ES2613806T3

ES2613806T3 - Ensayo de difusión con disco para oritavancina

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Publication number: ES2613806T3
Application number: ES12817566.8T
Authority: ES
Inventors: Adam Belley
Original assignee: Medicines Co
Current assignee: Medicines Co
Priority date: 2011-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2017-05-26
Anticipated expiration: 2032-07-26
Also published as: US20130029371A1; EP2737077B1; EP2737077A4; WO2013016529A2; US8815535B2; EP2737077A2; WO2013016529A3

Abstract

Un ensayo de difusión con disco para determinar la susceptibilidad de bacterias a oritavancina, comprendiendo dicho ensayo: a) impregnar un disco de papel con una solución que comprende oritavancina, polisorbato 80 y Span 80, b) colocar el disco impregnado sobre la superficie de una placa de medio de cultivo revestida con bacterias, c) incubar la placa de b) en condiciones que estimulen el crecimiento bacteriano, y d) medir una zona de inhibición alrededor del disco, en el que el ensayo produce un diámetro de la zona de inhibición >=15 mm cuando se usa la cepa de control de calidad del CLSI Staphylococcus aureus susceptible a meticilina (MSSA) 25923.

Description

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milímetros.

Procedimientos experimentales

5 Se disolvió la oritavancina en polvo en P80 esterilizado por filtración preparado recientemente (variando entre un 0,002 % y un 10 %) o (2-hidroxipropil)-β-ciclodextrina (HPCD; 10 %) en concentraciones entre 4,5 y 18 mg/ml (ajustadas para potencia basándose en la pureza de lote). Se dejaron secar discos de papel Whatman esterilizados con etanol (de 6 mm de diámetro) y a continuación se impregnaron con 20 microlitros de solución de oritavancina que contenía cantidades totales que variaron de 90 a 360 microgramos. Los discos se dejaron secar a temperatura

10 ambiente durante varios periodos de tiempo antes de su uso.

Se prepararon suspensiones bacterianas y se ajustaron a una densidad óptica de 0,1 a 600 nm. Se sembraron placas (de 90 mm de diámetro) de agar Mueller Hinton con ajuste de cationes con las suspensiones bacterianas por inoculación con hisopo inicial en el centro de la placa y a continuación moviéndose hacia fuera hacia el borde. La

15 placa se inoculó con hisopo una segunda vez, perpendicular a la orientación de la primera inoculación con hisopo. Para evaluar el impacto de la predifusión en el diámetro de las zonas de inhibición, se colocaron inmediatamente dos discos en una mitad de la placa y la placa se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Después de 3 horas, se colocaron dos discos adicionales en la otra mitad de la placa y a continuación la placa se incubó durante una noche a 37 ºC. Los diámetros de zona se midieron con una regla y se informaron en milímetros.

20 Resultados

Se identificaron tres condiciones que estimularon la difusión de oritavancina en agar y dieron como resultado diámetros de zona ≥ 15 mm para la cepa de control de calidad S. aureus ATCC 25923.

25 1) La predifusión aumenta los diámetros de zona. Se llevó a cabo un experimento inicial para determinar si una etapa de predifusión aumentaría los diámetros de zona. Se prepararon discos que contenían 360 µg de oritavancina disuelta en P80 al 0,002 % y se colocaron sobre placas sembradas con bacterias. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 3 horas para permitir la predifusión, las placas se pusieron a continuación a 37 ºC durante una noche. El diámetro de zona promedio sin predifusión producido por dos discos fue 10,5 mm frente a

30 MSSA ATCC 25923 (Figura 1A). El diámetro de zona promedio aumentó hasta 12,0 mm cuando se permitió una predifusión durante 3 horas (Figura 1C). Aunque las zonas de eliminación con la etapa de predifusión estuvieron por debajo del umbral mínimo de 15 mm de diámetro recomendado por el CLSI para el rendimiento adecuado del ensayo de difusión con disco, la predifusión aumentó el área de la zona de eliminación en aproximadamente un 24 % y por lo tanto se incorporó a ensayos adicionales.

35 2) La inclusión de P80 al 5 % como excipiente aumenta los diámetros de zona. Como se muestra en la Figura 1, el diámetro de zona promedio que resulta de dos discos preparados con oritavancina disuelta en una solución al 5 % de P80 frente a la cepa de control de calidad MSSA ATCC 25923 fue 14,8 mm (B) y aumentó hasta 17,0 mm cuando se llevó a cabo predifusión (D). Ensayos adicionales de excipientes revelaron que la HPCD ((2-hidroxipropil)-βciclodextrina) al 10 % también mejoró la difusión de oritavancina en agar (Tabla 1). Sin embargo, solo los discos

40 preparados con oritavancina disuelta en P80 al 5 % pero no con HPCD al 10 % exhibieron diámetros de zona que variaron de acuerdo con la MIC de microdilución en caldo de la cepa (Tabla 1). Por lo tanto, solo se usaron los discos que contenían oritavancina disuelta en P80 al 5 % en los experimentos posteriores.

Tabla 1. Efecto de los excipientes en los diámetros de zona para aislados de S. aureus

Cepa: Fenotipo MIC BMD de Oritavancina (μg/ml) Diámetro de zona promedioa (mm ± SD) para discos que contenían 360 µg de oritavancina

Excipiente

P80 al 5 %b: HPCD al 10 %c

ATCC 25923: MSSA 0,125 19,0 17,5

NRS2: hVISA 0,25 17,8 17,5

ATCC 700699: VISA 1 15,0 17,3

NRS3: VISA 1 14,0 16,8

NRS402: VISA 1 14,8 17,5

aLos diámetros de zona informados fueron de discos que habían experimentado la etapa de predifusión de 3 horas. Los resultados son el promedio de 2 discos.bLos discos preparados a partir de oritavancina disuelta en P80 al 5 % se almacenaron a temperatura ambiente durante 5 días antes de su uso. cLos discos preparados a partir de oritavancina disuelta en HPCD al 10 % se prepararon el mismo día de uso.

Se examinó el efecto del P80 al 5 % en la difusión de otros agentes antimicrobianos. Se prepararon discos que contenían 30 µg de daptomicina, telavancina o vancomicina sin (control) o con P80 al 5 %. Como se muestra en la Tabla 2, la adición de P80 al 5 % a discos que contenían 30 µg del lipoglicopéptido telavancina aumentó los diámetros de zona en un promedio de 1,5 mm frente a MSSA ATCC 25923. La inclusión de P80 al 5 % no tuvo ningún efecto en los diámetros de zona de daptomicina y vancomicina.

Tabla 2. Efecto del P80 al 5 % en los diámetros de zona obtenidos con diversos agentes antimicrobianos

Agente antimicrobiano: Cantidad en disco (µg) Diámetro de zona promedio (mm) obtenido con S. aureus ATCC 25923a

Control: + P80 al 5 %

Daptomicina: 30 18,5 18

Telavancina: 30 16,5 18

Vancomicina: 30 17,5 17,5

aLos resultados son el promedio de 2 discos sin predifusión.

3) El almacenamiento de los discos preparados a temperatura ambiente antes de su uso aumenta los diámetros de

10 zona. Se observó que los diámetros de zona aumentaron cuando los discos preparados a partir de oritavancina disuelta en P80 al 5 % se incubaron a temperatura ambiente durante periodos mayores que un día antes de su uso. Como se muestra en la Tabla 3, los diámetros de zona aumentaron a medida que transcurrió el tiempo entre la preparación del disco y su uso. A partir de estos resultados, los discos se almacenaron a temperatura ambiente durante al menos 8 días antes de su uso.

15 Tabla 3. Efecto en el diámetro de zona del almacenamiento de los discos a temperatura ambiente antes de su uso

Cepa: Diámetro de zona promedio a (mm)

Tiempo transcurrido entre la preparación del disco y su usob

Mismo día: 1 día 4 días 6 días 8 días

ATCC 25923: 14,0 15,0 15,8 16,3 17,0

aLos diámetros de zona informados fueron de discos que habían experimentado una etapa de predifusión de 3 horas. Los resultados son el promedio de 2 discos.bLos discos se prepararon a partir de una solución de trabajo individual de 18 mg/ml de oritavancina disuelta en P80 al 5 %. Los discos se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se sometieron a ensayo.

Usando las condiciones óptimas descritas anteriormente (inclusión de P80 al 5 %, predifusión de 3 horas y secado de los discos al menos 8 días antes de su uso), se llevaron a cabo experimentos para determinar si los aislados de 20 S. aureus de diferentes MIC BMD se podían distinguir mediante el diámetro de zona en ensayos con disco. Para estos experimentos, se prepararon discos que contenían 360 µg de oritavancina en P80 al 5 % y se almacenaron a temperatura ambiente durante 8 y 14 días antes de su uso. Como se muestra en la Tabla 4, los diámetros de zona disminuyeron para los aislados que exhibían un aumento de la MIC BMD frente a oritavancina. La correlación entre el diámetro de zona y la MIC BMD para todos los aislados sometidos a ensayo fue evidente (r = -0,78) y la 25 correlación mejoró cuando se excluyeron del análisis los dos aislados de susceptibilidad reducida a oritavancina seleccionados en laboratorio (r = -0,94): los diámetros de zona para los dos aislados de susceptibilidad reducida de

S. aureus fueron aproximadamente 2 mm menores en comparación con los aislados de MSSA y MRSA que exhibían las mismas MIC BMD. La predifusión aumentó los diámetros de zona para las cepas de MSSA y MRSA en un promedio de aproximadamente 2,5 mm. De forma similar, la predifusión aumentó los diámetros de zona para los

30 aislados de VISA y susceptibilidad reducida a oritavancina en un promedio de aproximadamente 1,1 mm.

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Tabla 10. Diámetros de zona de inhibición para aislados de S. aureus usando discos de Oxoid impregnados con oritavancina

Cepa: Fenotipo MIC BMD de oritavancina (μg/ml) Diámetro de la zona de inhibición (mm)a

ATCC 25923: MSSA 0,12 17,5

NRS2: hVISA 0,25 16,5

Mu50: VISA 1 13

aLos discos usados en este experimento se impregnaron con 20 µl de 18 µg/ml de oritavancina disuelta en P80 al 5 %. Los discos se incubaron durante 30 días a temperatura ambiente antes de su uso. La predifusión fue durante 6 horas a 4 ºC.

Ejemplo 4

Se investigaron excipientes alternativos en los que se disolvió la oritavancina incluyendo una mezcla tanto de P80 como de Span 80 y los tensioactivos Merpol SE, Brij 30 y poli(etilenglicol) hexaoleato de sorbitol.

Tabla 11. Artículos de ensayo

Artículo de ensayo: Proveedor

Difosfato de oritavancina (n.º de lote 87556IL00): The Medicines Company, Parsippany, NJ, EE.UU.

Discos de ensayo de susceptibilidad antimicrobiana-discos en blanco (n.º de catálogo CT0998B): Oxoid Ltd., Basingstoke, UK.

P80 (n.º de catálogo P5188-50ML, n.º de lote MKBF7194V): Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.

Span 80 (n.º de catálogo S6760-250ML, n.º de lote MKBF1605V): Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.

Tensioactivo Merpol SE (n.º de catálogo 421340-250ML, n.º de lote 03211CG): Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.

Brij 30 (n.º de catálogo 235989-100ML, n.º de lote MKBG9120V): Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.

Poli(etilenglicol) hexaoleato de sorbitol (n.º de catálogo 4664091L, n.º de lote MKBH9590V): Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, EE.UU.

Agar Mueller Hinton con ajuste de cationes (n.º de catálogo 211438): Becton Dickinson y Company, Sparks, MD, EE.UU.

Hisopos de alginato de calcio estériles (n.º de catálogo 25-806 2PA): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Hisopos de punta de algodón (n.º de referencia 89031-270): VWR International, LLC., Radnor, PA, EE.UU.

Hisopos de punta de fibra de poliéster estéril (n.º de catálogo 14959-90): Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canadá

Hisopos de algodón estériles (n.º de referencia 25-806 1PC): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Hisopos de poliéster estériles (n.º de referencia 25-806 1PD): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Hisopos de rayón estériles (n.º de referencia 25-806 1PR): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Hisopos de espuma estériles (n.º de referencia 25-1506 1PF): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Hisopos flocados estériles (n.º de referencia 25-3406 1PN): Puritan Medical Products Company, LLC, Guilford, ME, EE.UU.

Cepas de ensayo Las cepas de ensayo usadas en este estudio incluyeron la cepa de control de calidad de Staphylococcus aureus susceptible a meticilina (MSSA) ATCC 25923, el aislado de MIC BMD de control de calidad MSSA ATCC 29213, S.

aureus resistente a meticilina (MRSA) ATCC 33591, aislados de S. aureus de la Red de Resistencia Antimicrobiana de S. aureus de resistencia intermedia a vancomicina heterogéneo (hVISA) NRS2, hVISA NRS36, S. aureus de resistencia intermedia a vancomicina (VISA) Mu50 (ATCC 700699), VISA NRS3 y VISA NRS402, y aislados clínicos de los aislados clínicos (8) del estudio en fase 2 SIMPLFI (obtenidos en Covance, Indianapolis, IN, EE.UU.) MRSA

5 U206056, MSSA Q141066, MRSA Q670505, MSSA S815246, MSSA T759545, MRSA T998528, MSSA U148267, MSSA U781969, MSSA U933236, MRSA V257345, MRSA V406957, MRSA Q141067, MRSA Q670607, MSSA S815247, MSSA T811355, MRSA T998608, MRSA U260847, MRSA U784439, MRSA U933237, MRSA V288615 y MSSA V406985.

Diseño del estudio

Se añadió el agente emulgente Span 80 al P80 como segundo excipiente y se investigaron una diversidad de proporciones de P80:Span 80 en un esfuerzo por eliminar tanto la necesidad de almacenamiento de discos durante 30 días antes de su uso como la etapa de predifusión. Se evaluaron las concentraciones y proporciones de

15 excipientes que maximizaron la difusión pero no afectaron al crecimiento bacteriano. Se prepararon lotes de discos con fármaco y excipientes optimizados. Estos discos optimizados se usaron para determinar si los aislados clínicos y de referencia de S. aureus seleccionados que exhibían un intervalo de MIC BMD se podían distinguir basándose en sus diámetros de zona de inhibición.

Procedimientos experimentales

Debido a su alta viscosidad, se transfirieron P80 y Span 80 líquidos a tubos de tapa a presión Falcon de 15 ml mediante pipeteo y dejando que los volúmenes del líquido escurrieran completamente de la pipeta antes de la mezcla. Se mezclaron completamente P80 y Span 80 mediante inclinación exhaustiva y rotación de los tubos.

25 Después de eso, las mezclas de P80/Span 80 se diluyeron con agua estéril para conseguir una concentración de excipiente total de un 1 a un 4 % (vol/vol). Se prepararon soluciones de Merpol SE y Brij 30 en agua estéril al 5 % (vol/vol). Se preparó una solución de poli(etilenglicol) hexaoleato de sorbitol en agua estéril al 1 % (vol/vol).

Los índices de equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de las diversas mezclas de P80/Span 80 se calcularon usando la ecuación: HLB XY = HLB X (%X) + HLB Y (%Y). Por ejemplo, el HLB de una mezcla 1:1 (vol/vol) de P80 (HLB = 15) / Span 80 (HLB = 4,3) es 15(0,5) + 4,3(0,5) = 9,7.

Se disolvió oritavancina en polvo en soluciones preparadas recientemente de los excipientes indicados a concentraciones de 0,625, 1,25, 2,5, 5, y 10 mg/ml (ajustadas para la potencia basándose en el lote 87556IL00 de

35 pureza del 83,1 %) por agitación vorticial durante un mínimo de 5 minutos. Las soluciones de oritavancina en los diversos excipientes, aunque no visualmente transparentes, estaban exentas de cualquier material formado por partículas aparente según se evaluó visualmente. Se impregnaron discos en blanco de Oxoid estériles con 20 µl de estas soluciones de oritavancina, dando como resultado cargas de disco de oritavancina que variaron de 12,5 a 200 μg. A menos que se indique otra cosa, se dejó que los discos se secaran durante una noche a temperatura ambiente antes de su uso.

Se prepararon suspensiones bacterianas a partir de colonias aisladas en placas de agar Mueller Hinton con ajuste de cationes durante una noche en solución salina estéril y se ajustaron a una densidad óptica de 0,1 a 600 nm. Se sembraron placas de agar Mueller Hinton con ajuste de cationes convencionales (90 mm de diámetro) con

45 suspensiones bacterianas mediante inoculación con hisopo inicial en el centro de la placa y a continuación moviéndose hacia fuera. La inoculación con hisopo se continuó en un ángulo recto y a continuación en un ángulo oblicuo a las primera y segunda inoculaciones con hisopo. Los discos se colocaron en las placas sembradas con pinzas estériles. Las placas se incubaron a continuación durante una noche a 37 ºC y los diámetros de zona de inhibición se midieron con una regla y se informaron en milímetros.

Resultados

Se llevó a cabo una serie de experimentos para evaluar el impacto de los siguientes parámetros en los diámetros de zona de inhibición y otros atributos de la zona de inhibición que pudieran contribuir potencialmente a variabilidad en

55 la evaluación del diámetro de zona, tal como margen, concentricidad y grado de eliminación: 1) la concentración de excipiente total en la solución de oritavancina, 2) la proporción de P80/Span 80 en la solución de oritavancina, 3) la carga de disco de oritavancina y el tipo de hisopo usado para sembrar y 4) otros tensioactivos con índices HLB similares. A continuación se describen cada conjunto de experimentos relacionados y sus resultados. 1) Concentración de excipiente total en la solución de oritavancina. Como referencia, se disolvió oritavancina a 2,5 mg/ml en soluciones que contenían P80/Span 80 del 0,5 al 4 % (en una proporción 35:65 vol/vol). Se prepararon discos que contenían 25 µg de oritavancina en P80/Span 80 al 4 % y se dejaron secar durante aproximadamente 3 horas a temperatura ambiente. Como se muestra en la Tabla 12, el aumento del porcentaje de la mezcla de P80/Span 80 en solución de un 0,5 a un 4 % aumentó el diámetro de la zona de inhibición. Basándose en estos descubrimientos, se usó una solución al 4 % de P80/Span 80 para los ensayos adicionales. Sin embargo, las zonas

65 de inhibición en todas las condiciones sometidas a ensayo no fueron completamente concéntricas y tenían bordes dentados, dando como resultado la necesidad de estimar el diámetro de las zonas de inhibición. Se observó que la

superficie de agar estaba visiblemente arañada por los hisopos de punta de poliéster usados cuando se sembró con bacterias; por lo tanto, el tipo de hisopo se identificó como otra variable para explorar durante la optimización (posteriormente se presentan resultados adicionales).

Tabla 12. Efecto de la concentración total de excipiente (como porcentaje de P80/Span 80 en agua) en el diámetro de la zona de inhibición

Contenido del disco de oritavancinaa (μg): Porcentaje de P80/Span 80 en agua Diámetro de la zona de inhibiciónb para MSSA ATCC 25923 (mm)

50: 0,5 10

50: 1 15

50: 2 20

50: 4 28

aLos discos se impregnaron con 20 µl de una solución de 2,5 mg/ml de oritavancina disuelta en el porcentaje indicado de mezcla de P80/Span 80 (35:65) y se dejaron secar durante aproximadamente 3 horas a temperatura ambiente antes de su uso. bLos diámetros de zona de inhibición no fueron totalmente concéntricos y carecieron de un margen definido y por lo tanto se muestran estimaciones del diámetro.

2) Proporción de P80/Span 80 en la solución de oritavancina. El ensayo de referencia preliminar que comparó las proporciones de P80/Span 80 (vol/vol) de 20:80, 35:65 y 50:50 reveló que una proporción 50:50 (1:1) dio como 10 resultado mayores zonas de inhibición (no se muestran los datos). La proporción de P80/Span 80 se hizo variar además para determinar la proporción que daba como resultado los mayores diámetros de zona de inhibición. Se prepararon diferentes proporciones de P80/Span 80 (vol/vol) como se indica y se usaron para disolver oritavancina en polvo a una concentración de 2,5 mg/ml en solución de excipiente al 4 % (vol/vol). Los discos se impregnaron con 20 µl de las soluciones y se dejaron secar durante una noche antes de su uso. Como se muestra en la Tabla 13, la

15 variación de la proporción de P80/Span 80 afectó considerablemente al diámetro de la zona de inhibición. Se determinó que la proporción óptima de P80/Span 80 era 1:1 (vol/vol). De forma similar al descubrimiento que se ha indicado anteriormente, las zonas de inhibición no fueron concéntricas dado que también se usaron hisopos de punta de poliéster en este experimento.

20 Tabla 13. Efecto de la proporción de P80/Span 80 en el diámetro de la zona de inhibición frente a aislados de S. aureus

Aislado de S. aureus: Fenotipo MIC BMD de oritavancina (μg/ml) Contenido del disco de oritavancina (μg) Diámetro de la zona de inhibición (mm)a obtenido con discos que contenían un 4 % de la proporción de P80/Span 80 indicada

50:50: 60:40 70:30 80:20 90:10

ATCC 25923: MSSA 0,06 50 23 21 19 16 13

NRS2: hVISA 0,25 50 16 15 14 14 12

Mu50: VISA 1 50 10 11 12 12 12

aLos discos se impregnaron con 20 µl de una solución de 2,5 mg/ml de oritavancina disuelta en un 4 % de la proporción de P80/Span 80 indicada y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente antes de su uso. Los diámetros de zona de inhibición no fueron completamente concéntricos y carecieron de un margen definido y por lo tanto se muestran estimaciones del diámetro.

3) Carga del disco de oritavancina y tipo de hisopo. Los siguientes experimentos se llevaron a cabo para optimizar el contenido del disco de oritavancina y para determinar si el tipo de hisopo podía afectar a la forma y al margen de la 25 zona de inhibición, con un resultado deseado que fuera una zona más concéntrica con un margen definido. Se usaron soluciones de oritavancina que variaron de 0,625, 1,25, 2,5, 5 a 10 mg/ml en P80/Span 80 (1:1 vol/vol) al 4 % en agua para preparar discos que contenían 12,5, 25, 50, 100 y 200 µg de oritavancina, respectivamente. Los discos se secaron durante una noche a temperatura ambiente. Como se muestra en la Tabla 14, los diámetros de zona de inhibición para MSSA ATCC 25923 y hVISA NRS2 fueron los mayores con un contenido del disco de 25 µg de 30 oritavancina y posteriormente disminuyeron con cantidades crecientes, indicando probablemente una importante interacción entre la oritavancina y la mezcla de tensioactivos. Los diámetros de la zona de inhibición variaron de acuerdo con la MIC BMD de los aislados de S. aureus sometidos a ensayo. Los hisopos de alginato de calcio produjeron zonas de inhibición concéntricas (y casi ningún efecto visualmente perceptible en la superficie de agar) con diámetros solo moderadamente menores en comparación con las zonas obtenidas con hisopos de algodón 35 (Figura 2, panel superior izquierdo). A partir de este experimento, se seleccionó un contenido de disco de

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Aislado de S. aureus: Fenotipo MIC BMD de oritavancina (μg/ml) Diámetro de la zona de inhibición (mm)a

U148267: MSSA 0,015 21, 21

U781969: MSSA 0,03 22, 23

U933236: MSSA 0,06 21, 22

V257345: MRSA 0,12 21, 22

V406957: MRSA 0,12 21, 21

Q141067: MRSA 0,015 21, 22

Q670607: MRSA 0,03 21, 22

S815247: MSSA 0,015 20, 21

T811355: MSSA 0,03 21, 22

T998608: MRSA 0,03 22, 22

U260847: MRSA 0,06 21, 22

U784439: MRSA 0,03 20, 20

U933237: MRSA 0,12 21, 22

V288615: MRSA 0,03 23, 23

V406985: MSSA 0,12 24, 24

aLos discos se impregnaron con 20 µl de una solución de 1,25 mg/ml de oritavancina en P80/Span 80 (1:1 [vol/vol]) al 4 % y se dejaron secar durante una noche a temperatura ambiente antes de su uso.

La invención de la presente solicitud se ha descrito anteriormente tanto genéricamente como con respecto a realizaciones específicas. Aunque la invención se ha expuesto en lo que se cree que son las realizaciones preferentes, se puede seleccionar una amplia diversidad de alternativas conocidas por los expertos en la materia

5 dentro de la divulgación genérica. La invención no se limita de otro modo, salvo por la enumeración de las reivindicaciones.

Claims

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