ES2622889T3 - Detección de Anaplasma platys - Google Patents

Abstract

Un polipéptido purificado que comprende SEQ ID NO: 12 o al menos 20 aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 20 aminoácidos contiguos se eligen entre los aminoácidos 16 a 150 o 209 a 240 de SEQ ID NO: 12.

Description

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DESCRIPCION

Deteccion de Anaplasma platys

La bacteria Anaplasma platys (Apl) es una bacteria intracelular obligada que infecta a las plaquetas y provoca una trombocitopenia dclica en el perro. En este momento, el perro parece ser la unica especie afectada por este agente rickettsial, y muy probablemente la enfermedad es transmitida por la Rhipicephalus spp de las garrapatas. La Apl se publico por primera vez en los Estados Unidos en 1978 y desde entonces ha sido mencionado en Europa, Asia, America del Sur, Oriente Medio, Australia y Africa. Debido al vector comun, la infeccion de Apl se encuentra frecuentemente como una coinfeccion con Ehrlichia canis. La capacidad del organismo para producir una enfermedad clmica en el perro parece variar con la geograffa, lo que sugiere que las diferencias de cepa pueden contribuir a la virulencia. La Apl se relaciona con otra especie de Anaplasma que se sabe que causa enfermedad clmica en el perro, Anaplasma phagocytophilum (Aph). La Aph es capaz de infectar una amplia gama de mairnferos, incluyendo personas, y puede producir una morbilidad significativa. Los signos clmicos no son generalmente espedficos e incluyen anorexia, letargo, debilidad, fiebre y trombocitopenia. La Aph es transmitida por la Ixodes spp de garrapatas y se han publicado infecciones en los Estados Unidos, Reino Unido y Europa.

En este contexto, el documento WO 03/087758 A describe composiciones y metodos para la deteccion y la cuantificacion de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo de Anaplasma phagocytophilum (Aph) (conocida anteriormente como Ehrlichia equis). Ademas, Simpson et al. (Simpson, R. M. et al.; Immunocytochemical detection of Ehrlichia platys antigens in canine blood platelets; Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 3 (3); julio 1991; pp 228 a 231) describe un metodo de tincion optimizado para la deteccion de antfgenos de Ehrlichia platys.

Las pruebas diagnosticas actuales que intentan distinguir Aph y Apl tienen una especificidad limitada. La PCR para Aph y Apl utilizando 16SrRNA ha tenido tambien problemas con la especificidad. Por consiguiente, son necesarios en la tecnica ensayos de PCR para la deteccion espedfica de Apl. Adicionalmente, las pruebas serologicas para Apl que utilizan polipeptidos de Aph o anticuerpos espedficos para Apl tienden a no detectar todos los casos de infeccion o exposicion a Apl. Por tanto, son necesarias en la tecnica pruebas serologicas que detecten Apl con mayor precision.

Una realizacion de la invencion proporciona un polipeptido purificado que comprende la SEQ ID NO: 12 o al menos 20 aminoacidos contiguos de la SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 20 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 16-150 o 209 - 240 de la SEQ ID NO: 12. Un polipeptido puede comprender SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.La invencion tambien proporciona polinucleotidos aislados que codifican estos polipeptidos. Un polipeptido purificado puede comprender ademas un vehmulo. Un polipeptido purificado puede estar en forma multimerica. Un polipeptido purificado puede enlazarse a un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protema, un polipeptido heterologo o una combinacion de los mismos.

Otra realizacion de la invencion proporciona un metodo para detectar anticuerpos que se unen espedficamente a Anaplasma platys o un polipeptido de Anaplasma phagocytophilum o ambos. El metodo comprende poner en contacto un polipeptido purificado de la invencion con una muestra de ensayo, bajo condiciones que permiten que se formen complejos polipeptido/anticuerpo y la deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo. La deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que anticuerpos espedficos para Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum estan presentes en la muestra de ensayo, y la ausencia de complejos de polipeptido/ anticuerpo es una indicacion de que no estan presentes en la muestra de ensayo anticuerpos espedficos para Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum. Los complejos pueden ponerse en contacto con un reactivo indicador antes de la etapa de deteccion. Puede determinarse la cantidad de anticuerpo en la muestra de ensayo. El polipeptido purificado puede unirse a un sustrato. El polipeptido purificado puede ser una protema de fusion en la que el polipeptido purificado se fusiona con un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protemas, una protema heterologa, o una combinacion de los mismos. El polipeptido purificado puede estar en forma multimerica. El metodo puede comprender un ensayo de placa de microtftulo, un ensayo de union cromatografica de flujo reversible, un ensayo de inmunosorbente ligado a enzima, un radioinmunoensayo, un ensayo de hemaglutinacion, un ensayo de transferencia Western, un inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia indirecta.

Otra realizacion mas de la invencion proporciona un metodo para detectar una infeccion de Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum, y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum en un sujeto. El metodo comprende poner en contacto un polipeptido purificado de la invencion con una muestra biologica obtenida del sujeto bajo condiciones que permitan que se formen complejos de polipeptido/anticuerpo; y detectar complejos de polipeptido/anticuerpo. La deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que el sujeto tiene una infeccion por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum. La ausencia de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que el marnffero no ha tenido una infeccion por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum. Los complejos polipeptido/anticuerpo pueden ponerse en

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contacto con un reactivo indicador que genera una senal medible antes de la realizacion de la etapa de deteccion. El polipeptido purificado puede ser una protema de fusion en la que el polipeptido purificado se fusiona con un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protema, una protema heterologa o una combinacion de los mismos. Los complejos polipeptido/anticuerpo pueden detectarse aproximadamente 10 d^as despues de la exposicion o infeccion del sujeto con Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.

Otra realizacion mas de la invencion proporciona un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido p44 de Anaplasma platys, en donde el polipeptido consiste en al menos 10 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 10 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 209 - 240 de SEQ ID NO: 12. El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, o un anticuerpo de cadena simple.

Hay otra realizacion de la invencion que proporciona un metodo para detectar un polipeptido de Anaplasma platys o de Anaplasma phagocytophilum en una muestra. El metodo comprende poner en contacto uno o mas anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de Anaplasma platys con la muestra bajo condiciones que permiten la formacion de complejos polipeptido/anticuerpo; en donde el polipeptido de Anaplasma platys comprende al menos 20 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 20 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 209 - 240 de SEQ ID NO: 12 y detectar complejos de polipeptido/anticuerpo. La deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que un polipeptido de Anaplasma platys esta presente en la muestra y la ausencia de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que en la muestra esta presente un polipeptido de Anaplasma platys y la ausencia de complejos de polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que un polipeptido de Anaplasma platys no esta presente en la muestra.

Otra realizacion de la invencion proporciona un metodo para detectar polinucleotidos p44 de Anaplasma platys. El metodo comprende poner en contacto una muestra de ensayo con polinucleotidos de sonda que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, o combinaciones de los mismas, bajo condiciones que permiten complejos de hibridacion entre los polinucleotidos p44 de Anaplasma platys y los polinucleotidos sonda; y detectar complejos de polinucleotido p44 de Anaplasma platys/polinucleotido sonda; en donde la ausencia de complejos de de polinucleotido p44 de Anaplasma platys/polinucleotido sonda es una indicacion de que no estan presentes polinucleotidos de Anaplasma platys en la muestra de ensayo y en donde la presencia de complejos de polipeptido p44 de Anaplasma platys /polinucleotidos sonda es una indicacion de que los polinucleotidos de Anaplasma platys estan presentes en la muestra de ensayo.

Otra realizacion de la invencion proporciona metodos de deteccion de polinucleotidos de Anaplasma platys. Los metodos comprenden poner en contacto una muestra de ensayo con cebadores de acido nucleico que comprenden las SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7; y llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico. Se obtienen productos de amplificacion que comprenden polinucleotidos de Anaplasma platys si en la muestra de ensayo estan presentes polinucleotidos de Anaplasma platys. Se pueden usar sondas de acido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9 o ambas, para detectar los productos de amplificacion. Cualquier polinucleotido de Anaplasma phagocytophilum presente en la muestra de ensayo no puede ser amplificado. Las sondas de acido nucleico pueden comprender un marcador detectable. La reaccion de amplificacion de acido nucleico puede ser una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), una PCR de punto final, una PCR en tiempo real, un ensayo de PCR anidado. Se puede determinar la cantidad de polinucleotidos de Anaplasma platys en la muestra.

Otra realizacion de la invencion mas proporciona un metodo para diagnosticar la infeccion por Anaplasma platys en un sujeto, que comprende detectar la presencia de polinucleotidos que codifican la totalidad o parte de un polipeptido p44 de Anaplasma platys y/o detectar la presencia de un polipeptido p44 de Anaplasma platys en una muestra de ensayo.

Otra realizacion mas de la invencion proporciona un metodo para detectar y/o cuantificar polinucleotidos de Anaplasma platys en una muestra de ensayo. El metodo comprende anadir cebadores sentido y cebadores antisentido a la muestra de ensayo bajo condiciones adecuadas para una reaccion en cadena de la polimerasa, en donde los cebadores se hibridan con polinucleotidos p44 de Anaplasma platys de tal manera que se forma un producto de amplificacion si estan presentes los polinucleotidos p44 de Anaplasma platys en la muestra de ensayo; y detectar el producto de amplificacion, con lo que se detecta la presencia y/o la cantidad de polinucleotidos p44 de Anaplasma platys. Cualquier polinucleotido de Anaplasma phagocytophilum presente en la muestra de ensayo puede no ser amplificado.

Por consiguiente, la invencion proporciona metodos y composiciones para la deteccion serologica de Anaplasma platys o Anaplasma phagocytophilum y la deteccion espedfica de Anaplasma platys basada en acidos nucleicos.

Las figuras muestran:

La Figura 1A muestra una alineacion de secuencias de polinucleotidos p44 de Apl. La Figura 1B muestra una alineacion de secuencias de polipeptidos p44 de Apl.

La Figura 2A muestra la sensibilidad analftica de un ensayo de PCR en tiempo real para los polinucleotidos p44 de

Apl.La Figura 2B muestra la especificidad de un ensayo de PCR en tiempo real para los polinucleotidos p44de Apl.

La Figura 3 muestra una comparacion de los resultados de ELISA usando peptido p44 Aph y peptido p44 Apl en una poblacion de muestras de suero derivadas de perros que viven en areas endemicas para A. platys y libres de A. phagocytophilum.

5 La actual invencion describe secuencias de polinucleotidos para una protema de superficie externa principal de Apl, p44 y peptidos de la protema traducida que puede usarse para la deteccion robusta de la infeccion y/o exposicion de Apl y Aph. Adicionalmente, esta secuencia de p44 Apl proporciona un objetivo de PCR para distinguir las infecciones de Aply Aph usando, por ejemplo, una PCR en tiempo real con sondas de hibridacion.

Polipeptidos Apl

10 Un polipeptido es un polfmero de tres o mas aminoacidos unidos covalentemente mediante enlaces amida. Un polipeptido puede ser modificado post-traduccion. Un polipeptido purificado es un preparado de polipeptido que esta sustancialmente librede material celular, otros tipos de polipeptidos, precursores qmmicos, productos qmmicos usados en la smtesis del polipeptido, o combinaciones de los mismos. Un preparado de polipeptido que esta sustancialmente libre de material celular, medio de cultivo, precursores qmmicos, productos qmmicos utilizados en la 15 smtesis del polipeptido tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5%, 1% o mas de otros polipeptidos,

medio de cultivo , precursores qmmicos, y/u otros qmmicos usados en la smtesis. Por lo tanto, un polipeptido purificado es de una pureza de aproximadamente 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o mas.

Una realizacion de la invencion proporciona un polipeptido p44 Apl como se muestra en la SEQ ID NO: 12.

YFYVGLDYXP AFSKINGFEI RESTGETAAV YPYMKDGTRV EWKAEKFDWN

TPDPRIKFKN NPIVALEGSV GYSIGVARVE LEIGYEQFKT KGIRDTGSKE EEADAVYLLA KKLPHTLVSD QSDKFLEELK NTKAAEIVKF AEAVGTSAKD IDXKVCKKXX XNAAXSWXCX QXGSXXXXXX KXXSXXFTKA GVXXXXXGKA WPNGXXXXAA KAEDLSTALN RELTSAEKNK VAGLLTRTIS GGEWEIRAV

STTSVMXNAC YDLLS

20 En una realizacion de la invencion el aminoacido en la posicion 9 es S o C, el aminoacido en la posicion 153 es G o K, el aminoacido en la posicion 159 es N o H, el aminoacido en la posicion 160 es T o N, el aminoacido en la posicion 161 es N o G, el aminoacido en la posicion 165 es D, N o G, el aminoacido en la posicion 168 es K o Q, el aminoacido en la posicion 170 es E o T, el aminoacido En la posicion 172 es T o P, el aminoacido en la posicion 175 es G o E, el aminoacido en la posicion 176 es S o T, el aminoacido en la posicion 177 es D, E o S, el aminoacido en 25 la posicion 178 es T o esta ausente, el aminoacido en la posicion 179 es S o esta ausente, el aminoacido en la posicion 180 es G o A, el aminoacido en la posicion 182 es E, A o T, el aminoacido en la posicion 183 es F o L, el aminoacido en la posicion 185 es K o E, el aminoacido en la posicion 186 es L o I, el aminoacido en la posicion 193 es D o N, el aminoacido en la posicion 194 es A o T, el aminoacido en la posicion 195 es N o D, el aminoacido en la posicion 196 es E, G, o esta ausente, el aminoacido en la posicion 197 es K o ausente, el aminoacido en la posicion 30 205 es H o S, el aminoacido en la posicion 206 es T o ausente, el aminoacido en la posicion 207 es D o esta

ausente, el aminoacido en la posicion 208 es S o D, el aminoacido en la posicion 257 es L o I. Los polipeptidos de acuerdo con SEQ ID NO: 12 que incorporan cualquier combinacion de los restos de aminoacidos alternativos antes mencionados se incluyen en la invencion.

Una realizacion de la invencion es un polipeptido mostrado en la SEQ ID NO: 10: KDGTRV EWKAEKFDWNTPDPRI

35 Una realizacion de la invencion es un polipeptido mostrado en la SEQ ID NO: 11: KDGTRV EWKAEKFDWNTPDPRIKFKN

Una realizacion de la invencion es un polipeptido mostrado en la SEQ ID NO: 13 RVELEIGYEQFKT KGIRDTGSKEEEADA.

Una realizacion de la invencion proporciona un polipeptido purificado que comprende al menos aproximadamente

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Los polipeptidos purificados de la invencion pueden ser polipeptidos de longitud completa o fragmentos de polipeptidos. Por ejemplo, los fragmentos de polipeptidos de la invencion pueden comprender 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250 o mas aminoacidos de polipeptidos de la invencion. Los polipeptidos variantes son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98 o 99% identicos a las secuencias de polipeptidos mostradas en las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14 o 15.

Los polipeptidos variantes tienen una o mas variaciones conservadoras de aminoacidos u otras modificaciones menores y retienen actividad biologica, es decir, son equivalentes biologicamente funcionales. Un equivalente biologicamente activo tiene una funcion sustancialmente equivalente cuando se compara con el correspondiente polipeptido de tipo silvestre.

El porcentaje de identidad de secuencia tiene un significado reconocido en la tecnica y hay varios metodos para medir la identidad entre dos secuencias de polipeptidos o polinucleotidos. Vease, por ejemplo, Lesk, Ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, (1988); Smith, Ed., Biocomputing: Informatics And Genome Projects, Academic Press, Nueva York, (1993); Griffin & Griffin, Eds., Computer Analysis Of Sequence Data, Parte I, Humana Press, New Jersey, (1994); Von Heinje, Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, (1987); y Gribskov y Devereux, Eds., Sequence Analysis Primer, M Stockton Press, Nueva York, (1991). Los metodos para el alineamiento de polinucleotidos o polipeptidos se codifican en programas informaticos, incluyendo el paquete de programas GCG (Devereux et al., Nuc. Acids Res. 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FAsTa (Atschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403 (1990)), y el programa Bestfit (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 para Unix, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin 53711) que utiliza el algoritmo de homologfa local de Smith y Waterman (Adv. App. Math., 2: 482 - 489 (1981)). Por ejemplo, se puede usar el programa de ordenador ALIGN que emplea el algoritmo FASTA, con una busqueda de huecos afines con una penalizacion de abertura de hueco de -12 y una penalizacion de extension de hueco de -2.

Cuando se usa cualquiera de los programas de alineacion de secuencias para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, aproximadamente un 95% identica a una secuencia de referencia, los parametros se ajustan de manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud completa del polinucleotido de referencia y que se permiten espacios en la identidad de hasta un 5% del numero total de nucleotidos en el polinucleotido de referencia.

Las variantes se pueden identificar generalmente modificando una de las secuencias de polipeptidos de la invencion y evaluando las propiedades del polipeptido modificado para determinar si es un equivalente biologico. Una variante es un equivalente biologico si reacciona sustancialmente igual que un polipeptido de la invencion en un ensayo tal como un ensayo inmunohistoqmmico, un ensayo de inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), un ensayo inmunoenzimatico o un ensayo de transferencia Western , p. ej. tiene el 90 - 110% de la actividad del polipeptido original. En una realizacion, el ensayo es un ensayo de competicion en el que el polipeptido equivalente biologicamente es capaz de reducir la union del polipeptido de la invencion a un correspondiente antfgeno o anticuerpo reactivo en aproximadamente 80, 95, 99 o 100%. Un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido de tipo silvestre correspondiente tambien se une espedficamente al polipeptido variante. Los polipeptidos variantes pueden comprender aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 10 o 20 sustituciones de aminoacidos conservadoras.

Una sustitucion conservadora es una en la que un aminoacido se sustituye por otro aminoacido que tiene propiedades similares, de modo que un experto en la tecnica de la qmmica de peptidos esperana que la estructura secundaria y la naturaleza hidropatica del polipeptido estuviese sustancialmente sin cambios. En general, los siguientes grupos de aminoacidos representan cambios conservadores: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his.

Un polipeptido de la invencion puede comprender ademas una secuencia senal (o lfder) que co- traslacional o post- traduccionalmente dirige la transferencia de la protema. El polipeptido puede comprender tambien un enlazador u otra secuencia para facilitar la smtesis, la purificacion o la identificacion del polipeptido (por ejemplo, poli-His), o para potenciar la union del polipeptido a un soporte solido. Por ejemplo, un polipeptido puede conjugarse con una region Fc de inmunoglobulina o albumina de suero bovino.

Un polipeptido puede estar unido covalentemente o no covalentemente a una secuencia de aminoacidos a la que el polipeptido normalmente no esta asociado en la naturaleza, es decir, una secuencia de aminoacidos heterologa. Una secuencia de aminoacidos heterologa puede ser de un organismo no Apl (por ejemplo, un organismo Aph), una secuencia sintetica o una secuencia Apl no localizada usualmente en el termino carboxi o amino de un polipeptido de la invencion. Adicionalmente, un polipeptido puede estar covalentemente o no covalentemente unido a compuestos o moleculas distintas de los aminoacidos. Por ejemplo, un polipeptido puede enlazarse a un reactivo

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indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protema, o una combinacion de los mismos. En una realizacion de la invencion, un ligando de purificacion de protemas puede ser uno o mas restos de aminoacidos C, por ejemplo, el termino amino o el termino carboxi de un polipeptido de la invencion. Un espaciador de aminoacidos es una secuencia de aminoacidos que normalmente no esta asociada con un polipeptido de la invencion en la naturaleza. Un espaciador de aminoacidos puede comprender aproximadamente 1, 5, 10, 20, 100 o 1.000 aminoacidos.

Si se desea, un polipeptido puede ser una protema de fusion, que puede contener tambien otras secuencias de aminoacidos, tales como enlazadores de aminoacidos, espaciadores de aminoacidos, secuencias senal, secuencias de transferencia de parada TMR, dominios transmembrana, asf como ligandos utiles en la purificacion de protemas, tales como glutation-S-transferasa, etiqueta de histidina y protema A estafilococica, o combinaciones de los mismos. Mas de un polipeptido de la invencion puede estar presente en una protema de fusion. Los fragmentos de polipeptidos de la invencion pueden estar presentes en una protema de fusion de la invencion. Una protema de fusion de la invencion puede comprender uno o mas polipeptidos Apl de la invencion, fragmentos de los mismos o combinaciones de los mismos.

Los polipeptidos de la invencion pueden estar en una forma multimerica. Esto es, un polipeptido puede comprender una o mas copias de un polipeptido Apl de la invencion o una combinacion de las mismas. Un polipeptido multimerico puede ser un peptido antigenico multiple (MAP). Vease, p. ej. Tam, J. Immunol. Methods, 196: 17 - 32 (1996).

Los polipeptidos de la invencion pueden comprender un antigeno que es reconocido por un anticuerpo espedfico para p44 Apl. El antigeno puede comprender uno o mas epftopos (esto es, determinantes antigenicos). Un epftopo puede ser un epftopo lineal, un epftopo secuencial o un epftopo conformacional. Los epftopos dentro de un polipeptido de la invencion se pueden identificar por diversos metodos. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 4.554.101; Jameson & Wolf, CABIOS 4: 181 - 186 (1988). Por ejemplo, puede aislarse y cribarse un polipeptido de la invencion. Una serie de peptidos cortos, que abarcan juntos una secuencia polipeptfdica entera, se puede preparar mediante escision proteolftica. Comenzando, por ejemplo, con fragmentos de polipeptido 100-mero, cada fragmento puede ser ensayado en relacion con la presencia de epftopos reconocidos en un ELISA. Por ejemplo, en un ensayo ELISA, un polipeptido Apl, tal como un fragmento polipeptidico 100-mero, se une a un soporte solido, tal como los pocillos de una placa de pocillos multiples de material plastico. Se marca una poblacion de anticuerpos, se anade al soporte solido y se permite que se una al antfgeno no marcado, bajo condiciones en las que se bloquea la absorcion no espedfica, y se elimina por lavado cualquier anticuerpo no unido y otras protemas. La union de anticuerpo se detecta, por ejemplo, mediante una reaccion que convierte un sustrato incoloro en un producto de reaccion coloreado. Los fragmentos progresivamente mas pequenos y solapantes pueden ser luego ensayados a partir de un 100-mero identificado para mapear el epftopo de interes.

Un polipeptido de la invencion puede producirse de forma recombinante. Un polinucleotido que codifica un polipeptido de la invencion puede introducirse en un vector de expresion recombinante, que puede expresarse en un sistema de celula huesped de expresion adecuado utilizando tecnicas bien conocidas en este campo. En la tecnica se dispone de una variedad de sistemas de expresion bacterianos, de levaduras, vegetales, de mairftferos y de insectos y puede utilizarse cualquier sistema de expresion de este tipo. Opcionalmente, un polinucleotido que codifica un polipeptido puede traducirse en un sistema de traduccion libre de celulas. Un polipeptido tambien puede ser sintetizado qmmicamente u obtenido a partir de celulas Apl.

Un polipeptido inmunogenico de la invencion puede comprender una secuencia de aminoacidos mostrada en las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, 14, 15 o fragmentos de las mismas. Un polipeptido inmunogenico puede desencadenar anticuerpos u otras respuestas inmunologicas (por ejemplo, respuestas de celulas T del sistema inmunitario) que reconocen epftopos de un polipeptido que tiene la SEQ ID NO: 12. Un polipeptido inmunogenico de la invencion puede ser tambien un fragmento de un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. Un polipeptido inmunogenico de la invencion puede ser tambien un fragmento de un polipeptido que tiene una secuencia de aminoacidos que se muestra en la SEQ ID NO: 12. Un fragmento de polipeptido inmunogenico de la invencion puede ser de una longitud de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 o mas aminoacidos.

Polinucleotidos Apl

Los polinucleotidos de la invencion contienen menos de un genoma microbiano entero y pueden ser acidos nucleicos de cadena sencilla o doble. Un polinucleotido puede ser ARN, ADN, ADNc, ADN genomico, ARN o ADN sintetizado qmmicamente o combinaciones de los mismos. Los polinucleotidos pueden purificarse libres de otros componentes, tales como protemas, ftpidos y otros polinucleotidos. Por ejemplo, el polinucleotido puede ser purificado al 50%, 75%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. Los polinucleotidos de la invencion codifican los polipeptidos descritos anteriormente. En una realizacion de la invencion, los polinucleotidos codifican un polipeptido mostrado en la SEQ ID NO: 12 o fragmentos de los mismos. Los polinucleotidos de la invencion pueden comprender otras secuencias de nucleotidos, tales como secuencias que codifican enlazadores, secuencias senal, secuencias de transferencia de parada de TMR, dominios transmembrana o ligandos utiles en la purificacion de protemas tales

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como glutation-S-transferasa, etiqueta de histidina y protema A estafilococica.

Los polinucleotidos de la invencion pueden aislarse. Un polinucleotido aislado es un polinucleotido natural que no es inmediatamente contiguo con una o con las dos secuencias genomicas flanqueantes 5' y 3' con la que se asocia naturalmente. Un polinucleotido aislado puede ser, por ejemplo, una molecula de ADN recombinante de cualquier longitud, siempre y cuando las secuencias de acido nucleico que se encuentran naturalmente flanqueando inmediatamente la molecula de ADN recombinante en un genoma natural se elimine o este ausente. Los polinucleotidos aislados tambien incluyen moleculas de acido nucleico que no naturales. Una molecula de acido nucleico que existe entre cientos y millones de otras moleculas de acido nucleico dentro de, por ejemplo, bibliotecas de ADNc o genomicas o rodajas de gel que contienen un material de digestion de restriccion de ADN genomico, no se ha de considerar un polinucleotido aislado.

Los polinucleotidos de la invencion pueden comprender tambien fragmentos que codifican polipeptidos inmunogenicos. Los polinucleotidos de la invencion pueden codificar polipeptidos de longitud completa, fragmentos de polipeptidos y polipeptidos variantes o de fusion.

Las secuencias de nucleotidos degeneradas que codifican los polipeptidos de la invencion, asf como secuencias de nucleotidos homologas que son al menos aproximadamente 80, o aproximadamente 90, 96, 98, o 99% identicas a las secuencias de polinucleotidos de la invencion y sus complementos son tambien polinucleotidos de la invencion. El porcentaje de identidad de secuencia puede calcularse como se describe en la seccion "Polipeptidos". Las secuencias de nucleotidos degeneradas son polinucleotidos que codifican un polipeptido de la invencion o fragmentos de los mismos, pero difieren en la secuencia de acido nucleico de la secuencia polinucleotfdica de tipo silvestre, debido a la degeneracion del codigo genetico. Las moleculas de ADN complementario (ADNc), homologos de especies y variantes de polinucleotidos Apl que codifican polipeptidos Apl funcionales biologicamente tambien son polinucleotidos Apl.

Los polinucleotidos de la invencion pueden ser aislados a partir de secuencias de acidos nucleicos presentes, por ejemplo, en una muestra biologica, tal como sangre, suero, saliva o tejido de un individuo infectado. Los polinucleotidos tambien pueden sintetizarse en el laboratorio, por ejemplo usando un sintetizador automatico. Puede usarse un metodo de amplificacion tal como PCR para amplificar polinucleotidos a partir de ADN genomico o bien ADNc que codifica los polipeptidos.

Los polinucleotidos de la invencion pueden comprender secuencias de codificacion de polipeptidos naturales o pueden codificar secuencias alteradas que no se presentan en la naturaleza. Si se desea, los polinucleotidos pueden clonarse en un vector de expresion que comprende elementos de control de expresion, incluyendo, por ejemplo, ongenes de replicacion, promotores, potenciadores u otros elementos reguladores que conducen la expresion de los polinucleotidos de la invencion en celulas huesped. Un vector de expresion puede ser, por ejemplo, un plasmido, tal como pBR322, pUC, o ColEI, o un vector de adenovirus, tal como un vector de tipo 2 de adenovirus o vector de Tipo 5. Opcionalmente, pueden usarse otros vectores, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, virus Sindbis, virus de simio 40, vectores alfavirus, vectores poxvirus y vectores citomegalovirus y retrovirales, tales como virus del sarcoma murino, virus del tumor mamario de raton, virus de la leucemia murina Moloney y virus del sarcoma de Rous. Tambien pueden ser utilizados minicromosomas tales como MC y MC1, bacteriofagos, fagemidos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales bacterianos, partfculas vmcas, partfculas similares a virus, cosmidos (plasmidos en los que se han insertado sitios cos del fago lambda) y replicones (elementos geneticos capaces de replicacion bajo su propio control en una celula).

Los metodos para preparar polinucleotidos unidos operativamente a una secuencia de control de expresion y expresarlos en una celula huesped son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 4.366.246. Un polinucleotido de la invencion esta unido operativamente cuando esta situado adyacente o proximo a uno o mas elementos de control de expresion, que dirigen la transcripcion y/o la traduccion del polinucleotido.

Los polinucleotidos de la invencion pueden usarse, por ejemplo, como sondas o cebadores, por ejemplo, cebadores de PCR, para detectar la presencia de polinucleotidos Apl en una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica. Las sondas son moleculas capaces de interactuar con un acido nucleico diana, tfpicamente de una manera espedfica de la secuencia, por ejemplo, por hibridacion. Los cebadores son un subconjunto de sondas que pueden soportar una manipulacion enzimatica y que pueden hibridarse con un acido nucleico diana de forma que se produce la manipulacion enzimatica. Se puede preparar un cebador a partir de cualquier combinacion de nucleotidos o derivados de nucleotidos o analogos disponibles en la tecnica que no interfieren con la manipulacion enzimatica.

La hibridacion de acidos nucleicos es bien entendida en la tecnica y se discute en el presente texto. Tfpicamente, puede hacerse una sonda a partir de cualquier combinacion de nucleotidos o derivados de nucleotidos o analogos disponibles en la tecnica. La capacidad de tales sondas y cebadores para hibridarse espedficamente con secuencias de polinucleotidos Apl les permitira ser de utilidad en la deteccion de la presencia de secuencias complementarias en una muestra de ensayo dada. Las sondas polinucleotfdicas y los cebadores de la invencion pueden hibridarse con secuencias complementarias en una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica, incluyendo saliva, esputo, sangre, plasma, suero, orina, heces, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido amniotico, exudado de la herida o tejido. Los polinucleotidos de la muestra pueden ser sometidos, por ejemplo, a electroforesis en gel u

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otras tecnicas de separacion de tamanos o pueden inmovilizarse sin separacion de tamano. Las sondas polinucleotfdicas o cebadores pueden marcarse. Se conocen en la tecnica marcadores adecuados y metodos para marcar sondas y cebadores, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos incorporadas por traduccion de mella o por quinasa, etiquetas de biotina, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores bioluminiscentes, marcadores quelantes metalicos y marcadores enzimaticos . Los polinucleotidos de la muestra se ponen en contacto con las sondas o cebadores bajo condiciones de hibridacion de rigor adecuado.

Dependiendo de la aplicacion, pueden usarse diversas condiciones de hibridacion para conseguir diversos grados de selectividad de la sonda o cebador hacia la secuencia diana. Para aplicaciones que requieren alta selectividad se pueden usar condiciones relativamente rigurosas, tales como condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por una concentracion de sal de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M a temperaturas de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C. Para aplicaciones que requieran menos selectividad, se pueden usar condiciones de hibridacion menos rigurosas. Por ejemplo, las condiciones salinas de aproximadamente 0,14 M a aproximadamente 0,9 M de sal, a temperaturas que vanan de aproximadamente 20 °C a aproximadamente 55 °C. La presencia de un complejo hibridado que comprende la sonda o cebador y un polinucleotido complementario de la muestra de ensayo indica la presencia de Apl o una secuencia de polinucleotido Apl en la muestra.

Anticuerpos

Los anticuerpos de la invencion son moleculas de anticuerpo que se unen espedfica y establemente a un polipeptido p44 Apl de la invencion o un fragmento del mismo. Los anticuerpos de la invencion tambien pueden unirse espedfica y establemente a un polipeptido p44 Aph o un fragmento del mismo. Un experto en la tecnica puede determinar facilmente si un anticuerpo es espedfico para un polipeptido Aph o Apl usando ensayos que se describen en el presente texto. Un anticuerpo de la invencion puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo de cadena unica (scFv) o un fragmento de union con el antigeno de un anticuerpo. Los fragmentos de union con el antfgeno de anticuerpos son una porcion de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de union con el antfgeno o region variable de un anticuerpo intacto, en donde la porcion esta libre de los dominios de cadena pesada constante de la region Fc del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2 y Fv.

Un anticuerpo de la invencion puede ser cualquier clase de anticuerpos, incluyendo por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Un anticuerpo o fragmento del mismo se une a un epftopo de un polipeptido de la invencion. Un anticuerpo puede hacerse in vivo en animales de laboratorio adecuados o in vitro usando tecnicas de ADN recombinante. Los medios para preparar y caracterizar anticuerpos son bien conocidos en la tecnica. Vease, por ejemplo, Dean, Methods Mol. Biol. 80: 23 - 37 (1998); Dean, Methods Mol. Biol. 32: 361 - 79 (1994); Baileg, Methods Mol. Biol. 32: 381 - 88 (1994); Gullick, Methods Mol. Biol. 32: 389 - 99 (1994); Drenckhahn et al. Methods Cell. Biol. 37: 7 - 56 (1993); Morrison, Ann. Rev. Immunol. 10: 239 - 65 (1992); Wright et al. Crit. Rev. Immunol. 12: 125 - 68 (1992). Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos policlonales administrando un polipeptido de la invencion a un animal, tal como un ser humano u otro primate, raton, rata, conejo, cobaya, cabra, cerdo, perro, vaca, oveja, asno o caballo. El suero del animal inmunizado se recoge y los anticuerpos se purifican a partir del plasma, por ejemplo mediante precipitacion con sulfato de amonio, seguido de cromatograffa, tal como cromatograffa de afinidad. Las tecnicas para producir y procesar anticuerpos policlonales son conocidas en el campo.

"Se une espedficamente" o "espedfico para" significa que un primer antfgeno, por ejemplo un polipeptido Apl o Aph, reconoce y se une a un anticuerpo de la invencion con mayor afinidad que otras moleculas no espedficas. Una molecula no espedfica es un antfgeno que no comparte ningun epftopo comun con el primer antfgeno. En este caso, los polipeptidos p44 Apl o Aph no senan generalmente opciones deseables para moleculas control no espedficas. Por ejemplo, un anticuerpo producido contra un primer antfgeno (p. ej. un polipeptido) al que se une mas eficazmente que a un antfgeno no espedfico, puede ser descrito como que se une espedficamente al primer antfgeno. En una realizacion preferida, un anticuerpo o porcion de union a antfgeno del mismo se une espedficamente a un polipeptido de SEQ ID NO: 12 o fragmentos del mismo cuando se une con una afinidad de union Ka de 107 l/mol o mas. La union espedfica se puede ensayar usando, por ejemplo, un ensayo de inmunoabsorbente ligado a una enzima (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de transferencia Western usando una metodologfa bien conocida en la tecnica.

Adicionalmente, se pueden tambien producir facilmente anticuerpos monoclonales dirigidos contra epftopos presentes en un polipeptido de la invencion. Por ejemplo, las celulas B normales de un mairftfero, tal como un raton, que fue inmunizado con un polipeptido de la invencion, se pueden fusionar, por ejemplo, con celulas de mieloma de raton sensibles a HAT para producir hibridomas. Los hibridomas que producen anticuerpos espedficos de Apl o Aph pueden identificarse usando RIA o ELISA y ser aislados por clonacion en agar semisolido o por dilucion limitante. Los clones que producen anticuerpos espedficos de Apl o Aph se afslan mediante otra ronda de cribado. Los anticuerpos monoclonales pueden rastrearse o cribarse en cuanto a especificidad usando tecnicas estandar, por ejemplo uniendo un polipeptido de la invencion a una placa de microtftulo y midiendo la union del anticuerpo monoclonal mediante un ensayo ELISA. Las tecnicas para producir y procesar anticuerpos monoclonales son conocidas en la tecnica. Vease, por ejemplo, Kohler & Milstein, Nature, 256: 495 (1975). Los isotipos particulares de un anticuerpo monoclonal pueden prepararse directamente por seleccion de la fusion inicial, o preparados

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secundariamente, a partir de un hibridoma parental que secrega un anticuerpo monoclonal de un isotipo diferente usando una tecnica de seleccion de sib para aislar variantes de cambio de clase. Vease Steplewski et al., P.N.A.S. U.S.A. 82: 8653, 1985; Spria et al., J. Immunolog. Meth. 74: 307, 1984. Los anticuerpos monoclonales de la invencion tambien pueden ser anticuerpos monoclonales recombinantes. Veanse, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 4.474.893; patente de EE. UU. n° 4.816.567. Los anticuerpos de la invencion pueden ser tambien construidos qmmicamente. Vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 4.676.980.

Los anticuerpos de la invencion pueden ser quimericos (vease, p. ej., la patente de EE. UU. n° 5.482.856), humanizados (vease, p. ej., Jones et al., Nature 321: 522 (l986), Reichmann et al., Nature 332: 323 (1988), Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593 (1992)), anticuerpos caninizados, caninos o humanos. Los anticuerpos humanos se pueden obtener, por ejemplo, mediante inmortalizacion directa, presentacion de fagos, ratones transgenicos o una metodologfa trimera, vease, por ejemplo, Reisener et al., Trends Biotechnol. 16: 242 - 246 (1998).

Los anticuerpos que se unen espedficamente a antigenos Apl o Aph (por ejemplo, polipeptidos Apl o Aph) son particularmente utiles para detectar la presencia de Apl o antigenos Apl en una muestra, tal como una muestra de suero, sangre, plasma, orina, heces o saliva de un animal infectado con Apl o Aph. Un inmunoensayo para Aph o un antigeno Apl puede usar un anticuerpo o varios anticuerpos. Un inmunoensayo para Aph o un antigeno Apl puede usar, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal espedfico para un epttopo Apl, una combinacion de anticuerpos monoclonales espedficos para epftopos de un polipeptido Apl, anticuerpos monoclonales espedficos para epttopos de diferentes polipeptidos Apl, anticuerpos policlonales espedficos para el mismo antfgeno Apl, anticuerpos policlonales espedficos para diferentes antigenos Apl, o una combinacion de anticuerpos monoclonales y policlonales. Los protocolos de inmunoensayo se pueden basar, por ejemplo, en ensayos de competicion, reaccion directa o de tipo sandwich, usando, por ejemplo, anticuerpo marcado. Los anticuerpos de la invencion pueden marcarse con cualquier tipo de marcador conocido en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivos, enzimaticos, de metal coloidal, radioisotopos y bioluminiscentes.

Los anticuerpos de la invencion o fragmentos de los mismos pueden unirse a un soporte y usarse para detectar la presencia de Aph o de un antigeno Apl. Los soportes incluyen, por ejemplo, vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nilon, amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, agarosas y magletita.

Los anticuerpos de la invencion pueden usarse ademas para aislar organismos Apl, antfgenos Apl, organismos Aph o antfgenos Aph mediante columnas de inmunoafinidad. Los anticuerpos se pueden fijar a un soporte solido, por ejemplo por adsorcion o por enlace covalente, de manera que los anticuerpos retienen su actividad inmunoselectiva. Opcionalmente, pueden incluirse grupos espaciadores de modo que el sitio de union al antfgeno del anticuerpo permanezca accesible. Los anticuerpos inmovilizados pueden entonces usarse para unir organismos Apl, antfgenos Apl, organismos Apl, o antfgenos Apl de una muestra, tal como una muestra biologica incluyendo saliva, suero, esputo, sangre, orina, heces, lfquido cefalorraqrndeo, lfquido amniotico, exudado de herida o tejido. Los organismos Apl, antfgenos Apl, organismos Apl, o antfgenos Apl unidos se recuperan de la matriz de la columna, por ejemplo, mediante un cambio en el pH.

Tambien pueden usarse anticuerpos de la invencion en estudios de inmunolocalizacion para analizar la presencia y distribucion de un polipeptido de la invencion durante diversos eventos celulares o condiciones fisiologicas. Los anticuerpos tambien pueden usarse para identificar moleculas implicadas en inmunizacion pasiva y para identificar moleculas implicadas en la biosmtesis de antfgenos no proteicos. La identificacion de tales moleculas puede ser util en el desarrollo de vacunas. Los anticuerpos de la invencion, incluyendo por ejemplo anticuerpos monoclonales y anticuerpos de cadena simple, pueden usarse para monitorizar el curso de la mejora de una enfermedad causada por Apl o Aph. Midiendo el aumento o la disminucion de anticuerpos Apl y/o anticuerpos Aph contra antfgenos Apl y/o antfgenos Aph en una muestra de ensayo de un animal, se puede determinar si es efectivo un regimen terapeutico particular dirigido a mejorar el trastorno. Los anticuerpos se pueden detectar y/o cuantificar usando, por ejemplo, ensayos de union directa tales como ensayos RIA, ELISA o de transferencia Western.

Metodos de deteccion.

Los metodos de la invencion pueden usarse para detectar anticuerpos o fragmentos de anticuerpos espedficos para Apl; polipeptidos Apl; Aph; polipeptidos Aph;polinucleotidos Apl, o una combinacion de los mismos en una muestra de ensayo, tal como una muestra biologica, una muestra medioambiental o una muestra de laboratorio. Una muestra de ensayo puede comprender potencialmente polinucleotidos Apl, polipeptidos Apl, polipeptidos Aph, anticuerpos espedficos para Apl, y/o anticuerpos espedficos para Aph. Una muestra biologica puede incluir, por ejemplo, suero, sangre, celulas, plasma o tejido de un mairnfero tal como un caballo, un gato, un perro o un ser humano. La muestra de ensayo puede ser no tratada, precipitada, fraccionada, separada, diluida, concentrada o purificada.

En una realizacion, los metodos de la invencion comprenden poner en contacto un polipeptido Apl con una muestra de ensayo bajo condiciones que permiten que se forme un complejo polipeptido/anticuerpo, es decir, un inmunocomplejo. Esto es, un polipeptido de la invencion se une espedficamente a un anticuerpo espedfico para antfgenos Apl y/o Aph localizados en la muestra. Un experto en la tecnica esta familiarizado con los ensayos y las condiciones que se usan para detectar la union del complejo de anticuerpo/polipeptido. Se detecta la formacion de un complejo entre polipeptidos y anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en la muestra. En una realizacion de la invencion,

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se pueden detectar complejos anticuerpo-polipeptido aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30 o menos dfas despues de la exposicion o infeccion del sujeto por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.

Los anticuerpos de la invencion pueden usarse en un metodo de diagnostico de infeccion de Apl y/o Aph mediante la obteniendo una muestra de ensayo de, por ejemplo, un ser humano o animal sospechoso de tener una infeccion de Apl y/o Aph. Tambien se puede detectar la exposicion a Apl o Aph. La exposicion incluina la presencia de organismos Aph o Apl sin smtomas clmicos y antes de la infeccion con Aph o Apl. La muestra de ensayo se pone en contacto con anticuerpos de la invencion en condiciones que permiten la formacion de complejos anticuerpo- antigeno (es decir, inmunocomplejos). La cantidad de complejos anticuerpo-antigeno puede determinarse mediante una metodologfa conocida en la tecnica. Un nivel que es mas alto que el formado en una muestra de control indica una infeccion de Apl y/o Aph. Una muestra de control es una muestra que no comprende ningun polipeptido Apl y/o Aph o anticuerpos espedficos para Apl o Aph. En una realizacion de la invencion, un anticuerpo es espedfico para antigenos Apl solamente. Alternativamente, un polipeptido de la invencion puede ponerse en contacto con una muestra de ensayo. Los anticuerpos Apl y/o Aph en una muestra corporal positiva formaran un complejo antigeno- anticuerpo bajo condiciones adecuadas. La cantidad de complejos anticuerpo-antigeno puede determinarse por metodos conocidos en la tecnica.

En una realizacion de la invencion, el complejo polipeptido/anticuerpo se detecta cuando un reactivo indicador, tal como un conjugado enzimatico, que esta unido al anticuerpo, cataliza una reaccion detectable. Opcionalmente, un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de senal se puede aplicar al complejo polipeptido/ anticuerpo bajo condiciones que permiten la formacion de un complejo polipeptido/anticuerpo/indicador. Se detecta el complejo polipeptido/anticuerpo /indicador. Opcionalmente, el polipeptido o anticuerpo puede marcarse con un reactivo indicador antes de la formacion de un complejo polipeptido / anticuerpo. El metodo puede comprender opcionalmente un control positivo o negativo.

En una realizacion de la invencion, los anticuerpos de la invencion se fijan a una fase solida o sustrato. Se anade al sustrato una muestra de ensayo que comprende potencialmente una protema que comprende un polipeptido de la invencion. Se anaden anticuerpos que se unen espedficamente a polipeptidos de la invencion. Los anticuerpos pueden ser los mismos anticuerpos usados en la fase solida o pueden ser de una fuente o especie diferente y pueden enlazarse a un reactivo indicador, tal como un conjugado enzimatico. Antes de cada adicion pueden realizarse pasos de lavado. Se anade un cromoforo o sustrato enzimatico y se permite que se desarrolle color. La reaccion de coloracion se detiene y se puede cuantificar el color usando, por ejemplo, un espectrofotometro.

En otra realizacion de la invencion, los anticuerpos de la invencion se fijan a una fase solida o sustrato. Se anade al sustrato una muestra de ensayo que comprende potencialmente una protema que comprende un polipeptido de la invencion. Se anaden segundos anticuerpos anti-especie que se unen espedficamente a polipeptidos de la invencion. Estos segundos anticuerpos son de especie diferente a la de los anticuerpos en fase solida. Se anaden terceros anticuerpos anti-especie que se unen espedficamente a los segundos anticuerpos y que no se unen espedficamente a los anticuerpos en fase solida. Los terceros anticuerpos pueden comprender un reactivo indicador tal como un conjugado enzimatico. Pueden realizarse etapas de lavado antes de cada adicion. Se anade un cromoforo o sustrato enzimatico y se deja que se desarrolle color. Se detiene la reaccion de coloracion y se puede cuantificar el color usando, por ejemplo, un espectrofotometro.

Los ensayos de la invencion incluyen, pero sin limitarse a los basados en la competencia, ensayos de reaccion directa o de tipo sandwich, incluyendo pero sin limitarse a ellos ensayo inmunosorbente ligado a una enzima (ELISA), western transferencia, IFA, radioinmunoensayo (RIA), hemaglutinacion (HA), inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia (FPIA) y ensayos en placa de microtttulo (cualquier ensayo hecho en uno o mas pocillos de una placa de microtftulo). Un ensayo de la invencion comprende un ensayo de union cromatografica de flujo reversible, por ejemplo un ensayo SNAP®. Vease la patente de EE. UU. n° 5.726.010.

Los ensayos pueden usar fases solidas o sustratos o pueden realizarse mediante inmunoprecipitacion o cualquier otro metodo que no utilice fases solidas. Cuando se usa una fase solida o un sustrato, un polipeptido de la invencion se une directa o indirectamente a un soporte solido o un sustrato tal como un pocillo de microtitulacion, una esfera magnetica, una esfera no magnetica, una columna, una matriz, una membrana, un fieltro fibroso compuesto de fibras sinteticas o naturales (por ejemplo, materiales a base de vidrio o celulosa o polfmeros termoplasticos, tales como polietileno, polipropileno o poliester), estructura sinterizada compuesta de materiales en partmulas (por ejemplo, vidrio o varios polfmeros termoplasticos) o pelmula de membrana moldeada compuesta de nitrocelulosa, nilon, polisulfona o similares (generalmente de naturaleza sintetica). Un sustrato preferido son partmulas finas de polietileno sinterizado, comunmente conocido como polietileno poroso, por ejemplo, polietileno poroso de 10-15 micras de Chromex Corporation (Albuquerque, NM). Todos estos materiales sustrato pueden ser usados en formas adecuadas, tales como pelmulas, laminas o placas, o pueden recubrirse o unirse o laminarse a soportes inertes apropiados, tales como papel, vidrio, pelmulas de material plastico o telas. Los metodos adecuados para inmovilizar peptidos sobre fases solidas incluyen interacciones ionicas, hidrofobas, covalentes y similares.

En un tipo de formato de ensayo, uno o mas polipeptidos se pueden aplicar como revestimiento sobre una fase solida o sustrato. Una muestra de ensayo sospechosa de contener un anticuerpo anti-Apl y/o anti-Aph o un fragmento del mismo se incuba con un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de senales

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conjugado con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo espedfico para Apl y/o Aph durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos antigeno/anticuerpo de cualquiera de los anticuerpos de la muestra de ensayo contra polipeptidos de la fase solida o el compuesto reactivo indicador conjugado con un anticuerpo espedfico para Apl y/o Aph contra los polipeptidos de la fase solida. La reduccion en la union del reactivo indicador conjugado con un anticuerpo anti-Apl y/o anti-Aph a la fase solida puede medirse cuantitativamente. Una reduccion medible en la senal comparada con la senal generada a partir de una muestra de ensayo Apl y/o Aph confirmada negativa indica la presencia de anticuerpo anti-Apl y/o anti-Aph en la muestra de ensayo. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo.

En otro tipo de formato de ensayo, uno o mas polipeptidos de la invencion se aplican como revestimiento sobre un soporte o sustrato. Un polipeptido de la invencion se conjuga con un reactivo indicador y se anade a una muestra de ensayo. Esta mezcla se aplica al soporte o sustrato. Si estan presentes los anticuerpos Apl y/o Aph en la muestra de ensayo, se uniran al polipeptido conjugado con un reactivo indicador y al polipeptido inmovilizado sobre el soporte. Entonces puede ser detectado el complejo polipeptido/anticuerpo/indicador. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo.

En otro tipo de formato de ensayo, uno o mas polipeptidos de la invencion se aplican como revestimiento sobre un soporte o sustrato. La muestra de ensayo se aplica al soporte o sustrato y se incuba. Los componentes no unidos de la muestra se eliminan lavando el soporte solido con una solucion de lavado. Si los anticuerpos espedficos de Apl y/o espedficos de Aph estan presentes en la muestra de ensayo, se uniran al polipeptido aplicado como recubrimiento sobre la fase solida. Este complejo polipeptido/anticuerpo se puede detectar usando un segundo anticuerpo espedfico de la especie que esta conjugado con un reactivo indicador. El complejo indicador polipeptido/anticuerpo/anticuerpo antiespecie se puede detectar entonces. Este tipo de ensayo puede cuantificar la cantidad de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo.

La formacion de un complejo polipeptido/anticuerpo o un complejo polipeptido/anticuerpo/indicador puede detectarse por radiometricos, colorimetricos, fluorometricos, de separacion por tamanos o de precipitacion. Opcionalmente, la deteccion de un complejo polipeptido/anticuerpo es mediante la adicion de un anticuerpo secundario que esta acoplado a un reactivo indicador que comprende un compuesto generador de senal. Los reactivos indicadores que comprenden compuestos generadores de senal (marcadores) asociados con un complejo polipeptido/anticuerpo pueden detectarse usando los metodos descritos anteriormente e incluyen agentes cromogenicos, catalizadores tales como conjugados enzimaticos compuestos fluorescentes tales como fluorescema y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos, acridinios, fenantridinios, rutenio y luminol, elementos radiactivos, marcadores visuales directos, asf como cofactores, inhibidores, partfculas magneticas y similares. Los ejemplos de conjugados enzimaticos incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, beta-galactosidasa, y similares. La seleccion de un marcador particular no es cntica, pero sera capaz de producir una senal bien sea por sf sola o bien en union con una o mas sustancias adicionales.

La formacion del complejo es indicativa de la presencia de anticuerpos anti-Apl y/o anti-Aph en una muestra de ensayo. Por consiguiente, los metodos de la invencion se pueden usar para diagnosticar la infeccion de Apl y/o Aph en un paciente.

Los metodos de la invencion tambien pueden indicar la cantidad o cuantfa de anticuerpos anti-Apl y/o Aph en una muestra de ensayo. Con muchos reactivos indicadores, tales como conjugados de enzima, la cantidad de anticuerpo presente es proporcional a la senal generada. Dependiendo del tipo de muestra de ensayo, puede diluirse con un reactivo tampon adecuado, concentrarse o ponerse en contacto con una fase solida sin ninguna manipulacion. Por ejemplo, se prefiere normalmente probar muestras de suero o plasma que previamente han sido diluidas o concentrar espedmenes tales como orina, con el fin de determinar la presencia y/o la cantidad de anticuerpo presente.

La invencion puede usarse tambien en relacion con kits de ensayo (por ejemplo, artfculos de manufactura) para detectar anticuerpos anti- Apl y/o anti- Aph o fragmentos de anticuerpo, Apl, polipeptidos Apl, Aph y/o polipeptidos Aph en una muestra. Un kit comprende uno o mas polipeptidos de la invencion y medios para determinar la union del polipeptido a anticuerpos anti-Apl y/o o anticuerpos anti-Aph o fragmentos de anticuerpo en la muestra. Un kit o artfculo de manufactura tambien puede comprender uno o mas anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invencion y medios para determinar la union de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo a Apl, polipeptidos Apl, Aph y/o polipeptidos Aph en la muestra. Un kit puede comprender un dispositivo que contiene uno o mas polipeptidos o anticuerpos de la invencion e instrucciones para el uso del uno o mas polipeptidos o anticuerpos, por ejemplo para la identificacion de una infeccion de Apl y/o Aph en un marnffero. El kit tambien puede comprender envasar material que comprende una etiqueta que indica que el uno o mas polipeptidos o anticuerpos del kit pueden ser usados para la identificacion de la infeccion de Apl y/o Aph. Otros componentes tales como tampones, controles y similares, conocidos por los profesionales con experiencia normal en la tecnica, pueden incluirse en tales kits de ensayo. Los polipeptidos, anticuerpos y ensayos de la invencion son utiles, por ejemplo, en el diagnostico de casos individuales de infeccion de Apl y/o Aph en un paciente, asf como los kits descritos en el presente texto, son utiles por ejemplo en el diagnostico de casos individuales de infeccion de Apl y/o Aph en un paciente, asf como en estudios epidemiologicos de brotes de Apl y/o Aph. Tambien puede detectarse la exposicion a Apl o Aph. La exposicion incluina la presencia de organismos Aph o Apl sin smtomas clmicos y la infeccion anterior con Aph o Apl.

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Los polipeptidos y ensayos de la invencion se pueden combinar con otros polipeptidos o ensayos para detectar la presencia de Apl junto con otros organismos. Por ejemplo, los polipeptidos y ensayos de la invencion pueden combinarse con reactivos que detectan la dirofilariosis o gusano del corazon y/o la Borrelia burgdorferi y/o Anaplasma phagocytophilium y/o Ehrlichia canis.

Los polinucleotidos de la invencion pueden usarse para detectar la presencia de polinucleotidos Apl en una muestra. Los polinucleotidos pueden usarse para detectar polinucleotidos Apl en una muestra mediante una reaccion de hibridacion simple y pueden usarse tambien, por ejemplo, en reacciones en cadena de polimerasa (PCR) tales como una reaccion de PCR en tiempo real. Los metodos y composiciones de la invencion tambien pueden usarse para detectar diferencialmente la presencia Apl de Aph. Los ensayos de PCR estan bien descritos en la tecnica, incluyendo, por ejemplo, la patente de EE. UU. n° 4.683.195; patente de EE. UU. n° 4.683.202; patente de EE. UU. n° 4.965.188. Generalmente, los cebadores polinucleotidicos se reanillan dando cadenas desnaturalizadas de un acido nucleico diana. Los productos de extension del cebador se forman por polimerizacion de desoxinucleosido trifosfatos por una polimerasa. La PCR implica entonces ciclos repetitivos de desnaturalizacion de acido nucleico molde, reanillamiento del cebador y extension de los cebadores reanillados por la accion de una polimerasa termoestable. El procedimiento tiene como resultado una amplificacion exponencial de los acidos nucleicos Apl diana en la muestra de ensayo, lo que permite la deteccion de polinucleotidos diana que existen en concentraciones muy bajas en una muestra.

Los ensayos de PCR en tiempo real se basan en la deteccion de una senal, por ejemplo, una senal informadora fluorescente. Esta senal aumenta en proporcion directa a la cantidad de producto de PCR en una reaccion. La PCR en tiempo real es cualquier tecnica de amplificacion que hace posible el seguimiento de la evolucion de una reaccion de amplificacion en marcha. Vease Quantitation of DNA/RNA Using Real-Time PCR Detection, Perkin Elmer Applied Biosystems (1999); PCR Protocols (Academic Press New York, 1989). Registrando la cantidad de emision de fluorescencia en cada ciclo, es posible controlar la reaccion de PCR durante la fase exponencial en la que el primer aumento significativo de la cantidad de producto de PCR se correlaciona con la cantidad inicial de la plantilla diana. Cuanto mas alto sea el numero de copias de partida de la diana de acido nucleico, tanto mas pronto se observa un aumento significativo en la fluorescencia.

Una realizacion de la invencion proporciona un metodo para detectar y/o cuantificar polinucleotidos de Anaplasma platys en una muestra de ensayo. Se pueden anadir cebadores sentido y cebadores antisentido a una muestra de ensayo bajo condiciones adecuadas para una reaccion en cadena de la polimerasa. Los cebadores se hibridan con polinucleotidos p44 de Anaplasma platys de manera que se forma un producto de amplificacion si estan presentes los polinucleotidos p44 de Anaplasma platys en la muestra de ensayo. En una realizacion, los cebadores son SEQ ID NO: 6 y 7. Se detectan productos de amplificacion y se determina la presencia y/o la cantidad de polinucleotidos p44 de Anaplasma platys. Los productos de amplificacion pueden detectarse con una sonda de polinucleotido que se hibrida, bajo condiciones adecuadas para una reaccion en cadena de la polimerasa, con una secuencia de polinucleotidos p44 Apl. Los ejemplos de sondas incluyen SEQ ID NO: 8 y 9. El producto de amplificacion puede cuantificarse midiendo una senal de deteccion a partir de la sonda y comparando dicha senal de deteccion con una segunda senal de deteccion de sonda de un patron de cuantificacion. El patron de cuantificacion se puede extraer en paralelo con la muestra de ensayo.

En otra forma de realizacion de la invencion, los cebadores de PCR se pueden elegir entre las regiones variables de un polinucleotido p44 Apl. Por ejemplo, los cebadores de 10, 15, 20, 25, 30 o 40 nucleotidos contiguos pueden seleccionarse de la region entre la posicion 20 y la 450 de las SEQ ID NO: 16, 17 y/o 18.

En cada caso en el presente texto cualquiera de las expresiones “que comprende”, “que consiste esencialmente en” y “que consiste en” puede reemplazarse por cualquiera de las otras dos expresiones, manteniendo sus significados normales.

Ademas, cuando se describen caractensticas o aspectos de la invencion en terminos de grupos de Markush u otro grupo de alternativas, los expertos en la tecnica reconoceran que la invencion se describe tambien en terminos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush Grupo u otro grupo.

Ejemplos.

Ejemplo 1.

Clonacion de un homologo p44 de Apl.

Un homologo de un gen p44 Aph de Apl fue clonado a partir de la sangre de un perro infectado. La muestra de sangre fue obtenida de un perro residente en la reserva Hopi en Arizona. El ADN genomico se aislo a partir de 200 |jl de sangre entera usando tecnicas estandar (QiaAmp DNA Blood Miniprep Kit - Part # 51104). Se disenaron cebadores degenerados para dirigirse a las regiones conservadas de los genes Aph p44, Anaplasma marginale msp2, Anaplasma ovis msp2 y Anaplasma centrale msp2 (Cebador directo: 5 'TAT TTT TAT GTT GGT YTR GAY TAT WSH CC3' (SEQ ID NO: 1 ) Cebador inverso: 5 'GCT CAG CAG ATC GTA RCA NGC RTT YAW CAT 3' (SEQ ID NO: 2)).

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Se uso PCR basada en cebadores degenerados en un termociclador convencional para amplificar un polinucleotido con una longitud de aproximadamente 800 nucleotidos de un gen p44 Apl segun protocolos estandar (Platinum® Taq, Invitrogen). Los productos de PCR fueron clonados, secuenciados y analizados en relacion con los reportados para otras especies de Anaplasma. La Figura 1A muestra una alineacion de las secuencias parciales obtenidas a partir de diferentes aislados de p44 Apl. El gen p44 Apl clonado contema una region hipervariable flanqueada por secuencias conservadas en los extremos 5 ' y 3'. Esto es similar a Aph p44, pero la longitud de la region hipervariable fue mas corta para p44 Apl. La Figura 1B muestra una alineacion de aminoacidos para p44 Apl con la region correspondiente de una secuencia de Aph publicada (Aph p44-1, numero de registro ABA26590). Aunque las secuencias de nucleotidos Apl p44de la presente invencion (p. ej. Figura 1A) muestran mas del 90% de identidad entre sf, comparten menos del 70% de identidad con la de Aph p44 y lo mismo es valido para las secuencias de aminoacidos.

Ejemplo 2

Deteccion de Apl por ensayo de PCR en tiempo real.

Se desarrollo un ensayo de PCR en tiempo real para detectar un polinucleotido Apl p44 de ADN genomico. Los tipos de muestra para analisis inclrnan sangre entera canina, asf como garrapatas ninfa y adultas. Se seleccionaron cebadores y sondas de hibridacion para ser espedficos para un gen Apl p44 y no amplificaron el gen p44 de Aph. Las secuencias de los cebadores y sondas se muestran a continuacion:

p44 Apl cebador directo: 5' CCGGCGTTTAGTAAGATAAATG 3' (SEQ ID NO: 6)

p44 Apl cebador inverso: 5' GCAAATTTAACGATCTCCGCC 3' (SEQ ID NO: 7)

sonda Apl p44 1129 - FITC: 5' ACAGTATCGGGGTAGCGAGAGTAGAA 3' (SEQ ID NO: 8)

sonda Apl p44 1183 - LC670: 5' GGAGATCGGCTATGAACAGTTCAAGAC 3' (SEQ ID NO: 9)

Estos fueron sintetizados por un proveedor comercial. La PCR en tiempo real fue optimizada para el Roche LightCycler® 480 usando reactivos Roche (Genotyping Master Mix n° 04707524001). Los cebadores se usaron a una concentracion de 0,3 pM para el cebador directo y 0,6 pM para el cebador inverso. Ambas sondas se usaron a una concentracion de 0,3 pM. La PCR se realizo en las siguientes condiciones: un ciclo unico de arranque caliente a 95°C durante 10 minutos seguido de 50 ciclos de desnaturalizacion a 95°C durante 30 segundos, reanillamiento a 58 °C durante 25 segundos y extension a 72°C durante 20 segundos. Se llevo a cabo una curva de fusion calentando el producto de la PCR a 95 °C durante 1 minuto, enfriando a 40 °C durante un minuto y calentando despues gradualmente a 80 °C. Se identificaron muestras positivas del software por tener tanto puntos de cruce positivos como una temperatura de la curva de fusion de 66,5 °C ± 1 °C. Se determino que la sensibilidad analitica era de al menos 0,1 fg en ADN genomico canino negativo (Figura 2A). La PCR p44 Apl detecto cepas de Apl procedentes de Estados Unidos, el Caribe y Brasil. La PCR p44 Apl no detecto ADN de Aph p44 de un plasmido de control que contema la plantilla Aph p44 o muestras de campo positivas para PCR (Figura 2B).

Ejemplo 3.

Deteccion de Apl mediante un ELISA indirecto anti-especie.

Se ensayo un peptido sintetico derivado del gen p44 de Apl en un formato ELISA para determinar la reactividad serologica en perros procedentes de un area con una carga elevada de garrapatas Rhipicephalus y una elevada seroprevalencia para E. canis. Estas areas geograficas han mostrado tener niveles relativamente altos de infecciones de A. platys y ausencia de infecciones de A. phagocytophilum en perros por PCR. La secuencia peptfdica se muestra a continuacion:

Cys-Lys-Asp-Gly-Thr-Arg-Val-Glu-Trp-Lys-Ala-Glu -Lys-Phe-Asp-Trp-Asn-Thr-Pro-Asp-Pro-Arg-Ile. (SEQ ID NO: 15). Una secuencia de peptido alternativa comprende:

Cys-Lys-Asp-Gly-Thr-Arg-Val-Glu-Trp-Lys-Ala-Glu-Lys-Phe-Asp-Trp-Asn-Thr-Pro-Asp-Pro-Arg-Ile-Lys -Phe-Lys-Asn (SEQ ID NO: 14).

El peptido sintetico de SEQ ID NO: 15 se solubilizo en DMSO y se aplico como recubrimiento en placas Immulon 2Hb (Thermo Electron Corporation n° 3455) a una concentracion de 0,25 pg/ml en Tris 50 mM, pH 7,5 durante la noche a temperatura ambiente. Las placas fueron bloqueadas con un tampon Tris/TWEEN® (Tris 0,1 M, pH 7,6 con TWEEN® 20 al 2%) durante 4 horas. Las placas se lavaron tres veces con lavado de placas (PBS, pH 7,2 con TWEEN®20 al 0,05%). Se anadio suero a una dilucion 1:100 en diluyente de muestras (PbS, pH 7,2 con TWEEN®20 al 0,05% y BSA al 1%) y se dejo incubar a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron 5 veces y se anadio un conjugado anti-perro (Jackson ImmunoResearch n° 304-035-003) a una dilucion 1: 2000 en diluyente de muestras y se dejo incubar durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces y se anadio un sustrato TMB de un componente y se dejo incubar durante 5 minutos antes de detenerse la reaccion con SDS al 1%. Se leyeron los valores de la absorbancia en un lector de placas estandar a una longitud de onda de 650

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nm. Se determino un valor de corte de 0,4. Las muestras se compararon con un ELISA clmico similar para Aph p44 (Snap®4DX™, IDEXX Laboratories, Inc.) y los resultados se muestran en la Figura 3. La columna marcada "SNAP® AP result" muestra los resultados obtenidos mediante inspeccion visual. La columna marcada "SNAP® NET AP" muestra resultados cuantitativos obtenidos por medidas densitometricas.

Se ensayaron un total de 67 muestras. Veintisiete muestras dieron negativo y 16 muestras dieron positivo en ambos ensayos. Veinticuatro muestras dieron negativo en el ELISA clmico para Aph p44, pero dieron positivo mediante el ELISA indirecto de p44 Apl anti-especie. Asf pues, el ensayo de Apl detecta la exposicion de Apl en perros que se perdena mediante pruebas con ensayos de Aph.

El Apl p44 proporciona un medio para detectar la infeccion de Apl mas alla de lo que se identifica por reactividad cruzada con p44 de Aph. Los polinucleotidos Apl p44 permiten la diferenciacion entre Apl y Aph.

Ejemplo 4

Sensibilidad de ELISA Apl directo.

Se infectaron experimentalmente perros con Apl y se recogieron muestras de suero una vez pasado un tiempo. Los anticuerpos en suero contra Apl se ensayaron usando un ELISA de Apl directo y el SNAP® 4Dx. Espedficamente, el peptido sintetico derivado del gen p44 de Apl (SEQ ID NO: 14 y denominado como Apl _p44L en las Tablas 1 y 2) se solubilizo en DMSO y se aplico como recubrimiento sobre placas Immulon™ 2Hb (Thermo Electron Corporation n° 3455) a una concentracion de 0,25 pg/ml en carbonato sodico 50 mM, pH 9,6, durante la noche a temperatura ambiente. Las placas fueron bloqueadas (TWEEN® 20 al 2% en Tris 0,1 M, pH 7,6) durante 2 horas. El suero (25 jl) se mezclo con 50 jl de un conjugado espedfico (el conjugado, Apl _p44L: HRPO se preparo a razon de 1:1 y se diluyo a 0,5 jl/ml en Tris 50 mM pH 7,6, 0,05% TWEEN®20, 5 % de BSA, y 10% FBS), y se anadio inmediatamente al pocillo recubierto para incubacion a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron entonces 6 veces antes de anadirse un sustrato de TMB de un componente para el desarrollo de color. Las medidas de absorbancia se leyeron en un lector de placas estandar a una longitud de onda de 650 nm. Se determino un valor de corte de 0,07. Las mismas muestras se ensayaron tambien usando un ELISA en clmica desarrollado para Aph (Snap® 4DxTM, IDEXX Laboratories, Inc.) y los resultados se muestran en la Tabla 1 (la columna marcada "SNAP® NET AP" muestra resultados cuantitativos obtenidos mediante medidas densitometricas. "Dfas PI" se refiere al numero de dfas despues de la infeccion.)

Tabla 1

Estudio del curso del tiempo por ELISA peptido Apl p44

ID Canino

ID IDEXX Apl_P44L valor de corte 0,07 SNAP® AP NETO Dfas PI

105376

A1_0 0,03 0 3

A1_1 0,04 0 7

A1_2 0,45 0 10

A1_3 0,68 0 14

A1_4 0,37 0,01 17

A1_5 0,17 0,03 21

A1_6 0,07 0,05 24

A1_7 0,11 0,2 28

A1_8 0,26 0,34 35

A1_9 0,20 0,31 42

A1_10 0,25 0,29 49

A1_11 0,20 0,13 56

A1_12 0,46 0,18 63

A1_13 1,11 0,43 71

Claims (32)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Un polipeptido purificado que comprende SEQ ID NO: 12 o al menos 20 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 20 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 16 a 150 o 209 a 240 de SEQ ID NO: 12.
2. 2. Un polinucleotido aislado que codifica el polipeptido segun la reivindicacion 1a
3. 3. El polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a, en donde el polipeptido comprende SEQ ID NO: 10;

   SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 o SEQ ID NO: 15.
4. 4. El polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a, que comprende ademas un vehmulo.
5. 5. El polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a, en donde el polipeptido purificado esta en una forma multimerica.
6. 6. El polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a, en donde el polipeptido purificado esta enlazado a un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protema, un polipeptido heterologo o una combinacion de los mismos.
7. 7. Un metodo para detectar anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de Anaplasma platys o de Anaplasma phagocytophilum o ambos, que comprende:

   (a) poner en contacto el polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a con una muestra de ensayo, bajo condiciones que permiten que se formen complejos polipeptido/anticuerpo;

   (b) detectar complejos polipeptido/anticuerpo;

   en donde la deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que estan presentes en la muestra de ensayo anticuerpos espedficos para Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum, y en donde la ausencia de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que no estan presentes en la muestra de ensayo anticuerpos espedficos para Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.
8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7a, que comprende ademas poner en contacto los complejos de la etapa (a) con un reactivo indicador antes de la realizacion de la etapa (b).
9. 9. El metodo segun la reivindicacion 7a, en donde se determina la cantidad de anticuerpo en la muestra de ensayo.
10. 10. El metodo segun la reivindicacion 7a, en donde el polipeptido purificado se fija a un sustrato.
11. 11. El metodo segun la reivindicacion 7a, en donde el polipeptido purificado es una protema de fusion en la que

    el polipeptido purificado se fusiona con un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protemas, una protema heterologa, o una combinacion de los mismos.
12. 12. El metodo segun la reivindicacion 7a, en donde el polipeptido purificado esta en forma multimerica.
13. 13. El metodo segun la reivindicacion 7a, en donde el metodo comprende un ensayo en placa de microtftulo, un

    ensayo de union cromatografica de flujo reversible, un ensayo de inmunosorbente ligado a una enzima, un radioinmunoensayo, un ensayo de hemaglutinacion, un ensayo de transferencia Western, un inmunoensayo de polarizacion de fluorescencia o un ensayo de inmunofluorescencia indirecta.
14. 14. Un metodo para detectar una infeccion de Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum, y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum en un sujeto, que comprende:

    (a) poner en contacto el polipeptido purificado segun la reivindicacion 1a, con una muestra biologica obtenida del sujeto, bajo condiciones que permiten que se formen complejos de polipeptido/anticuerpo; y

    (b) detectar complejos de polipeptido/anticuerpo;

    en donde la deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que el sujeto tiene una infeccion por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum, y en donde la ausencia de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que el mairnfero no ha tenido una infeccion por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum y/o una exposicion a Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.
15. 15. El metodo segun la reivindicacion 14a, que comprende ademas poner en contacto los complejos polipeptido/anticuerpo de la etapa (a) con un reactivo indicador que produce una senal medible, antes de la

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    realizacion de la etapa (b).
16. 16. El metodo segun la reivindicacion 14a, en donde el polipeptido purificado esta fusionado con un reactivo indicador, un espaciador de aminoacidos, un enlazador de aminoacidos, una secuencia senal, una secuencia de transferencia de parada, un dominio transmembrana, un ligando de purificacion de protema, un polipeptido heterologo o una combinacion de los mismos.
17. 17. El metodo segun la reivindicacion 14a, en donde los complejos polipeptido/anticuerpo son detectados aproximadamente 10 dfas despues de la exposicion o la infeccion del sujeto por Anaplasma platys y/o Anaplasma phagocytophilum.
18. 18. Un anticuerpo que se une espedficamente a un polipeptido p44 de Anaplasma platys, en donde el polipeptido consiste en al menos 10 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 10 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 209 a 240 de SEQ ID NO: 12.
19. 19. El anticuerpo segun la reivindicacion 18a, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento Fab'-SH, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, o un anticuerpo de cadena simple.
20. 20. Un metodo para detectar un polipeptido de Anaplasma platys o de Anaplasma phagocytophilum en una muestra, que comprende

    (a) poner en contacto uno o mas anticuerpos que se unen espedficamente a un polipeptido de Anaplasma platys con la muestra bajo condiciones que permiten que se formen complejos polipeptido/anticuerpo; en donde el polipeptido de Anaplasma platys comprende al menos 20 aminoacidos contiguos de SEQ ID NO: 12, en donde los al menos 20 aminoacidos contiguos se eligen entre los aminoacidos 209 a 240 de SEQ ID NO: 12: y

    (b) detectar complejos polipeptido/anticuerpo;

    en donde la deteccion de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que un polipeptido de Anaplasma platys esta presente en la muestra y la ausencia de complejos polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que en la muestra esta presente un polipeptido de Anaplasma platys y la ausencia de complejos de polipeptido/anticuerpo es una indicacion de que un polipeptido de Anaplasma platys no esta presente en la muestra.
21. 21. El metodo segun la reivindicacion 20a, en donde el uno o mas anticuerpos son anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos Fab'-SH, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fv, o anticuerpos de cadena simple.
22. 22. Un metodo para detectar polinucleotidos p44 de Anaplasma platys que comprende:

    (a) poner en contacto una muestra de ensayo con polinucleotidos de sonda que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7, 8, 9, o combinaciones de los mismas, bajo condiciones que permiten complejos de hibridacion entre los polinucleotidos p44 de Anaplasma platys y los polinucleotidos sonda; y

    (b) detectar complejos de polinucleotido p44 de Anaplasma platys/polinucleotido sonda;

    en donde la ausencia de complejos de polinucleotido p44 de Anaplasma platys/polinucleotido sonda es una indicacion de que no estan presentes polinucleotidos de Anaplasma platys en la muestra de ensayo y en donde la presencia de complejos de polipeptido p44 de Anaplasma platys/polinucleotidos sonda es una indicacion de que los polinucleotidos de Anaplasma platys estan presentes en la muestra de ensayo.
23. 23. Un metodo para detectar polinucleotidos de Anaplasma platys que comprende:

    (a) poner en contacto una muestra de ensayo con cebadores de acidos nucleicos que comprenden las SEQ ID NO: 6y SEQ ID NO: 7; y

    (b) llevar a cabo una reaccion de amplificacion de acido nucleico;

    en donde los productos de la amplificacion que comprenden polinucleotidos de Anaplasma platys se producen si estan presentes polinucleotidos de Anaplasma platys en la muestra de ensayo.
24. 24. El metodo segun la reivindicacion 23a, en donde se usan sondas de acido nucleico que comprenden SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, o ambas, para detectar los productos de amplificacion.
25. 25. El metodo segun la reivindicacion 23a, en donde cualquier polinucleotido de Anaplasma platys presente en la muestra de ensayo no es amplificado.
26. 26. El metodo segun la reivindicacion 24a, en donde las sondas de acido nucleico comprenden un marcador detectable.
27. 27. El metodo segun la reivindicacion 23a, en donde la reaccion de amplificacion de acido nucleico es una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), una PCR de punto final, una PCR en tiempo real o un ensayo de PCR anidada.
28. 28. El metodo segun la reivindicacion 23a, en donde se determina la cantidad de polinucleotidos de Anaplasma 5 platys en las muestras.
29. 29. Un metodo para diagnosticar una infeccion de Anaplasma platys en un sujeto, que comprende detectar la presencia de polinucleotidos que codifican todo o parte de un polipeptido p44 de Anaplasma platys y/o detectar la presencia de un polipeptido p44 de Anaplasma platys en una muestra de ensayo.
30. 30. Un metodo para detectar y/o cuantificar polinucleotidos de Anaplasma platys en una muestra de ensayo, 10 que comprende:

    (a) anadir cebadores sentido y cebadores antisentido a la muestra de ensayo bajo condiciones adecuadas para una reaccion en cadena de la polimerasa, en donde los cebadores se hibridan con polinucleotidos p44 de Anaplasma platys de tal manera que se forma un producto de amplificacion si estan presentes los polinucleotidos p44 de Anaplasma platys en la muestra de ensayo; y

    15 (b) detectar el producto de amplificacion, con lo que se detecta la presencia y/o la cantidad de polinucleotidos

    p44 de Anaplasma platys.
31. 31. El metodo segun la reivindicacion 30a, en donde cualquier polinucleotido de Anaplasma phagocytophilum presente en la muestra de ensayo no es amplificado.
32. 32. El metodo segun la reivindicacion 30a, en donde los cebadores comprenden las secuencias expuestas en 20 SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO: 7.

    Apl p44-l Apl p44-2 Apl_p4 4-3

    TATTTTTATG TATTTTTATG TATTTTTATG

    Apl p44-l Apl p44-2 Apl_p44-3

    GTTTGAGATA GTTTGAGATA GTTTGAGATA

    Apl_p44-1 Apl p44-2 Apl_p44-3

    TGAAAGATGG TGAAAGATGG TGAAAGATGG

    Apl_p4 4-1 Apl_p44~2

    ACACCAGATC ACACCAGATC

    Apl_p44-3

    ACACCAGATC

    Apl_p44-1 Apl_p44-2 Apl p44-3

    AGGAAGTGTG AGGAAGTGTG AGGAAGTGTG

    Apl p44-l Apl_p44-2 Apl p44-3

    GCTATGAACA GCTATGAACA GCTATGAACA

    Apl p44-l Apl_p44-2 Apl p44-3

    GAAGAAGCTG GAAGAAGCTG GAAGAAGCTG

    Apl_p4 4-1 Apl_p44-2 Apl_p44-3

    GGTGAGTGAC GGTGAGTGAC GGTGAGTGAC

    Apl p44-l Apl p44-2 Apl_p44-3

    CGGCGGAGAT CGGCGGAGAT CGGCGGAGAT

    Apl p44-l Apl p44-2 Apl_p44-3

    ATTGATAAGA ATTGATGGAA ATTGATGGAA

    TTGGTYTGGA YTATWGCCCG TTGGTTTGGA TTATTGCCCG TTGGTTTAGA TTATAGTCCG

    AGAGAGAGTA CCGGGGAAAC AGAGAGAGTA CCGGGGAAAC AGAGAGAGTA CCGGGGAAAC

    AACTAGAGTG GAGTGGAAAG AACTAGAGTG GAGTGGAAAG AACTAGAGTG GAGTGGAAAG

    CGAGGATTAA GTTTAAAAAC CGAGGATTAA GTTTAAAAAC

    CGAGGATTAA GTTTAAAAAC

    GGCTACAGTA TCGGGGTAGC GGCTACAGTA TCGGGGTAGC GGCTACAGTA TCGGGGTAGC

    GTTCAAGACG AAAGGAATAA GTTCAAGACG AAAGGAATAA GTTCAAGACG AAAGGAATAA

    ATGCCGTGTA CCTGTTGGCT ATGCCGTGTA CCTGTTGGCT ATGCCGTGTA CCTGTTGGCT

    CAGAGCGATA AATTCCTGGA CAGAGCGATA AATTCCTGGA CAGAGCGATA AATTCCTGGA

    CGTTAAATTT GCTGAGGCTG CGTTAAGTTT GCTGAGGCTG CGTTAAATTT GCTGAGGCTG

    AGGTTTGTAA GAAGCACACT AGGTTTGTAA GAAGCACAAC AGGTTTGTAA GAAGAACACT

    GCGTTTAGTA AGATAAATGG GCGTTTAGTA AGATAAATGG GCGTTTAGTA AGATAAATGG

    TGCGGCAGTA TATCCGTACA TGCGGCAGTA TATCCGTACA TGCGGCAGTA TATCCGTACA

    CTGAGAAGTT CGACTGGAAC CTGAGAAGTT CGACTGGAAC CTGAGAAGTT CGACTGGAAC

    AATCCTATCG TAGCGTTGGA AATCCTATCG TAGCGTTAGA

    AATCCTATCG TAGCGTTGGA

    GAGAGTAGAA CTGGAGATCG GAGAGTAGAA CTGGAGATCG GAGAGTAGAA CTGGAGATCG

    GAGATACGGG AAGTAAGGAA GAGATACGGG AAGTAAGGAA GAGATACGGG AAGTAAGGAA

    AAGAAGCTAC CGCATACCCT AAGAAGCTAC CGCATACCCT AAGAAGCTAC CGCATACCCT

    GGAGCTGAAG AATACGAAAG GGAGCTGAAG AATACGAAAG GGAGCTGAAG AATACGAAAG

    TTGGCACATC GGCAAAGGAT TTGGCACATC GGCAAAGGAT TTGGCACATC GGCAAAGGAT

    AACAATGCGG CGAACAGTTG GGCAATGCGG CAGGCAGTTG AACAATGCGG CAGACAGTTG

    Apl_p4 4-1 Apl_p44-2 Apl_p44-3

    Apl_p44-1

    Apl_p44-2

    Apl_p44-3

    Apl_p44-1 Apl_p4 4-2 Apl_p44-3

    Apl_p44-1 Apl_p44-2 Apl_p4 4-3

    Apl_p44-1

    Apl_p44-2

    Apl_p44-3

    GAAGTGCGAG

    GCAGTGCACG

    GAAGTGCGAG

    CAGCCTGGAA

    CAGACTGGCA

    CAGACTGGCA

    GCGGCACCGA

    GCGAAACAAG

    GCGGCAGCGA

    GACAAGCGCC CG...GC... CG...GC...

    AAGGCGTTCA

    AAGACGTTGA

    AAGGAGTTCA

    GTGAAATATT TACGAAGGCA GGCGTAAATA CTGACGGCAA AGGCAAAGCA

    GTGAGATATT TACGAAGGCT GGCGTGGATG CTAAC......GGCAAAGCA

    GTAAACTATT TACGAAGGCT GGCGTGGATG CTAACGAGAA AGGCAAAGCG

    TGGCCTAACG GGCACACCGA CAGCGCCGCG AAAGCGGAAG ACCTAAGTAC

    TGGCCTAACG GA.....AG CGACGCCGCG AAAGCGGAAG ACCTAAGTAC

    TGGCCTAACG GGCACACCGA CAGCGCCGCG AAAGCGGAAG ACCTAAGTAC

    GGCGTTGAAT AGAGAACTAA CCAGCGCCGA AAAGAACAAG GTAGCTGGGC TGCGTTGAAT AGAGAACTAA CCAGCGCTGA AAAGAACAAG GTAGCTGGCC GGCGTTGAAT AGAGAACTAA CCAGCGCCGA AAAGAACAAG GTAGCTGGGC

    TGCTAACCAG GACTATATCC GGTGGTGAGG TAGTGGAGAT CCGTGCGGTG TACTAACCAG GACTATATCC GGTGGCGAGG TAGTGGAGAT CCGTGCGGTG TGCTAACCAG GACTATATCC GGTGGTGAGG TAGTGGAGAT CCGTGCGGTG

    Apl_p44-1 Apl_p4 4-2 Api_p44-3

    TCGACAACGT

    TCGACAACGT

    TCGACAACGT

    CAGTAATGWT AAATGCGTGY TACGATCTGC CAGTAATGAT AAACGCATGT TACGATCTGC CAGTAATGTT AAACGCCTGC TACGATCTGC

    TGAGC

    TGAGC

    SEQ

    SEQ

    ox?r\

    uuy

    ID

    ID

    ID

    NO: 16 NO: 17 NO: 18

    Secuencia traducida

    imagen1

    imagen2

    243

    E V V E I R A V S T T S V M X N A C

    237

    E V V E I R A V S T T S V M I N A C

    241

    E V V E I R A V S T T S V M L N A C

    271

    E V V E X R A V S S T S V M V N A C

    Y

    D L L S Apl p44-l SEQ ID NO: 3

    Y

    D L L S Apl p44-2 SEQ ID NO: 4

    Y

    D L L S Apl p4 4-3 SEQ ID NO: 5

    Y

    D L L S Aph p44-l SEQ ID NO: 19

    Figura 2A. Sensibilidad analftica de una PCR en tiempo real de Apl p44

    Concentracion de plasmido

    Punto de cruce Temperatura de fusion (°C)

    100 pg

    17,05 66,42

    10 pg

    21,04 66,44

    i pg

    24,78 66,35

    100 fg

    28,56 66,33

    10 fg

    32,57 66,73

    1 fg

    34,14 67,13

    0,1 fg

    35,27 67,48

    Agua

    Neg Neg

    10 fg en ADN genomico canino

    30,02 66,66

    0,1 fg en ADN genomico canino

    33,25 66,43

    Figura 2B. Resultados de la PCR en muestras y plasmido testigo ensayados en la PCR en tiempo real de Aph y Apl p44

    Muestra

    PCR Aph PCR Apl

    Punto de cruce

    Temp. de fusion Punto de cruce Temp. de fusion

    Turks & Caicos

    n/a n/a 30,53 66,68

    Arizona

    n/a n/a 32,01 66,33

    Brasil-1

    Negativo Negativo 29,76 66,5

    Brasil-2

    Negativo Negativo 29,43 66,8

    Tick-1

    Negativo Negativo 35,84 66,88

    Tick-2

    Negativo Negativo 30,66 66,48

    Nymph-1

    Negativo Negativo 30,69 66,17

    Nymph-2

    Negativo Negativo 33,5 66,54

    Minnesota

    34,98 64,54 Negativo Negativo

    Massachusetts

    30,89 64,58 Negativo Negativo

    Plasmido Aph (1 fg)

    36,44 64,56 Negativo Negativo

    Figura 5. Comparacion del ELISA en clfnica Snap®4Dx™ Aph con ELISA indirecto peptido antiespecie Apl p44.

    Muestra

    SNAP® AP result SNAP® NETAP Apl p44 Muestra SNAP® AP result SNAP® NETAP Apl p44

    P1

    0 0.149 HP 116 * 0.00 0.368

    P4

    - 0 0.383 HP 117 - 0.00 0.3705

    P5

    0.3 2.718 HP 119 • 0.00 0.236

    P6

    + 0.22 1.773 HP 120 - 0.00 0.220

    py

    - 0 0.2715 HP 121 * 0.00 • .0.441;

    P8

    - 0 ,.0.4275 HP 123 + 0.84 2.309

    P9

    _ 0 V 0.9595' HP 124 0.00 0.316

    P12

    - 0 • 0.6725 HP 126 - 0.00 0.173

    P13

    - 0 -0.6115 HP 127 - 0.00 ■ 0.524

    P15

    + 0.32 3.0265 HP 128 0.00 0.7555

    P16

    - 0 0.222 HP 136 + 0.75 2.509

    P18

    0 0.4395 HP 138 * 0.00 0.4125

    P19

    - 0 v.0;9025: HP 139 - 0.00 0.204

    P20

    * 0 1.492 HP 140 0.00 0.5165

    P21

    + 0.07 0.5095 HP 142 - 0.00 0.25

    P22

    + 0.18 1.716 HP 143 0.00 0.348

    P23

    + 0.56 2.7275 HP 144 - 0.00 0.246

    P25

    0 0.114 HP 145 - 0.00 . 1.057

    P26

    + 0.1 0.74 HP 146 . 0.00 0.316

    P27

    - 0 0.217 HP 148 0.00 0.467

    P29

    - 0 0.489 HP 149 - 0.00 , 0,656;

    P32

    0 0.294 HP 150 * 0.00

    P33

    + 0.33 2.658 HP 152 * 0.00 rv a a~7 U. IU/

    P34

    - 0 2.2985 HP 153 - 0.00 0.721;?

    P35

    - 0 0.264 HP 154 0.00 0.16

    P39

    - 0 0.2535 HP 155 - 0.00 0.1685

    P40

    + 0.15 1.346 HP 156 0.00 0.209

    P41

    - 0 0.678 HP 158 - o’.'oo 0.32

    P43

    • 0 ' 0.841 HP 159 - 0.00 0.2745

    P45

    - 0 0.236 HP 160 - 0.00 77X1:5665:;

    P48

    - 0 - 1.118 HP 170 + 0.64 2.747

    P49

    0 . :.;0;5345: ; HP 230 + 0.58 2.747

    HP 235 + 0.48 1.563

    HP 242 + 0.75 2.131

    HP 249 + 0.55 1.376