ES2605808T3 - Antagonistas de GRASP55 para su uso como un medicamento - Google Patents

Antagonistas de GRASP55 para su uso como un medicamento Download PDF

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Abstract

Un antagonista de la proteína de apilamiento y de reensamblaje del aparato de Golgi de 55 kDa (Grasp55), para su uso como un medicamento, en el que dicho antagonista es un anticuerpo que inhibe la interacción de Grasp55 con una molécula de adhesión de unión (JAM) o un ácido nucleico que se dirige a un ARNm que codifica Grasp55.

Description

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[0099] Se generaron plásmidos que contenían ARNhc contra luciferasa o ARNhc contra GRASP55 y variantes de GRASP55, fusionadas con EYFP o mCherry en plásmidos pSUPER.retro o pEYFP-N1 o pmCherry-N1, respectivamente (Clontech). El ARNhc contra luciferasa fue suministrado amablemente por Michael Sebbagh,
5 CRCM, Marsella.
[0100] Se realizaron transfecciones transitorias en una monocapa confluente al 50% de células B16F10 con 10 nM de ARNip o 5 µg de ARNhc contra luciferasa usados como control o ARNhc contra GRASP55 en Lipofectamina ARNimax (Invitrogen). Se llevó un seguimiento de la eficacia de transfección a 24 h por qRT-PCR y
10 transferencias Western para la expresión de transcrito o proteína GRASP55. Para la selección de transfectantes estables se cultivaron células en DMEM que contenían 10 µg/ml de puromicina (Sigma Aldrich) empezando 48 h después de la transfección.
Anticuerpos
15 [0101] Se obtuvieron anticuerpos policlonales de conejo JAM-C y JAM-B antirratón inmunizando conejos con las proteínas JAM-C o JAM-B solubles recombinantes que contienen los dominios VH-C2. Los anticuerpos fueron producidos por Covalab (Lyon, Francia). El anticuerpo monoclonal (AMc) de rata H36 dirigido contra JAM-C de ratón fue descrito anteriormente (Aurrand-Lions y col., 2001a; Aurrand-Lions y col., 2001b; Johnson-Leger y col., 2002b).
20 El AMc CD44 antihumano IgG2 de rata (Hermes, 9B5) usado como control de isotipos fue descrito anteriormente (Lamagna y col., 2005a). El AMc de rata JB4 contra ratón JAM-B se obtuvo por inmunización de rata con una molécula JAM-B recombinante que contenía los dominios VH-C2. El AMc H202 de rata contra ratón JAM-A ya ha sido descrito (Malergue). El anticuerpo contra ratón CD146 fue suministrado amablemente por Francoise Dignat-George, Facultad de farmacia, Marsella. Las moléculas GRASP55 y actina se detectaron con anticuerpos adquiridos en
25 Interchim y Sigma Aldrich, respectivamente. Las inmunotransferencias de proteína se sondearon con anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Jackson Research Laboratories) y se detectaron con reactivos ECL (Amersham). PE anti-rata y FITC anti-conejo, usados para tinción FACS, se adquirieron en Jackson Immunoresearch Laboratories. Las quimeras JAM-B/Fc y JAM-C/Fc de ratón recombinantes se adquirieron en R&D.
30 Inmunoprecipitación y transferencia Western
[0102] Las inmunoprecipitaciones de JAM-A, JAM-B, JAM-C y CD146 de ratón se realizaron con AMc de rata anti-JAM-C 19H36, anti-JAM-B JB4 de rata, anti-JAM-A H202 de rata y anti-CD146 AMM1 de rata y usando HNTG (50 mM Hepes pH = 7,5, EGTA 1 mM, Triton al 1%, Glicerol al 10%, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, NaF 0,2% e 35 inhibidores de proteasas) o tampón de lisis TNT (Tris 50 mM pH = 7,5, EGTA 1 mM, Triton al 1%, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, NaF al 0,2% e inhibidores de proteasas (Roche Diagnostics). Después de SDS-PAGE y transferencia de membrana de nitrocelulosa de los inmunoprecipitados, se revelaron las proteínas con anticuerpos anti-GRASP55, anti-JAM-C o anti-actina y posteriormente con HRP anti-conejo (Jackson Immunoresearch Laboratories) y reactivos de detección de ECL (Amersham Pharmacia Biotech). La concentración de proteínas de las muestras se determinó
40 según el método de Bradford.
Generación de proteína de fusión GST-GRASP55 y su producción
[0103] La proteína GRASP55 de tipo silvestre murina y sus diversos dominios se escindieron del pcDNA3.1+
45 plásmido en el que se clonaron previamente. Los fragmentos de interés escindidos de pcDNA3.1+ se separaron por electroforesis en gel, se purificaron y se ligaron con pGEX4T1 linealizado que contenía una etiqueta de proteína GST. Estas construcciones se transformaron en las bacterias Rosetta para producir las diversas proteínas GST-GRASP55. Se cultivó un precultivo de una colonia bacteriana de cada de construcción de plásmido durante 16 h en agitación a 37°C en 3 ml de medio LB que contenía ampicilina. Al día siguiente, se inocularon 200 ml de medio LB
50 suplementado con ampicilina con 500 µl de precultivo. Cuando el cultivo bacteriano se encontraba en fase de crecimiento exponencial (DO600 nm = 0,6-0,8), se indujo la biosíntesis de las proteínas dadas por adición de isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido, IPTG (0,5 mM) a 22°C durante 16 h. El cultivo bacteriano se centrifugó a 3.000 x g durante 30 min y se lisaron los sedimentos bacterianos en tampón de lisis TNT (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM y Tritón al 1%) suplementado con inhibidores de la proteasa (Roche) a 4°C. A continuación se somete la
55 suspensión bacteriana a sonicación 5 veces durante 10 segundos con amplitud del 30% y seguido inmediatamente por una centrifugación durante 40 min a 2.000 x g a 4°C. Estos diversos sobrenadantes bacterianos se verificaron por SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie para la expresión de las proteínas de fusión GST-GRASP55.
Ensayo ELISA para detección de la interacción entre GRASP55 y JAM-C.
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ensayo de doble híbrido en levadura tal como se describe anteriormente en el ejemplo 1.
La Tabla I presenta las interacciones medidas usando tecnología de doble híbrido en levadura. Los símbolos "+++" y "-" indican el crecimiento de levadura en medios selectivos tal como se muestra en la Figura 13, NP 5 indica que la interacción no ha sido probada.
JAM-C
JAM-C ΔPDZbm JAM-A JAM-A ΔPDZbm JAM-B JAM-B ΔPDZbm ADAM10 ADAM17
Grasp55 FL
+++ - +++ - +++ - - -
PDZI (1-79)
- - - - - - - -
PDZI’ (1-107)
+++ - NP NP NP NP - -
PDZII (80-160)
- - - - - - +++ +++
PDZII’ (108-208)
- - NP NP NP NP - -
PDZI+II (1-160)
+++ - +++ - +++ - - -
PDZI’+II’ (1-208)
+++ - NP NP NP NP - -
[0133] Los resultados (Tabla 1) indican que la secuencia 1 a 107 de Grasp55 es la región mínima de Grasp55 requerida para la interacción con la región del extremo C de JAM-C. Dado que las regiones de consenso mínimas 10 mostradas en el ejemplo 5 (SEQ ID NO: 32, 33, 34) sugieren que JAM-A y JAM-B mostrarán muy probablemente un patrón de interacción similar a JAM-C, no se han probado en este ensayo. Finalmente, se cartografió la región mínima de Grasp55 requerida para la interacción con las partes citoplásmicas del extremo C de las metaloproteinasas ADAM10 y 17 responsables de la liberación de JAM-A y JAM-C. Una región que comprende la secuencia de aminoácidos 80 a 160 de Grasp55 fue capaz de interaccionar con ADAM10 y 17 lo que indica que la
15 unión de las JAM y las ADAM para Grasp55 puede producirse simultáneamente dado que las regiones de Grasp55 necesarias para las interacciones respectivas se superponían sólo parcialmente.
EJEMPLO 7 Medida de HTRF de la interacción de los péptidos JAM del extremo C con dominios GST-PDZ de Grasp55
20 [0134] Para refinar y extender los resultados obtenidos por doble híbrido en levadura, se ha configurado un ensayo de fluorescencia con resolución en tiempo homogénea (HTRF) para medir las interacciones de distintos péptidos con proteínas GST recombinantes que corresponden a diferentes regiones de Grasp55. La tecnología (Cisbio, http://www.htrf.com/splash.asp) se asemeja al ensayo ELISA, pero no necesita etapas de lavado y se basa
25 en señales FRET de proximidad entre el donante que se une a la fracción de Grasp55 (anticuerpo anti-GST) y el aceptor (estreptavidina-d2) que se une al péptido biotinilado.
[0135] Brevemente, la técnica consistió en la incubación durante 18 h a 4°C de los péptidos en el extremo C biotinilados (SEQ ID NO: 26 a 34) a la concentración de 1,9*10-7 M con la proteína de fusión GST, el anticuerpo anti30 GST acoplado a terbio (8*10-10 M cada uno) y la estreptavidina acoplada a d2 (4*10-8 M) (los dos de Cisbio), en 0,1 mL de Hepes 0,05 M, NaCl 0,15 M BSA al 0,1%, pH 7,2. En algunos experimentos, se añadieron péptidos o agentes químicos en competencia a la mezcla de incubación para la concentración indicada. Después de la incubación, se tomaron placas de microvaloración (Costar #3693) usando PolarScan Omega (BMG Labtech) equipado para medidas de HTRF. Tras la excitación a 320 nm, se produjo una emisión de fluorescencia de 620 nm por el donante
35 terbio que a su vez excita una emisión luminosa de 665 nm por una estreptavidina-d2 (aceptor) unida al péptido biotinilado de interacción si este último interacciona con el donante. Se obtiene la relación A665/A663 R y se calcula una Delta F como: [(Rmuestra-RFNE)/RFNE]*100 en la que RFNE es la señal de fondo no específica determinada en incubados en los que se omisión la proteína de fusión GST.
40 [0136] Usando esta técnica, se han confirmado las interacciones de péptidos JAM-A, JAM-B y JAM-C con las construcciones GST PDZI’ y PDZI’+II’, mientras que la interacción de CD146 sólo se detectó con la construcción GST PDZI’ (Fig. 12). En consecuencia, las secuencias de aminoácidos 1 a 107 de Grasp55 se requiere mínimamente para la interacción con JAM-A, JAM-B, JAM-C y CD146, mientras que el dominio PDZ2 de Grasp55 en el péptido PDZII’ (región 108-208) limita la interacción de Grasp55 con los miembros de la familia JAM. El péptido
45 biotinilado de control PDZbm (Fig. 9, SEQ ID NO: 31) no produjo señal con respecto al fondo, lo que indica que los tres aminoácidos hidrófobos terminales de JAM-C son necesarios para la interacción con los dominios PDZ de Grasp55.
[0137] Con el fin de definir y validar mejor esta tecnología de rendimiento semialto para medidas de
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interacción, se ha usado un péptido no biotinilado que corresponde a JAM-C (SEQ ID NO: 30, Fig. 9) para inhibir la interacción entre JAM-C y Grasp55. Los resultados se expresan como Delta F/Delta F0 en los que Delta F0 corresponde a la señal en ausencia de péptido en competencia y proporcionan una visión de la constante de afinidad aparente (AppAff) de la unión de JAM-C con los dominios PDZ Grasp PDZ. Tal como se muestra en la Figura 5 13, el péptido no marcado compite con la señal HTRF con EC50 en el intervalo micromolar bajo para GST-PDZI’+II’ y GST-GraspFL (GST-Grasp55 de longitud completa) mientras que se observa un aumento de veinte veces en EC50 cuando se usa la construcción GST-PDZI’. Esto indica que la afinidad de la interacción de JAM-C con Grasp55 mejora enormemente por la presencia del dominio PDZ2 de Grasp55 (péptido PDZII’) y que los antagonistas que inhiben la interacción Grasp55/JAM-C deberían seleccionarse más preferentemente por su capacidad para interferir
10 con la interacción GST PDZI’+ II’/JAM-C.
EJEMPLO 8 Medida de HTRF de la interacción de los péptidos JAM en el extremo C con dominios GST-PDZ de Grasp55
15 [0138] La medida de HTRF se ha usado además usando péptido JAM-C no marcado para determinar la afinidad relativa de péptidos JAM-A, JAM-B y CD146 para las proteínas recombinantes GST-PDZI’ y GST-PDZI’+II’ (Fig. 14). Los resultados indican que la AppAff de JAM-C es igual a la AppAff de JAM-A, mayor que la AppAff de CD146 y menor que la AppAff de JAM-B. Además, los datos indican que la JAM-B interacciona igualmente con las proteínas recombinantes GST-PDZI’ y GST-PDZI’+II’, mientras que JAM-A y JAM-C muestra una AppAff superior para proteína
20 recombinante GST-PDZI’+II’ que para GST-PDZI’. Asimismo, estos resultados muestran que este ensayo permite la identificación de interacciones soportadas por antagonistas de Grasp55. La inhibición de la interacción de JAM-A, CD146 y JAM-B por péptido no marcado JAM-C aporta la prueba de concepto de que existen antagonistas naturales y que la estequiometría relativa de asociación de Grasp55 con JAM-A, JAM-B, JAM-C y CD146 puede basarse en la afinidad relativa de las interacciones con Grasp de longitud completa, polipéptido PDZI’ (dominio PDZ1) o polipéptido
25 PDZI’+II’ (dominios PDZ1 y PDZ2 dominios).
EJEMPLO 9 Detección selectiva de biblioteca NINDS para inhibidores de interacción Grasp55 con JAM-C
[0139] Se ha demostrado que la medida de HTRF de interacción es una tecnología fiable para identificar los
30 inhibidores de la interacción. Se ha iniciado una detección selectiva de una biblioteca de compuestos químicos proporcionada por MRCt. La detección selectiva consistía en la misma técnica HTRF utilizada en el Ejemplo 7 con la salvedad de que los compuestos de la biblioteca se añadieron en la mezcla de incubación a la concentración final de 6,6 x 10-5 M. De los 1.040 compuestos proporcionados por la biblioteca NINDS, sólo veinte compuestos redujeron la señal Delta F usando las construcciones GST-PDZI’ o GST-PDZI’+II’ y JAM-C biotinilada (datos en la Fig. 15
35 mostrados sólo para disulfiram, carboplatino y ácido elágico). En particular, la mayoría de los compuestos inhibieron las señales obtenidas con construcciones Grasp55 recombinantes GST-PDZI’ y GST-PDZI’+II’. Dado que dicho resultado pudo deberse a una inhibición específica de la interacción del péptido JAM-C con los dominios PDZ de Grasp55 recombinante o con una inhibición no específica de la señal FRET entre donador y aceptor en tecnología HTRF, los veinte compuestos seleccionados se han probado adicionalmente. De hecho, los compuestos podrían
40 interferir potencialmente con la unión del anticuerpo anti-GST marcado con terbio con la GST de la proteína de fusión, la unión de estreptavidina-d2 con el péptido biotinilado o promover una intensa interferencia en 320, 630 ó 665 nm. Así, los posibles impactos obtenidos se sometieron a detección selectiva de inhibición no específica. Para este fin, se sometió la proteína recombinante GSTPDZI’+ II’ a biotinilación usando Sulfo-NHS Biotina según las instrucciones del fabricante (Pierce). Esto permite el diseño de un ensayo de HTRF en el que la estreptavidina
45 acoplada a d2 (aceptor) y el anticuerpo anti-GST acoplado a terbio están unidos directamente a la proteína recombinante GST-PDZI’+II’ y producen señal Delta F independientemente del péptido biotinilado. Los veinte compuestos seleccionados fueron así probados en este ensayo para eliminar aquellos que proporcionaban una falsa inhibición de las señales de HTRF mientras que los inhibidores de la interacción de péptidos biotinilados con GSTPDZI’+II’ no debería interferir en este ensayo.
50 [0140] Los resultados muestran que sólo doce compuestos no redujeron significativamente las señales de control por debajo del 80% de la señal de control, entre los cuales sólo el disulfiram (1,1’,1",1"’[disulfanodiilbis(carbonotioilnitrilo)]tetraetano), el carboplatino (cis-diamina(1,1-ciclobutanodicarboxilato)platino (II)) y el ácido elágico (2,3,7,8-tetrahidroxi-cromeno[5,4,3-cde]cromeno-5,10-diona) redujeron las señales obtenidas con
55 GST-PDZI’ o GST-PDZI’+II’ y péptido JAM-C biotinilado para más del 40% (Fig. 16, barras negras). En consecuencia, estos tres compuestos son nuevos antagonistas de la interacción JAM C/Grasp55 y pueden usarse como antagonista de compañeros de Grasp55 que interaccionan con dominios PDZ y en particular péptido PDZI’ para carboplatino, péptido PDZI’+II’ para disulfiram y los dos péptidos para ácido elágico.
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