ES2599480T3 - Método para eliminar una enzima lítica a partir de una mezcla heterogénea - Google Patents

Abstract

Un método para remover una enzima lítica a partir de una mezcla biológica que contiene a la enzima lítica y a una macromolécula de interés que es sensible a la enzima lítica, donde el método comprende los pasos de: facilitar a la mezcla biológica en forma de una mezcla heterogénea que contiene a la enzima lítica, y a la macromolécula, donde por lo menos un 50% de la enzima lítica está disuelta y por lo menos un 50% de la macromolécula está en una forma sólida; facilitar a un inhibidor de la enzima lítica inmovilizado en un portador; contactar a la mezcla heterogénea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la solubilidad de la macromolécula en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado con la enzima lítica enlazada de la mezcla.

Description

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Metodo para eliminar una enzima iftica a partir de una mezcla heterogenea

Descripcion

AREA DEL INVENTO

[0001] Este invento se refiere a la purificacion de una macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada a partir de una mezcla que comprende a dicha macromolecula en la presencia de una enzima lltica.

ANTECEDENTES DEL INVENTO

[0002] Comunmente, la purificacion de macromoleculas intactas y no degradadas a partir de mezclas biologicas se dificulta debido a la presencia de enzimas llticas en estas mezclas. La presencia de enzimas llticas afecta la estabilidad de la macromolecula en la mezcla biologica al causar su degradacion. Por lo tanto, la neutralizacion rapida de la enzima lltica en un paso temprano en el proceso de purificacion es beneficiosa para incrementar la produccion y la calidad (por ejemplo, la homogeneidad, la integridad y/o la funcionalidad) de la macromolecula purificada.

[0003] La purificacion se complica aun mas cuando la mezcla que comprende a la macromolecula es heterogenea (es decir comprende a partlculas solidas, es decir, a partlculas precipitadas en una solucion acuosa) y, por lo tanto, no puede exponerse a un proceso de purificacion en el cual la mezcla pase con un caudal especlfico a traves de una columna que contiene a una resina comprimida (denominado en este documento como “purificacion de columna”) sin agregar pasos previos, por ejemplo, la solubilizacion de las partlculas, dialisis, filtraciones y/o similares para obtener a una solucion clara.

[0004] La adicion de aquellos pasos previos para remover a las partlculas solidas de la mezcla puede consumir tiempo y es caro y puede, ademas, remover, no deseablemente, a la macromolecula de interes, resultando, consecuentemente, en una produccion baja de la macromolecula purificada.

[0005] Por ejemplo, la purificacion de fibrinogeno en su forma intacta y no degradada a partir de una precipitacion de hidroxido de aluminio [un subproducto del proceso de fabricacion del factor VIII (FVIII)] se caracteriza por la presencia de un alto nivel de la enzima lltica plasmina y/o plasminogeno en la precipitacion.

[0006] US 6,815,535 presenta a un metodo para obtener a una preparacion enriquecida con fibrinogeno, por ejemplo, a partir de una pasta precipitada de heparina, un subproducto del proceso de fabricacion de FVIII. El metodo incluye la adicion de un monto efectivo de un polisacarido sulfatado (SPS - sulphated polysaccharide) a una solucion que contiene fibrinogeno para formar a una precipitacion que contiene fibrinogeno; y extraer al fibrinogeno de la precipitacion que contiene fibrinogeno con una solucion que contiene NaCl y el acido £-aminocaproico, un inhibidor soluble de la enzima proteolltica plasmina/plasminogeno.

[0007] La patente de Estados Unidos 7'125.569 presenta la remocion de plasmina/plasminogeno de una mezcla homogenea/clara utilizando a una columna comprimida con acido tranexamico inmovilizado. Las patentes de Estados Unidos 4'341.764 y 4'455.300 presentan a fracciones diferentes de sus productos durante la fabricacion de FVIII, es decir, la fraccion residual de hidroxido de aluminio, que puede ser utilizada para la purificacion de fibronectina y fibrinogeno.

[0008] GB 1480867 A presenta un metodo para remover a proteasas de protelnas que comprende el tratamiento de una solucion protelnica con un inhibidor de proteasas insolubles en agua y enlazadas a un portador para remover a la proteasa de la protelna, la cual es, preferiblemente, calicrelna.

[0009] WO 02/095019 A1 presenta a un metodo para remover o aislar especlficamente a plasminogeno o plasmina en la presencia de fibrinogeno a partir de una mezcla que contiene a plasminogeno o plasmina mediante el contacto de la mezcla con un aminoacido rlgido donde dicho aminoacido rlgido esta enlazado covalentemente con un soporte solido mediante un grupo amino del aminoacido.

[0010] DD 204944 A1 presenta un proceso de separacion de proteasas a partir de preparaciones de glucosa-oxidasa en las cuales las soluciones acuosas de la glucosa-oxidasa entran en contacto con un inhibidor inmovilizado de proteasas en una columna de separacion o en un proceso de lotes y donde el complejo inmovilizado del inhibidor de proteasas permanece en la columna de separacion o se separa mediante filtraciones.

[0011] Existe la necesidad de un metodo rapido y efectivo para purificar una macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada a partir de una mezcla que comprende a dicha macromolecula en la presencia de enzimas llticas.

RESUMEN DEL INVENTO

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[0012] Este invento se refiere a un metodo efectivo de purificacion de una macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada a partir de una mezcla que comprende a dicha macromolecula en la presencia de una enzima lltica.

[0013] Se puede obtener a la macromolecula purificada como resultado de la neutralizacion y de la remocion de la enzima lltica a partir de una mezcla en una etapa temprana en los pasos de purificacion.

[0014] Por lo tanto, el invento tambien se refiere a un metodo para una neutralizacion eficiente y una remocion rapida de una enzima lltica presente en una mezcla biologica, donde la mezcla comprende a la enzima lltica y a una macromolecula de interes que es sensible a la degradacion mediante la enzima lltica.

[0015] En un aspecto, el invento se refiere a un metodo para la remocion de una enzima lltica a partir de una mezcla biologica que contiene a la enzima lltica y a una macromolecula de interes que es sensible a la enzima lltica, donde el metodo comprende los pasos de: suministrar a la mezcla biologica como una mezcla heterogenea que contiene a la enzima lltica y a la macromolecula, donde por lo menos el 50% de la enzima lltica se disuelve y por lo menos el 50% de la macromolecula esta presente en una forma solida; suministrar a un inhibidor de la enzima lltica inmovilizado en un portador; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la solubilidad de la macromolecula en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado de la mezcla.

[0016] En una implementacion del invento, la mezcla biologica comprende a una fraccion celular seleccionada de un grupo que consiste de un extracto de plaquetas; un extracto de tejidos animales; un extracto oseo de animales; una mezcla enriquecida con gelatina o con colageno proveniente de una fuente animal; una mezcla enriquecida con albumina serica bovina; una grasa inmiscible en agua derivada de animales; un extracto de cultivos celulares; o un exudado de cultivos celulares.

[0017] En otra implementacion del invento, la mezcla biologica es, o se deriva de, un fluido corporal seleccionado de un grupo que consiste de semen, esputo, orina, heces, sudor, saliva, mocos nasales, fluido cerebroespinal y una fraccion sangulnea.

[0018] En otra implementacion del invento, la mezcla biologica es una precipitacion protelnica.

[0019] En otra implementacion adicional del invento, la precipitacion protelnica es una precipitacion criogenica.

[0020] En otra implementacion del invento, la precipitacion protelnica es un subproducto del proceso de fabrication del factor VIII y se selecciona de un grupo que consiste de precipitaciones acidas, precipitaciones de enfriamiento, precipitaciones de hidroxido de aluminio, precipitaciones de glicina, precipitaciones de etanol y pasta precipitada de heparina.

[0021] En otra implementacion adicional del invento, la precipitacion protelnica es una precipitacion de hidroxido de aluminio.

[0022] En una implementacion del invento, la macromolecula es una protelna.

[0023] En otra implementacion del invento, la enzima lltica es una proteasa.

[0024] En otra implementacion adicional del invento, el inhibidor es un analogo de aminoacidos. En otra implementacion adicional del invento, la macromolecula es fibrinogeno, la enzima lltica es plasmina y/o plasminogeno, y el inhibidor es un analogo de glicina. En una implementacion del invento, el analogo de lisina es el acido tranexamico.

[0025] En otra implementacion del invento, la mezcla heterogenea es preparada al suministrar a una precipitacion protelnica; y suspender a la precipitacion con una solution acuosa bajo condiciones que retrasan la solubilization de la macromolecula y/o aumentan la solubilizacion de la enzima lltica.

[0026] En otra implementacion del invento, las condiciones se seleccionan de un grupo que consiste de un rango de pH de 7.2-7.3, un rango de temperaturas de 30-32 °C, una concentration de etanol en el rango de 0.2 a 5%, y una de sus combinaciones.

[0027] En otra implementacion del invento, las condiciones comprenden a un rango de pH de 7.2-7.3, un rango de temperaturas de 30-32 °C, y una concentracion de etanol en el rango de 0.2 a 5%.

[0028] En otra implementacion del invento, la precipitacion protelnica esta congelada.

[0029] En otra implementacion del invento, el metodo comprende ademas el paso de reducir el tamano medio de partlculas de la precipitacion congelada a alrededor de 2-8 mm antes de la suspension.

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[0030] En una implementacion del invento, la reduction en el tamano medio de partlcuias se ejecuta mecanicamente.

[0031] En una implementacion del invento, la reduccion en el tamano medio de las partlculas se ejecuta utilizando una licuadora.

[0032] En otra implementacion del invento, el paso de contacto se ejecuta por mas de 30 minutos.

[0033] En otra implementacion del invento, el contacto de la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado se ejecuta durante 90 minutos.

[0034] En otra implementacion del invento, el paso de separation se ejecuta mediante centrifugaciones y/o filtraciones.

[0035] En otro aspecto, el invento se refiere a un metodo para remover a la enzima lltica de una mezcla biologica precipitada que contiene a la enzima lltica y a una macromolecula de interes que es sensible a la enzima lltica, donde el metodo comprende los pasos de: facilitar a la mezcla biologica precipitada; facilitar un inhibidor de la enzima lltica inmovilizado en un portador; disolver parcialmente a la mezcla biologica precipitada con una solution acuosa para obtener una mezcla heterogenea que contenga a partlculas solidas que tengan a la macromolecula, donde la mayorla de las enzimas llticas estan en una forma soluble y donde la mayorla de las macromoleculas estan en una forma insoluble; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; disolver a las partlculas solidas en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado de la mezcla.

[0036] En una implementacion del invento, la mezcla biologica precipitada se deriva de un fluido corporal seleccionado de un grupo que consiste de semen, esputo, orina, heces, sudor, saliva, mocos nasales, fluido cerebroespinal, y una fraction sangulnea.

[0037] En otra implementacion del invento, la mezcla biologica precipitada es una precipitation protelnica.

[0038] En una implementacion adicional, la precipitacion protelnica es una precipitacion criogenica.

[0039] En otra implementacion del invento, la mezcla biologica precipitada es una precipitacion de un subproducto proveniente de un proceso de fabrication del factor VIII y se selecciona de un grupo que consiste de una precipitacion acida, una precipitacion de enfriamiento, una precipitacion de hidroxido de aluminio, una precipitacion de glicina, una precipitacion de etanol, y una pasta precipitada de heparina.

[0040] En otra implementacion adicional del invento, la precipitacion es una precipitacion de hidroxido de aluminio.

[0041] En otra implementacion del invento, la macromolecula es una protelna.

[0042] En otra implementacion del invento, la enzima lltica es una proteasa.

[0043] En otra implementacion, el inhibidor es un analogo de aminoacidos.

[0044] En una implementacion del invento, la macromolecula es fibrinogeno, la enzima lltica es plasmina y/o plasminogeno y el inhibidor es un analogo de lisina.

[0045] En otra implementacion del invento, el analogo de lisina es el acido tranexamico.

[0046] En otra implementacion adicional del invento, la mezcla biologica precipitada esta congelada.

[0047] En otra implementacion del invento, el metodo comprende ademas el paso de reducir el tamano medio de las partlculas de la mezcla biologica precipitada congelada a alrededor de 2-8 mm.

[0048] En una implementacion del invento, la reduccion del tamano medio de las partlculas se ejecuta mecanicamente, por ejemplo, mediante una licuadora.

[0049] En una implementacion del invento, el paso de contacto se ejecuta por mas de 30 minutos, por ejemplo, por 90 minutos.

[0050] En otra implementacion del invento, el paso de separacion se lleva acabo mediante centrifugaciones y/o filtraciones.

[0051] En una implementacion del invento, los pasos de disolver parcialmente a la mezcla biologica precipitada y de contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado se ejecutan simultaneamente.

[0052] En otra implementacion del invento, las condiciones de disolucion parcial son seleccionadas de un grupo que

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consiste de un rango de pH de 7.2-7.3, un rango de temperatura de 30-32 °C, una concentracion de etanol en el rango de 0.2 a 5%, y una de sus combinaciones.

[0053] En otra implementation adicional del invento, las condiciones de disolucion parcial comprenderan a un rango de pH de 7.2-7.3, un rango de temperatura de 30-32 °C y una concentracion de etanol en el rango de 0.2 a 5%.

[0054] En otro aspecto, el invento se refiere a un metodo para purificar a una macromolecula de una mezcla biologica que contiene a la macromolecula y a la enzima lltica especlfica para la macromolecula. El metodo comprende los pasos de: suministrar la mezcla biologica en forma de una mezcla heterogenea conformada de la enzima lltica y de la macromolecula, donde por lo menos el 50% de la enzima lltica esta disuelta y por lo menos el 50% de la macromolecula esta en una forma solida; suministrar un inhibidor de la enzima lltica inmovilizado en un portador; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la

[0055] Solubilidad de la macromolecula en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado de la mezcla.

DESCRIPCION BREVE DE LOS ESQUEMAS

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La figura 1 muestra la concentracion de fibrinogeno coagulable en el transcurso del tiempo de 2 muestras que contienen fibrinogeno que fueron purificadas de una precipitation de hidroxido de aluminio que contiene a la enzima proteolltica plasmina y/o plasminogeno. Las muestras fueron tratadas con o sin el acido tranexamico inmovilizado (TEA - tranexamic acid) durante el proceso de purification.

La figura 2 es un flujograma que muestra una implementacion de un metodo para el enriquecimiento de fibrinogeno incluyendo la remocion de plasmina y de plasminogeno (la enzima lltica) de un material precipitado de hidroxido de aluminio. El TEA inmovilizado en geles es agarosa y fue utilizado como el inhibidor. El material precipitado estaba congelado. La composition del amortiguador de suspension utilizado fue de: 480 ml de amortiguador (7 g de NaCl; 2.95 gramos de citrato de tri-sodio deshidratado; 8 mg/mililitro de albumina serica humana; y agua pura a 1 l; pH = 7.4); 6-40 ml de TEA-Sefarosa asentada; y 3.6 gramos de un 2% de Al(OH)3; con un pH 7.4.

DESCRIPCION DE LAS IMPLEMENTACIONES DEL INVENTO

[0057] Este invento se refiere a un metodo efectivo para purificar una macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada a partir de una mezcla que comprende a dicha macromolecula en la presencia de enzimas llticas.

[0058] Los terminos “macromolecula intacta” y “macromolecula no degradada” se refieren, por ejemplo, a la macromolecula natural, fisiologica, sin danos y/o funcional.

[0059] Este invento presenta un metodo para remover a la enzima lltica de la mezcla biologica que contiene a la enzima lltica y a una macromolecula de interes que es sensible a la enzima lltica. El metodo comprende los siguientes pasos: facilitar a la mezcla biologica en forma de una mezcla heterogenea que contiene a la enzima lltica y a la macromolecula donde por lo menos el 50% de la enzima lltica esta disuelta y por lo menos el 50% de la macromolecula esta en una forma solida; facilitar un inhibidor de la enzima lltica inmovilizado en un portador; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la solubilidad de la macromolecula en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado con la enzima lltica enlazada de la mezcla.

[0060] Sin atarse al mecanismo, parece que contactar a la mezcla heterogenea que contiene a la enzima lltica con el inhibidor inmovilizado en lotes resulta en la formation de un complejo inmovilizado de inhibidor-enzima lltica.

[0061] El termino “un complejo inmovilizado de inhibidor-enzima lltica” se refiere a una composicion que tiene al inhibidor inmovilizado y a la enzima lltica asociados mediante enlaces covalentes o no covalentes. El termino “enlaces no covalentes” incluye, pero no se limita a, enlaces de hidrogeno, enlaces ionicos, fuerzas de Van der Waals, interacciones hidrofobicas o electrostaticas. El termino “complejo” tambien incluye la forma plural de “complejos”.

[0062] Este invento tambien presenta un metodo para remover una enzima lltica de una mezcla biologica precipitada que contiene a la enzima lltica y a una macromolecula de interes que es sensible a la enzima lltica, donde el metodo comprende los siguientes pasos: facilitar la mezcla biologica precipitada que contiene a la enzima lltica y a la macromolecula; facilitar un inhibidor de la enzima lltica inmovilizado en un portador; disolver parcialmente a la mezcla biologica precipitada con una solution acuosa para obtener a una mezcla heterogenea que contiene a partlculas solidas que contienen a la macromolecula, donde la mayorla de la enzima lltica esta en una forma soluble y donde la mayorla de la macromolecula esta en una forma insoluble; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; disolver las partlculas solidas en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado con la enzima lltica enlazada de la mezcla.

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[0063] El termino “remover a una enzima lltica de una mezcla” se utiliza intercambiablemente con el termino “reducir el nivel de una enzima lltica en la mezcla”, y se refiere a reducir el contenido de la enzima lltica en la mezcla.

[0064] El termino “mezcla biologica precipitada” se refiere, comunmente, a una mezcla biologica que contiene precipitaciones tales como materiales insolubles y/o solidos.

[0065] La mezcla biologica precipitada puede ser facilitada, por ejemplo, al cambiar cualquier parametro en una mezcla de una solucion biologica que reduce la solubilidad de las moleculas en la solucion tal como la temperatura, el pH, y la concentracion de solventes organicos; y entonces, la fraccion solida/insoluble puede separarse y recolectarse, por ejemplo, mediante filtraciones, precipitaciones a lo largo del tiempo, por la fuerza gravitacional y/o despues de una centrifugacion.

[0066] El termino “disolver parcialmente a la mezcla biologica precipitada” se refiere, comunmente, a disolver incompletamente a una precipitacion con una solucion acuosa que conlleva a la formation de una solucion heterogenea que contiene a partlculas solidas y/o no disueltas que son visibles a simple vista.

[0067] En una implementation del invento, las condiciones de disolucion parcial comprenden a un nivel de pH de 7.27.3. En otra implementacion del invento, las condiciones de disolucion parcial comprenderan un rango de temperatura de 30-32 °C. En otra implementacion adicional del invento, las condiciones de disolucion parcial comprenden a una concentracion de etanol en el rango de 0.2 al 5%. En otra implementacion del invento, las condiciones de disolucion parcial comprenden a un nivel de pH de 7.2-7.3, un rango de temperatura de 30-32 °C, y una concentracion de etanol en el rango de 0.2 a 5%. En una implementacion del invento, la disolucion parcial se ejecuta durante un periodo de tiempo de menos de 90 minutos (por ejemplo, menos de 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5 minutos). Se descubrio, de acuerdo a este invento, que el suspender a una fraccion precipitada de hidroxido de aluminio y exponer a la precipitacion a una solucion conformada de acido tranexamico (TEA - tranexamic acid) inmovilizado permitio la remocion de aproximadamente el 80% de plasmina y/o plasminogeno de la precipitacion suspendida. Por lo tanto, en una implementacion del invento, se removio alrededor del 80% (por ejemplo, 80 ± 20%) de la enzima lltica. El termino “macromolecula sensible a una enzima lltica” se refiere a una macromolecula que puede degradarse y/o desactivarse, por lo menos parcialmente, por la enzima lltica. Se descubrio, de acuerdo a este invento, que el exponer a una precipitacion de hidroxido de aluminio a TEA inmovilizado (un inhibidor de la enzima proteolltica plasminogeno/plasmina) en una etapa temprana en el proceso de purification de la macromolecula de fibrinogeno (una macromolecula que es sensible a, y que puede ser degradada por, el plasminogeno/plasmina) resulto en una preparation con niveles incrementados de fibrinogeno funcional en comparacion a una preparation obtenida en la ausencia del TEA inmovilizado. Ademas, se descubrio, sorpresivamente, de acuerdo a este invento, que al agregar al inhibidor inmovilizado (TEA inmovilizado) en una precipitacion suspendida bajo condiciones que retrasaron la solubilization de la macromolecula y/o aumentaron la solubilization de la enzima lltica (formando una mezcla heterogenea), se obtuvo una neutralization eficiente y una remocion rapida de la actividad de la enzima lltica lo cual resulto en una preparacion optima con fibrinogeno funcional. Mas especlficamente, se descubrio, sorpresivamente, de acuerdo a este invento, que la neutralizacion de la enzima lltica ocurrio incluso cuando la precipitacion no se habla disuelta completamente (es decir, estaba parcialmente solubilizada).

[0068] Sin atarse al mecanismo, parece que la enzima lltica (estando en una forma soluble) es accesible y puede ser neutralizada y/o capturada por el inhibidor inmovilizado mientras que la macromolecula (estando en una forma insoluble) no es accesible y se presume que esta protegida de la lisis por la enzima lltica. Con el tiempo, ocurre la solubilizacion gradual de la macromolecula, y se reduce la concentracion y/o la actividad de la enzima lltica libre en la mezcla (puesto que la mayorla de la enzima lltica se inhibe y/o se captura por el inhibidor inmovilizado), y, por lo tanto, la macromolecula solubilizada esta protegida de la lisis de la enzima lltica.

[0069] Mas particularmente, se descubrio, de acuerdo a este invento, que utilizar un inhibidor inmovilizado, en vez de un inhibidor soluble, permitio, en general, una facil remocion de la mayorla de la actividad de la enzima lltica con el aglutinamiento del inhibidor inmovilizado y otros materiales no deseables para el proceso tales como hidroxido de aluminio, por ejemplo, mediante centrifugaciones y/o filtraciones.

[0070] Comparativamente, en el caso que el inhibidor soluble sea una molecula pequena (por ejemplo, el acido tranexamico de alrededor de 150 Daltons) su remocion de la mezcla, despues de su uso, es factible solamente al ejecutar varios pasos exhaustivos de exclusion tales como ultrafiltraciones y diafiltraciones.

[0071] En una implementacion como esa (donde se usa una molecula pequena como el inhibidor), debido a la diferencia de la masa molecular entre la enzima lltica y el inhibidor soluble (comunmente, la masa molecular de la enzima lltica es de alrededor de decenas de kilodaltons o mas y la masa molecular de los inhibidores solubles es comunmente menor que un kilo Dalton), el inhibidor soluble puede removerse de la mezcla por medio de filtraciones mientras que la enzima lltica permanecera en la mezcla y su actividad lltica sera restaurada lo cual no es deseable.

[0072] Ademas, se descubrio, de acuerdo al invento, que contactar a la enzima lltica con el inhibidor mediante el metodo de lotes permite la purificacion de macromoleculas intactas en los casos en que la mezcla que comprende a

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las macromoleculas sea heterogenea y, por lo tanto, no pueda purificarse mediante una resina pre-comprimida en una columna (denominada en este documento como “purificacion de columna”) sin agregar pasos adicionales anteriores para obtener una solucion homogenea y clara (por ejemplo, solubilizaciones de partlculas, dialisis y/o filtraciones). Adicionalmente, en lotes, la superficie de interaction y velocidad de interaction entre la enzima y el inhibidor son mayores que cuando se las compara con la purificacion de columna, lo cual expide el proceso de neutralization de la enzima lltica.

[0073] El termino “purificacion de columna” se refiere, generalmente, a una tecnica en la cual se le permite a una mezcla viajar a traves de una columna que contienen a una resina comprimida a un caudal especlfico, y un componente individual esta siendo absorbido por la resina. Generalmente, la purificacion de columna requiere la remocion de material de partlculas, por ejemplo, mediante centrifugaciones y/o filtraciones (para obtener una solucion homogenea/clara) puesto que las columnas de cromatografla convencionales se construyen rapidamente por partlculas. El material que no se ha enlazado se recauda del otro lado de la columna despues de que la mezcla pasa a traves de esta. La purificacion de columna es una tecnica bien conocida en la industria tal como se describe en Practical Protein Chromatography (Cromatografla Protelnica Practica) editada por Kennedy y Fowell volumen 11 Humana Press, 1992.

[0074] Tal como se utiliza en este documento, el termino “metodo de lotes”, “en forma de lotes”, y “en lotes” se refiere, generalmente, a una tecnica en la cual se contacta a una mezcla con una resina, comunmente en un procedimiento de absorcion de una sola etapa. El termino “procedimiento de absorcion de una sola etapa” se refiere a un procedimiento en el cual todos los componentes del proceso de purificacion (por ejemplo, la resina y la mezcla) se incuban juntos, por ejemplo, en un tanque de agitation, en un reactor de lotes o en un matraz, y la absorcion se ejecuta en una forma continua. La fraction no enlazada puede ser recaudada entonces mediante un paso adicional de centrifugation y/o o de filtration.

[0075] En una implementation del invento, se contacta a la mezcla con la resina en un contenedor, por ejemplo, un tubo de ensayo, y despues de un periodo de incubation, se centrifuga al contenedor y se recolecta al sobrenadante que contiene a la macromolecula. El metodo de lotes puede ejecutarse en un contenedor o en un reactor de lotes.

[0076] El termino “resina” se refiere a un “portador” tal como se define mas adelante lo cual comprende, comunmente, a un inhibidor inmovilizado.

[0077] Los hallazgos de acuerdo al invento abrieron el camino para el desarrollo de un metodo para purificar rapidamente y eficientemente a una macromolecula funcional y/o intacta de interes a partir de una mezcla biologica heterogenea que contienen a una enzima lltica y a la macromolecula de interes mediante una neutralizacion y remocion rapida de la enzima lltica presente en la mezcla. En la mezcla heterogenea, la enzima lltica se encuentra, sustancialmente, en una forma soluble mientras que la macromolecula esta, sustancialmente, en una forma insoluble.

[0078] El termino “completamente soluble” se refiere a una disolucion del 100%, por ejemplo, sin ninguna particula solida. El termino “parcialmente soluble” se refiere a que la enzima lltica puede tener una disolucion de alrededor de 50% a menos de 100%. Por ejemplo, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 99 o menos del 100%, incluyendo cualquier rango entre los porcentajes presentados tales como el 50-55%, el 50-60%, el 50-65%, el 50-70%, el 50-75%, el 50-80%, el 50-85%, el 50-90%, el 50-95%, el 50-99%, el 55-60%, el 55-65%, el 55-70%, el 5575%, el 55-80%, el 55-85%, el 55-90%, el 55-95%, el 55-99%, el 60-65%, el 60-70%, el 60-75%, el 60-80%, el 6085%, el 60-90%, el 60-95%, el 60-99%, el 65-70%, el 65-75%, el 65-80%, el 65-85%, el 65-90%, el 65-95%, el 6599%, el 70-75%, el 70-80%, el 70-85%, el 70-90%, el 70-95%, el 70-99%, el 75-80%, el 75-85%, el 75-90%, el 7595%, el 75-99%, el 80-85%, el 80-90%, el 80-95%, el 80-99%, el 85-90%, el 85-95%, el 85-99%, el 90-95%, el 9099%, el 95-99%.

[0079] En una implementacion del invento, la enzima lltica esta disuelta en un 50 a un 95%. Los porcentajes son de la enzima lltica total que esta presente en la mezcla.

[0080] El termino “completamente insoluble” se refiere a que el 100% esta en forma solida, por ejemplo, congelada.

El termino “parcialmente insoluble” se refiere a menos del 100% en una forma solida, por ejemplo, la macromolecula puede estar en un estado solido desde alrededor del 50% a menos del 100%, por ejemplo, el 50, el 55, el 60, el 65, el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 99 o menos del 100%, incluyendo a cualquier rango entre los porcentajes presentados tales como el 50-55%, el 50-60%, el 50-65%, el 50-70%, el 50-75%, el 50-80%, el 50-85%, el 50-90%, el 50-95%, el 50-99%, el 55-60%, el 55-65%, el 55-70%, el 55-75%, el 55-80%, el 55-85%, el 55-90%, el 55-95%, el 5599%, el 60-65%, el 60-70%, el 60-75%, el 60-80%, el 60-85%, el 60-90%, el 60-95%, el 60-99%, el 65-70%, el 6575%, el 65-80%, el 65-85%, el 65-90%, el 65-95%, el 65-99%, el 70-75%, el 70-80%, el 70-85%, el 70-90%, el 7095%, el 70-99%, el 75-80%, el 75-85%, el 75-90%, el 75-95%, el 75-99%, el 80-85%, el 80-90%, el 80-95%, el 8099%, el 85-90%, el 85-95%, el 85-99%, el 90-95%, el 90-99%, el 95-99%. En una implementacion del invento, la macromolecula esta en una forma solida en un 50 a un 95%. Los porcentajes son de las macromoleculas totales que estan presentes en la mezcla.

[0081] Una mezcla biologica puede comprender a una fraccion celular tal como a un extracto de plaquetas; un

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extracto de tejidos animales; un extracto oseo de animales; una mezcla enriquecida con gelatina o colageno de una fuente animal; mezclas que contienen albumina serica bovina; grasa inmiscible en agua derivada de un animal; un extracto de cultivo celular; o un exudado de cultivos celulares tales como protelnas recombinantes o fracciones de extractos bacterianos tales como cuerpos de inclusion.

[0082] El termino “extracto de plaquetas” se refiere a una mezcla que comprende a factores derivados de plaquetas. Comunmente, los extractos son libres de celulas.

[0083] El termino “animal” tal como se utiliza en este documento incluye a sujetos mamlferos y humanos.

[0084] La mezcla biologica puede derivarse de fluidos corporales de mamlferos y humanos. En una implementacion, la mezcla biologica puede ser semen, esputo, orina, heces, sudor, saliva, mocos nasales, fluidos cerebroespinales, y una fraccion sangulnea, es decir, un producto de sangre completa tal como una precipitacion criogenica, plasma o suero. La mezcla biologica puede ser una precipitacion protelnica.

[0085] La mezcla biologica puede ser una fraccion precipitada de plasma humana, una fraccion precipitada de una precipitacion criogenica suspendida o una fraccion precipitada de plasma humano.

[0086] La precipitacion puede ser una precipitacion criogenica. El termino “precipitacion criogenica” se refiere a un componente sangulneo que se obtiene de plasma congelado preparado a partir de sangre completa, plasma recuperada o de una fuente de plasma que se recolecta mediante plasmaferesis. Se puede obtener a una precipitacion criogenica cuando el plasma congelado es descongelado lentamente en el frlo, comunmente a una temperatura de 0-4 °C, lo que resulta en la formacion de una precipitacion que contiene fibrinogeno y el factor XIII. La precipitacion puede recolectarse, por ejemplo, mediante centrifugacion.

[0087] La precipitacion puede ser un subproducto del proceso de fabricacion de VFIII, por ejemplo, una precipitacion acida, una precipitacion de enfriamiento, una precipitacion de hidroxido de aluminio (refierase, por ejemplo, a la patente de Estados Unidos 4’455.300), una precipitacion de glicina (refierase, por ejemplo, a la patente de Estados Unidos 4’297.344), una precipitacion de etanol y pasta precipitada de heparina.

[0088] El termino “subproducto” se refiere a un material no deseado y/o que no fue elaborado a proposito y/o que no fue utilizado y/o un material residual producido usualmente o formado en el transcurso de un proceso industrial o biologico en adicion al material/producto deseado.

[0089] El termino “precipitacion” y “fraccion precipitada” son intercambiables.

[0090] En una implementacion del invento, la precipitacion protelnica es una precipitacion de hidroxido de aluminio. Ventajosamente, cuando una precipitacion comprende a hidroxido de aluminio, el hidroxido de aluminio puede ser removido facilmente de la precipitacion suspendida junto con proteasas que dependen de la vitamina K, por ejemplo, mediante centrifugaciones y/o filtraciones. En contraste, cuando una precipitacion comprende a heparina, la heparina no puede removerse facilmente de la precipitacion suspendida mediante centrifugaciones y/o filtraciones puesto que la heparina se solubiliza en la solucion acuosa. Incluso si la heparina pudiese ser removida mediante procesos mas complejos, por ejemplo, ultra filtraciones, enzimas liticas desinhibidas, las proteasas se quedaran atras en la solucion libres para atacar a la macromolecula de interes.

[0091] Tal como se utiliza en este documento, el termino “enzimas liticas” se refiere a una enzima capaz de degradar especificamente o no especificamente a moleculas de sustratos. El termino enzima litica incluye, pero no se limita a, enzimas que degradan protelnas (es decir, proteasas tales como colagenasas, plasmina, y/o plasminogeno), grasas (es decir, lipasas), ADN (es decir ADNasas), ARN (es decir, ARNasas), almidones (es decir, amilasas), y celulosa (es decir, celulasas). En una implementacion del invento, el tamano de la enzima litica esta en el rango de alrededor de decenas de kilo Daltons o mas.

[0092] El termino “una macromolecula de interes” se refiere comunmente a cualquier macromolecula presente en una mezcla la cual se desea purificar, e incluye a cualquier bio - polimero tal como protelnas, lipidos, acidos nucleicos, carbohidratos, por ejemplo, el glicogeno y la celulosa. Comunmente, las macromoleculas protelnicas tienen una masa molecular que varla entre las decenas a los millones de kilo Daltons o mas.

[0093] El termino “una enzima litica” podria referirse a una sola o a una mezcla de enzimas liticas y el termino “una macromolecula” podria referirse a una sola o a una combinacion de macromoleculas. En una implementacion del invento, la macromolecula es una proteina y la enzima litica es una proteasa (es decir, una enzima proteolitica). En otra implementacion, la proteina es fibrinogeno (masa molecular de alrededor de 270.000-340.000 Daltons). En una implementacion adicional del invento, la enzima proteolitica es plasmina y/o su zimogeno plasminogeno [denominado en este documento “plasmin(ogeno)” con una masa molecular de alrededor de 75.000-90.000 Daltons]. En una implementacion adicional del invento, la macromolecula en la mezcla biologica es grasa inmiscible en agua y la enzima litica es una lipasa. En una implementacion como esa, para obtener a una mezcla heterogenea, la mezcla biologica puede mantenerse a temperaturas bajas y a temperaturas por sobre la temperatura de congelamiento. En

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aquellas condiciones, se disuelve la lipasa en agua la cual es accesible para su inhibidor mientras que las grasas inmiscibles en agua estan en una forma insoluble y no pueden ser alcanzadas por la lipasa para su degradacion. El termino “mezcla heterogenea” se refiere, en este documento, a una mezcla que comprende a solidos, que estan parcialmente disueltos y/o no han sido solubilizados y no pueden pasar, a traves de, o ser sujetos a, una purificacion de columna (por ejemplo, una cromatografla de afinidad, una filtracion de gel, un intercambio de iones, o una interaccion hidrofobica) sin agregar a pasos adicionales anteriores de clarificacion u homogenizacion, por ejemplo, la solubilizacion de partlculas, dialisis, filtraciones y/o similares.

[0094] Agregar pasos previos para remover las partlculas de la mezcla puede consumir tiempo y puede ser caro y tambien puede remover, en una forma inconveniente, a la macromolecula de interes que esta presente en la mezcla en una forma solida insoluble, lo cual resulta en una baja produccion de la macromolecula purificada. Ventajosamente, el metodo del invento se ejecuta sin remover a las partlculas solidas de la mezcla lo cual resulta en una produccion incrementada de la macromolecula purificada. En una implementacion del invento, la produccion de la macromolecula es de por lo menos el 90%.

[0095] Una mezcla heterogenea generalmente se refiere a una mezcla que comprende a un llquido y a partlculas, por ejemplo, partlculas solidas y/o insolubles. En una implementacion, la mezcla heterogenea se compone de alrededor del 50 al 95% (masa/masa) de fase llquida. En otra implementacion, la mezcla heterogenea se compone de alrededor del 5 al 50% (masa/masa) de partlculas solidas y/o insolubles. En una implementacion adicional, la mezcla heterogenea esta compuesta de un 80% (masa/masa) de la fase llquida y de un 20% (masa/masa) de partlculas insolubles y/o solidas. Los porcentajes que se acaban de mencionar se refieren a la fraccion del llquido y las partlculas en la mezcla cuando se empieza a ejecutar el metodo. Sin embargo, con el tiempo las partlculas podrlan disolverse y la tasa, tomando en cuenta la masa, de las partlculas solidas y/o insolubles en relacion a la fase llquida podrla alterarse.

[0096] En una implementacion del invento, la mezcla heterogenea comprende a partlculas precipitadas suspendidas en una solucion acuosa.

[0097] La mezcla heterogenea comprende a la mayorla de enzimas llticas en una forma soluble y a la mayorla de las macromoleculas en una forma insoluble.

[0098] Se descubrio, de acuerdo a este invento, que puede obtenerse una mezcla heterogenea a partir de una precipitacion al suspender a la precipitacion con una solucion acuosa bajo condiciones que retrasan a la tasa de solubilizacion de la macromolecula y/o aumentan la tasa de solubilizacion de la enzima lltica. Estas condiciones se alcanzaron, por ejemplo, mediante el ajuste del nivel de pH a 7,2-7,3, de la temperatura a 30-32 °C, y al reducir la concentracion de etanol de alrededor del 5% a alrededor del 1%.

[0099] Asimismo, se puede suministrar a una mezcla heterogenea empezando con partlculas solidas que contienen a la enzima lltica y a la macromolecula (por ejemplo, un pellet), y suspendiendo a las partlculas solidas con una solucion acuosa bajo condiciones que retrasan la solubilizacion de la macromolecula en la mezcla. Alternamente, o en paralelo, se puede manipular la solubilidad de la enzima lltica, por ejemplo, agregando agentes que conllevan a la carga de sal de la enzima tal como la adicion de cloruro de sodio o agentes caotropicos tales como la urea o el clorhidrato de guanina.

[0100] El termino “pellet” se refiere a la fraccion insoluble y/o solida de la solucion que esta separada de la solucion debido a un cambio en cualquier parametro que reduce la solubilidad de las moleculas en la solucion tal como la temperatura, el pH, y la concentracion de solventes organicos; y/o se refiere a una acumulacion de moleculas protelnicas lo suficientemente grandes para poder verse a simple vista y que pueden recaudarse mediante centrifugaciones a alrededor de 10.000 g. La fraccion insoluble y solida y/o la acumulacion de moleculas protelnicas pueden recolectarse, por ejemplo, mediante filtraciones, precipitaciones a lo largo del tiempo por la fuerza gravitacional y/o despues de centrifugaciones.

[0101] El termino “pellet”, en ocasiones, se usa intercambiablemente con el termino “precipitacion”. Se pueden presentar a las partlculas insolubles y/o solidas, de acuerdo al metodo del invento, en un estado congelado. Un “estado congelado” puede obtenerse a una temperatura en la cual un llquido de una composicion especificada se solidifica bajo una presion especificada. El termino “estado congelado” se utiliza en este documento para incluir a un estado semi - congelado o completamente congelado.

[0102] En una implementacion del invento, las condiciones que retrasan la solubilizacion de la macromolecula y/o aumentan la solubilizacion de la enzima lltica comprenden a un nivel de pH en el rango de 7,2-7,3. En otra implementacion del invento, las condiciones comprenden una temperatura en el rango de 30-32 °C. En otra implementacion del invento, las condiciones comprenden a una concentracion de etanol en el rango de 0,2 al 5%. En otra implementacion adicional del invento, las condiciones comprenden a un nivel de pH en el rango de 7,2-7,3, una temperatura en el rango de 30-32 °C, y una concentracion de etanol en el rango de 0,2 al 5%.

[0103] Alternamente, una mezcla heterogenea puede presentarse al iniciar con una mezcla homogenea que contiene

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a la enzima y a la macromolecula y reduciendo selectivamente la solubilidad de la macromolecula en la mezcla.

[0104] La reduccion de la solubilidad de la macromolecula en la mezcla puede lograrse, por ejemplo, mediante enfriamientos, ajustes del pH, la adicion de solventes tales como la acetona y el etanol, la adicion de agentes tales como el glicol de polietileno (PEG - polyethylene glycol) y sustancias polivalentes, la adicion de sales anti-caotropcias tales como el sulfato de amonio y el sulfato de sodio, la adicion de sales u otros agentes que causan una carga de sal tales como cloruro de sodio y/o similares.

[0105] En una implementacion del invento, la macromolecula es fibrinogeno, la enzima lltica es plasmina y/o plasminogeno, y el inhibidor es un analogo de lisina tal como el acido tranexamico y el acido 4-aminometilbiciclo- [2.2.2.]-octano-1-carboxllico (EMBOCA).

[0106] En otra implementacion del invento, la mezcla biologica es una precipitacion protelnica, por ejemplo, un etanol que contiene a una precipitacion protelnica. En otra implementacion del invento, la mezcla heterogenea se suministra por la suspension de etanol que contiene (por ejemplo, en la concentracion de hasta un 10% de etanol) a una precipitacion protelnica que contiene fibrinogeno y plasmin(ogeno) con un solvente. En otra implementacion del invento se ejecuta a la suspension a una baja temperatura (por ejemplo, en el rango de -4 a 20 °C. En otra implementacion del invento, la suspension se ejecuta con una concentracion de etanol en el rango de 0.2 al 5%, con un valor de pH bajo (por ejemplo, inferior a 7.3), y a una temperatura de 30-32 °C. En una implementacion del invento, bajo estas condiciones, se retrasa selectivamente la solubilizacion de la macromolecula de fibrinogeno y se aumenta la solubilizacion del plamin(ogeno). En una implementacion del invento, el solvente es una solucion acuosa. La solucion acuosa puede contener cloruro de sodio, citrato de tri-sodio deshidratado, albumina serica humana, citrato de tri-sodio, glicina, gel de hidroxido de aluminio [Al(OH)3]. La adicion del inhibidor inmovilizado a la mezcla puede ejecutarse en el paso de suspension al suplementar a la solucion acuosa utilizada para suspender a la precipitacion con el inhibidor inmovilizado. La solucion acuosa utilizada para suspender a la precipitacion protelnica puede calentarse previamente (por ejemplo, a una temperatura de 34 °C) antes de su uso. El amortiguador de suspension puede agregarse a la precipitacion con una tasa del 1:4 entre la masa de la precipitacion y el volumen del amortiguador de suspension, respectivamente.

[0107] Tal como se utiliza en este documento, el termino “un inhibidor inmovilizado en un portador” se refiere a cualquier modalidad de asociacion del inhibidor con una superficie del material del portador. El inhibidor puede adherirse al portador mediante enlaces covalentes, enlaces ionicos, enlaces flsicos, enlaces transversales con un reactivo bi-funcional y/o mediante cualquier otro metodo conocido por aquellas personas con conocimiento en la industria.

[0108] El portador puede tener una superficie hidrofobica o hidrofllica que interactue con por lo menos una parte del inhibidor mediante interacciones covalentes hidrofobicas/hidrofllicas. La superficie hidrofobica/hidrofflica del portador tambien podrla ser un pollmero tal como un plastico o cualquier otro pollmero donde los grupos hidrofobicos/hidrofllicos se han enlazado a elementos tales como el polietileno, el poliestireno o el polivinilo. Alternamente, el inhibidor puede enlazarse covalentemente al portador mediante una molecula o un enlazador que crea una conexion entre el portador y el inhibidor. El termino “enlazador” tal como se acaba de utilizar se refiere a un brazo o una correa espaciadora que tiene una masa molecular que varla desde las decenas a los millones de Daltons que es utilizada como un conector intermedio entre el portador y el inhibidor, por ejemplo, el enlazador puede ser una protelna, un peptido y/o un aminoacido. En caso que el portador se enlace directamente con el inhibidor (sin un enlazador), podrla utilizarse un grupo reactivo adentro del inhibidor, tal como un grupo hidroxilo, un ester o un grupo amino o un grupo para juntar al grupo reactivo presente en el portador para crear al enlace covalente. El portador tambien podrla tener una superficie cargada o podrla modificarse para aportar a un grupo cargado que interactue con el inhibidor. El portador podrla tener a otros grupos reactivos que podrlan activarse qulmicamente para adherirse al inhibidor. Por ejemplo, las matrices activadas por el bromuro de cianogeno, las matrices activadas por epoxi, las matrices activadas por N-hidroxisuccinimida, las matrices activadas por el acido fosfatldico de di-araquinodilo (DAPA - di-arachidonyl phosphatidic acid), las matrices activadas por diaminodipropilamina (DAPA), las matrices activadas por 1,6 diaminohexano, las matrices activadas por el acido succlnico, las matrices activadas por 1,3 diamino-2- propanol, las matrices activadas por la etilendiamina (EDA), las matrices activadas por el acido 5-tio-2-nitrobenzoico, las matrices activadas por piridildisulfuro, las matrices activadas por la yodoacetamida, las matrices activadas por la maleimida, o sus combinaciones. El portador tambien podrla contener a un material inorganico tal como material de oxido de silicio, por ejemplo, gel de sllice, al cual el inhibidor puede enlazarse covalentemente. El termino “portador” tal como se utiliza en este documento incluye a un soporte, o a cualquier material utilizado para adherir, inmovilizar, portar, o estabilizar al inhibidor. Los soportes son bien conocidos en la industria tal como se describe en Hermanson et al. Immobilized Affinity Ligand Techniques (Tecnicas de Ligandoos con Afinidad Inmovilizada) (Academic Press Inc. 1992). El soporte para ejecutar al metodo del invento puede ser cualquier material que sea capaz de enlazarse con el inhibidor.

[0109] En una implementacion del invento, el soporte/portador es un material cromatografico. El material cromatografico puede ser un material hidrofilico tal como la agarosa, la sefarosa, microparticulas acrilicas, la celulosa, vidrio con poros controlados, geles de sllice, dextrano; material hidrofobico tal como la resina; o un pollmero organico artificial/sintetico tal como materiales que se basan en poliestirenos de poliacrilamidas. Materiales/polimeros comunes estan disponibles comercialmente bajo los nombres comerciales Sephacryl® (Pharmacia, Suecia), Ultragel®

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(Biosepara, Francia), TSK-Gel Toyopearl® (Toso Corp., Japon), HEMA (Alltech Ass. (Deer-field, 111., Estados Unidos de America), Eupergit® (Rohm Pharma, Darmstadt, Alemania). Ademas, materiales que se basan en azlactonas (3M, St. Paul, Minn., Estados Unidos de America). La agarosa® o la sefarosa® son particularmente preferidas. Estos materiales estan disponibles comercialmente de Sigma, St. Louis. En una implementacion del invento, el portador es FRACTOGEL® EMD, la matriz polimerica TOYOPEARL®, o TSK-GEL®.

[0110] Los materiales portadores pueden ser solidos o fluidos. Los soportes solidos incluyen, pero no se limitan a, matrices, microcircuitos (por ejemplo, microcircuitos de silice, de silice-vidrio o de oro), materiales cromatograficos, diapositivas de microscopios, tubos de ensayo, matraces, botellas, discos de micro titulacion, soportes de ELISA, superficies de vidrio de plastico, laminas, particulas (por ejemplo, agarosa o sefarosa), microparticulas incluyendo microparticulas magneticas, geles, polvos, fibras, y similares. En una implementacion del invento, el portador es un material cromatografico que se suspende en un medio apropiado y el material espeso resultante es utilizado en un metodo de cromatografia de lotes, por ejemplo, utilizando un tubo de ensayo, un matraz, una botella, un receptor de lotes y similares.

[0111] El termino “inhibidor de la enzima litica” se refiere a cualquier agente (incluyendo un agonista) que es capaz de enlazarse (o capturar) a la enzima litica e interfiere directamente o indirectamente con su actividad litica en contra de la macromolecula de interes. El inhibidor puede enlazarse al lugar catalitico, al lugar de enlaces de sustratos, al lugar alosterico, o a cualquier otra parte de la enzima litica. Se puede utilizar un inhibidor competitivo que compite con el enlace de la macromolecula con la enzima litica. El enlace del inhibidor con la enzima litica puede ser reversible o irreversible. Los inhibidores pueden ser de un origen natural, de un origen sintetico o de un origen natural con modificaciones sinteticas.

[0112] El inhibidor puede ser una molecula pequena (por ejemplo, un aminoacido tal como la lisina o un analogo de aminoacido tal como el acido tranexamico y EMBOCA), un polipeptido tal como un anticuerpo especifico o sus fragmentos siempre y cuando muestren una especificidad de enlace tal como el anticuerpo completo, un inhibidor de ribonucleasas, un peptido corto o una secuencia peptido mimetica. En una implementacion del invento, el inhibidor es un analogo de aminoacido tal como un analogo de lisina. En otra implementacion del invento, el analogo de lisina es el acido tranexamico.

[0113] El termino “contactar” se refiere a una accion combinatoria que hace que la mezcla heterogenea entre en contacto con el portador y, mas particularmente, a una accion combinada que hace que la enzima litica entre en contacto con el inhibidor inmovilizado en una forma que provoca una interaction de enlace entre el inhibidor y enzima litica que se encuentra presente la mezcla. La mezcla puede incubarse con el portador durante un periodo suficiente tiempo que permita el contacto, el enlace y/o la formation de complejos entre el inhibidor inmovilizado y enzima htica.

[0114] Se descubrio, de acuerdo a este invento, que el contacto de la mezcla heterogenea con el portador que contienen al inhibidor inmovilizado durante un periodo de incubation de 90 minutos resulto en una preparation con niveles incrementados de fibrinogeno funcional en comparacion con una preparacion obtenida siguiendo un periodo de incubacion mas corto de 30 minutos. Por lo tanto, la mezcla puede contactarse con el portador que contiene al inhibidor inmovilizado durante un periodo de incubacion de mas de 30 minutos, por ejemplo, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, y 90 minutos o mas.

[0115] Sin atarse a ningun mecanismo, parece que una incubacion prolongada permite la captura y remocion subsiguiente de la mayoria de enzimas proteoliticas, obteniendo, por lo tanto, una macromolecula de fibrinogeno no degradada y funcional.

[0116] Tambien se descubrio, de acuerdo a este invento, que cuando el material de inicio esta presente en el metodo del invento en una forma solida, por ejemplo, en una forma congelada, la reduction de tamano medio de las particulas del solido antes del contacto de la mezcla con el inhibidor inmovilizado resulto en una preparacion con niveles incrementados de fibrinogeno funcional.

[0117] Sin querer atarse por el mecanismo, parece que la reduccion del tamano medio de las particulas del solido maximiza el area superficial de contacto del solido con el portador que contiene al inhibidor inmovilizado durante el paso de contacto lo cual resulta en un enlace rapido y eficiente y en la neutralization de la enzima litica.

[0118] El tamano medio de las particulas del solido puede reducirse mecanicamente, por ejemplo, utilizando una licuadora, cuchillas rotatorias o tamices con cuchillas; manualmente, por ejemplo, utilizando tijeras o al quebrar al solido con un martillo y/o con un cincel, o mediante cualquier otro metodo conocido en la industria.

[0119] Se descubrio, sorpresivamente, de acuerdo a este invento, que la reduccion del tamano medio de las particulas de un pellet congelado con un cincel y un martillo (para obtener a particulas de tamano inferior a 5 cm), seguido por una trituration mecanica (para obtener particulas de 2-8 mm) resulto en una mejor recuperation de fibrinogeno funcional en comparacion con la reduccion del tamano medio de las particulas con un cincel y un martillo, seguido por una trituracion manual (es decir, cortando el pellet con tijeras).

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[0120] Comunmente, la trituracion mecanica es mas rapida, produce partlcuias de tamano uniforme, y puede iniciarse a una temperatura mas baja (en comparacion con la trituracion manual), minimizando el inicio del proceso lltico, pero, por otro lado, durante el procedimiento en si se podrla producir calor y se lo podrla aplicar al material y, por lo tanto, podrlan ocurrir danos a la actividad protelnica. En contraste, la trituracion manual (por ejemplo, utilizando tijeras) es suave, pero consume tiempo y podrla conllevar a la production de partlculas de tamanos variables. Tal como se indico, la funcion y recuperation optima del fibrinogeno se observo utilizando el metodo de trituracion mecanica.

[0121] El termino “metodo de trituracion mecanica” se refiere a metodos de desmenuzamiento que utilizan a una maquina que usa una fuente de energla tal como la energla electrica o hidraulica. Un “metodo de trituracion manual” se refiere comunmente a metodos de desmenuzamiento que se basan en la fuerza flsica del operador, por ejemplo, cortando a las partlculas solidas con tijeras.

[0122] En una implementation del invento, el tamano medio de las partlculas del solido (por ejemplo, una precipitation) se redujo a alrededor de 2-8 mm antes de que se contacte a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado. En otra implementacion del invento, la reduction en el tamano medio de partlculas del solido se ejecuto mecanicamente.

[0123] En otra implementacion adicional del invento, la reduccion del tamano medio de partlculas del solido se ejecuto por medio de una licuadora. En otra implementacion del invento, antes de la trituracion mecanica, el material solido (por ejemplo, una precipitacion congelada) fue roto/quebrado con un cincel y un martillo, por ejemplo, para obtener un tamano medio de partlculas que sea inferior a 5 cm.

[0124] Se descubrio, de acuerdo al invento, que una vez que la enzima lltica se captura y se neutraliza en el complejo con el inhibidor inmovilizado, la macromolecula esta protegida y puede ser solubilizada en una “forma segura”.

[0125] Asimismo, despues de que la mezcla heterogenea se contacta con el portador que contiene al inhibidor inmovilizado en lotes, la solubilidad de la macromolecula se incrementa. En un paso subsiguiente, el inhibidor inmovilizado que esta en un complejo con la enzima lltica se separa de la mezcla.

[0126] El incrementar la solubilidad de la macromolecula y/o la disolucion de las partlculas solidas en la mezcla se puede ejecutar al alterar las condiciones de la mezcla tal como se indico anteriormente y/o la solubilidad de la macromolecula puede alcanzarse siguiendo un tiempo prolongado de incubation.

[0127] La separation del inhibidor inmovilizado con la enzima lltica enlazada de la mezcla puede ejecutarse mediante centrifugaciones y/o filtraciones. La centrifugation puede ser no continua (por ejemplo, a 17.000 g durante 25 minutos a la temperatura del cuarto) o continua. La centrifugacion continua se usa generalmente para procesar a volumenes industriales de llquidos. Se ejecuta al suministrar continuamente un fluido en un rotor, recolectando el sedimento en el rotor mientras se saca continuamente al sobrenadante mientras el rotor gira. Una centrifugacion no continua se refiere, en general, a un proceso de centrifugacion en el cual se suministra al llquido en porciones definidas por cada ciclo de centrifugacion (“lote”) y el sobrenadante se extrae al final del ciclo de centrifugacion despues de que se detiene completamente a la centrifugacion.

[0128] Generalmente, despues del paso de centrifugacion, se recauda al sobrenadante dejando a un pelete no deseado con una aglutinacion del inhibidor inmovilizado y la enzima lltica capturada.

[0129] En los casos en los que se utiliza a una precipitacion de hidroxido de aluminio como el material inicio, la centrifugacion alcanza ventajosamente a la remocion de ambos: el aglutinamiento de hidroxido de aluminio y el complejo de enzima lltica-inhibidor inmovilizado todo en un solo paso.

[0130] Un paso sucesivo de filtration (por ejemplo, a traves de filtros 3 y 1-1.2 pm) puede ejecutarse para remover a los montos residuales de inhibidores inmovilizados y de la enzima lltica capturada.

[0131] En caso de que se utilicen micropartlculas magneticas como portadores, la separacion puede ejecutarse mediante tecnologlas de separacion que se basan en micropartlculas magneticas, por ejemplo, tal como se describe

en Bjorn-Ivar Haukanes y Catrine Kvam. Application of Magnetic Beads in Bioassays (Aplicacion de Micropartlculas Magneticas en Bioensayos). Nature Biotechnology (Biotecnologla Natural) 11, 60 - 63 (1993).

[0132] El inhibidor inmovilizado puede reconstituirse y reutilizarse, por ejemplo, al liberar a la enzima lltica enlazada utilizando una concentration alta de sal o al utilizar a una concentration alta de la forma solubilizada del inhibidor y luego separando a la enzima lltica liberada y al inhibidor inmovilizado (por ejemplo, mediante centrifugaciones).

Los materiales biologicos derivados de componentes sangulneos son purificados comunmente a partir de partlculas inefectivas para minimizar el riesgo potencial presentado por patogenos que se originan en la sangre.

El procedimiento de purification puede ejecutarse mediante nanofiltraciones, tratamientos con solventes/detergentes, tratamientos

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con calor, y radiation gamma o UVC (inferior a 280 nm), o por cualquier otro metodo conocido en la industria.

El termino “particulas inefectivas” se refiere a una particula microscopica, tal como, pero sin limitarse a, un microorganismo o un prion, que puede afectar o propagarse en un organismo biologico. Las particulas inefectivas pueden ser particulas virales.

El procedimiento de desactivacion de las particulas inefectivas puede ejecutarse agregando una molecula a la mezcla antes de, y/o durante, el procedimiento. Las moleculas agregadas y sus productos pueden sacarse mediante gravitaciones, cromatografias de columna, separation de fases o mediante cualquier otro metodo conocido en la industria. La remocion de particulas inefectivas puede ejecutarse mediante metodos de filtration o de absorcion selectiva tales como cromatografias de afinidad, de intercambio ionico o hidrofobicas. Se puede ejecutar un procedimiento de desactivacion viral de varios pasos. Por ejemplo, se puede exponer a la mezcla a un tratamiento de solventes/detergentes, a pasteurizaciones, a cromatografias selectivas y a nanofiltraciones.

[0133] El termino “desactivacion viral” se refiere a la situacion donde virus se mantienen en la mezcla, pero se los vuelve no viables (por ejemplo, mediante la disolucion de su recubrimiento de lipidos), y/o a la situation en la cual virus son removidos fisicamente de la mezcla (por ejemplo, mediante tecnicas de exclusion de tamano).

[0134] El termino “tratamiento de solventes detergentes (S/D)” se refiere comunmente a un proceso que desactiva a virus envueltos o cubiertos con lipidos al destruir a su envoltura de lipidos. El tratamiento puede ejecutarse mediante la adicion de detergentes (tal como Triton X-45, Triton X-100 o Tween 80) y solventes [tal como el fosfato de tri(n-butilo), di- o trialquilfosfatos]. La combination solvente-detergente utilizada para desactivar a virus envueltos en lipidos podria ser cualquier combination de solvente-detergente conocida en la industria tal como TnBC y Triton X-100; Tween 80 y colato de sodio y otras combinaciones.

[0135] La concentration utilizada de los solventes y de los detergentes puede incluir aquellas utilizadas comunmente en la industria, por ejemplo, menos del 0.1% de TnBP menos del 0.1% de Triton X-100. En otra implementation del invento se utiliza una combination de 1% de Triton X-100 y 0.3 por ciento de TnBP. Comunmente, las condiciones bajo las cuales el solvente- detergente desactiva a los virus consiste de 10-100 mg/mililitro de solvente-detergente con un nivel de pH que varia desde 5-8, y una temperatura que varia desde 2-37 °C durante 30 minutos a 24 horas. Sin embargo, otras combinaciones de solvente-detergente y condiciones adecuadas seran aparentes para cualquier persona con conocimiento en la industria. El aglutinamiento del solvente- detergente utilizado en el tratamiento S/D puede removerse, por ejemplo, utilizando columnas de cromatografia tales como la columna de cromatografia de interaction hidrofobica (HIC - hydrophobic interaction chromatography column), por ejemplo, material de empaque de silice C-18 y SDR (remocion de Solventes-Detergentes - Solvent-Detergent removal) HyperD; matrices de absorcion proteinica tales como matrices de intercambio de iones; matrices de afinidad; matrices de extraction de aceite y/o de exclusion por tamano. En otra implementation del invento, SDR HyperD, que es un empaque cromatografico hecho de micro particulas de silice en los cuales el volumen de los poros se llena con un polimero acrilico hidrofobico reticulado tridimensional, se utiliza para remover al solvente-detergente. El SDR HyperD incluye, ventajosamente, una absorcion de modalidad mixta de la interaction hidrofobica y se asocia con un efecto de exclusion molecular [Guerrier L et al. "Specific sorbent to remove solvent-detergent mixtures from virus-inactivated biological fluids" (“Sorbente especifico para remover mezclas de solventes-detergentes de fluidos biologicos de virus desactivados”). J Chromatogr B Biomed Appl. 1995 Feb 3;664(1): 119-125].

[0136] El termino “pasteurization” se refiere comunmente a un proceso por el cual el calor destruye a virus envueltos en lipidos y no envueltos. El termino “pasteurizacion” es intercambiable con el termino “desactivacion por medio del calor” o “tratamiento de calor”. La desactivacion por calor puede ejecutarse a alrededor de 60 °C durante 10 horas. Estabilizadores tales como la sacarosa y glicina pueden agregarse a la mezcla durante el paso de pasteurizacion.

El termino “nanofiltracion” se refiere a un proceso por el cual virus envueltos en lipidos y no envueltos son excluidos de la mezcla, por ejemplo, utilizando filtros de escalas de nanometres tales como Planova™ 20N, 35N y 75N; Viresolve/70™, Viresolve/180™.

[0137] Los centros pueden tener un tamano de poros de menos de 70 nm, preferiblemente entre 15 y 50 nm. Sin embargo, cualquier membrana que tenga un tamano de poros suficiente para reducir o eliminar a virus de la muestra puede utilizarse en la nanofiltracion. Los virus removidos por nanofiltraciones pueden envolverse [por ejemplo, el VIH, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus del Nilo occidental, el citomegalovirus (CMV), el virus de Epstein-Barr (EBV - Epstein-Barr virus) el virus del herpes simple], y no envueltos (por ejemplo, el virus de la hepatitis A, el parvovirus B19, el virus del polio).

[0138] La mezcla puede concentrarse mediante procesos de ultrafiltraciones. La ultrafiltracion puede seguirse con una diafiltracion para intercambiar al amortiguador. La concentracion y dialisis mediante ultrafiltraciones y diafiltraciones, respectivamente, puede ejecutarse en un paso o como 2 pasos separados. La diafiltracion puede ejecutarse en cualquier solution que sea adecuada para su administracion humana.

[0139] En un paso posterior de la purificacion, la mezcla es homogenea y, si se desease, puede pasarse a traves de, y sujetarse a, una purification de columna para incrementar la purification de la enzima critica residual, por ejemplo, al utilizar a una columna de afinidad empacada con un inhibidor inmovilizado. En el caso de que la enzima litica sea plasmin(ogeno), la macromolecula de interes es fibrinogeno, y el inhibidor es TEA y/o EMBOCA, se puede utilizar un metodo cromatografico descrito en US 7,125,569 y WO02095019.

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[0140] A menudo, los materiales de inicio para la purification de macromoleculas son peletes o precipitaciones tales como la precipitation de hidroxido de aluminio, precipitaciones de etanol, precipitaciones acidas, precipitaciones de enfriamiento, precipitaciones de glicina y pastas precipitadas de heparina, que comprenden a la macromolecula de interes. Sin embargo, aparte de la macromolecula de interes, estos materiales comprenden un gran monto de enzimas llticas con las cuales aquellas macromoleculas tienen una alta sensibilidad. Comunmente, antes de la remocion de estas enzimas llticas (por ejemplo, mediante la purification de cromatografia de columna) se expone al material a un paso de solubilization completa para obtener a una solution homogenea que sea capaz de pasar a traves de la columna. Sin embargo, durante o despues de la solubilization completa, la macromolecula se vuelve accesible a una degradation por parte de las enzimas llticas hasta cierto punto.

[0141] Ventajosamente, en el metodo presentado por este invento, las enzimas llticas son capturadas y neutralizadas en etapas tempranas del proceso de purificacion o de fabricacion cuando la macromolecula esta en una forma no soluble o antes de que el material de inicio sea solubilizado completamente. Por ejemplo, un inhibidor inmovilizado de la enzima lltica se agrega a la mezcla heterogenea que contienen a la enzima lltica soluble y a la macromolecula insoluble. Ademas, el uso en el metodo de un inhibidor inmovilizado en lotes antes de que el material de inicio se solubilice completamente permite una neutralizacion rapida de la enzima lltica al inicio del proceso de purification de las macromoleculas. Este paso de solubilization completa de la macromolecula y la separation (por ejemplo, una centrifugation) permite la remocion de la mayorla de la enzima lltica junto con el aglutinamiento del inhibidor, y permite obtener una preparacion de la macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada

[0142] En una implementation del invento, la enzima lltica plasmina y/o plasminogeno es removida de una precipitation de hidroxido de aluminio que contiene a la enzima lltica y a macromoleculas de fibrinogeno. En implementaciones como estas, el inhibidor puede ser acido tranexamico (TEA - tranexamic acid) que es inmovilizado en gel de sefarosa. Los componentes requeridos para el proceso de purificacion son agregados en lotes antes de que la precipitacion se solubilice completamente o se disuelva completamente. En otra implementation del invento, el procedimiento de purification se ejecuta de la siguiente forma: se obtiene una precipitation (pellet) congelada de hidroxido de aluminio; se rompe a la precipitation congelada con un martillo y con un cincel hasta obtener partlculas con tamanos inferiores a 5 cm; se incuba a las partlculas rotas a 4 °C durante aproximadamente una hora (hasta que el material del pellet alcance una temperatura de alrededor de 0 °C); se desmenuza a las partlculas utilizando una licuadora durante 2-3 pulsaciones de 15-20 segundos cada una con intervalos de 40 segundos entre las pulsaciones, hasta obtener partlculas de unos pocos millmetros, por ejemplo, 2-8 mm; las partlculas licuadas son mezcladas con un amortiguador de suspension calentado previamente (34 °C) con una tasa de 1:4 entre la masa de los pedazos de hielo y el volumen del amortiguador de suspension (por ejemplo, 7 g de NaCl; 2,95 gramos de citrato de tri-sodio deshidratado; 8 mg/mililitros de albumina serica humana; y agua pura a 1 l; pH = 7,4; 6-40 ml de TEA-Sefarosa asentada; y opcionalmente 3:6 g de un 2% de Al(OH)3; con un pH de 7,4); se agita a la mezcla obtenida durante 90 minutos mientras que se mantiene a la temperatura a 30-32 °C y a un nivel de pH de 7,2; se centrifuga a la mezcla, por ejemplo, en una forma no continua (17.000 g; 25 minutos; temperatura del cuarto) o en una forma continua; se filtra al sobrenadante obtenido a traves de un filtro de 3 pm, por ejemplo, a traves de un filtro de polipropileno seguido por un filtro de 1-1,2 pm, por ejemplo, fibra de vidrio junto con un filtro; se agregan estabilizadores (por ejemplo, Ca2+ y glicina); se ejecutan pasos dobles de desactivacion viral, por ejemplo, un tratamiento de solvente/detergente (S/D) seguido por una pasteurization; se ejecuta un paso de ultrafiltracion/diafiltracion; se expone a la solution obtenida a una purification de columna utilizando una columna de TEA-Sefarosa, por ejemplo, tal como se presento en US 7’125.569 y WO02095019; y se obtiene a una composition enriquecida con fibrinogeno.

[0143] Por lo tanto, el invento tambien permite obtener una preparacion enriquecida con la macromolecula de interes en su forma intacta y no degradada y/o una preparacion purificada de la macromolecula en su forma intacta y no degradada.

[0144] En una implementation del invento, la macromolecula de interes es fibrinogeno y el termino “una preparation enriquecida con fibrinogeno” se refiere a una preparation que comprende a por lo menos 10 mg/mililitro (por ejemplo, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 mg/ml o mas) de fibrinogeno funcional.

[0145] El termino “preparacion purificada de la macromolecula”, tal como se utiliza en este documento, se refiere a una preparation obtenida despues de la remocion de por lo menos el 80% (por ejemplo, 80 ± 20%) de la enzima lltica a partir del material de inicio (por ejemplo, una mezcla biologica y/o una mezcla biologica precipitada) que contiene a la enzima lltica y a la macromolecula.

[0146] La concentracion de fibrinogeno funcional puede medirse mediante el procedimiento modificado de ensayo de farmacopea europea (0903/1997) tal como se indica en: European Pharmacopaiea (Farmacopea Europea), Fibrin sealant kit (Botiquln sellador de fibrina). 1997; 0903:858; y Clauss A. Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haematol. 1957; 17: 237-246; o mediante cualquier otro metodo conocido en la industria.

[0147] El invento se basa en los siguientes experimentos y hallazgos que usan un ejemplo del metodo de acuerdo al invento. Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no son limitantes.

EJEMPLOS

[0148] En los siguientes experimentos se removio a la enzima proteolltica plasmina y/o plasminogeno [denominado en este documento “plasmin(ogeno)”] de una precipitation congelada de hidroxido de aluminio que contenla la macromolecula de fibrinogeno y la enzima proteolltica de plasmin(ogeno).

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Materiales y metodos.

[0149] Preparation de la precipitation de hidroxido de aluminio.

[0150] La precipitation de hidroxido de aluminio (denominado en este documento como “pellet”) es un subproducto obtenido durante el proceso de fabrication del factor VIII (FVIIi).

[0151] Generalmente, durante la preparation de FVIII, de fibrinogeno, de fibronectina, del factor XIII junto con proteasas tales como el plasmin(ogeno) se precipitan desde una precipitation criogenica re-suspendida mediante la adicion de etanol a una temperatura baja seguido por un paso de centrifugation. Antes del paso de centrifugation, se agrega hidroxido de aluminio a la precipitation criogenica re-suspendida lo cual resulta en la precipitation de factores de coagulation que dependen de la vitamina K tales como el factor II, el factor VII y el factor X con el hidroxido de aluminio durante el paso de centrifugation. La precipitation obtenida de hidroxido de aluminio que contiene fibrinogeno, fibronectina y el factor XIII se separa entonces del sobrenadante que contenia FVnI y se utilizo en los experimentos que se describen mas adelante.

[0152] En mayor detalle, la precipitation de hidroxido de aluminio se obtuvo al ejecutar los siguientes pasos: se preparo, esencialmente, a una precipitation criogenica tal como se describio en WO 93/05822 y WO 94/22503. En breve, la precipitation criogenica se preparo a partir de plasma humano congelado (-30 °C) que fue descongelado a 4 °C y se removio al sobrenadante. La precipitation criogenica fue congelada a -30 °C y despues se descongelo a 0-4 °C. En el siguiente paso, la precipitation criogenica que se descongelo en un rango de temperatura que variaba desde 10° a 20 °C en un volumen doble de WFI (agua para inyeccion - water for injection) que contenia a 1-3 U/mililitro de sodio de heparina (se agrego heparina como un inhibidor de proteasas). El pH se ajusto a un nivel de 7-8 utilizando acido acetico diluido. Entonces, se agrego un 5% de etanol (para promover la precipitation de fibrinogeno) que contenia de 1 a 3 U/mililitro de sodio de heparina a la mezcla en el mismo volumen de la mezcla (masa/volumen) a una temperatura de 10 a 20 °C. El pH se ajusto a 6,8-7,2 utilizando acido acetico diluido. Se enfrio a la mezcla a una temperatura de 10 °C-15 °C mientras se agitaba y se agrego hidroxido de aluminio (agregado para precipitar a los factores de coagulation que dependen de la vitamina K) a la precipitation criogenica re-suspendida a una concentration final de aproximadamente 0,05%. A este paso le siguio un paso de centrifugation (ejecutado a 17.000 g durante 25 minutos a 14-18 °C). Es sobrenadante (que contenia a FVIII) se removio y se obtuvo al pellet. El pellet contenia entre otras cosas a fibrinogeno, al factor XIII, a fibronectina, a enzimas proteoliticas tales como el plasmin(ogeno), a hidroxido de aluminio y a factores de coagulation que dependen de la vitamina K. El pellet conformado de una alta concentration de etanol (aproximadamente 5% de etanol) y tuvo un nivel de pH inferior a 7,2. El material del pellet fue congelado y se mantuvo a -80 °C hasta los siguientes pasos de procesamiento.

[0153] Concentration del fibrinogeno.

[0154] La concentration de fibrinogeno se midio mediante el metodo de tiempo de coagulation de Clauss. Este metodo mide los niveles funcionales de fibrinogeno en una muestra desconocida de acuerdo a su tiempo de coagulation en la presencia de un monto constante de trombina utilizando una maquina que mide el tiempo de coagulation. El tiempo de coagulation que fue medido para la muestra desconocida se compara con aquellos obtenidos con una curva de calibration producida con un estandar de fibrinogeno. El metodo utilizado es una modification del ensayo Eu. Ph. 0903/1997 tal como se indico en: European Pharmacopaiea (Farmacopea Europea), Fibrin sealant kit (Botiquin sellador de fibrina). 1997; 0903: 858; y Clauss A. Gerinnungsphysiologische Schnellmethode zur Bestimmung des Fibrinogens. Acta Haematol. 1957; 17: 237-246.

Tratamiento de solvente/detergente (S/D).

[0155] Se agrego un 1% (masa/masa) de cada uno de TnBP (Tri-n-butilfosfato) y Triton X-100 (mezcla S/D) a la composition (calentada previamente a 30 °C) mientras se mezclaba (aproximadamente 150 revoluciones por minuto). Se agito continuamente a la composition durante 4 horas a 30 °C. En el siguiente paso, la mezcla S/D se removio mediante una extraction con aceite de ricino seguido por una cromatografia hidrofobica de la siguiente forma: la extraction de aceite de ricino se ejecuto con un 5% (masa/masa, concentration final) de aceite de ricino (aceites de Henry Lamotte) al agitar a la mezcla durante 25 minutos a 20 °C seguido por una incubation a 20 °C durante una hora para permitir la separation de las fases. Se formaron 2 fases, una fase acuosa inferior compuesta de fibrinogeno y una fase aceitosa superior compuesta de la mezcla S/D. La fase inferior fue recolectada y filtrada a traves de un filtro con una profundidad de 0,8 + 0,45 micrometres (Sartopore 2 300, Sterile Capsule, Sartorius). La filtration se transfirio a traves de una columna C-18 para remover a los vestigios remanentes de S/D.

Pasteurizacion.

[0156] Se agrego un 180% (masa/masa) de sacarosa y un 11% (masa/masa) de glicina a la solution en calidad de estabilizadores durante el paso de pasteurization. Se agito lentamente a la composition (50 revoluciones por minuto) durante 10 horas a 58-60 °C.

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Composition amortiguadora I

Componente Concentration

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Cloruro de sodio 120 mM

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Citrato de tri-sodio 10 mM

3

Glicina 120 mM

Valoracion a un pH 7.4; se agregaron a los componentes 4-5 antes de su uso

4

2% de gel de hidroxido de aluminio(Al(OH)3) 0,75 gramos por cada 30 g del pellet

5

Gel* de sefarosa de TEA 10 ml (resina asentada) ** por cada 30 g del pellet

* GE healthcare, numero de catalogo 28-4109-03. Se agrego al gel de sefarosa de TEA al amortiguador utilizado para la suspension de las piezas 2 y 4 exclusivamente (refierase al procedimiento mas adelante).

** “Volumen de la resina asentada”-el volumen de la resina despues de que se le permitio precipitarse y despues de remover el exceso del amortiguador.

Composition del amortiguador II

Componente Concentration

1

Cloruro de sodio 120 mM

2

Citrato de tri-sodio 10 mM

Valoracion a un pH 7,4; se agregaron a los componentes 3-5 antes de su uso

3

Albumina serica humana 8 mg/mililitro

4

2% de gel de hidroxido de aluminio 3,6 g por cada 120 g del pellet

5

*Gel de sefarosa de TEA 10 ml (de resina asentada) ** por cada 120 g del pellet

* Se agrego solamente en un grupo de tratamiento (refierase al procedimiento mas adelante). ** “Volumen de la resina asentada”-el volumen de la resina despues de que se le permitio precipitarse y despues de remover el exceso del amortiguador.

Composition del amortiguador III

Componente Concentration

1

Cloruro de sodio 120 mM

2

Citrato de tri-sodio 10 mM

3

Cloruro de calcio 1 mM

Valoracion a un pH 7,0-7,2

Ejemplo 1: Remocion del plasmin(ogeno) de un material de una precipitation de hidroxido de aluminio que contiene fibrinogeno

[0157] El material de la precipitation de hidroxido de aluminio que es un subproducto del proceso de purification de FVIII (descrito en la section de materiales), contiene un monto grande de fibrinogeno. Por lo tanto, esta precipitation de hidroxido de aluminio puede utilizarse como un material de inicio para la purification de fibrinogeno. Sin embargo, este material usualmente

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contiene altas concentraciones de enzimas proteollticas, por ejemplo, el plasmin(ogeno) que podrian afectar a la estabilidad de la macromolecula de fibrinogeno.

[0158] La precipitation de hidroxido de aluminio (pellet) fue suministrada en forma de un bloque congelado. La intention del siguiente experimento era la de neutralizar y remover al plasmin(ogeno) lo mas pronto posible a partir de este pellet para evitar degradaciones de la macromolecula de fibrinogeno a traves de los siguientes pasos de purification.

[0159] Al inicio del proceso de purification, es ventajoso el reducir el tamano medio de las partlculas congeladas para maximizar al area de la superficie de contacto del pellet con la solution amortiguadora que sera utilizada en un paso subsiguiente. Por lo tanto, el primer metodo fue el de producir partlculas congeladas de 2-8 mm del pellet. Se probaron a 2 metodos diferentes para reducir el tamano de las partlculas: Una trituration manual utilizando tijeras o una trituration mecanica utilizando una licuadora (antes de cada metodo, se redujo al tamano de las partlculas utilizando un cincel y un martillo).

[0160] Comunmente, la trituration mecanica es mas rapida, produce partlculas de tamanos uniformes, y se puede iniciar a temperaturas mas bajas (en comparacion con la trituration manual)-minimizando el inicio del proceso lltico, pero, por otro lado, durante el procedimiento en si se podrla generar calor el cual serla aplicado al material y, por lo tanto, podrian causarse danos a la actividad protelnica. En contraste, la trituration manual es suave, pero consume tiempo y podrla producir a partlculas de tamanos variados.

[0161] El siguiente metodo fue el exponer a las partlculas congeladas de 2-8 mm que contenlan fibrinogeno a la remocion de plasmin(ogeno). Con este fin, las partlculas de hielo fueron expuestas en lotes al acido tranexamico inmovilizado bajo condiciones especlficas que permiten la formation de una mezcla heterogenea. Los siguientes parametros afectan la solubilidad de las moleculas: la temperatura, el pH y la presencia de solventes organicos. Se suspendieron a las partlculas congeladas del pellet de 28 mm en soluciones diferentes (con o sin el acido tranexamico inmovilizado) en las cuales se ajustaron estos parametros para obtener a la mezcla heterogenea.

[0162] Para crear inicialmente a una solubilidad diferencial del plasmin(ogeno) y del fibrinogeno, se suspendieron a las partlculas congeladas de 2-8 mm que conforman al pellet de partlculas en un amortiguador que contiene al acido tranexamico congelado (composition del amortiguador I tal como se especifico en la section de materiales y metodos) con un nivel de pH ajustado a 7,27,3, se mantuvo a la temperatura entre 30-32 °C, y se redujo la concentration de etanol a entre alrededor del 5% a alrededor del 1% (como resultado de la adicion del amortiguador). Este paso de suspension se ejecuto mediante una incubation durante 30 o 90 minutos. Despues del paso de suspension, se centrifugo y se filtro a la mezcla para remover al hidroxido de aluminio, el inhibidor inmovilizado, y al plasmin(ogeno) capturado de la mezcla.

[0163] Para examinar si la macromolecula obtenida de fibrinogeno es funcional, se midio la concentracion del fibrinogeno mediante el metodo de tiempo de coagulacion de Clauss descrito anteriormente en la seccion materiales y metodos.

[0164] El procedimiento de purification se ejecuto especlficamente tal como se menciona a continuation:

1. Se introdujo al material de inicio de la precipitacion de hidroxido de aluminio del pellet (preparado tal como se describio en la seccion de materiales y metodos) al proceso de purificacion en forma de un bloque congelado solido, a - 80 °C. Se removio al pellet congelado del congelador y se rompio con un cincel y con un martillo para obtener 4 pedazos congelados de 30 g cada uno (pedazos mas pequenos que 5 cm). Se enviaron a los pedazos congelados a un congelador a -20 °C durante aproximadamente una hora y se les permitio equilibrarse a -20 °C. Entonces, se incubo al material a la temperatura del cuarto (20-25 °C) durante 15 minutos hasta que los pedazos alcanzaron una temperatura de aproximadamente 0 °C.

2. En el siguiente paso, se redujo el tamano de los 4 pedazos. Los pedazos 1 y 2 fueron triturados/desmenuzados (2 veces durante 20 segundos cada vez con un intervalo de 40 segundos) utilizando una licuadora/o una maquina de trituration a la velocidad mas alta (licuadora comercial, modelo 36BL74, Waring Commercial, CO, Estados Unidos de America) y los pedazos 3 y 4 se cortaron con tijeras. En ambos metodos se obtuvieron pedazos de alrededor de 2-8 mm. Este paso fue ejecutado a la temperatura del cuarto.

3. Se suspendieron a cada uno de los 4 pedazos triturados/cortados de hielo del pellet en 120 ml de amortiguador de suspension pre-calentado (34 °C) (a una tasa de 1:4 entre la masa de los pedazos de hielo y el volumen del amortiguador de suspension). Se utilizaron a 2 amortiguadores diferentes con (los pedazos 2 y 4) o sin (los pedazos 1 y 3) gel de TEA- Sefarosa (refierase a los componentes del amortiguador en la section de materiales y metodos bajo “composition del amortiguador I”). Los pedazos 1 y 3 (sin el gel de TEA-Sefarosa en la composition del amortiguador) se utilizaron como referencia. Se agitaron a las soluciones en un dispositivo agitador magnetico durante 10 minutos mientras que se mantuvo a la temperatura entre 30-32 °C.

4. Se ajusto al pH a 7,2-7,3 utilizando 0,1 M de NaOH.

5. Se incubo a la solution mientras se agitaba a 30-32 °C durante 30 minutos (una suspension durante 30 minutos). Se monitoreo al pH y se ajusto al pH a 7,2-7,3 utilizando 0,1 M de NaOH.

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6. La mitad de cada una de las soluciones se transfirio a un nuevo tubo de ensayo y se proceso inmediatamente de acuerdo al procedimiento indicado mas adelante (desde el paso 7 en adelante). El resto se incubo durante 60 minutos adicionales (una duration total de la suspension de 90 minutos incluyendo los 30 minutos que se ejecutaron en el paso 5) mientras se agitaba a 30-32 °C. El pH se monitoreo cada 30 minutos y se ajusto con 0,1 M de NaOH a 7,2-7,3.

7. Las soluciones de todos los 8 tratamientos*fueron centrifugadas a 17.000 g durante 25 minutos a 20 °C y el sobrenadante (que contenlan fibrinogeno) se transfirio a un nuevo tubo de ensayo. Este paso fue ejecutado para remover al aglutinamiento del hidroxido de aluminio, el aglutinamiento del gen de sefarosa de TEA y el plasmin(ogeno) capturado.

8. Se filtro el sobrenadante utilizando una bomba peristaltica a traves de un filtro pre-humedecido (con el amortiguador de suspension) MidiCap de 3 pm (Sartorius, Sartopure; numero de catalogo PP2 #5595302P7-00-A). Para evitar danos al fibrinogeno durante la filtration, se mantuvo a la presion por <0.2 bar ajustando la velocidad de la bomba.

9. Se realizo una filtracion adicional utilizando un filtro de fibra de vidrio (GF - glass fiber) MidiCap de 1.2 micrometres (Sartorius, Sartopure GF+; numero de catalogo #5555303P7-00-A). Los 2 pasos de filtracion resultaron en una remocion maxima del hidroxido de aluminio, del gel de TEA-Sefarosa y de residuos capturados de enzimas llticas. El primer paso de filtracion (a traves del filtro de 3 pm) se ejecuto para evitar un bloqueo del filtro de 1,2 micrometres.

10. Se agrego 0,1 M de CaCl2 a una concentration final de 1 mM por razones de estabilizacion.

[0165] Los tratamientos fueron-tratamiento 1: el pellet triturado mecanicamente; tratamiento 2: el pellet triturado mecanicamente y tratado con TEA inmovilizado; tratamiento 3: pellet triturado manualmente; tratamiento 4: pellet triturado manualmente y tratado con TEA inmovilizado. Cada uno de los tratamientos 1-4 se suspendieron y se incubaron durante 30 o 90 minutos.

[0166] La concentracion de fibrinogeno se midio en los 8 grupos diferentes en 2 momentos en el tiempo: al final del paso 10 (T0) dlas despues de la incubation a la temperatura del cuarto (20-25 °C; T4). Se midio la concentration de fibrinogeno mediante el metodo de tiempo de coagulation de Clauss tal como se describio en la section de materiales y metodos. Los resultados se muestran en la tabla 1.

Tabla 1: concentration de fibrinogeno en los diferentes tratamientos a los diferentes momentos en el tiempo.

Tratamiento

Duracion de la suspension (minutos) 30 90

Concentration de fibrinogeno (miligramo/mililitro)

Tiempo de incubation ^as) T0 T4 T0 T4

1

Mecanica (licuadora) 35,3 0 36,8 9,3

2

Mecanica (licuadora) + TEA inmovilizada 40,2 23,0 57,6 27,5

3

Manual (tijeras) 17,3 2,2 42,2 1,6

4

Manual (tijeras) + TEA inmovilizada 25,8 11,9 44,6 25,5

*Ambos metodos mecanico y manual incluyeron un paso previo de reducir manualmente el tamano medio de las partlculas

utilizando un cincel y martillo (refierase al paso 1 del procedimiento de purification mencionado anteriormente).

[0167] En los grupos 1 y 3 se observo que cuando se solubilizo el pellet con solamente el amortiguador, el fibrinogeno se degrado casi completamente en T4. Por lo tanto, es crltico neutralizar a las enzimas llticas durante el paso de solubilization.

[0168] Tal como se observo en los grupos 2 y 4, esta degradation se controlo mediante la adicion de TEA inmovilizado.

[0169] Tambien se observo que la reduction del tamano medio de las partlculas mediante un metodo mecanico combinado con la adicion de TEA inmovilizado dio mejores resultados (tabla 1 tratamiento 2 vs. 4).

[0170] Mas especlficamente, se observo que el tratamiento 2 (es decir, la reduction mecanica en el tamano de las partlculas y la suspension de 30 o de 90 minutos en la presencia de un inhibidor inmovilizado) resulto en una concentration incrementada de fibrinogeno en T0 y T4 en comparacion con los otros tratamientos (tratamientos 1, 3 y 4). La comparacion entre los 2 periodos de suspension (30 vs. 90) del tratamiento 2 muestra que el perlodo prolongado de suspension (90 minutos) resulto en una concentration incrementada de fibrinogeno en comparacion con el perlodo mas corto (30 minutos) en los 2 momentos en el tiempo (27,5 en comparacion a 23,0 miligramos/mililitro en T4; y 57,6 en comparacion con 40,2 miligramos/mililitro en T0).

[0171] Ademas, se observo que la adicion de un inhibidor inmovilizado en el amortiguador de suspension resulto en una

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concentration incrementada de fibrinogeno en ambos momentos en el tiempo en comparacion con el grupo de control sin el inhibidor inmovilizado (compare el tratamiento 2 con el tratamiento 1, el tratamiento 4 con el tratamiento 3).

[0172] Se descubrio, por lo tanto, que, para obtener a una macromolecula funcional de fibrinogeno, es beneficioso agregar a un inhibidor inmovilizado al amortiguador de suspension mientras se crea una solubilidad diferencial entre el fibrinogeno y el plasmin(ogeno). Ventajosamente, para incrementar aun mas la funcionalidad, las partlculas materiales pueden reducirse mediante medios mecanicos, por ejemplo, a un tamano medio de partlculas de 2-8 mm (puede ejecutarse una reduction manual previa en el tamano medio de las partlculas de menos de 5 cm) antes de la suspension y la suspension podrla ejecutarse durante un periodo prolongado de tiempo (tal como 30 minutos o mas).

[0173] En el tratamiento 2 con una incubation de 90 minutos, aproximadamente el 80% del plasmin(ogeno) se removio de la precipitacion.

[0174] El siguiente experimento se ejecuto para verificar los resultados previos y examinar el efecto del metodo utilizado para reducir el tamano medio de las partlculas antes del paso de suspension (trituration mecanica vs. manual como 2° paso de reduction del tamano de las partlculas) y la duration del paso de suspension (30 versus 90 minutos) en la funcionalidad de la macromolecula obtenida de fibrinogeno. En este experimento, todos los grupos de tratamiento se suspendieron en la presencia de un inhibidor inmovilizado.

[0175] El procedimiento se ejecuto tal como se indico en los pasos 1-10 mencionados anteriormente con las siguientes modificaciones:

1) Solo 2 pedazos congelados se obtuvieron en el paso 1, uno se trituro utilizando una licuadora y el otro fue cortado con tijeras; 2) ambos pedazos congelados, se suspendieron en el paso 3 en un amortiguador que inclula a gel de TEA-Sefarosa (se utilizo al amortiguador de suspension I tal como se listo en la section de materiales y metodos excepto que solo se utilizo a 7 ml de resina asentada por cada 30 g del pellet); 3) en el paso 9, se ejecuto la filtration utilizando 1 pm de Ultipor GF+ un filtro (PALL, numero de catalogo U010Z047050) en vez de 1,2 micrometros.

[0176] Se midio la concentration de fibrinogeno de los diferentes grupos en T0 (al final de los procesos) y 3 dlas despues de la incubation a la temperatura del cuarto (20-25 °C; T3). La medicion se ejecuto tal como se describio anteriormente.

Tabla 2: Concentration de fibrinogeno con diferentes configuraciones en los diferentes momentos en el tiempo

Tratamiento

Duration de la suspension (minutos) 30 90

Concentration de fibrinogeno (miligramo/mililitro)

Tiempo de incubation (dias) T0 T1 T0 T3

1

Mecanica (licuadora) 25,4 19,5 27,9 24,2

2

Manual (tijeras) 21,6 19,0 21,3 7,2

[0177] Los resultados confirman a los resultados previos y muestran que reducir ventajosamente al tamano medio de las partlculas congeladas utilizando un metodo mecanico (adicionalmente a una reduction manual previa del tamano medio de partlculas utilizando un cincel y un martillo) combinado con una duration prolongada de la suspension (por ejemplo, 90 minutos) en la presencia de un inhibidor inmovilizado resulta, ventajosamente, en una concentracion incrementada de fibrinogeno (refierase a la concentration de fibrinogeno en T0 y T3 con un periodo de suspension de 90 minutos del tratamiento 1 en comparacion a los grupos paralelos de tratamiento).

[0178] Un experimento de gran escala se ejecuto con 120 g de un pellet congelado. En este experimento, la reduction del tamano de partlculas de todos los grupos de tratamiento se ejecuto mediante medios mecanicos y se ejecuto una suspension (90 minutos). Este experimento incluyo a 2 grupos de tratamiento: suspendidos con o sin un inhibidor inmovilizado.

[0179] Se ejecuto al experimento en la misma forma que se indico anteriormente excepto que: (1) Se prepararon a los pedazos congelados de 120 g (refierase al paso 1 en el procedimiento indicado anteriormente) y se ejecuto la suspension en el paso 3 en 480 ml de amortiguador calentado previamente (34 °C) tal como se menciono anteriormente-una tasa de 1:4 entre la masa de los pedazos de hielo y el volumen del amortiguador de suspension); (2) Se ejecuto una reduction del tamano de las partlculas por medio de una licuadora (tal como se indico anteriormente en el paso 2); (3) La composicion del amortiguador II se utilizo en el paso 3 (para la suspension) y 8 (para la humidification de la bomba); (4) Solamente se ejecuto un periodo de suspension de 90 minutos; (5) Se ejecuto una estabilizacion (paso 10 mencionado anteriormente) tambien mediante la adicion de glicina a una concentration final de 120 mM (en el procedimiento previo se incluyo glicina en el amortiguador de suspension, por lo cual no se agrega en el paso de estabilizacion).

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[0180] En este experimento se ejecutaron pasos adicionales de production (adicionalmente a aquellos mencionados en los pasos 1 a 10) tal como se indica mas adelante.

[0181] Los materiales biologicos administrados a humanos deben sujetarse a pasos de desactivacion de virus para minimizar el riesgo potencial presentado por patogenos que se originan en la sangre. Por lo tanto, se sujeto a la composition obtenida a 2 pasos de desactivacion viral: el tratamiento solvente/detergente (S/D) que desactiva los virus envueltos en lipidos; y la pasteurization por la cual el calor destruye a los virus envueltos en lipidos y los virus que no estan envueltos en lipidos (se especifica a ambos tratamientos en la section de materiales y metodos). En el siguiente paso, la composition viralmente desactivada se diluyo con 2,5 masas (para reducir la viscosidad) del amortiguador (refierase a la composition del amortiguador III que se indico anteriormente) y se filtro a traves de un filtro de 3 pm (Sartopure PP2, Sartorius) para remover a particulas gruesas. Los estabilizadores (la sacarosa y la glicina que se agregan en el paso de pasteurizacion) se removieron de la solucion mediante ultrafiltraciones/diafiltraciones en contra del amortiguador III usando cintas con un tamano de poros de 100 K (Pall). La solution homogenea resultante fue sujeta a una purification de columna utilizando una columna de TEA-Sefarosa (GE healthcare) para remover el plasmin(ogeno) remanente de la solution tal como se describio en EP 1390485. Se concentro entonces a la solution mediante ultrafiltraciones [utilizando cintas de tamanos de poros de 100 K (Pall)] a una concentration de 80-120 mg/mililitro de proteinas totales y formulada con glicina (agregada a una concentration de 120 mM), y clorhidrato de arginina (agregado a una concentration del 2%).

[0182] La concentracion de fibrinogeno se midio en grupos diferentes (con o sin inhibidores inmovilizados en el amortiguador de suspension) en T0 (al final del proceso de production) y a los 2, 3, 5, 8 y 11 dias despues de la incubation a la temperatura del cuarto (20-25 °C). Los resultados se muestran en la tabla 3 y en la figura 1.

Tabla 3: Concentraciones de fibrinogeno al pasar del tiempo en muestras tratadas con o sin gel de TEA-Sefarosa durante el paso

de suspension

Tratamiento durante el paso de suspension

Concentration de fibrinogeno (miligramos/mililitro) * *

Tiempo de incubation (dias)

0

2 3 5 8 11

Con TEA-Sefarosa inmovilizada

56 56 *ND 57 53 57

Sin TEA-Sefarosa inmovilizada

47 50 44 38 28 *ND

* ND - Indeterminado (Not Determined)

** Se examino una prueba en cada momento del tiempo. Cada muestra se leyo 2 veces.

[0183] Los resultados concuerdan con los resultados previos y muestran que la adicion de un TEA inmovilizado en el paso de suspension resulto en una concentracion incrementada de fibrinogeno en T0 (es decir, una produccion incrementada de fibrinogeno) en comparacion con tratamientos que no tienen a TEA inmovilizada en el paso de suspension.

[0184] Adicionalmente, las muestras tratadas con TEA inmovilizado en el paso de suspension mostraron una estabilidad incrementada en comparacion a las muestras que no fueron expuestas a TEA inmovilizado en el paso de suspension. Por ejemplo, no se observo ninguna reduccion sustancial en la concentracion de fibrinogeno en el transcurso del tiempo en las muestras tratadas con gel de TEA-Sefarosa inmovilizado durante el paso de suspension incluso 11 dias despues de la incubation a la temperatura del cuarto. Mientras que las muestras que no fueron tratadas con el gel de TEA-Sefarosa inmovilizado en el paso de suspension mostraron aproximadamente una reduction del 40% en la concentration de fibrinogeno despues de 8 dias.

[0185] La figura 2 muestra un flujograma de pasos de la implementacion para la remocion de plasmina y plasminogeno (la enzima litica) a partir de un material de una precipitation de hidroxido de aluminio que contiene a fibrinogeno (la macromolecula). El acido tranexamico inmovilizado en gel de Sefarosa se utilizo como un inhibidor y se agrego al amortiguador de suspension. El material de la precipitacion se suministro en una forma congelada. La composicion del amortiguador de suspension utilizado fue de: 480 ml de amortiguador (7 g de NaCl; 2,95 gramos de citrato de tri-sodio deshidratado; 8 mg/mililitro de albumina serica humana; y agua pura hasta completar 1 l; pH = 7,4); 6-40 ml de TEA-Sefarosa asentada; y 3,6 gramos de un 2% de Al(OH)3; con un pH de 7,4.

Claims (16)

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para remover una enzima litica a partir de una mezcla biologica que contiene a la enzima litica y a una

   macromolecula de interes que es sensible a la enzima litica, donde el metodo comprende los pasos de: facilitar a la

   mezcla biologica en forma de una mezcla heterogenea que contiene a la enzima litica, y a la macromolecula, donde por lo menos un 50% de la enzima litica esta disuelta y por lo menos un 50% de la macromolecula esta en una forma solida; facilitar a un inhibidor de la enzima litica inmovilizado en un portador; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la solubilidad de la macromolecula en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado con la enzima litica enlazada de la mezcla.
2. 2. Un metodo para remover a una enzima litica de una mezcla biologica precipitada que contiene a la enzima litica y a una

   macromolecula de interes que es sensible a la enzima litica, donde el metodo comprende los pasos de: facilitar a la

   mezcla biologica precipitada; facilitar a un inhibidor de la enzima litica inmovilizada en un portador; disolver parcialmente a la mezcla biologica precipitada con una solucion acuosa para obtener a una mezcla heterogenea que contenga a particulas solidas que contengan a la macromolecula, donde, la mayoria de la enzima litica esta en una forma soluble y la mayoria de la macromolecula esta en una forma insoluble; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; disolver las particulas solidas en la mezcla; y separar al inhibidor inmovilizado con la enzima litica enlazada de la mezcla.
3. 3. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde la mezcla biologica es, o se deriva de, un fluido corporal seleccionado de un grupo que consiste de semen, esputo, orina, heces, sudor, saliva, mocos nasales, fluido cerebroespinal, y una fraction sanguinea.
4. 4. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde la mezcla biologica es una precipitation proteinica, preferiblemente en la cual la precipitation proteinica es una precipitation criogenica.
5. 5. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 4, donde la precipitation proteinica es un subproducto del proceso de fabrication del factor VIII y se selecciona de un grupo que consiste de precipitaciones acidas, precipitaciones de enfriamiento, precipitaciones de hidroxido de aluminio, precipitaciones de glicina, precipitaciones de etanol, y pasta precipitada de heparina, preferiblemente donde la precipitation proteinica es una precipitation de hidroxido de aluminio.
6. 6. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde la macromolecula es una proteina.
7. 7. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde la enzima litica es una proteasa.
8. 8. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde el inhibidor es un analogo de aminoacidos.
9. 9. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde la macromolecula es fibrinogeno, la enzima

   litica es plasmina y/o plasminogeno, y el inhibidor es un analogo de glicina, preferiblemente donde el analogo de glicina es el acido tranexamico.
10. 10. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1, donde la mezcla heterogenea se prepara al facilitar a una precipitation proteinica; y se suspende a la precipitation con una solution acuosa bajo condiciones que retrasan la solubilization de la macromolecula y/o aumentan la solubilization de la enzima litica, preferiblemente donde las condiciones se seleccionan de un grupo que consiste de un rango de pH de 7,2-7,3, un rango de temperaturas de 30-32 °C, una concentration de etanol en el rango de 0,2 al 5%, y una de sus combinaciones.
11. 11. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 2 o 10, donde la mezcla biologica precipitada se suministra en una forma congelada.
12. 12. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 11, que comprende ademas el paso de reducir el tamano medio de las particulas de la mezcla biologica precipitada congelada a alrededor de 2-8 mm, preferiblemente donde la reduction del tamano medio de las particulas se ejecuta mecanicamente, preferiblemente donde la reduction en el tamano medio de las particulas se ejecuta utilizando una licuadora.
13. 13. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde el paso de contacto se ejecuta por mas de 30 minutos.
14. 14. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 1 o a la reivindicacion 2, donde el paso de separacion se ejecuta mediante centrifugaciones y/o filtraciones.
15. 15. El metodo de acuerdo a la reivindicacion 2, donde los pasos de disolucion parcial de la mezcla biologica precipitada y de contacto de la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado se ejecutan simultaneamente, preferiblemente donde las condiciones de disolucion parcial se seleccionan de un grupo que consiste de un rango de pH de 7,2-7,3, un rango de temperatura de 30-32 °C, una concentration de etanol en el rango de 0,2 al 5%, y una de sus combinaciones.

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16. 16. Un metodo para purificar a una macromolecula a partir de una mezcla biologica que contiene a la macromolecula y a una enzima litica especifica para la macromolecula, donde el metodo comprende los pasos de: facilitar a la mezcla biologica en forma de una mezcla heterogenea que contiene a la enzima litica y a la macromolecula, donde por lo menos el 50% de la enzima litica esta disuelta y por lo menos el 50% de la macromolecula se encuentra en una forma solida; facilitar a un inhibidor de la enzima litica inmovilizada en un portador; contactar a la mezcla heterogenea con el inhibidor inmovilizado en lotes; incrementar la solubilidad de la macromolecula en la mezcla; y separar y extraer al inhibidor inmovilizado con la enzima litica enlazada de la mezcla.