ES2337328B1 - Biosensor amperometrico desechable, metodo de fabricacion del mismo ymetodo de determinacion de la presencia de analitos en alimentos. - Google Patents
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Abstract
Biosensor amperométrico desechable, método de
fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de
analitos en alimentos.
Biosensor amperométrico desechable (100), método
de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia
de analitos en alimentos, que comprende, básicamente el uso de una
fina capa de oro (3) depositada por sputtering en un electrodo.
Description
Biosensor amperométrico desechable, método de
fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de
analitos en alimentos.
El objeto de la presente memoria descriptiva
está referido a un biosensor amperométrico desechable para la
determinación de, por ejemplo, fructosa en todo tipo de alimentos
que contengan el analito a detectar.
Se han construido biosensores de fructosa
utilizando diferentes estrategias de inmovilización de la FDH:
adsorción sobre partículas de oro coloidales que se depositan
posteriormente sobre el electrodo de carbono vitrificado [Yabuki,
S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9 (1997) 23-25];
incorporación de la enzima en electrodos de pasta de carbono
[Parellada, J.; Domínguez, E.; Fernández, V.M. Anal. Chim. Acta 330
(1996) 71-77], [Paredes, P.A.; Parellada, J.;
Fernández, V.M.; Katakis, I.; Domínguez, E. Biosens. &
Bioelectron. 12 (1997) 1233-1243]; encapsulamiento
de la enzima en membranas depositadas sobre el electrodo [Xie, X.;
Kuan, S.S.; Guilbault, G.G. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991)
49-54], [Ikeda, T.; Matsushita, F.; Senda, M.
Biosens. & Bioelectron. 6 (1991) 299-304],
[Antiochia, R.; Palleschi, G. Anal. Lett. 30 (1997)
683-697], [Tká\check{c}, J.; Vo\check{s}tiar,
I.; \check{S}turdík, E.; Gemeiner, P.; Mastihuba, V.; Annus, J.
Anal. Chim. Acta 439 (2001) 39-46], [Tká\check{c},
J.; Vo\check{s}tiar, I.; Gemeiner, P.; \check{S}turdík, E.
Bioelectrochem.55 (2002) 149-151]; atrapamiento de
la enzima en películas conductoras (fundamentalmente polipirrol)
[Khan, G.F.; Kobatake, E.; Shinohara, H.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M.
Anal. Chem. 64 (1992) 1254-1258], [Khan, G.F.;
Kobatake, E.; Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal.
Chim. Acta 281 (1993) 527-533],
[Swann, M.J.; Bloor, D.; Haruyama, T.; Aizawa, M. Biosens. &
Bioelectron. 12 (1997) 1169-1182], [García, C.A.B.;
de Oliveira Neto, G.; Kubota, L.T. Anal. Chim. Acta 374 (1998)
201-208] y no conductoras [Bassi, A.S.; Lee, E.;
Zhu, J.-X. Food Research International 31 (1998)
119-127]; inmovilización en
sílica-gel [García, C.A.B.; de Oliveira Neto, G.;
Kubota, L.T.; Grandin, L.A. J. Electroanal. Chem. 418 (1996)
147-151]; adsorción sobre bicapas de fosfolípidos
[Kinnear, K.T.; Monbouquette, H.G. Anal. Chem. 69 (1997)
1771-1775]; adsorción sobre monocapas
autoensambladas de ODTNB [Darder, 20Darder, M.; Casero, E.;
Pariente, F.; Lorenzo, E. Anal. Chem. 72 (2000)
3784-3792] e inmovilización mediante enlace
covalente con glutaraldehído sobre una monocapa de cistamina
[Watanabe, S.; Kubo, I. Electrochem. 70 (2002)
258-263].
En general, en cuanto a la estabilidad de los
biosensores, aquellos que se han construido utilizando un método de
inmovilización sencillo, como la adsorción directa sobre electrodos
metálicos o de carbono ([Yabuki, S.; Mizutani, F. Electroanalysis 9
(1997) 23-25], [Begum, A.; Kobatake, E.; Suzawa, T.;
Ikariyama, Y.; Aizawa, M. Anal. Chim. Acta 280 (1993)
31-36]), suelen presentar tan baja estabilidad que
su aplicación a la determinación de fructosa en muestras reales no
es posible. El biosensor en el que la enzima se ha inmovilizado en
bicapas de fosfolípidos depositadas sobre el electrodo, presenta
mayor estabilidad [Kinnear, K.T.; Monbouquette, H.G. Anal. Chem. 69
(1997) 1771-1775], pero la etapa de inmovilización
suele ser excesivamente larga, requiriendo procesos de diálisis de
varios días de duración (2-6 días). Los mejores
resultados se han logrado con biosensores fabricados por
modificación de pasta de carbono con la enzima [Ikeda, T.;
Matsushita, F.; Senda, M. Biosens. & Bioelectron. 6 (1991)
299-304], [Paredes, P.A.; Parellada, J.; Fernández,
V.M.; Katakis, I.; Domínguez, E. Biosens. & Bioelectron. 12
(1997) 1233-1243], Estos dispositivos se pueden
utilizar durante unos 7-15 días, con respuestas del
orden del 30-50% de la intensidad inicial. Sin
embargo, como todos los biosensores desarrollados sobre pasta de
carbono, presentan los inconvenientes de requerir un gasto de enzima
elevado y de proporcionar una mala reproducibilidad.
También se ha desarrollado un biosensor de
fructosa deshidrogenasa que mejora los anteriores en el que se
produce la coinmovilización de la enzima FDH y el mediador redox TTF
mediante entrecruzamiento con glutaraldehído sobre un electrodo de
oro convencional modificado con una monocapa de ácido
mercaptopropiónico (MPA) [Campuzano, O.A. Loaiza, M. Pedrero, F. J.
Manuel de Villena, J. M, Pingarrón, Bioelectrochemistry 63 (2004)
199-206], esta monocapa es necesaria para separar la
superficie del electrodo de oro de la enzima para que no se produzca
la desactivación de la FDH. Con este biosensor se consiguen tiempos
de operatividad de más dé 30 días y se pueden realizar más de 150
análisis con el mismo biosensor. Sin embargo, el tiempo requerido
para su fabricación es de más de un día, debido a que es necesario
este tiempo para depositar la monocapa de MPA necesaria para que no
se produzca la desactivación de la enzima.
El oro depositado sobre la superficie de acero
inoxidable mediante sputtering tiene una estructura diferente a la
del electrodo de oro convencional que no produce la desactivación de
la enzima y por tanto no es necesaria la modificación con monocapas
de MPA del oro depositado sobre la superficie del electrodo de acero
inoxidable. Además el electrodo de acero inoxidable recubierto con
oro mantiene todas las demás característica del electrodo de oro
convencional en aplicaciones electroquímicas.
El recubrimiento de cristales de cuarzo con oro
mediante sputtering es una técnica usual en la construcción de
biosensores piezoeléctricos. Recientemente también ha sido empleada
en la construcción de biosensores electroquímicos principalmente en
forma de pistas sobre materiales no conductores poliméricos o sobre
otros metales previamente depositados sobre superficies poliméricas
como Cr igual que se hace en la construcción de los cristales
piezoeléctricos. Se han construido biosensores con oro depositado
por sputtering para la construcción de biosensores enzimáticos
[Masatoshi Hashimoto, Sanjay Upadhyay, Hiroaki Suzuki, Biosensors
and Bioelectronics 21 (2006) 2224-2231; Huaqing Li,
Zonghui Guoa, Hui Wang, Dafu Cui, Xinxia Cai; Sensors and Actuators
B 119 (2006) 419-424] e inmunosensores [Eva M.
Abad-Villar, M. Teresa
Fernández-Abedul, Agustiín
Costa-García, Biosensors and Bioelectronics 17
(2002) 797-780; Eva M. Abad-Villar,
M. Teresa Fernández-Abedul, Agustiín
Costa-García, Analytica Chimica Acta 453 (2002)
63-69] que necesitan modificar la superficie de oro
para conseguir una buena estabilidad del
biosensor.
biosensor.
Ninguno de los biosensores electroquímicos
mencionados anteriormente, se han construido por deposición de oro
mediante sputtering sobre superficies de metales como acero
inoxidable. La deposición de oro sobre acero inoxidable por
sputtering es sencilla y económica para construir electrodos
(biosensores) de oro, ya que mediante dicha deposición se inmoviliza
la enzima directamente sobre la superficie del electrodo sin que
haya una desactivación de la enzima como se ha comentado
anteriormente.
La presente invención está referida a un
electrodo enzimático desechable para la determinación,
preferentemente de fructosa, en todo tipo de alimentos que contengan
este analito. De forma más concreta, el biosensor consiste en una
matriz electrónica de acero inoxidable o cualquier otro material
conductor embebido en un material aislante en el que se ha
depositado una película de oro mediante la técnica de
"sputtering" sobre una de las superficies de la matriz
electródica, estando la otra superficie en contacto con el
potenciostato. Sobre la película de oro se deposita la enzima
correspondiente con el mediador adecuado y se encapsula con una
membrana de diálisis.
Es un segundo aspecto de la presente invención,
el procedimiento para la determinación de la presencia de analitos
en alimentos, particularmente fructosa, mediante la medida de la
señal amperométrica obtenida de la monitorización del analito en una
disolución de trabajo a la que se le ha añadido una alícuota de la
muestra.
Este método se basa en el empleo de un
dispositivo que comprende el biosensor objeto de la invención, junto
con un electrodo de referencia de Ag/AgCl y un electrodo auxiliar de
un material conductor. Este dispositivo está sumergido en una
disolución de trabajo a la que se añade una alícuota de la muestra
del alimento. El biosensor está conectado a un instrumento que
además de utilizarse como potenciostato permite, mediante una
calibración previa, relacionar la corriente generada en el biosensor
con el contenido del analito (en las unidades adecuadas) en la
muestra de alimento analizada. En este instrumento de medida se ha
diseñado específicamente para el biosensor, solucionando los
problemas de comunicación y registro de datos para proporcionar un
resultado fiable.
La determinación del contenido de analito en la
muestra se puede realizar de dos maneras diferentes: a) mediante
calibrado externo y b) empleando el método de adiciones
estándar.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para preparar electrodos enzimáticos amperométricos
desechables. El procedimiento se caracteriza por preparar los
bioelectrodos según la metodología que se expone a continuación:
Sobre una de las superficies del acero
inoxidable (o cualquier otro material conductor) embutido en un
material aislante, se coloca una fina capa de oro por
spputering, a continuación, sin realizar ningún tratamiento
de limpieza o acondicionamiento del oro se colocan la cantidad de
enzima adecuada en disolución, se deja secar la disolución,
posteriormente se adiciona una alícuota con la cantidad adecuada de
mediador, se deja secar la disolución. Por último se coloca sobre la
superficie de oro que contiene la enzima y el mediador una membrana
de diálisis (o cualquier otra membrana permeable al analito).
Además, al biosensor se implementa un dispositivo que permita su
reconocimiento individual por el instrumento de medida con el fin de
realizar un cuenteo del número de medidas.
Con este procedimiento de fabricación, el
biosensor enzimático se fabrica por simple atrapamiento físico entre
la superficie del oro y la membrana, sin necesidad de separar
mediante cualquier tipo de procedimiento (normalmente
mono-capas auto-ensambladas de
tioles) de la enzima, ya que la enzima en contacto con la superficie
de electrodos de oro convencionales se desactiva. La no
desactivación de la enzima por las partículas de oro depositadas
sobre la superficie de acero inoxidable es debido a la diferente
estructura a nivel microscópico que tiene con respecto a las
superficies de oro convencionales.
Esta metodología diferente a los otros
procedimientos de fabricación de biosensores hace que el proceso de
fabricación sea más sencillo, rápido y barato sin perder las
características de estabilidad y funcionamiento de los electrodos de
oro convencionales y sin tener que volver a utilizarlo, es decir una
vez que se ha agotado el tiempo de vida del biosensor se puede
desechar, ya que el coste por biosensor es mucho menor que los
electrodos de oro convencionales que tendrían que ser regenerados
para tener un coste por medida aceptable.
La estabilidad del biosensor desechable es buena
como se pone de manifiesto cuando se consideran diferentes aspectos:
a) Repetibilidad de la respuesta amperométrica para un biosensor, b)
Reproducibilidad en la fabricación de diferentes electrodos
fabricados de la misma forma y c) Tiempo de vida útil del biosensor
que es de 1 mes o 100 medidas, una vez cumplidos estos requisitos el
biosensor se desecha.
El biosensor así construido de coloca en la
unidad sensora y se sumerge en la disolución de trabajo obteniéndose
las medidas de analito en la disolución de trabajo por amperométria,
midiendo la corriente cuando se alcanza el estado estacionario a un
potencial constante de 150 mV frente a Ag/AgCl.
La electrónica del dispositivo además de ser un
potenciostato al que se conecta la unidad sensora, permite
correlacionar las corrientes obtenidas en el biosensor con la
concentración de analito en la muestra, mediante un calibrado
previamente establecido y teniendo en cuenta el factor de dilución
para cada muestra en particular.
\vskip1.000000\baselineskip
A continuación se pasa a describir de manera muy
breve una serie de dibujos que ayudan a comprender mejor la
invención y que se relacionan expresamente con una realización de
dicha invención que se presenta como un ejemplo no limitativo de
ésta.
Figura 1.- Vista del biosensor amperométrico
desechable, objeto de la presente invención, en una vista
explosionada (figura 1a) y vista de conjunto (figura 1b).
Figura 2.- Vista del dispositivo de empleo del
biosensor amperométrico desechable, objeto de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Tal y como puede observarse en la figura 1 el
biosensor amperométrico desechable (100) comprende, al menos:
un cuerpo conductor (1) con un eje longitudinal,
preferentemente cilíndrico y de acero inoxidable, sobre el que se
sitúa un dispositivo de reconocimiento individual de cada sensor
amperométrico desechable (7) configurado para que el instrumento de
medida, no mostrado en las figuras, realice un cuenteo del número de
medidas;
un cuerpo aislante (2) con un eje longitudinal,
preferentemente cilíndrico, situado de manera coaxial sobre el
cuerpo conductor (1) de tal forma que dicho cuerpo conductor (1)
quede parcialmente rodeado a lo largo de su eje longitudinal por el
segundo cuerpo (2);
y donde, sobre la base (12) del extremo del
cuerpo conductor (1) rodeado coaxialmente por el cuerpo aislante (2)
se sitúan, al menos:
una capa de oro (3) depositada por
sputtering, sobre la que se deposita la capa de enzima (4)
correspondiente con el mediador adecuado;
estando encapsulada, la base (12) con la capa de
oro (3) y la capa de enzima (4), con una membrana de diálisis (5)
cerrada con un anillo (6).
\vskip1.000000\baselineskip
El biosensor amperométrico desechable (100),
objeto de la presente invención, se utiliza mediante un dispositivo
mostrado en la figura 2. Dicho dispositivo comprende, al menos:
un primer cuerpo (200) contenedor de las
conexiones, incluyendo el elemento conectar (202) con un
potenciostato, no mostrado en las figuras, y configurado para la
calibración del dispositivo;
un segundo cuerpo (201) situado en la parte
inferior del primer cuerpo (200), que en su parte inferior
comprende, a su vez:
- un primer biosensor amperométrico desechable (100), objeto de la presente invención;
- un segundo electrodo de referencia (203) preferentemente de Ag/AgCl; y
- un tercer electrodo auxiliar de un material conductor (204);
donde dicho dispositivo está configurado para
ser sumergido en una disolución de trabajo a la que se añade una
muestra alícuota del alimento.
\vskip1.000000\baselineskip
El procedimiento de fabricación del biosensor,
segundo aspecto de la presente invención comprende, al menos, las
siguientes etapas:
(i) una primera etapa de colocación de una capa
de oro por sputtering sobre una superficie de un material
conductor embutido en un material aislante;
(ii) una segunda etapa de colocación de la
enzima adecuada en disolución, secándose dicha disolución y
adicionando una alícuota con la cantidad adecuada de mediador,
secando la solución en conjunto; y
(iii) una tercera etapa de colocación de una
membrana de diálisis u otra membrana permeable al analito sobre la
superficie del conjunto formado por la enzima y el mediador junto
con el oro.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de determinación de la presencia de
analitos en alimentos comprende, al menos, las siguientes
etapas:
(i) una primera etapa de calibrado del
dispositivo de medida que incluye el biosensor amperométrico
desechable (100), de tal forma que se configure para la relación
entre la corriente generada en el biosensor con el contenido del
analito en las unidades adecuadas y en la muestra de alimento
analizada;
(ii) una segunda etapa de inserción del
dispositivo en una disolución de trabajo a la que se añade una
alícuota de la muestra del alimento; y
(iii) una tercera etapa de medida y muestra de
resultados.
Claims (2)
1. Biosensor amperométrico desechable (100)
caracterizado porque comprende:
un cuerpo conductor (1) con un eje longitudinal
sobre el que se sitúa un dispositivo de reconocimiento individual de
cada biosensor amperométrico desechable (7) configurado para que el
instrumento de medida realice un cuenteo del número de medidas;
un cuerpo aislante (2) con un eje longitudinal,
situado de manera coaxial sobre el cuerpo conductor (1) de tal forma
que dicho cuerpo conductor (1) quede parcialmente rodeado a lo largo
de su eje longitudinal por el cuerpo aislante (2);
y donde, sobre la base (12) del extremo del
cuerpo conductor (1) rodeado coaxialmente por el cuerpo aislante (2)
se sitúan, al menos:
una capa de oro (3) depositada por
sputtering, sobre la que se deposita una capa de enzima (4)
correspondiente con el mediador adecuado;
estando encapsulada, la base (12) con la capa de
oro (3) y la capa de enzima (4), con una membrana permeable al
analito (5) cerrada con un anillo (6).
2. Procedimiento de fabricación del biosensor
amperométrico desechable (100) de la reivindicación 1
caracterizado porque comprende, las siguientes etapas:
(i) una primera etapa de colocación de una capa
de oro (3) por sputtering sobre la base (12) de un material
conductor (1) parcialmente rodeado a lo largo de su eje longitudinal
por un material aislante (2);
(ii) una segunda etapa de colocación de la
enzima (4) adecuada en disolución, secándose dicha disolución y
adicionando una alícuota con la cantidad adecuada de mediador,
secando la solución en conjunto; y
(iii) una tercera etapa de colocación de una
membrana de diálisis (5) u otra membrana permeable al analito sobre
la superficie del conjunto formado por la enzima (4) y el mediador
junto con el oro (3).
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| ES200802211A ES2337328B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Biosensor amperometrico desechable, metodo de fabricacion del mismo ymetodo de determinacion de la presencia de analitos en alimentos. |
| PCT/ES2009/000381 WO2010010211A2 (es) | 2008-07-24 | 2009-07-20 | Biosensor amperométrico desechable, método de fabricación del mismo y método de determinación de la presencia de analitos en alimentos |
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| ES200802211A ES2337328B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Biosensor amperometrico desechable, metodo de fabricacion del mismo ymetodo de determinacion de la presencia de analitos en alimentos. |
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| ES2337328A1 ES2337328A1 (es) | 2010-04-22 |
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|---|---|---|---|
| ES200802211A Active ES2337328B1 (es) | 2008-07-24 | 2008-07-24 | Biosensor amperometrico desechable, metodo de fabricacion del mismo ymetodo de determinacion de la presencia de analitos en alimentos. |
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| JP6905543B2 (ja) | 2016-06-15 | 2021-07-21 | イーストマン ケミカル カンパニー | 物理蒸着したバイオセンサー部品 |
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-
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|---|
| PALMISANO, F. et al. Flow injection analysis of L-lactate in milk and yoghurt by on-line microdialysis and amperometric detection at a disposable biosensor. The Analyst. Junio 2001, Vol. 126, n$^{o}$ 6, páginas 866-870, ISSN 0003-2654 (Print) <DOI: 10.1039/b010180j>. * |
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| WO2010010211A2 (es) | 2010-01-28 |
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