, cada q y s se seleccionan independientemente de 0 a 6 y cada r se selecciona independientemente de 1 a 6;A* es un grupo reactivo reaccionado que se acopla a T, siendo T un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto;y en el que la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional como se ha definido anteriormente y un radionuclido capaz de suministrar radioterapia a la diana de interes y unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional; y el metodo comprende las etapas de:(a) administrar al sujeto el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para que el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional se unan a la diana de interes; y(b) en donde se ha administrado un compuesto bifuncional, administrar al sujeto ademas una composicion, comprendiendo la composicion un radionuclido capaz de administrar radioterapia al blanco de interes, de manera que el grupo quelante R1 del compuesto bifuncional quela el radionuclido en la diana de interes. - 4. Un precursor del compuesto bifuncional, un compuesto bifuncional o una molecula bifuncional, en donde:(a) el precursor del compuesto bifuncional se representa por la formula:
imagen7 o sales del mismo; en la que:(i) X es NR e Y es C=O, m se selecciona de 0 a 6 y p se selecciona de 1 a 6; o(ii) Y es NR y X es C=O, y m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;en la que R1 y B son como se define en la reivindicacion 1;A es un grupo reactivo para acoplamiento a un grupo diana capaz de unirse a una diana de interes en el sujeto; (b) el compuesto bifuncional se representa por la formula:5101520253035404550imagen8 o sales del mismo; en la que:(i) X es NR e Y es C=O, m se selecciona de 0 a 6 y p se selecciona de 1 a 6; o(ii) Y es NR y X es C=O, y m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;en la que R1, B y A* son como se definen en la reivindicacion 1; y(c) la molecula bifuncional comprende un compuesto bifuncional y un radionuclido unido a traves de un grupo quelante del compuesto bifuncional, en donde el compuesto bifuncional de la molecula bifuncional se representa por la formula:imagen9 o sales del mismo;en la que una de X e Y es C=O y la otra es NR;en la que cada m y p se seleccionan independientemente de 0 a 6;en la que R1, B, A* y T son como se definen en la reivindicacion 1. - 5. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular de acuerdo con la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en un metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con la reivindicacion 3, o el precursor del compuesto bifuncional, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde s se selecciona independientemente de 0 a 6, cada r se selecciona independientemente de 1 a 6 y q se selecciona de 1 a
- 6.
- 6. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagenmolecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5, el compuesto bifuncional o la moleculabifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de lasreivindicaciones 3 o 5, o el precursor del compuesto bifuncional, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con la reivindicacion 4 o la reivindicacion 5, en donde el grupo reactivo A es un grupo funcional reactivo con la proteina y, opcionalmente, el grupo reactivo se selecciona del grupo que consiste en una maleimida, aldehido, ester, hidrazina, derivado de hidrazina, alcoxiamina, derivado de alcoxiamina, alquino, alqueno y grupo azida.
- 7. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagenmolecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 5 o 6, el compuesto bifuncional o la moleculabifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de lasreivindicaciones 3, 5 o 6, o el precursor del compuesto bifuncional, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde R1 es
imagen10 yR2, R3 y R4 son como se definen en la reivindicacion 1, y en particular son independientemente H o CH3 8 - 8. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 5 a 7, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 7, o el precursor del compuesto bifuncional, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en donde B se representa por una de las siguiente formulas:5101520253035
imagen11 - 9. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostics por imagen molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1,2 o 5 a 8, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 8, o el precursor del compuesto bifuncional, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, m es 2 y p es 1.
- 10. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostics por imagen molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 a 9, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 9, o el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, que comprende un compuesto bifuncional o una molecula bifuncional, obtenibles a partir de un precursor de compuesto bifuncional representado por la formula:o
imagen12 imagen13 - 11. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 a 10, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 10, o el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, en donde el grupo diana y la diana de interes son un receptor y un ligando, o un anticuerpo y un antigeno, o una sonda metabolica, por ejemplo, transportador de glucosa/glucosa, hipoxia/resto sensible a hipoxia, o mineral de hueso/bisfosfonato, o avidina (o estreptavidina o proteina relacionada)/biotina o un derivado similar a biotina, o ARN/ARN antisentido y, opcionalmente, en donde el grupo diana es un peptido, una proteina, un anticuerpo, un aptamero o un ligando de molecula pequena capaz de unirse a un companero de union en la diana de interes y ademas, opcionalmente, en donde el grupo diana incluye Anexina V y el dominio C2 de una sinaptotagmina, TIMP-2, CEA, peptido RGD, peptido de direccionamiento del receptor de somatoestatina, bombesina, gastrina o peptido de direccionamiento de VCAM.
- 12. El compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen5101520253035molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 a 11, el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 11, o el compuesto bifuncional o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en donde la diana de interes es un ligando o un receptor expresado en celulas o tejido enfermos, un antigeno de superficie celular asociado a un estado de enfermedad, marcadores tumorales, tales como un marcador especifico de cancer, o un marcador especifico de tejido, o la diana de interes es una ubicacion, un organo, un tipo de tejido, un agente infeccioso o una propiedad fisiologica en un sujeto sometido a la obtencion de imagen molecular.
- 13. La molecula bifuncional para uso en el metodo in vivo de diagnostico por imagen molecular de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 5 a 12, la molecula bifuncional para uso en el metodo de terapia con radionuclidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 5 a 12, o la molecula bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12, en donde el radionuclido es un isotopo de escandio, hierro, cobalto, cobre, galio, itrio, circonio, tecnecio, indio, estano, renio, gadolinio, terbio, holmio, bismuto 213 o lutecio, opcionalmente en donde el radionuclido es un isotopo de galio, Ga- 68, Ga-67 o Bi-213.
- 14. El precursor de compuesto bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, en donde el precursor del compuesto bifuncional se representa por las formulas:
imagen14 o - 15. Un kit para su uso en un metodo de diagnostico por imagen molecular in vivo o para su uso en un metodo de terapia con radionuclidos, comprendiendo el kit: una composicion de compuesto bifuncional que tiene un compuesto bifuncional de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13; y una composicion que comprende un radionuclido.
- 16. Un complejo de ligando de galio en donde el complejo de ligando de galio comprende un ligando representado por la siguiente formula:
imagen15 yun isotopo de galio complejado al ligando.
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