ES2600527A1 - Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias - Google Patents

Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias Download PDF

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Abstract

Sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias. El sistema utiliza un biosensor amperométrico que comprende un sistema bi-enzimático; un electrodo de trabajo; un contra-electrodo; y un electrodo de referencia. El sistema bi-enzimático está compuesto por las enzimas sulfito oxidasa humana y peroxidasa; y la inmovilización de las enzimas en el electrodo de trabajo se lleva a cabo mediante simple retención física. La mezcla de las enzimas se mezcla a su vez con un mediador químico. El método comprende las fases de aplicación de una muestra al biosensor amperométrico; cambio de corriente eléctrica al entrar en contacto con el analito a detectar; y medir amperométricamente dicha corriente eléctrica en soluciones con agitación continua, utilizando un potencial constante.

Description

imagen1
imagen2
También es objeto del invento el dispositivo de medida resultante, que ha demostrado satisfactoria selectividad y estabilidad al sulfito como sustrato en matrices tales como los crustáceos.
Hoy en día no existe un biosensor comercial de sulfito aplicado a la industria agroalimentaria y ninguna enzima comercial está disponible.
El sistema objeto del invento ofrece unos resultados tanto o más fiables que el método de referencia (Monier-Williams) hoy utilizado, pero con unas características/particularidades ventajosas respecto a él que se reflejan de forma resumida en la siguiente tabla:
Método Monier-Williams optimizado (AOAC 962.16)
Objeto del invento
Procedimiento
Destilación ácida seguida de valoración Oxidación enzimática del sulfito, detección amperométrica
Tiempo de análisis
1 hora 3 Minutos
Simplicidad
Baja Media
Interpretación
Comparación con los estándares al comienzo de la valoración Resultado en pantalla
Limitación
Cuantificación limitada Calibración diaria
DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Para comprender mejor el objeto de la invención, se representa en las figuras adjuntas una forma
10 preferente de realización, susceptible de cambios accesorios que no desvirtúen su fundamento. En este caso:
La figura 1 representa el esquema de reacción para la determinación de sulfito.
La figura 2 representa la curva de calibrado para ver el rango de respuesta del biosensor al sulfito.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
15 La presente invención preconiza un sistema para medir sulfito en muestras alimentarias mediante biosensor; un método para la determinación de sulfito en muestras alimentarias utilizando el citado biosensor; y el uso del citado biosensor para medir los valores de sulfito en muestras alimentarias.
imagen3
imagen4
Se construye una recta de calibrado de 5 puntos (sin incluir el blanco), y de 3 réplicas para cada concentración. Se evalúa la linealidad comprobando el coeficiente de regresión r2 y el Factor Respuesta/Concentración.
Una vez comprobada la linealidad en el rango de 50 a 300 mg/kg, se estudia si las calibraciones
5 rutinarias realizadas por el biosensor (2 puntos) son lo suficientemente estables para garantizar la exactitud y precisión durante la vida útil del biosensor. Para ello se realizaron 23 calibraciones con 5 biosensores distintos, de modo que se comprobó la estabilidad de la pendiente (m), del coeficiente de regresión lineal (r2). Los criterios de aceptación propuestos son los siguientes:
-El % RSD de la pendiente no excederá del 15 %
10 -Ninguna recta tendrá un r2< 0,995 (R < 0,99)
Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla: El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORWITZ
BIOSENSOR
r2 PENDIENTE (m) PUNTO DE CORTE (b)
Biosensor 1
0,9986 -268451,72 -9,19
Biosensor 1
0,9998 -216795,02 -2,08
Biosensor 1
0,9997 -212064,04 -3,3
Biosensor 1
0,9997 -213370,52 -3,38
Biosensor 1
0,9999 -216305,44 -1,96
Biosensor 2
0,9999 -252625,28 -1,21
Biosensor 2
0,9997 -238793,58 -3,21
Biosensor 2
0,9997 -260319,96 -3,89
Biosensor 2
0,9999 -160476,95 -0,16
Biosensor 2
0,9998 -162145,8 1,92
Biosensor 3
0,9994 -158693,02 -3,36
Biosensor 3
0,9998 -199188,24 -2,5
Biosensor 3
0,9999 -200175,32 -1,59
Biosensor 3
0,9987 -207896,84 -6,96
Biosensor 3
0,9994 -175763,08 3,96
Biosensor 4
0,9999 -165459,56 0,9
Biosensor 4
0,9999 -241312,66 -0,55
Biosensor 4
0,9999 -224968,14 1,14
Biosensor 4
0,9999 -225537,96 -0,47
Biosensor 5
0,9998 -254172,28 -2,75
Biosensor 5
0,9998 -240394,24 -3,07
Biosensor 5
0,9992 -226618,6 -5,68
Biosensor 5
0,9989 -217246,88 -6,48
MEDIA
0,9996 -214729,35 -2,34
SD
0,0004 32738,83 3
RSD (%)
0,04 15 -
imagen5
Durante la vida útil del biosensor, la estabilidad de las rectas de calibrado se considera adecuada.
5 La exactitud es el grado de concordancia entre el resultado del ensayo y un valor de referencia aceptado. Dicha exactitud se obtiene mediante el estudio de recuperaciones, en todo el rango de trabajo, desde 50 hasta 300 mg/kg, de modo que en cada nivel de concentración se analizan las dos matrices de estudio (langostino crudo y cocido). Se considera el método de buena exactitud si la recuperación media en todos los niveles de concentración, cumple los criterios establecidos por
10 AOAC. La siguiente tabla muestra los resultados:
PLANIFICACIÓN Y RESULTADOS
EXACTITUD
RECUPERACIÓN
VALOR DE REFERENCIA (mg/kg)
MATRIZ Nº Réplicas % REC. MEDIO CRITERIO Aceptación
50
LANGOSTINO CRUDO 4 84 80-110 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
100
LANGOSTINO CRUDO 4 96 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
200
LANGOSTINO CRUDO 4 92 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
300
LANGOSTINO CRUDO 4 96 90-107 SI
LANGOSTINO COCIDO
4
El método se considera exacto en todo el rango de concentración, desde 50 a 300 mg/kg, en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los intervalos de recuperación aceptables establecidos por AOAC.
Por otra parte, se determina el grado de concordancia entre resultados de ensayos
15 independientes obtenidos en condiciones predeterminadas. Dicha precisión se suele expresar como imprecisión mediante el cálculo de desviaciones estándar relativas y/o el cociente Horrat. Para obtener la máxima imprecisión se ha considerado en todos los niveles de concentración, la máxima variabilidad de matrices (especies, productos frescos y elaborados,…), medidas a lo largo de la vida del biosensor, etc.
20 La siguiente tabla muestra los resultados:
Muestra
Biosensor Monier-Williams modificado Intervalo de incertidumbre Monier-Williams modificado Aceptación
1
180,9 214 166-262 Sí
2
195,5 224 176-272 Sí
3
216 236 184-288 Sí
4
104,76 115 90-140 Sí
5
112,06 128 100-156 Sí
6
137,06 127 99-155 Sí
7
131,5 117 92-142 Sí
8
183,82 194 150-238 Sí
9
81 96 74-118 Sí
10
68 81 62-100 Sí
11
156 165 130-200 Sí
12
155 190 146-234 Sí
13
97 121 96-146 Sí
14
121 143 112-171 Sí
15
120 131 103-159 Sí
16
226 222 174-270 Sí
17
181 241 189-293 No
18
96 122 94-150 Sí
19
155 176 137-215 Sí
20
117 163 128-198 No
21
127 162 127-197 Sí
22
165,96 202 158-246 Sí
23
124,16 154 119-189 Sí
24
117,16 130 102-158 Sí
25
107 135 107-163 Sí
26
60,28 55 42-68 Sí
27
75,28 67 51-83 Sí
28
75,18 92 73-111 Sí
29
294,8 337 265-409 Sí
30
86,12 84 65-103 Sí
31
58,16 63 50-76 Sí
32
61,02 75 59-91 Sí
33
88,02 102 80-124 Sí
34
22,34 21 16-26 Sí
35
41,58 46 35-57 Sí
36
76,1 84 65-103 Sí
37
132,2 166 131-201 Sí
38
172,54 206 162-250 Sí
39
70,6 90 71-109 Sí
40
72,52 84 65-103 Sí
41
65,26 75 59-91 Sí
42
64,6 78 62-94 Sí
43
79,84 88 69-107 Sí
imagen6
El método se considera preciso en todo el rango de trabajo, desde 50 a 300 mg/kg y en las matrices objeto de ensayo (langostino crudo y cocido), de acuerdo a los criterios de RSD HORWITZ.
Para asegurar que los resultados obtenidos son adecuados se realizó un estudio comparativo con
5 el método modificado Monier Williams para determinación de sulfitos en muestras en las que se encuentren presentes otros compuestos volátiles de azufre. Se basa en la transformación de los sulfitos en SO2. El SO2 es oxidado a H2SO4 que finalmente es valorado con una disolución estandarizada de NaOH. El método modificado Monier Williams está basado en el método de la AOAC, Sulfurous Acid (Total) in Food, Optimized Monier-Williams Method. 990.28, pp29, 1995.
10 Este método se emplea con frecuencia en el control oficial de sulfitos en alimentos.
Para ello se analizaron un total de 44 muestras de langostinos cocidos y crudos tanto por el método de Monier-Williams modificado como por el método objeto del invento. Los resultados obtenidos se muestran en la anterior tabla.
El estudio comparativo con el método modificado de Monier-Williams, muestra un valor de 15 fiabilidad del 95%.
Por último, se determina la vida útil del biosensor en relación a su almacenamiento y número de medidas que puede soportar. Para ello, se testan una serie de biosensores con 0, 15, 30, 60 y 90 días de secado almacenados a 3-8ºC, e hidratados a día 1, 7 y 15 tras su secado. Los resultados se muestran en la siguiente tabla:
lote calibración nº de medidas cumuladas
lote calibración nº de medidas cumuladas
lote calibración nº de medidas cumuladas
T0
H1
H7 H15
Biosensor 1
Biosensor 1
Biosensor 1
R = 0,9996
R = 0,9999 R = 0,9999
110
105 108
T15
H1
H7 H15
Biosensor 2
Biosensor 2
Biosensor 2
R=0,9999
R=0,9999
R=0,9998
107
110 104
T30
H1
H7 H15
Biosensor 3
Biosensor 3
Biosensor 3
R = 0, 9999
R=0,9999 R= 0,9998
104
110 120
T60
lote calibración nº de medidas cumuladas
lote calibración nº de medidas cumuladas
H1
H7 H15
Biosensor 4 R=0,9993 105
Biosensor 4 R=0,9999 105 Biosensor 4 R=0,9993 110
T90
H1
H7 H15
Biosensor 2 R=0,9999 115
Biosensor 2 R=0,9999 105 Biosensor 2 R=0,9999 108
siendo:
T0= 0 días de almacenamiento en seco T15= 15 días de almacenamiento en seco T30= 30 días de almacenamiento en seco T60= 60 días de almacenamiento en seco T90= 90 días de almacenamiento en seco H1= 1 día hidratado H7= 7 días hidratado H15= 15 días hidratado
Los biosensores son capaces de aguantar un mínimo de 100 medidas en cualquiera de las condiciones anteriormente mencionadas mostrando una perfecta calibración.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE
5 Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la presente invención.
Ejemplo 1. Determinación se sulfito total en gamba cruda
Limpiar y desechar el caparazón, el cefalotórax y otras partes no comestibles del exoesqueleto y
10 tracto digestivo visible. A continuación, homogeneizar la muestra con ayuda de una picadora. Pesar 2 gr del homogeneizado y mezclarlo con 18 ml de solución de extracción (tampón 0,1M CAPS pH 9,5). Agitar vigorosamente 30 segundos y aplicar ultrasonidos de alta intensidad durante 20 minutos con pulsos de 20 segundos y una amplitud del 60%; dejar atemperar antes de procede al análisis.
15 Añadir 1 mL del homogeneizado a la celda electroquímica con 10 mL de tampón 0,1M CAPS pH 9,5, con agitación constante y comenzar la medida amperométrica en el biosensor a un potencial de 0 mV.
Ejemplo 2. Determinación se sulfito total en langostino cocido 11
imagen7

Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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