ES2590685T3

ES2590685T3 - Composiciones de microgel

Info

Publication number: ES2590685T3
Application number: ES11707214.0T
Authority: ES
Inventors: Brian Saunders; Amir Hossein Milani; Ruixue Liu; Anthony Freemont
Original assignee: GELEXIR HEALTHCARE Ltd
Current assignee: Gelexir Healthcare Ltd
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2011-02-18
Publication date: 2016-11-23
Anticipated expiration: 2031-02-18
Also published as: WO2011101684A1; EP2542620A1; US20120308508A1; ES2861002T3; US10660989B2; DK3095817T3; EP3095817A1; CA2827600C; DK2542620T3; EP2542620B1; GB201002862D0; CA2827600A1; US11197947B2; EP3854845A1; US20190151512A1; EP3095817B1; US20190224372A1; US20220202993A1; US10695465B2

Abstract

Una composición que comprende una pluralidad de partículas de microgel, en donde las partículas de microgel adyacentes están unidas entre sí por cualquiera de (i) un enlace cruzado covalente formado por la reacción de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partículas de microgel; y/o (ii) una red de polímero reticulado que interpenetra partículas de microgel adyacentes y de este modo une las partículas entre sí, en donde la red de polímero se forma por la polimerización de un monómero de reticulación soluble en agua que comprende dos o más grupos vinilo.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones de microgel

Esta invencion se refiere a composiciones de microgel y, en particular, a composiciones de gel formadas mediante la union de una pluralidad de particulas de microgel individuales juntas. La presente invencion tambien se refiere a procesos para la preparation de estas composiciones y a su uso para aplicaciones particulares, las aplicaciones especialmente medicas, tales como la reparation de tejido de soporte de carga danado, degenerado o formado inapropiadamente (tal como, por ejemplo, discos intervertebrales).

Antecedentes

Particulas de microgel, que son particulas coloidales nanoscopicas o microscopicos de polimero reticulado, han sido investigadas por un numero de diferentes aplicaciones potenciales. Los ejemplos particulares incluyen su uso como microreactores para la sintesis de plantilla de nanoparticulas inorganicas, como materiales opticamente activos, incluyendo lentes y cristales fotonicos, y como sistemas de liberation de farmacos (Das et al. Annual Reviews of Materials Research, 2006, Vol.36: 117-142).

Las particulas de microgel se han utilizado tambien para la preparacion de hidrogeles fotonicos, hidrogeles especialmente fotonicos capaces de manipular los fotones en el espectro visible e infrarrojo cercano (vease Cai et al. Macromolecules, 2008, Vol.41:9508-9512). Mas especificamente, Cai et al., describen hidrogeles fotonicos derivados de particulas de microgel sensibles termicamente, de vinilo funcionalizadas. Las particulas de microgel, que se forman a partir de polimeros de PEG, estan reticuladas por cadenas de polimero de interconexion formadas por la polimerizacion de monomeros de etilenglicolacrilato (PEGA) y/o acrilamida. Tras la fotoiniciacion, los monomeros de etilenglicolacrilato (PEGA) o acrilamida reaccionan con los grupos vinilo presentes en las particulas de microgel y polimerizan para formar poliinterconexion (PEGA) o cadenas de polimero de poli (acrilamida). El resultado es un hidrogel compuesto de particulas de microgel conectados entre si por la interconexion de cadenas polimericas de longitud variable.

Una aplicacion particular de particulas de microgel biocompatibles es su utilidad potencial para la sustitucion o la reparacion de tejidos blandos que soportan carga lesionados, degenerados o formados inapropiadamente, tal como, por ejemplo, tales como, por ejemplo, discos intervertebrales y los tejidos encontrados en las articulaciones articulares (tales como el codo, rodilla, cadera, muneca, hombro y tobillo). Estos tejidos blandos deben ser capaces de soportar cargas significativas y cambios en la presion. Por ejemplo, las presiones experimentadas dentro de los discos intervertebrales humanos pueden variar desde aproximadamente 0.5 MPa cuando esta sentado a aproximadamente 2.3 MPa al levantar un peso de 20 kg. En consecuencia, la capacidad de los tejidos blandos, tales como discos intervertebrales, que soportan cargas variables biomecanicas es esencial para el funcionamiento normal del cuerpo.

El principio de tejido de soporte de carga del disco intervertebral es el nucleo pulposo en forma de disco, que forma el centro de un disco intervertebral. El nucleo pulposo consiste en condrocitos (celulas productoras de cartilago) dentro de una matriz de colageno y proteoglicanos. El cartilago articular, que es el tejido que cubre los extremos oseos de las articulaciones articulares, tiene una composition similar a la encontrada en el nucleo pulposo. Los proteoglicanos tienen una alta densidad de carga negativa y son responsables de la alta presion de hinchazon del nucleo pulposo. El nucleo pulposo es un hidrogel ionico natural y contiene aproximadamente 75% de agua en los adultos. El contenido de proteoglicano disminuye gradualmente con la edad, debido a la degeneration natural, y esto puede resultar en la formation de tres canales de dimensiones conocidas como "hendiduras". La formation de hendiduras proporciona puntos debiles o huecos en la estructura del disco, lo que finalmente puede llegar a ser perjudicial para la forma general, la forma, las dimensiones y rendimiento del disco, en particular cuando se aplica una presion.

Cualquier lesion, degeneracion o malformation en los tejidos de soporte de carga puede resultar en dolor significativo y falta de movilidad. Una proportion importante de todos los discos intervertebrales en la parte inferior de la columna vertebral muestra signos de degeneracion por la edad de 50. Esto puede dar lugar a dolor de espalda cronico, que es una causa importante de morbilidad y ausencia del trabajo.

El tratamiento de los tejidos blandos de soporte de carga danados, tales como discos intervertebrales o uniones articulares, generalmente se enfocan en el alivio sintomatico del dolor. En los casos graves, puede ser necesaria la intervention quirurgica para eliminar algunos de los tejidos danados e insertar una sustitucion protesica. La intervention quirurgica es eficaz para aliviar el dolor, pero puede resultar en el dano de los tejidos adyacentes y alteraciones en las propiedades biomecanicas/de soporte de carga del tejido en cuestion. Ademas, la intervencion quirurgica puede requerir una estancia prolongada en el hospital y la morbilidad significativa para el paciente en cuestion.

Un enfoque de la ciencia de materiales para abordar el problema de la degeneracion de los discos intervertebrales y otros tejidos de soporte de carga consiste en inyectar moleculas que polimerizan en el sitio de inyeccion. El deposito de polimero formado proporciona resistencia mecanica adicional al reforzar el tejido restante. Un ejemplo particular descrito en WO2000/062832 es la polimerizacion in situ de poli(etilenglicol)tetra-acrilato en el nucleo pulposo del disco intervertebral. Otro ejemplo consiste en la inyeccion de quitosano en el nucleo pulposo y permitiendo que se polimerice. El quitosano es un polisacarido de carga positiva que es soluble en agua a pH bajo. Se experimenta una transition de

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solucion a gel cuando se aumenta el pH. Por lo tanto, se ha contemplado que el quitosano se puede inyectar como una solucion de bajo pH y despues se deja formar un gel cuando se expone a un pH mayor in vivo. El gel que se forma in vivo no esta cargado y forma una red de pollmero que ocupa todo el volumen de la solucion inyectada. Por lo tanto, se convierte en un macrogel a traves de polimerizacion in situ.

El suministro de materiales inyectables que se pueden utilizar para tratar los tejidos de soporte de carga danados o degenerados, tales como discos intervertebrales, es un reto importante. Tambien debe apreciarse que un criterio clave para tales materiales es que sus propiedades mecanicas se replican a la del tejido de soporte de carga normal sano mas cerca posible.

La WO2007/060424 describe el uso de partlculas de microgel sensibles al pH para esta aplicacion particular. El uso de partlculas de microgel sensibles al pH biocompatibles ofrece muchas atracciones. En particular, las partlculas de microgel se pueden inyectar en una configuracion compacta (o "no hinchada") mediante el control del pH del medio de inyeccion. Sin embargo, una vez presente en el cuerpo, el pH por lo general se ajusta al pH fisiologico normal del tejido debido a las barreras naturales presentes en los fluidos fisiologicos. A valores de pH fisiologicos, el pollmero que forma las partlculas de microgel sensibles al pH sufren un cambio conformacional, que hace que las partlculas de microgel se hidraten y se hinchen. A continuacion, las micropartlculas hinchadas, proporcionan una masa gelatinosa que llena cualquier region de tejido degenerado y proporciona soporte mecanico adicional para el tejido que se trate.

Sin embargo, a pesar de los lugares de interes de este enfoque, las propiedades mecanicas del gel no son optimas y hay una tendencia a que las partlculas de microgel disipen/migren fuera del lugar de inyeccion, por lo que todavla subsiste la necesidad de inyectables alternativas que son capaces de proporcionar mas apoyo biomecanico mejorado para el tratamiento o la sustitucion de los tejidos de soporte de carga danados o degenerados.

La US5508325 (The Glidden Company) se refiere a una composition acuosa de recubrimiento protector para revestimientos de latas, basado en un aglutinante polimerico que comprende partlculas de microgel epoxi reticuladas.

La WO2011009867 (Glaxo Group Limited) se refiere a una composicion para el cuidado oral que comprende una dispersion de partlculas de microgel sensibles o no sensibles, y al menos un portador o excipiente oralmente aceptable para el tratamiento de la hipersensibilidad dentinaria.

Por lo tanto, es un objeto por tanto un objeto de la presente invention obviar o mitigar uno o mas de los problemas de la tecnica anterior, ya sea identificado en este documento o en otro lugar. En particular, es un objeto de la presente invencion proporcionar un metodo mejorado para la reparation de tejido de soporte de carga danado y degenerado.

Breve resumen de la divulgation

La presente invencion proporciona composiciones de microgel novedosas que tienen propiedades mecanicas generadas que les permiten ser utilizadas para la reparacion y/o reemplazo de tejido blando danado, tal como discos intervertebrales, as! como para otras aplicaciones.

En sus terminos mas amplios, la presente invencion proporciona una composicion de acuerdo con la revindication 1 que comprende una pluralidad de partlculas de microgel, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si por cualquiera de

(i) enlace cruzado covalente formado por la reaction de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y/o

(ii) por una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde la red de pollmero de vinilo se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulation soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.

Las composiciones de la presente invencion poseen propiedades mecanicas ventajosas, en particular en terminos de su capacidad para soportar cargas. Las propiedades mecanicas de estas composiciones pueden ser facilmente y ventajosamente afinadas y controladas con el fin de optimizar las propiedades mecanicas de la composicion de hidrogel resultante para aplicaciones de soporte de carga. Las propiedades mecanicas se pueden modificar mediante, por ejemplo, la modification de las condiciones de preparation de la composicion, variando las partlculas de microgel originales, modificando las condiciones de reaccion de reticulacion, alterando el pH de la composicion o la concentration de las partlculas de microgel.

En particular, las propiedades mecanicas de las composiciones de la invencion pueden replicar sustancialmente las del tejido de soporte de carga sano normal, tal como, por ejemplo, los discos intervertebrales, y por lo tanto permitir la provision de materiales de composiciones de hidrogel que se pueden utilizar para el tratamiento de tejidos de soporte de carga danados o degenerados. Por otra parte, las composiciones de la invencion ventajosamente se pueden formar in situ en el sitio diana deseado. Esto permite que los materiales precursores (incluyendo, entre otras cosas, las partlculas de microgel, monomeros de reticulacion y/u otros reactivos necesarios) sean administrados en una forma conveniente

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(por ejemplo, mediante la inyeccion de llquido) a un sitio diana (por ejemplo, in vivo) antes de que las composiciones de hidrogel y/o microgeles doblemente reticulados (DX) esten debidamente formados y moldeados in situ dentro del sitio diana deseado.

Las composiciones de la presente invencion tambien proporcionan una forma flsica mas consistente, que es particularmente ventajosa para aplicaciones in vivo donde la previsibilidad de la forma final es crucial. Tales composiciones tambien son estables y robustos, que tiene cepas crlticas altas, y tienen una baja propension a migrar o redispersar al servir una funcion de soporte de carga, especialmente in vivo. En particular, tales composiciones tienen una propension reducida a redispersar en ambientes acuosos alcalinos o acidos.

Las composiciones de la presente invencion tienen la ventaja adicional de que pueden formarse a partir de sus precursores convenientemente administrables utilizando ya sea la temperatura de hinchazon activado por el pH de las partlculas de microgel. Esto permite que los componentes precursores necesarios para formar las composiciones de la invencion sean almacenados eficazmente durante largos perlodos antes de la administracion y formacion de la composition. Esto es particularmente ventajoso para aplicaciones medicas en las que la forma administrable de la composition debe satisfacer regulaciones y requisitos para la fabrication, el transporte, y el almacenamiento de la forma administrable. Por otra parte, para aplicaciones in vivo, las propiedades de las composiciones se pueden modificar para permitir que un pH fisiologico proporcione la hinchazon activada por el pH de las partlculas de microgel. Por ejemplo, hinchazon activada por el pH fisiologico de las partlculas de microgel puede hacer que las partlculas de microgel adyacentes para agrandar e interpenetrar con sus partlculas de microgel precursoras vecinas y facilitar la reticulation de las partlculas de microgel adyacentes para formar las composiciones de la invencion. Esto es ventajoso porque las partlculas mantienen una estructura 3-dimensional conectada (no porosa) con distribution de carga maximizadas dentro del gel.

Las ventajas de los microgeles DX sobre los microgeles reticulados por separado (SX) incluyen los valores del modulo elastico mas altos, las cepas de mayor rendimiento, y la hinchazon en soluciones acuosas sin ningun tipo de redispersion.

Aunque los microgeles DX se asemejan a un hidrogel en que son macroscopicos, tambien son muy diferentes porque los microgeles DX se componen de partlculas de microgel interunidas de tamano de nanometros (o, a veces micrometro). Esto significa que las propiedades no mecanicas y la hinchazon se pueden modificar en la escala de tamano de las partlculas de microgel. Esto ofrece nuevas posibilidades para sintonizar las propiedades mecanicas, la construction de hlbridos y mezclas, que no existen para los hidrogeles macromoleculares convencionales. El termino hidrogel macromolecular se refiere a hidrogeles formados por moleculas de union covalente -hidrogeles convencionales.

Una ventaja particular de los metodos de preparation de microgel DX de la presente invencion es que las partlculas de microgel interpenetran antes de doble reticulacion. Esto significa que hay una red eficiente, de tres dimensional, en lugar de la distribucion de la tension una vez que se forma el material. Como tal, los valores de modulo son mas altos que los de los geles flsicos SX precursores.

Asl, en un aspecto particular, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas covalentemente entre si mediante enlace cruzado covalente formado por la reaction de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel. En este aspecto de la invencion, las partlculas de microgel de vinilo funcionalizadas son reticuladas directamente entre si sin que intervenga ningun reticulador(es). Esto puede ser ventajoso porque la qulmica de reticulacion es simple y requiere menos reactivos. Las composiciones de hidrogel resultantes poseen tambien una forma flsica mas consistente, que generalmente es mas robusta con una menor propension a la migration y/o re-dispersion cuando soporta cargas (por ejemplo, in vivo). Ademas, la administracion de composiciones de la presente invencion es particularmente conveniente (especialmente cuando se forma la composicion in vivo). Estas composiciones tambien poseen propiedades mecanicas ventajosas, propiedades elasticas particularmente ventajosas. Estas composiciones tambien muestran excelente reologla de gel con baja viscosidad, lo que es ideal para la reparation de tejidos blandos. Por otra parte, las propiedades mecanicas de las composiciones se pueden ajustar finamente y controlar facilmente, alterando simplemente el grado de funcion de vinilo de las partlculas de microgel, y tambien la concentration de las partlculas de microgel utilizadas durante la preparacion de la composicion. Como tal, las composiciones se pueden adaptar para una variedad de aplicaciones especlficas.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un proceso de acuerdo con la revindication 8 para la preparacion de una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel, en donde las partlculas de microgel, en donde partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si mediante enlace cruzado covalente formado por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel, comprendiendo el proceso:

(i) proporcionar, en un medio acuoso, una pluralidad de partlculas de microgel que comprenden unidades estructurales funcionales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y

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(ii) hacer que las partlcuias de microgel se hinchen de manera que las partlcuias de microgel adyacentes se ponen en contacto una con la otra y facilitar el acoplamiento de radicales libres de los grupos vinilo para unir de forma covalente partlculas de microgel adyacentes entre si.

La presente divulgacion tambien describe una partlcula de microgel que comprende una pluralidad de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre la superficie de la partlcula de microgel.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un proceso de preparacion de una partlcula de microgel que comprende una pluralidad de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre la superficie de la partlcula de microgel, comprendiendo el proceso hacer reaccionar una partlcula de microgel con un compuesto de la formula:

Z-L-B

en donde Z, L y B son como se definen en este documento.

En un aspecto particular adicional, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel que estan unidos por una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes, en donde la red de pollmero de vinilo se forma mediante la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo. Las composiciones de este aspecto particular de la invencion tienen la ventaja de que las composiciones con propiedades mecanicas altamente deseables, particularmente las apropiadas para la reparacion de tejido blando, se pueden formar sin la necesidad de prefuncionalizar las partlculas de microgel con unidades estructurales que contienen vinilo. Esto puede simplificar el proceso de formacion de la composicion para ciertas aplicaciones, y, potencialmente, simplifica la fabricacion de la forma administrable de las composiciones, especialmente cuando se pretenden aplicaciones in vivo. Por otra parte, tales composiciones aun permiten la hinchazon desencadenada por temperatura y/o pH, las ventajas de las que se describen anteriormente, en particular con respecto a aplicaciones in vivo. Las propiedades de tales composiciones tambien se pueden controlar facilmente y ajustar variando el peso molecular del monomero de reticulacion.

En una realizacion, la composicion esta sustancialmente libre de cualquier reticulacion directa entre las partlculas de microgel (esto es, no hay enlace cruzado covalentes directo formado entre las cadenas de pollmero que forman partlculas de microgel adyacentes).

Alternativamente, las composiciones de este aspecto de la invencion pueden comprender ademas enlace cruzado covalente formado por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de partlculas de microgel adyacentes. Estos enlaces cruzados covalentes pueden ser, convenientemente, ademas de la red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes. Como tal, la composicion puede comprender microgeles que estan unidos por tanto la reticulacion directa como una red de pollmero interpenetrante separada.

Alternativa o adicionalmente, la composicion puede comprender un grado de reticulacion indirecta entre las partlculas de microgel, por ejemplo, donde las partlculas de microgel prefuncionalizadas con unidades estructurales de vinilo reticulables estan reticuladas a traves del monomero de reticulacion (esto es, uno de los grupos vinilo del monomero de reticulacion reacciona con un grupo vinilo en una partlcula de microgel mientras que otro de los grupos vinilo del monomero de reticulacion reacciona con un grupo vinilo en otra partlcula de microgel). El uso de un monomero de reticulacion que comprende dos o mas grupos vinilo, por ejemplo, un monomero de reticulacion bi-vinilo, es ventajoso sobre el uso de los monomeros de reticulacion que comprenden un solo grupo vinilo porque la longitud de la cadena de cualquier enlace cruzado indirecto generalmente se regula mejor, por lo tanto, las propiedades de la composicion se controlan mas facilmente y sintonizado fino a traves de la seleccion del monomero de reticulacion apropiado. Cuando, como en el caso Cai et al. (Macromolecules, 2008, Vol.41: 9508-9512), un monomero de reticulacion comprende un solo grupo vinilo, se forman enlaces cruzados entre microgeles con diferentes longitudes de cadena (despues de la polimerizacion propagada de los monomeros de reticulacion por si mismos), que realiza el control de las propiedades de la composicion resultante.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un proceso para la preparacion de una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel que estan unidas entre si por una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde se forma la red del pollmero de vinilo mediante la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo, comprendiendo el proceso:

(i) proporcionar, en un medio acuoso, una pluralidad de partlculas de microgel; y

(ii) hacer que las partlculas de microgel se hinchen en presencia de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo de tal manera que las partlculas de microgel adyacentes se ponen en contacto una con la otra y facilitar la polimerizacion del monomero de reticulacion para formar una red de pollmero reticulado que interpenetra las partlculas y une las partlculas de microgel adyacentes entre si.

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En un aspecto particular adicional, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si por una combinacion de:

(i) enlace cruzado covalente formado por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y

(ii) por una red de pollmero reticulado que interpenetra las partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde la red de pollmero de vinilo se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.

La composicion de la invencion es convenientemente obtenible por cualquiera de los procesos definidos en este documento.

Se describe con mas detalle en este documento una composicion de precursor para la formacion de una composicion de la invencion como se define en este documento, la composicion de precursor que comprende una pluralidad de partlculas de microgel entre si con uno o mas reaccionantes o reactivos de reticulacion adicionales (por ejemplo, monomeros reticulantes, iniciadores de la polimerizacion de vinilo). De manera apropiada, las partlculas de microgel estan en una configuracion no hinchada en la composicion de precursor, lo que les permite ser convenientemente almacenadas y administradas al sitio diana para la formacion in situ de la composicion de la invencion.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una composicion como se define en este documento para su uso en el tratamiento de una condicion caracterizada por tejido blando danado o degenerado.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una composicion como se define en este documento para su uso en el tratamiento de una condicion caracterizada por tejido blando danado o degenerado, en donde dicha composicion se forma in situ dentro del cuerpo.

Ademas, se describe en este documento un metodo de tratamiento de un sujeto que sufre de una condicion caracterizada por tejido blando danado o degenerado, el metodo comprende la administracion de una composicion de precursor como se define en este documento, que reacciona para formar una composicion tal como se define en este documento in situ dentro del cuerpo.

Se describe ademas en este documento una composicion de precursor tal como se define en este documento para su uso en el tratamiento de una condicion caracterizada por tejido blando danado o degenerado, en donde dicha composicion forma una composicion de la invencion como se define en este documento in situ dentro del cuerpo.

Los anteriores y otros aspectos se describen en la invencion con mas detalle en este documento.

Breve descripcion de los dibujos

Las realizaciones particulares de la invencion se describen adicionalmente a continuacion con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es un esquema que muestra un primer metodo para preparar una composicion de partlculas de microgel reticuladas de la presente invencion;

La figura 2 es un esquema que muestra un segundo metodo para preparar una composicion de partlculas de microgel reticuladas de la presente invencion;

La figura 3 es un esquema que muestra un tercer metodo para preparar una composicion de partlculas de microgel reticuladas de la presente invencion; y

Las figuras 4 a 18 se describen en los ejemplos adjuntos.

Descripcion detallada

Composiciones de microgel

La presente invencion proporciona composiciones de microgel que poseen propiedades mecanicas especialmente ventajosas que las hacen apropiadas para una serie de aplicaciones, incluyendo la reparacion del tejido blando danado o degenerado.

Las composiciones de la invencion comprenden partlculas de microgel que estan bien unidas entre si por enlaces cruzados covalentes formados por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas en la superficie de las partlculas de microgel; y/o por una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes

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y de este modo une las partlcuias entre si, en donde la red de pollmero se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.

Tambien se describen las composiciones de precursor para la formacion de una composition de la invention, donde la composition precursora que comprende una pluralidad de partlculas de microgel junto con uno o mas reactivos o reactivos de reticulacion adicionales (por ejemplo, de monomeros de reticulacion, iniciadores de polimerizacion de vinilo, etc.). De manera apropiada, las partlculas de microgel estan en una configuration no hinchada en la composicion de precursor, lo que les permite ser convenientemente almacenadas y administradas al sitio diana para la formacion in situ de la composicion de la invencion.

Una composicion de la invencion es convenientemente obtenible por una cualquiera de los procesos definidos en este documento.

Como se discute en mas detalle a continuation, los enfoques para unir las partlculas de microgel juntos se basan en la qulmica de radicales libres para inducir el acoplamiento de grupos vinilo (si se trata de la polimerizacion de radicales libres de los monomeros de reticulacion que comprenden dos o mas grupos vinilo o las unidades estructurales que contienen vinilo injertadas en la superficie de las partlculas de microgel, o una combination de los mismos).

Partlculas de microgel

Las composiciones de la presente invencion son composiciones de hidrogel macrogel que se forman mediante la union junto con una pluralidad de partlculas de microgel.

Por el termino "partlcula de microgel", se quiere decir una partlcula de hidrogel que tiene un tamano dentro del intervalo de 1 nm a 100 pm y que comprende un pollmero reticulado formado por la polimerizacion de una pluralidad de comonomeros reticulados.

La partlcula de microgel en si, se puede considerar que es una macromolecula (esto es, el pollmero reticulado) que comprende una masa molar entre aproximadamente l06 y 1010 Da. (Por ejemplo, entre 106 y 109 Da). Sin embargo, los comonomeros individuales que se utilizaron durante la preparation de las partlculas de microgel pueden comprender una masa molar entre aproximadamente 5Da y 5000 Da, mas preferiblemente, entre aproximadamente 10 Da y 1000 Da, incluso mas preferiblemente, entre aproximadamente 50 Da y 500 Da, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 75 Da y 400 Da. En una realization mas preferida, los comonomeros utilizados en la reaction de polimerizacion comprenden una masa molar entre aproximadamente 100 Da y 300 Da.

La partlcula de microgel es convenientemente una partlcula de copollmero reticulado que es sensible al pH y/o a la temperatura. Por "sensible a pH y/o a temperatura" se quiere decir que el pollmero que forma las partlculas de microgel puede someterse a un cambio conformacional dependiente del pH y/o de la temperatura, que tiene un efecto consiguiente en la hidratacion de la partlcula. Esto significa que variando el pH y/o la temperatura, las partlculas de microgel pueden tener transition entre una configuracion colapsada, en la cual la partlcula esta en una configuracion compacta, a una configuracion hinchada, en la que la partlcula es en forma de un gel altamente hidratado (o microgel).

Por el termino "configuracion colapsada", nos referimos a la partlcula se reduce sustancialmente en tamano y tiene un diametro medio menor que en la configuracion hinchada. En este estado, el pollmero presente en las partlculas de microgel adopta una configuracion que no favorece la entrada de agua en la partlcula. El llmite de la configuracion colapsada es cuando la partlcula contiene practicamente nada de agua. Por lo tanto, la partlcula de microgel comprende preferiblemente menos de aproximadamente 70% (peso/peso) de agua, mas preferiblemente, menos de aproximadamente 50% (peso/peso) de agua, preferiblemente, menos de aproximadamente 30% (peso/peso) de agua, e incluso mas preferiblemente, menos de aproximadamente 20% (peso/peso) de agua, y mas preferiblemente, menos de aproximadamente 10% (peso/peso) de agua en la configuracion colapsada. En una realizacion particular, las partlculas comprenden una proportion menor de agua (menos de aproximadamente 40% peso/peso) en la configuracion colapsada. Se apreciara que este contenido de agua es una referencia al agua presente dentro de la partlcula.

Se apreciara que el diametro de las partlculas de microgel dependera de la hidratacion (contenido de agua) de la misma que a su vez depende de la configuracion del pollmero. El diametro de la partlcula de microgel en la configuracion colapsada es por lo general menos de aproximadamente 100 pm, mas por lo general, menos de aproximadamente 50 pm, e incluso mas por lo general, menos de aproximadamente 20 pm. Sin embargo, en una realizacion preferida, se prefiere que el diametro de la partlcula de microgel en la configuracion colapsada sea inferior a aproximadamente 10 pm, mas preferiblemente, menos de aproximadamente 5 pm, e incluso mas preferiblemente menos de aproximadamente 1 pm. La mayorla de partlculas preferidas son en la escala de nanometros, esto es, el diametro medio de la partlcula de microgel en la configuracion colapsada esta preferiblemente entre aproximadamente 1 nm y 1000 nm, mas preferiblemente, entre aproximadamente 10 nm y 750 nm, incluso mas preferiblemente, entre aproximadamente 20- 500 nm, y mas preferiblemente, entre aproximadamente 50 y 100 nm de diametro.

Por el termino "configuracion hinchada", queremos decir que la partlcula de microgel es sustancialmente hidratada y ampliada, y por lo tanto tiene un diametro medio mayor que el de la partlcula cuando esta en la configuracion colapsada.

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Se apreciara que esta inflamacion es causada por un flujo de agua en la partlcuia. En la configuracion hinchada, la partlcula de microgel comprende preferiblemente al menos aproximadamente 70% (peso/peso) de agua, mas preferiblemente, al menos aproximadamente 85% (peso/peso) en agua, preferiblemente, al menos aproximadamente 90% (peso/peso) de agua, incluso mas preferiblemente, al menos aproximadamente 95% (peso/peso) de agua, y mas preferiblemente, al menos aproximadamente 99% (peso/peso) de agua. Se apreciara que la cantidad de agua en la partlcula dependera de la temperatura y/o pH, as! como las propiedades del pollmero que constituyen la partlcula de microgel (por ejemplo, densidad de carga). De manera apropiada, el diametro medio de la partlcula de microgel esta adaptado para aumentar en al menos 20%, mas convenientemente, por al menos 50%, mas convenientemente por lo menos 100%, incluso mas convenientemente, por lo menos 200%, ya que la transicion de una configuracion colapsada a una hinchada en respuesta a un cambio en el pH y/o temperatura.

En una realizacion, el diametro de las partlculas de microgel en la configuracion hinchada es de aproximadamente 5 nm a 100 pm, de forma apropiada de aproximadamente 5 nm a 10 mm, y preferiblemente de 50 nm a 1 mm.

Para dispersiones concentradas de partlculas de microgel (por ejemplo, concentraciones superiores a 2 % en peso), La transicion de una configuracion colapsada a una configuracion hinchada puede ser referida como una etapa de macrogelacion dependiente del pH o la temperatura. El cambio conformacional del pollmero causa solvente en el medio que rodea a la entrada en la partlcula y hacer que se hinche. Asl, en la configuracion colapsada que las partlculas se dispersan en un medio sustancialmente fluido, que tiene una baja viscosidad y puede fluir. Por lo tanto, en esta configuracion, las partlculas de microgel se pueden transportar facilmente a la ubicacion deseada, por ejemplo, mediante la inyeccion de las partlculas a la ubicacion deseada en el cuerpo. Sin embargo, en la configuracion hinchada, las partlculas de microgel forman una masa gelificada que tiene una viscosidad mas alta y un gel flsico de mayor viscosidad.

Para la aplicacion particular, por lo que las composiciones de la invencion se usan para el tratamiento de tejido de soporte de carga danado o degenerado, el pollmero que constituye la partlcula de microgel se puede seleccionar de modo que la transicion a una configuracion hinchada a pH fisiologico o temperatura. Esto significa que el pH o la temperatura del medio de inyeccion pueden ser manipulados de modo que las partlculas de microgel estan en su configuracion compacta en el punto de administracion, lo que les permite administrar facilmente a la ubicacion deseada por inyeccion. El cambio posterior en la temperatura y/o pH en el cuerpo, entonces hara que las partlculas de microgel se hinchen de manera que entran en contacto con partlculas de microgel adyacentes. A continuation, las partlculas de microgel hinchadas se pueden unir juntas por la reaction entre los grupos vinilo proporcionados en o cerca de la superficie de las partlculas de microgel hinchadas adyacentes y/o por la formation de una red de pollmero reticulado dentro de la matriz de microgel hinchada. El resultado es una composition de macrogel cohesiva que tiene propiedades mecanicas ventajosas.

Con el fin de que las partlculas de microgel se hinchen, tienen que dispersarse en un medio acuoso apropiado. Se prefieren agua, solution reguladora o fluidos fisiologicos.

La pluralidad de partlculas de microgel utilizadas para formar las composiciones de la presente invencion pueden todos poseen la misma composicion polimerica, esto es, los mismos comonomeros se utilizan para formar los pollmeros que componen las partlculas de microgel. Sin embargo, en ciertas realizaciones de la invencion, la pluralidad de partlculas de microgel puede comprender dos o mas tipos diferentes de partlculas de microgel formadas a partir de pollmeros que se componen de diferentes componentes comonomericos o con diferentes proporciones de los mismos componentes comonomericos.

Una dispersion de microgel es diferente a un hidrogel, ya que tiene la capacidad de fluir y existir en el estado fluido. Un hidrogel no puede hacer eso porque es un macroscopico (por ejemplo, material de tamano de millmetros o centlmetros). La dispersion de microgel se compone de partlculas de microgel dispersas dentro de una solucion (acuosa). Debido a que hay espacio entre las partlculas que pueden fluir y es un fluido. Sin embargo, el uso de las partlculas de microgel sensibles al pH de la presente invencion, el pH se utiliza para desencadenar un aumento en el tamano de la partlcula de microgel para que ocupen todo el volumen del fluido. Esto provoca la formacion de un gel flsico (reticulado por separado). En este estado las periferias de las partlculas de microgel se interpenetran.

El nuevo metodo para la formacion de microgel DX toma ventaja de esta mediante acoplamiento covalente de las periferias de microgeles funcionalizados de vinilo interpenetrados. Esto da un segundo nivel de reticulation (doble reticulado) que une las partlculas de microgel entre si.

Partlculas de microgel sensibles al pH

En una realizacion particular, las partlculas de microgel son sensibles al pH. Cualquier partlcula de microgel sensible al pH apropiada puede ser utilizada para formar las composiciones de la presente invencion.

En una realizacion particular, el pollmero sensible al pH es un pollmero definido en WO2007/060424, de la cual los contenidos completos se incorporan en este documento por referencia. En particular, los pollmeros apropiados para la formacion de partlculas de microgel sensibles al pH se definen en la pagina 12/lfnea 21 a la pagina 22/llnea 17, y pagina

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26/llnea 20 a la pagina 28/llnea 22, de WO2007/060424. Las partlcuias de microgel se pueden hacer por cualquier metodo apropiado conocido en la tecnica. Los iniciadores apropiados para su uso en la formacion de tales partlculas de microgel sensibles al pH se definen en la pagina 22/llnea 19 a la pagina 24/llnea 3 de WO2007/060424. Los surfactantes apropiados que tambien se pueden utilizar se definen en la pagina 24/llnea 5 hasta la pagina 26/llnea 11.

Para las composiciones de la presente invencion, se prefiere que la partlcula de microgel comprenda un comonomero hidrofobo. Por lo tanto, se prefiere que la partlcula de microgel comprenda una partlcula de pollmero copolimerizado, que puede definirse por la siguiente formula I:

Poli (B-co-P-co-X) (i)

en donde:

P es un comonomero sensible al pH;

X es un comonomero de reticulacion funcional; y B es un comonomero hidrofobo.

Estos pollmeros de microgel particulares se describen en la pagina 19/llnea 21 hasta la pagina 22/llnea 8 de WO2007/060424.

En una realizacion preferida, la partlcula de microgel comprende acrilato de etilo (EA esto es, que es el comonomero hidrofobo, B), acido metacrllico (MAA esto es, que es el comonomero sensible al pH, P), y 1,4-butanodiol diacrilato (esto es BDDA, que es el comonomero de reticulacion funcional, X). De acuerdo con lo anterior, una partlcula de microgel preferido comprende poli (EA/MAA/BDDA).

El poli(EA/MAA/BDDA) utilizado para formar la partlcula de microgel puede comprender un % de masa maximo de EA (monomero hidrofobo) de aproximadamente 95%, un % de masa mlnimo de MAA (monomero sensible al pH) de aproximadamente 5%, y un % de masa mlnimo de BDDA (monomero de reticulacion) de aproximadamente 0.1%. De manera apropiada el % de masa de BDDA esta dentro del intervalo de 0.1 a 2%.

En una realizacion particular, las partlculas de microgel poli (EA/MAA/BDDA) comprenden 65.9% de EA, aproximadamente 33.1% de MAA y aproximadamente 1.0% de BDDA basado en la masa total de monomeros. Esto puede ser definido como una relacion de masa de EA/MAA/BDDA como 65.9/33.1/1.0, o como una relacion molar de EA/MAA/BDDA es 130.4/76.0/1.0.

En otra realizacion preferida, la partlcula de microgel comprende metacrilato de metilo (esto es, MMA, que es el comonomero hidrofobo, B), acido metacrllico (esto es, MAA, que es el comonomero sensible al pH, P) y etilenglicol dimetacrilato (esto es, EGDMA, que es el comonomero de reticulacion funcional, X). De acuerdo con lo anterior otra partlcula de microgel preferida comprende poli(MMA/MAA/EGDMA).

El poli (MMA/MAA/EGDMA) utilizado para formar la partlcula de microgel puede comprender una % de masa maxima de MMA (monomero hidrofobo) de aproximadamente 95%, un % de masa minima de MAA (monomero sensible al pH) de aproximadamente 5%, y una % de masa minima de EGDMA de aproximadamente 0.1% (monomero de reticulacion). De manera apropiada, el % en masa de EGDMA esta dentro del intervalo de 0.1 a 2%.

En una realizacion particular, el poli (MMA/MAA/EGDMA) de las partlculas de microgel comprende aproximadamente 66.8% de MMA, aproximadamente 32.8% de MAA y aproximadamente 0.4% de EGDMA basado en la masa total de monomeros. Esto puede ser definido como una relacion de masa de MMA/MAA/EGDMA de 167/82/1.0, o como una relacion molar de MmA/MAA/EGDMA es de 320/185/1.0.

En una realizacion particular, la composition o (o composition de precursor utilizada para formar dicha composition) como se define en este documento comprende partlculas de microgel que se hinchan o colapsan como consecuencia de un cambio en el pH del ambiente circundante. En una realizacion particular, la composicion (o composicion de precursor utilizada para formar dicha composicion) tiene un estado de almacenamiento y/o estado de administration que tiene un entorno de pH que es diferente del entorno de pH del sitio diana (por ejemplo, pH fisiologico). En el estado de almacenamiento o administracion, las partlculas de microgel existen convenientemente en un estado sustancialmente no hinchado. El hueco entre el entorno de pH del almacenamiento y/o estado de la administracion y ambiente de pH del sitio diana es convenientemente suficiente para hacer que las partlculas de microgel se hinchen de manera que su diametro hidrodinamico (dh) aumenta. De manera apropiada, el pH en el sitio diana provoca que el diametro hidrodinamico (dh) de las partlculas de microgel aumentan en relacion con el almacenamiento o el estado administracion por al menos 10%, mas convenientemente por lo menos 25%, incluso mas convenientemente por lo menos 50%, y mas convenientemente por lo menos 100%. El sitio diana puede ser convenientemente in vivo, que tiene un ambiente de pH fisiologico.

Las partlcuias de microgel sensibles al pH apropiadas se pueden obtener comercialmente o preparar utilizando metodologla bien conocida en la tecnica.

Partlculas de microgel sensibles a la temperatura

Las partlculas de microgel de la presente invencion tambien pueden ser sensibles a la temperatura. Cualquier partlcula 5 de microgel sensible a la temperatura apropiada puede ser utilizada para formar las composiciones de la presente invencion.

El termino "sensible a la temperatura" se utiliza en este documento para referirse a pollmeros que se someten a un cambio dependiente de la temperatura en la hidratacion. La temperatura a la que un cambio sustancial en la hidratacion polimerica se produce se conoce como la temperatura de solucion crltica (CST). La temperatura de solucion crltica 10 inferior (LCST) es la temperatura crltica inferior a la que el copollmero se vuelve altamente miscible con agua. De acuerdo con lo anterior, por encima de la LCST el copollmero es altamente deshidratado y por debajo de la LCST el copollmero es altamente hidratado. Los pollmeros apropiados de la presente invencion tienen una LCSt en el intervalo de 20°C a 40°C. La LCST deseable sera dictada en ultima instancia por la aplicacion pretendida de la composicion de microgel. Por ejemplo, para aplicacion in vivo, sera deseable tener una LCST por encima de 37°C. Para otras 15 aplicaciones, por ejemplo, la condicion de una pellcula de microgel sensible a la temperatura para aplicaciones de cultivo celular, puede ser necesaria una LCST de, por ejemplo 30 a 34°C. Un ejemplo de un pollmero que tiene una LCST inferior de aproximadamente 32°C es Poli (N-isopropilacrilamida). El termino "sensible a la temperatura" tambien se utiliza en este documento para referirse a monomeros que, cuando se polimerizan forman pollmeros, sensibles a la temperatura que se someten a un cambio dependiente de la temperatura en la hidratacion como se discutio 20 anteriormente.

En una realizacion particular de la invencion, el pollmero sensible a la temperatura utilizada para formar las partlculas de microgel es un copollmero de la siguiente formula II:

Poli (C-co-Q-co-X) (II)

en donde:

25 C es un monomero sensible a la temperatura;

Q es un monomero que contiene un grupo hidroxilo o un comonomero P sensible al pH tal como se define anteriormente en este documento; y

X es un comonomero de reticulacion tal como se define en WO2007/060424.

Cualquier monomero sensible a la temperatura (componente C) apropiado se puede utilizar. Los ejemplos apropiados 30 del monomero C sensible a la temperatura incluyen N-isopropilacrilamida y vinilcaprolactona. De manera apropiada, C constituye 40 a 98 % mol., del pollmero sensible a la temperatura.

Un ejemplo apropiado de Q es hidroxi etil metacrilato, alcohol de vinilo, etilenglicol metacrilato, o poli(etilenglicol) metacrilato. De manera apropiada, C constituye 1-55 % mol del pollmero sensible a la temperatura.

Como el anterior, X constituye convenientemente de 0.01 a 2 % mol del pollmero sensible a la temperatura.

35 Los pollmeros utilizados para preparar las partlculas de microgel de la presente invencion pueden comprender ademas un monomero que comprende una cadena lateral que contiene vinilo (en lugar de, o ademas de, el monomero de reticulacion X). La cadena lateral que contiene vinilo provee grupos vinilo funcionales, al menos una proporcion de las cuales estaran en o cerca de la superficie de la partlcula de microgel y por lo tanto proporcionan un medio por el que las partlculas de microgel pueden reaccionar y unirse entre si. Un ejemplo apropiado de dicho monomero serla metacrilato 40 de alilo (AM). Un ejemplo apropiado de un pollmero que comprende metacrilato de alilo es poli (EA/MAA/AM) como se define en Dalmont et al. (Langmuir, 2008, 24, 2834-2840).

Injerto de unidades estructurales que contienen vinilo

En una realizacion particular, la presente invencion proporciona una composicion que comprende una pluralidad de partlculas de microgel, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas covalentemente entre si por grupos 45 de reticulacion formados por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las partlculas de microgel. Como tal, la composicion precursora puede comprender convenientemente partlculas de microgel con unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre la misma.

Se preve que las unidades estructurales que contienen vinilo seran injertadas predominantemente en la superficie de la partlcula de microgel, o la proxima a la misma.

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El injerto de unidades estructurales que contienen vinilo en las partlculas de microgel preformadas proporciona una pluralidad de unidades estructurales que contienen vinilo que posteriormente se pueden hacer reaccionar para formar el enlace cruzado covalente entre partlculas de microgel adyacentes.

Cualquier unidad estructural que contiene vinilo apropiado que puede ser injertada en la partlcula de microgel se puede utilizar para este proposito. De manera apropiada, la unidad estructural que contiene vinilo es soluble en agua.

En una realizacion, la unidad estructural que contiene vinilo se proporciona por reaccion de una partlcula de microgel con un compuesto soluble en agua de la formula (III):

Z-L-B (III)

en donde:

Z es un grupo reactivo;

L es un enlace o un grupo de union entre Z y B; y B es un grupo que comprende un grupo funcional vinilo.

Z puede ser cualquier grupo reactivo apropiado. El proposito del grupo Z es reaccionar con un grupo funcional presente en la partlcula de microgel y por lo tanto injertar la parte de -L-B del compuesto de formula III en la superficie de la partlcula para proporcionar la fraccion que contiene vinilo. Por lo tanto, la selection de un grupo Z funcional apropiado sera dictada por la naturaleza de la partlcula de microgel en cuestion. Un qulmico experto serla facilmente capaz de seleccionar grupos apropiados. Por ejemplo, si la partlcula de microgel comprende unos grupos de acido carboxllico, a continuation, Z puede ser cualquier grupo que reaccionara para formar un ester con el grupo de acido carboxllico, tal como, por ejemplo, un halogeno, hidroxilo, amino o un grupo epoxido. Del mismo modo, si la partlcula de microgel comprende un grupo amino, a continuacion, Z puede ser un grupo que reacciona con la amina para formar un enlace amida (por ejemplo, Z puede ser un grupo -C(O)M, en donde M es un grupo saliente, por ejemplo, un halogeno tal como cloro), o un grupo que reacciona para formar un enlace de sulfonamida (por ejemplo, Z es un grupo tal como -S(O)2Cl).

Alternativamente, si la partlcula de microgel comprende un grupo (o grupos) de acido carboxllico, Z puede ser convenientemente un grupo amino, tales como amino etilmetacrilato (o sal del mismo), y el acoplamiento puede conducir convenientemente en una amida de acido. En tales casos, el compuesto III convenientemente puede acoplarse con el(los) grupo(s) de acido carboxllico despues de la activation previa del(los) grupo(s) de acido carboxllico (por ejemplo, a traves de la formation de un acil-cloruro) o el uso de un agente de acoplamiento (por ejemplo, 1-etil- 3- (3- dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC), carbonildiimidazol (CDI)). Z puede ser convenientemente alquilamino (o una sal del mismo), por ejemplo, clorhidrato de etilamina.

En una realizacion particular, Z es un grupo epoxido.

L puede ser cualquier enlace o grupo de union apropiado, tal como, por ejemplo, una cadena de alquileno funcionalizada que comprende opcionalmente uno o mas grupos funcionales seleccionados de -O-,-C(O)-, -C(O)O-, - OC(O)-, -NRa-, -NRa-C(O)-, o -C(O)-NRa-, en donde Ra es H o alquilo (C1-2) o L puede ser -(OCH2CH2)n-, donde n es 1 a 50 (inclusive). La cadena de alquileno puede ser un grupo corto (1-3 atomos de carbono) que comprende uno o mas de estos grupos funcionales definidos anteriormente.

B puede ser cualquier grupo que contiene vinilo apropiado. En una realizacion particular, B es un grupo -CR1 = CR2R3, esto es, la fraccion que contiene vinilo es un compuesto de formula estructural IV mostrada a continuacion:

R,

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(IV)

en donde Z y L son como se definen anteriormente; y R1, R2 y R3 se seleccionan de H o alquilo (C1-3).

R1, R2 y R3 se seleccionan convenientemente de H, metilo o etilo, especialmente H o metilo.

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En una realizacion de la invencion, el compuesto de formula III o IV se selecciona de metacrilato de glicidilo, acrilato de glicidilo o de otros glicidilacrilatos funcionalizados. Tales compuestos se pueden acoplar a los grupos de acido carboxllico, amina o hidroxilo en la superficie de las partlculas de microgel.

En una realizacion particular, el compuesto de formula III o IV es metacrilato de glicidilo.

En una realizacion alternativa, el compuesto de formula III o IV es alilamina, que puede ser unido covalentemente a grupos de acido carboxllico en la superficie de las partlculas de microgel utilizando qulmica de carbodiimida soluble en agua.

En una realizacion alternativa, el compuesto de formula III o IV es clorhidrato de metacrilato de aminoetilo (AEMHCI). Tales compuestos pueden convenientemente estar acoplados a un(os) grupo(s) de acido carboxllico en las partlculas de microgel por medio de una reaccion de acoplamiento que implica EDC.

Un experto en la tecnica sera capaz de seleccionar las condiciones experimentales apropiadas para injertar la fraccion que contiene vinilo en la partlcula de microgel.

De manera apropiada, la reaccion se llevara a cabo en el solvente acuoso a un pH entre 2 y 7, y preferiblemente a un pH entre 2 y 4.

De manera apropiada, la concentracion de las partlculas de microgel en el solvente acuoso es entre 0.05 y 20% en peso.

De manera apropiada, la concentracion del grupo que contiene vinilo (por ejemplo, metacrilato de glicidilo, acrilato de glicidilo u otros glicidilacrilatos funcionalizados) esta comprendida entre 10-3 y 10 Mol dm'3, y preferiblemente entre 0.1 y 5 Mol dm-3.

Una temperatura apropiada para la reaccion de injerto es entre 0 y 100°C, y preferiblemente entre 40 y 70°C. La reaccion puede proceder entre 0.5 y 48 horas, y preferiblemente entre 4 y 12 horas.

De manera apropiada, la unidad estructural que contiene vinilo debe corresponder a una concentracion entre 0.1 y 60% mol con respecto a todos los comonomeros presentes en el gel. Preferiblemente, la concentracion de la fraccion que contiene vinilo debe estar entre 10 y 30% mol con respecto a todos los comonomeros presentes en el gel.

Reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado

Las unidades estructurales que contienen vinilo injertadas en la superficie de las partlculas de microgel pueden someterse a una reaccion de acoplamiento de los radicales libres directamente con las unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de partlculas de microgel adyacentes para formar un enlace covalente directo entre ellas.

Esta reaccion particular se muestra esquematicamente en la figura 2. La primera etapa de la reaccion consiste en proporcionar partlculas de microgel que tienen unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre a sus superficies. La siguiente etapa consiste en llevar las superficies de las partlculas adyacentes en contacto una con la otra. Esto se puede lograr haciendo que las partlculas de microgel que responden a hincharse mediante la variacion de la temperatura o el pH (como se describe anteriormente en este documento). La hinchazon de las partlculas de microgel, como se hidratan hace que las superficies de las partlculas adyacentes esten en contacto entre si e incluso se superponen para formar regiones interpenetrantes de pollmero gelificado. Este dispone las unidades estructurales que contienen vinilo injertado de superficie de micropartlculas adyacentes en estrecha proximidad entre si para facilitar el acoplamiento de los radicales libres de las unidades estructurales de vinilo, como se discute mas adelante.

La reaccion entre las unidades estructurales que contienen vinilo injertadas en la superficie de partlculas de microgel adyacentes se consigue mediante la qulmica de radicales libres utilizando tecnicas bien conocidas en la tecnica. Una caracterlstica clave de la presente invencion es que la reaccion debe tener lugar en el medio acuoso, por lo que los reactivos solubles en agua convenientemente deben ser utilizados. Para aplicaciones in vivo tambien se prefiere que ninguno de los reactivos utilizados posea poca o ninguna toxicidad para el sujeto.

De manera apropiada, la reaccion se realiza en presencia de un iniciador de radical libre (en lo sucesivo, denominado como un iniciador), que es soluble en agua. De manera apropiada, el iniciador es sensible a la temperatura o la radiacion ultravioleta.

Los iniciadores solubles en agua apropiados incluyen:

Iniciadores anionicos:

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• iniciadores de la formula general [M]S2Os2', en donde M es un cation tal como K+, Na+ o NH4+, o un cation divalente. Persulfato de amonio, (NH4+)2S2Os2', es un ejemplo especlfico.

• un iniciador azo anionico organico de formula V:

[R90R91 (cn) C-N = N-(CN) R92R93] (V)

en donde:

R90 y R92 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo (C1-10) lineal o ramificado; o un grupo -NH- alquilo (C1-10) o-N [alquilo (C1-10)]2; y

R91 y R93 pueden ser CR94COOH (en donde R94 puede ser -CH2-, -CH2CH2- o cadena de alquileno (C1-20) lineal, o ramificada) o fenilo que esta opcionalmente sustituido (por ejemplo, por uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de halo, alquilo (C1-6), amido, amino, hidroxi, nitro, y alcoxi (C1-6)).

Un iniciador particularmente apropiado perteneciente a este grupo es acido azobiscianopentanoico (tambien conocido como 4,4'-azobis (acido 4-cianovalerico)).

Iniciadores cationicos:

• un iniciador de amina cationica de formula estructural VI:

[R80R81R82C-N = N-R83R84R85] xHCl (VI)

en donde R80, R81, R83 y R84 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo (C1-10) lineal o ramificado; un grupo -NH- alquilo (C1-10) o-N [alquilo (C1-10)]2; y en donde R82 y R85 pueden ser C (= NR86) NH2, en donde R86 se puede seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo (C1-10) lineal o ramificado.

Por ejemplo, un ejemplo especlfico es propanimidamida, 2,2'-azobis [2-metil-,dihidrocloruro]. Este iniciador tambien se conoce como V50.

Iniciadores de peroxido:

• un iniciador de peroxido se define por la formula estructural VII:

R70-O-O-R71 (VII)

en donde R70 o R71 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo (C1-10) lineal o ramificado; un grupo -NH- alquilo (C1-10) o-N [alquilo (C1-10)]2; o fenilo que esta opcionalmente sustituido (por ejemplo, por uno a tres grupos sustituyentes seleccionados de halo, alquilo (C1-6), amido, amino, hidroxi, nitro, y alcoxi (C1-6)).

Los fotoiniciadores ultravioletas solubles en agua apropiados son de la formula VIII:

R52-ph-R53 (VIII)

donde R52 es HO-(CH2)2- y R53 es -C(O)C(OH)(CH3)2 y ph representa un anillo de fenilo.

Un iniciador particular de acuerdo con esta formula se conoce como Irgacure 2959.

La reaccion de acoplamiento de los radicales libres tambien puede llevarse a cabo en presencia de un acelerador soluble en agua apropiado. Ejemplos apropiados de tales aceleradores incluyen TEMED (1,2-bis(dimetilamino)etano, N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina) y acido ascorbico (tambien conocido como acido DL-ascorbico).

Un qulmico experto sera capaz de seleccionar las condiciones experimentales apropiadas con el fin de llevar a cabo las reacciones de acoplamiento de vinilo.

La hinchazon de las partlculas de microgel puede ser iniciado por la variacion de la temperatura y/o pH. La temperatura y/o pH requerido dependera de los componentes polimericos de las partlculas de microgel. Por lo general, todas las partlculas de microgel sensibles a la temperatura se hinchan dentro de un intervalo de temperatura de 0 a 100°C, y convenientemente en el intervalo de 20 a 80°C. Para aplicaciones in vivo, donde se puede requerir la reticulacion in situ de las partlculas de microgel, se prefiere que las partlculas de microgel se hinchan a la temperatura corporal y/o el pH del tejido diana.

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La reaccion de acoplamiento del vinilo puede proceder a cualquier temperatura apropiada. Se pueden utilizar temperaturas que van de 0 a 100°C, y convenientemente de 20 a 80°C. Una vez mas, para aplicaciones in vivo donde se puede requerir la reticulacion in situ de las partlculas de microgel, se prefiere que la reaccion de reticulacion se lleve a cabo a la temperatura normal del cuerpo.

La cantidad de las partlculas de microgel requerida para la reaccion de acoplamiento de vinilo es convenientemente 1 a 60% en peso, y preferiblemente de 10 al 20% en peso, del medio de reaccion.

La concentracion de iniciadores debe estar en el intervalo de 0.01 a 10% en peso con respecto al agua. La concentracion preferida es de 0.1 a 2% en peso con respecto al agua.

Cualquier intervalo de pH apropiado puede ser utilizado para la reaccion de acoplamiento de vinilo. El intervalo de pH debe incluir el pKa para el pollmero de microgel si es una partlcula de microgel sensible al pH. Una vez mas, para aplicaciones in vivo donde se puede requerir la reticulacion in situ de las partlculas de microgel, se prefiere que la reaccion de acoplamiento de vinilo proceda a pH fisiologico. El intervalo de pH utilizado durante la union de las partlculas de microgel para las partlculas de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) es de 6.0 a 9.0, y es preferiblemente de 7.0 a 8.0.

La relacion de hinchazon (q = V/Vcoii) define el grado de hinchazon de las partlculas de microgel. V es el volumen de partlculas de microgel medido en una configuracion parcialmente hinchado o totalmente hinchado. Vcoii es el volumen de la configuracion colapsada, no hinchada de las partlculas de microgel. El valor de q durante la reaccion de acoplamiento de vinilo debe ser 1.1 - 500. Preferiblemente, el valor de q debe ser 3 - 100.

Si se utiliza la fotoiniciacion ultravioleta, entonces la intensidad de la irradiacion UV requerida es, por ejemplo, la mitad de un minuto a 2 horas de exposicion bajo una lampara de UV proporcionando una intensidad de luz en el intervalo de 0.1 a 100 mW/cm2. En una realizacion particular, la exposicion es de 3 minutos.

Reticulacion de las partlculas de microgel mediante la formacion de una red de pollmero interpenetrante

Un enfoque alternativo para unir las partlculas de microgel entre si se muestra esquematicamente en la figura 1. La primera etapa de la reaccion implica proporcionar las partlculas de microgel (sin ninguna de las unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las partlculas). La siguiente etapa consiste en llevar las superficies de las partlculas adyacentes en contacto una con la otra en presencia de un monomero de reticulacion que comprende dos o mas grupos vinilo. Esto se puede lograr haciendo que las partlculas de microgel sensibles se hinchen (por variacion de la temperatura o el pH como se ha descrito anteriormente) en presencia del monomero de reticulacion. La hidratacion y la hinchazon de las partlculas de microgel hace que las superficies de las partlculas adyacentes se pongan en contacto entre si y se superponen para formar regiones que se interpenetran del pollmero gelificado. La polimerizacion iniciada libre de radicales del monomero de reticulacion que contiene vinilo entonces se puede iniciar. El resultado es la formacion de una red de pollmero interpenetrante reticulado dentro de las partlculas de microgel hinchadas. Esta red une las partlculas de microgel entre si para formar una estructura de gel cohesiva.

Por "red de pollmero interpenetrante" se entiende que la red de pollmero se forma dentro de las partlculas de microgel hinchadas y se extiende desde una partlcula de microgel a otra. La red de pollmero se forma in situ y entre las partlculas hinchadas por la polimerizacion de los monomeros solubles en agua que se difunden en las partlculas de microgel hinchadas como hidrato.

Una ventaja de este metodo es que la adicion del monomero de reticulacion soluble en agua proporciona una herramienta util para el ajuste de las propiedades mecanicas del precursor. Por ejemplo, un agente de reticulacion de masa molar baja (por ejemplo, EGDMA) puede ser absorbido en los microgeles de interpenetrados, y por lo tanto los une juntos. La dispersion de microgel precursor en ese caso es un gel flsico.

Un agente de reticulacion de masa molar mas alta (por ejemplo, PEGDMA550) puede ser excluido de la partlcula de microgel interior y, como tal, un mecanismo de deshinchamiento osmotico puede ser responsable de parte de la hinchazon de las partlculas de microgel. En ese caso la dispersion precursora es un fluido (incluso cuando el pH ha aumentado). La reticulacion puede resultar en la formacion de una matriz de hidrogel que encapsula las partlculas de microgel. Esta red puede, en cierta medida interpenetrar las periferias de las partlculas de microgel.

Se puede observar que la masa molar del pollmero soluble en agua adicionado juega un papel importante en las propiedades flsicas del precursor dispersion de microgel y tambien las propiedades mecanicas de los microgeles DX finales.

La reaccion de polimerizacion de vinilo se puede llevar a cabo utilizando el iniciador soluble en agua como se describe anteriormente.

Un acelerador soluble en agua como se describe en este documento tambien puede estar presente.

Las condiciones de reaccion apropiadas para la reaccion de polimerizacion seran bien conocidas para los expertos en el arte y tambien se hace referencia a las condiciones generales descritas anteriormente para las reacciones de acoplamiento de vinilo.

Cualquier monomero de reticulacion soluble en agua apropiado puede ser utilizado para formar la red de pollmero 5 interpenetrante que une las partlculas de microgel entre si. Para aplicaciones in vivo, es necesario que los monomeros (y la red de pollmero resultante interpenetrantes formada) son biocompatibles. Para ser soluble en agua un agente de reticulacion puede tener convenientemente algo de solubilidad en agua, por ejemplo, que van desde 10'6 a 100% en peso con respecto a la fase de agua. En realizaciones particulares, el agente reticulante tiene una solubilidad en agua de al menos 0.1% en peso, convenientemente al menos 1% en peso, o convenientemente al menos 10% en peso.

10 De manera apropiada, el monomero de reticulacion comprendera dos o mas grupos vinilo para permitir que una red de pollmero interpenetrante altamente reticulado se forme.

En una realization, la masa molar del monomero de reticulacion es convenientemente 220 a 750 g/mol, convenientemente 350 a 600 g/mol, o mas convenientemente de 500 a 600 g/mol.

De manera apropiada, el monomero de vinilo de reticulacion tiene la siguiente formula: -

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R-2 R2-' R« R22

\ / \ /

/“X XC=CN

R21 R31

en donde:

(a) R21, R22, R23, R31, R32 y R33 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo lineal o ramificado; o un grupo N-alquilo de hasta 10 unidades de C; y

en donde (b) R24 se puede seleccionar independientemente de un grupo que consiste en: -

20 (i) -C(=O)-O-R34-O-C(=O)-, en donde R34 puede comprender -CH2-, -CH2CH2- o un grupo alquilo lineal o ramificado, tal

como una cadena de metileno, que puede tener hasta 20 cadenas de C de longitud; o -C6H4-; o C6H3R35, en donde R35 comprende sustituyentes tales alquilo, por ejemplo, CH3; un grupo halogeno; o un grupo amida; u otros grupos fenilo dio trisustituidos que contiene mas de uno de estos sustituyentes;

(ii) -C(=O)-O-R36-C(=O)-, en donde R36 puede ser -(CH2CH2O)n- en donde n puede ser de 1 a 30;

25 (iii) -C(=O)-O-R37R38R37-, en donde R37 puede comprender enlaces ester degradables, por ejemplo, lactona, - [(CH2)5C(=O)-O]m-, lactida, -[CH(CH3)C(=O)-O]m-, glicolido, -[CH2C(=O)-O]m-, en donde m puede ser de 1 a 50, y en donde R38 puede ser -(CH2CH2OV, en donde n puede ser de 1 a 30;

(iv) -C(=O)-O-R39-, en donde R39 puede comprender enlaces ester degradables, por ejemplo, lactona, [(CH2)5C(=O)- O]m, lactida, [CH(CH3)C(=O)-O]m-, glicolido, [CH2C(=O)-O]m-, en donde m es entre 1 a 100;

30 (v) alilacrilatos, por ejemplo -C(=O)-O-R40-, en donde R40 puede ser -CH2-, -CH2CH2- o una cadena de metileno lineal, o

ramificada hasta 20 cadenas de C de longitud, o -C6H4-, C6H3R41, en donde R41 puede comprender sustituyentes, tal como alquilo, CH3, un halogeno o un grupo amida u otros grupos fenilo di- o tri-sustituidos que contienen mas de uno de estos sustituyentes;

(vi) vinilbencenos, por ejemplo, C6H4 o C6H3R42, en donde R42 comprende sustituyentes, tales como alquilo; CH3; a 35 halogeno o un grupo amida (vease (iii) anteriormente); u otros grupos fenilo sustituidos que contienen mas de uno de

estos sustituyentes;

(vii) acrilamidas, por ejemplo C(=O)-NR43-R44-NR45C(=O)-, en donde R43 y R44 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo lineal o ramificado; un grupo dialquilo; un grupo N-alquilo, de hasta 10 unidades de C; y en donde R44 puede comprender -CH2-, -CH2CH2- o una cadena de

40 metileno lineal, o ramificada hasta 20 cadenas de C de longitud; o -C6H4-, C6H3R41 en donde R41 comprende sustituyentes, tales como alquilo; CH3; un halogeno o un grupo amida u otros grupos fenilo di- o tri-sustituidos que contiene mas de uno de estos sustituyentes;

(viii) monomeros de reticulacion trifuncionales, en donde R24 comprende cualquiera de los grupos enumerados en (b), as! como R21R22C=CR23, donde R21, R22 y R23 se describen en (a);

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(ix) monomeros de reticulacion tetrafuncionales, en donde R24 comprende cualquiera de los grupos enumerados en (b), as! como R21R22C=CR23 y R31R32C=CR33, en donde R21, R22, R23, R31, R32 y R33 se describen en (a); y

(x) en donde R24 puede contener cualquier combinacion de los grupos enumerados en (b).

Sin embargo, se prefiere que el monomero comprende un monomero de reticulacion funcional (preferiblemente, una funcionalidad di- o superior) adicional tal como, por ejemplo, un acrilato funcional sustituido. Por lo tanto, el monomero puede comprender metacrilato de alilo o divinilbenceno. Por lo tanto, el monomero puede comprender diacrilato de butanodiol. Sin embargo, preferiblemente, el monomero comprende dimetacrilato de etilenglicol.

El comonomero reticulante funcional puede tener otros grupos entre los grupos vinilo terminales, por ejemplo, poli (etilenglicol) dimetacrilato (PEGDMA).

El monomero de reticulacion de vinilo preferido desde el punto de vista de la reparation del disco intervertebral es PEGDMA con una masa molar en el intervalo de 200 a 1000 g/mol. Preferiblemente, la masa molar debe estar entre 220 y 750 g/mol, mas preferiblemente de 300 y 600 g/mol. El monomero de reticulacion de vinilo mas preferido es EGDMA.

Reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado combinado con la formation de una red polimerica interpenetrante

La figura 3 muestra una realization alternativa adicional de la presente invention que es una combinacion de los enfoques que se muestran en las figuras 1 y 2.

Por lo tanto, las composiciones formadas por este enfoque comprenden una pluralidad de partlculas de microgel unidas juntas por la reaction de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel y por una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes (y de ese modo une ademas las partlculas entre si), en donde la red de pollmero se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.

En una realizacion particular, las partlculas de microgel se forman a partir de poli (MMA/MAA/EGDMA) y metacrilato de glicidilo se injerta en la superficie para proporcionar los grupos vinilo funcionales. Estas partlculas de microgel "funcionalizadas" son entonces sometidas a una reaccion de acoplamiento de vinilo tal como se define en este documento en presencia de un monomero de reticulacion, tal como PEGDMA que tiene una masa molar en el intervalo de 300 a 600 g/mol.

Este metodo combina los beneficios de reticulacion directamente de las partlculas de microgel de vinilo injertado y la reticulacion de las partlculas de microgel mediante la formacion de una red polimerica interpenetrante. La red de interpenetration puede ser considerada como un refuerzo de la microgel reticulada doblemente directamente, sino que tambien proporciona un medio adicional para ajustar las propiedades mecanicas de la dispersion precursora y propiedades de microgel DX utilizando la masa molar del agente de reticulacion soluble en agua.

Propiedades de las composiciones de partlculas de microgel unidas de la invencion

Las composiciones de microgel de la presente invencion pertenecen a la clase de materiales conocidos como hidrogeles. Se diferencian de los hidrogeles convencionales porque estan compuestos de partlculas de microgel ligados o unidos.

El modulo elastico (G) de las composiciones de la invencion dependera del metodo utilizado para su preparation. Los valores de G', tal como se mide por reologla dinamica, seran por lo general mayores de 10 Pa (sin ningun llmite superior). Los valores para el modulo de perdida (G") seran menores que el modulo de elasticidad para cada composicion de la invencion debido a su clasificacion como hidrogeles.

Las caracterlsticas de hinchazon de las composiciones de la invencion pueden volver a ser definidos por la relation de hinchazon (como se define anteriormente). El valor de q sera por lo general entre 1.2 y 500. Para la aplicacion especlfica de la reparacion del disco intervertebral, se prefiere que la relacion de hinchazon sea entre 3 y 200.

Las composiciones de la invencion, al igual que las partlculas de microgel componentes, seran sensibles a la temperatura y/o al pH. Las composiciones sensibles a la temperatura seran en la configuration hinchada a temperaturas por debajo de la LCST y en la configuracion colapsada a temperaturas por encima de la LCST. El valor de q para tales composiciones estara por lo general entre 1.2 y 200. Los modulos elasticos tendran los mismos valores mlnimos especificados anteriormente.

Para las composiciones sensibles al pH de la invencion que comprende partlculas de microgel compuestas de monomeros acidos, las partlculas estaran en una configuracion hinchada en valores de pH mayores que el pKa de los monomeros acidos, y en la configuracion colapsada a valores de pH menores que el valor de pKa de los monomeros

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acidos. Los valores de pKa pueden estar en el intervalo de 1 a 13. El intervalo preferido para la aplicacion de disco intervertebral es de 5.0 a 8.0.

Para las composiciones sensibles al pH de la invencion que comprende partlculas de microgel compuestos de comonomeros basicos, las partlculas estaran en la configuracion hinchada a valores de pH menores que el pKa del acido conjugado de los monomeros basicos y en la configuracion colapsada en valores de pH superiores a este valor de pKa. Los valores de pKa pueden estar en el intervalo de 1 a 13.

Las composiciones de microgel de la presente invencion tienen convenientemente significativos valores crlticos de tension (g*). El valor crltico de deformacion es el valor de la tension, medido por un reometro, a la que el modulo elastico (G') alcanza primero un valor de 95% del que se mide cuando g = 1.0%. El intervalo preferido para g* para las composiciones de la invencion es de 2 a 500%, mas preferido es de 5 a 300%, e incluso mas preferido es de 5 a 200%.

Aplicaciones

Las composiciones (incluyendo composiciones de precursor) de la presente invencion se pueden utilizar para una variedad de diferentes aplicaciones, incluidas las aplicaciones en la administracion de farmacos, fotonica, catalisis, almacenamiento de informacion, o se pueden utilizar como materiales absorbentes.

Se preve que las composiciones (o composiciones de precursor) de la presente invencion seran particularmente apropiadas para aplicaciones medicas. Se preve particularmente que las composiciones de la presente invencion se pueden utilizar para reparar tejido blando danado o degenerado en un sujeto.

Por lo tanto, la presente invencion proporciona una composition (o composition de precursor) tal como se define en este documento para su uso en el tratamiento de tejido danado o degenerado, especialmente tejidos de soporte de carga danados o degenerados.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un metodo de tratamiento de tejido danado o degenerado, especialmente tejidos de soporte de carga danados o degenerados, en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, comprendiendo el metodo administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composicion (o la composicion de precursor) como se define en este documento.

De manera apropiada, una composicion de la invencion se forma in situ dentro del cuerpo (por ejemplo, de una composicion de precursor). Por lo tanto, las partlculas de microgel se administran junto con cualesquiera otros materiales necesarios para unir las partlculas de microgel entre si (por ejemplo, los reactivos necesarios para las reacciones de acoplamiento de vinilo) y de este modo formar una composicion de la presente invencion in situ en el cuerpo. Por "junto con" queremos decir que uno o mas de los reactivos son ya sea coadministrados con las partlculas de microgel, administradas antes de que las partlculas de microgel o administrados despues de las partlculas de microgel.

Por lo tanto, en una realization, las partlculas de microgel que tienen unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre sus superficies se administran junto con un iniciador soluble en agua y, opcionalmente, un acelerador de soluble en agua.

En otra realizacion, las partlculas de microgel (sin unidades estructurales que contienen vinilo injertadas en la superficie) se administran junto con el monomero de reticulation (que forma una red de pollmero interpenetrante despues de la polimerizacion) y un iniciador soluble en agua y, opcionalmente, un acelerador soluble en agua.

En una realizacion adicional, las partlculas de microgel que tienen unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre sus superficies se administran junto con un monomero de reticulacion de vinilo (que forma una red de pollmero interpenetrante) y un iniciador soluble en agua y, opcionalmente, un acelerador de soluble en agua.

Los componentes adicionales, tales como un vehlculo apropiado, agentes reguladores, acidos, bases, u otros excipientes farmaceuticamente aceptables tambien se pueden administrar junto con las partlculas de microgel y cualesquiera otros reactivos.

En una realizacion, las partlculas de microgel se administran en la configuracion colapsada o sustancialmente plegada, que hace la composicion de partlculas mas fluidas y por lo tanto mas faciles de administrar, por ejemplo, por inyeccion. Cuando las partlculas de microgel en la configuracion colapsada llegan al sitio previsto, las partlculas se hinchan preferiblemente como consecuencia de un cambio en el pH y/o temperatura, y la reaction de acoplamiento de vinilo luego pueden ser iniciados para formar una composicion de la presente invencion en la que las partlculas de microgel estan unidas entre si.

En una realizacion particular, las partlculas de microgel son sensibles al pH y estan adaptados para estar en una configuracion hinchada o sustancialmente hinchada en el pH fisiologico del tejido diana. A continuation, el pH de la composicion administrada se puede manipular de manera que las partlculas estan en una configuracion colapsada en el

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momento de la administracion, pero a continuacion, se hincha dentro del tejido diana. La velocidad de hinchazon se puede aumentar mediante la administracion de una solucion de acido, base o solucion reguladora fisiologicamente aceptable, ya sea con o despues de la administracion de las partlculas de microgel.

Por ejemplo, si las partlculas de microgel se administran a un IVD en un sujeto, se sabe que el pH medio del IVD es de aproximadamente 7.5. Las partlculas de microgel que se encuentran en una configuracion hinchada o sustancialmente hinchada a un pH entre 6.5 y 8, mas preferiblemente entre 6.6 y 7.5, serlan particularmente apropiadas para la administracion a un IVD. El pH de la composicion de partlculas de microgel administradas al sujeto podrla entonces ser manipulado de modo que las partlculas de microgel se encuentran en la configuracion colapsada o colapsada sustancialmente en el punto de administracion. En una realizacion, las partlculas de microgel se mantienen a un pH de menos de 6.6, de manera que despues de la administracion en el IVD, las partlculas se hincharan y causaran la gelificacion de la composicion. En dicha realizacion, las partlculas pueden ser mantenidas en la configuracion colapsada a un pH entre aproximadamente 5.0 a 6.6, mas preferiblemente entre aproximadamente 5.5 a 6.6, y aun mas preferiblemente entre aproximadamente 6.0 a 6.6 antes de la administracion. A estos valores de pH, el diametro de las partlculas de microgel es convenientemente entre aproximadamente 50-200 nm, y mas preferiblemente, aproximadamente 80 a 150 nm (como se mide por Microscopla Electronica de Barrido). De acuerdo con lo anterior, el aumento de pH de menos de 6.6 a aproximadamente 7.5 in vivo hace que el agua entre en las partlculas de tal manera que se hinchen. Cuando se administra a un IVD danado o degenerado, la hinchazon y la reticulacion in situ de las partlculas de microgel proporciona una composicion de la invencion que proporciona soporte de carga adicional al IVD.

En una realizacion alternativa, las partlculas de microgel se administran en una configuracion hinchada o sustancialmente hinchada. De manera apropiada, las partlculas de microgel se producen a hincharse justo antes de la administracion. Una ventaja de este enfoque es que las partlculas de microgel llegan al tejido diana en forma hinchada que es apropiado para la rapida reticulacion para formar una composicion de la invencion. Por ejemplo, las partlculas de microgel sensibles al pH se pueden administrar en una configuracion hinchada o sustancialmente hinchada a un pH de, por ejemplo, 7.5 a 7.8.

En una realizacion particular, las partlculas de microgel se administran en la configuracion colapsada o sustancialmente colapsada, y se dejaron hinchar in situ. Se anaden los reactivos de reticulacion (el iniciador y, opcionalmente un acelerador y un monomero de reticulacion (si una red de pollmero interpenetrante se va a formar)) una vez que las partlculas de microgel son suficientemente hinchadas para que la reticulacion ocurra.

En una realizacion preferida, las partlculas de microgel se administran en la configuracion hinchada o sustancialmente hinchada y los reactivos de reticulacion (el iniciador y, opcionalmente un acelerador y un monomero de reticulacion (si una red de pollmero interpenetrante se va a formar)) son coadministrados o administrados inmediatamente despues de la administracion de las partlculas de microgel.

Se puede preferir ponerse en contacto con la composicion que comprende la partlcula de microgel con un acido, base (por ejemplo, NaOH o KOH) o solucion reguladora fisiologicamente aceptables para facilitar un cambio en el pH y acelerando de este modo la gelificacion in vivo. Se apreciara que un acido, base o solucion reguladora fisiologicamente aceptable se pueden administrar al tejido diana, ya sea antes o despues de la composicion que comprende la partlcula de microgel se ha administrado. Alternativamente, un procedimiento de coadministracion se puede utilizar donde tanto la composicion que comprende las partlculas de microgel, como una solucion reguladora fisiologicamente aceptable se administran sustancialmente al mismo tiempo. Esto se puede conseguir por ejemplo a traves de una aguja de la jeringa especialmente construida.

De manera apropiada, la reaccion de reticulacion con vinilo se produce rapidamente despues de la administracion (antes de que el iniciador y opcionalmente el acelerador se difunda lejos del sitio de administracion). Por tanto, se prefiere que el iniciador y, opcionalmente, acelerador son ya sea coadministrados con las partlculas de microgel o administradas inmediatamente despues de las partlculas de microgel. Cualquier monomero de reticulacion que reacciona para formar una red de pollmero interpenetrante para unir las partlculas entre si puede ser coadministrado con las partlculas de microgel o administrarse antes de o despues de la administracion de las partlculas de microgel.

Como resultado de la formacion in situ de la composicion de la invencion dentro de un sujeto, es preferiblemente, un aumento de la altura del disco y tambien modulo de Young del IVD como las formas de composicion y la resistencia mecanica se restaura eficazmente. Ventajosamente, esto proporciona un metodo mlnimamente invasivo que puede llenar el interior de cualquiera hendidura de forma irregular en el IVD. Es probable que tenga un tiempo de recuperacion muy reducido, Por lo tanto, este metodo mlnimamente invasivo no implica ninguna intervencion de cirugla mayor, lo que significa por lo tanto que el sujeto esta siendo tratado.

Otra ventaja del metodo es que no requiere la eliminacion de cualquier tejido sano. Esto es en contraste directo con las tecnologlas de reemplazo de nucleo que implican microdiscectomla y extraccion de tejido del nucleo pulposo.

En otra realizacion, la composicion administrada para formar la composicion de la invencion puede comprender al menos una celda de nucleo pulposo y/o al menos una celula madre y/o al menos una celula de mamlfero.

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Los ejemplos de celulas de mamlfero apropiadas, que se pueden anadir a la composicion incluyen los condrocitos (por ejemplo, autologo o autogeno). Ejemplos de celulas madre apropiadas, que pueden anadirse a la composicion incluyen mesenquimales, hematopoyeticas etc., incluyendo celulas madre embrionarias y clonadas. Ademas, la composicion administrada puede comprender ademas colageno y/o proteoglicanos. Se espera que la adicion de celulas de nucleo pulposo de la composicion aumentara la velocidad de recuperacion del sujeto. Por lo tanto, una ventaja adicional del metodo de acuerdo con la invencion es que permite la mezcla de celulas vivas (por ejemplo, celulas NP o celulas madre) con la composicion que comprende la dispersion de partlculas de microgel con el fin de facilitar el recrecimiento de tejido NP. Asl, el metodo de acuerdo con la invencion es susceptible de la combination de soporte mecanico con un sistema de reparation biologica.

Los ejemplos de tejidos blandos apropiados que se pueden tratar incluyen piel, musculo, ligamento o tejido adiposo. Tal tejido blando danado o degenerado puede comprender una herida, la cual puede ser aguda o cronica. Sin embargo, se prefiere que el tejido blando que se esta tratando comprende tejido de soporte de carga danado o degenerado tal como, por ejemplo, discos intervertebrales y los tejidos encontrados en las articulaciones articulares (tales como el codo, rodilla, cadera, muneca, hombro y tobillo). Ademas, las composiciones de la invencion se pueden usar para tratar articulaciones que soportan baja carga, como, por ejemplo, las articulaciones presentes en un dedo o un pulgar.

Es mas preferido que las composiciones de la presente invencion se utilizan para tratar discos intervertebrales o vertebrales (DIV) danados o degenerados. Preferiblemente, el metodo del segundo aspecto comprende administrar la composicion directamente en el IVD, y preferiblemente en el nucleo pulposo (NP) de los mismos. Por lo tanto, ventajosamente, no hay cirugla se requiere utilizando este enfoque. Mas preferiblemente, la composicion se puede administrar directamente en las hendiduras dentro de la NP, que se forman cuando el contenido de proteoglicanos en el IVD disminuye con la edad. Ademas, se prefiere que los componentes necesarios para formar la composicion de la invencion se administren por inyeccion en el tejido diana.

Condiciones de la enfermedad, que se pueden tratar con el medicamento del primer aspecto o el metodo de acuerdo con el segundo aspecto incluyen artritis, degeneration del disco intervertebral, dolor de espalda, dolor lumbar bajo, ciatica, cervical, espondilosis, dolor de cuello, cifosis, escoliosis, enfermedad degenerativa de las articulaciones, osteoartritis, espondilolisis, espondilolistesis, prolapso del disco intervertebral, cirugla de la columna fallada, y la inestabilidad de la columna. La condition de la enfermedad puede ser cronica o aguda, por ejemplo, dolor de espalda cronico o agudo.

En una realization particular, la composicion de la invencion se utiliza para el tratamiento de condiciones osteoartrlticas en las articulaciones como una alternativa a la sustitucion del cartllago. En tales realizaciones, la composicion de la invencion esta formada por in situ dentro de la articulation mediante la inyeccion de los componentes necesarios para formar la composicion de la invencion en la capsula de la articulacion de una articulacion osteoartrltica. A continuation, la composicion de la invencion proporcionarla un medio de mantener los extremos del hueso aparte.

La presion de hinchazon de los geles de la presente invencion se puede ajustar utilizando el pH y/o la temperatura con el fin de aumentar el modulo de Young eficaz de los tejidos blandos de carga de microgel. Ademas, los inventores creen que deberla ser posible ajustar el pKa de estos microgeles variando la composicion qulmica de las partlculas, lo que permitira el ajuste fino de las propiedades de soporte de carga de estos materiales en el pH del tejido de soporte de carga danado.

Se apreciara que la composicion de acuerdo con la presente invencion se puede utilizar en una monoterapia (esto es, uso de la composicion de acuerdo con la invencion solos para prevenir y/o tratar enfermedades caracterizadas por el tejido blando danado o degenerado, y preferiblemente, tejidos de soporte de carga). Alternativamente, la partlcula de microgel de acuerdo con la invencion puede ser utilizada como un complemento, o en combinacion con otras terapias conocidas.

Las composiciones que comprenden la partlcula de microgel de acuerdo con la invencion se pueden utilizar en un numero de maneras. Preferiblemente, la composicion se puede administrar mediante inyeccion.

La terapia se puede administrar como una sola administration (por ejemplo, una sola inyeccion). Alternativamente, la composicion utilizada puede requerir la administracion repetida a intervalos predeterminados.

La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de una partlcula de microgel junto con reactivos para formar la composicion de la invencion in situ en el cuerpo. Una "cantidad terapeuticamente eficaz" es cualquier cantidad de una partlcula de microgel de acuerdo con la invencion que, cuando se administra a un sujeto forma una composicion de la invencion que previene y/o trata una enfermedad caracterizada por tejido blando danado o degenerado.

En un aspecto adicional, la presente invencion proporciona un kit de partes que comprende partlculas de microgel como se define en este documento (opcionalmente en presencia de un medio de vehlculo/dispersion apropiado) y uno o mas reactivos de reticulation como se define en este documento. Los reactivos apropiados comprenden un iniciador como se define anteriormente, y pueden comprender ademas un acelerador y/o un monomero de reticulacion como se ha

definido anteriormente. De manera apropiada, el kit comprende ademas instrucciones que explican como administrar el contenido de la formacion de gel in situ.

En toda la descripcion y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, las palabras "comprenden" y "contienen" y variaciones de ellos significan "incluyendo, pero no limitado a", y no se pretende que (y no lo hacen) excluyen otras 5 unidades estructurales, aditivos, componentes, numeros enteros o etapas. A lo largo de la descripcion y las reivindicaciones de esta memoria descriptiva, el singular abarca el plural a menos que el contexto requiera lo contrario. En particular, donde se utiliza el artlculo indefinido, la memoria descriptiva se debe entender que contempla la pluralidad, as! como la singularidad, a menos que el contexto requiera lo contrario.

EJEMPLOS

10 La invencion se describira ahora con mas detalle en relacion a los siguientes ejemplos ilustrativos.

Mediciones flsicas

A menos que se indique lo contrario, se utilizo la siguiente metodologla para obtener mediciones flsicas.

Las mediciones de titulacion se llevaron a cabo utilizando una unidad de valoracion de Mettler en presencia de un electrolito de soporte (NaCl 0.1 M). Las mediciones de espectroscopia de correlation de fotones se realizaron utilizando 15 dispersiones que contienen ^p = 3 x 10-4 de microgel. Las mediciones se llevaron a cabo utilizando un aparato de dispersion de luz BI-9000 de Brookhaven (Brookhaven Instrument Cooperation), equipado con una 20 mW HeNe y el detector se fijo en angulo de dispersion 90°. La extension de la hinchazon de la partlcula se caracteriza en terminos de la relacion de hinchazon estimada, Q. Esto se da por la siguiente ecuacion.

imagen2

20 Para la ecuacion (1) d y dcoii son los diametros de las mediciones utilizando espectroscopia de correlacion de fotones (PCS) a un pH dado y el tamano de partlcula colapsada, respectivamente. En este trabajo los valores de dcoii fueron los obtenidos a pH = 4 a menos que se indique lo contrario. Las mediciones SEM se obtuvieron utilizando un instrumento de FEGSEM Philips. Las muestras se secaron a temperatura ambiente o mediante liofilizacion. Al menos 100 partlculas fueron contadas para las estimaciones del tamano de partlcula. Las mediciones de reologla dinamica se realizaron 25 utilizando un reometro con control de temperatura AR G2 instrumento TA con una camara ambiental. Se utilizo una geometrla de placa de diametro de 20 mm con una trampa de solvente. La brecha fue de 1000 nm.

Los experimentos de hinchazon para los microgeles DX (reticulados) de la presente invencion se llevaron a cabo mediante la colocation de muestras en solution reguladora y a continuation, permitiendo que la muestra se equilibre con agitation suave durante un perlodo de 8 dlas. La solucion reguladora se cambio con regularidad. Periodicamente, 30 se extrajo la muestra, le dio unas palmaditas con una toalla de papel seca, se peso y luego regreso inmediatamente a la solucion reguladora. Las soluciones reguladoras utilizadas fueron fosfato o ftalato de base, tenia una fuerza ionica de aproximadamente 0.1 M, y se prepararon como se describe en otro lugar (J. Brandrup, E. H. Immergut, E. A. Grulke, A. Abe, and D. R. Bloch (1999) CRC Polimer Handbook, 4 ed., John Wiley & Sons). La relacion de hinchazon de volumen para los microgeles de DX (QDX) se determino gravimetricamente y se calcula utilizando:

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Para la ecuacion (2) Qox(m) es la relacion de la masa de gel hinchado a la masa seca. ps y pp son las densidades del solvente y polimero, respectivamente. Estos se tomaron como 1.2 y 1.0 gcm-3.

Metodo 1 - Preparation de particulas de microgel de poli (MMA/MAA/EGDMA) (utilizadas para formar las composiciones de la invencion)

40 El poli (MMA/MAA/EGDMA) se preparo utilizando polimerizacion en emulsion. Un bano de agua se calento a 80°C. 1.8 g de dodecilsulfato de sodio (SDS) se disolvio en 517.5 g de agua desionizada (DI). Despues, la solucion se filtro en un matraz de cuatro cuellos y se purgo con nitrogeno durante 30 minutos. La mezcla de monomeros se preparo con la siguiente composition: mMa (189.76 g), MAA (94.87 g) y EGDMA (2.882 g). Esto incluye 15% de exceso con el fin de dar cuenta de la perdida durante la etapa de alimentation. Despues de la disolucion de SDS, se adicionaron 31.5 g de

mezcla de monomeros (semilla), mientras se agita, al recipiente seguido inmediatamente por la adicion de respectivamente solucion de K2PO4 (0.2264 g en 2.93 g de agua DI) y solucion de persulfato de amonio (APS) (0.2 g en 3.39 g de agua DI). La mezcla se dejo en agitacion durante otros 30 minutos y la temperatura se elevo a 88°C. La mezcla de monomeros restantes se adiciono durante 90 min a una velocidad de aproximadamente 2.5 ml/min. Despues 5 de que la alimentacion se completo, una solucion de APS se adiciono (0.0874g en 3 g de agua DI). La dispersion se dejo agitar al menos durante 2 horas hasta que no pudieron detectarse monomeros y despues se enfriaron con agua y mezcla de hielo mientras se agitaba. El producto enfriado (una dispersion lechosa) se filtro. Este microgel contenla una concentracion nominal de 66% en peso de MMA, 33% en peso de MAA y 1% en peso de EGDMA.

Metodo 1A - Preparacion de poli (MMA/MAA/EGDMA) partlculas de microgel (utilizado para formar composiciones de la 10 invencion)

El poli (MMA/MAA/EGDMA) tambien se preparo utilizando el siguiente metodo. 1.8 g de SDS en 517.5 g de agua DI se adicionaron a un matraz de fondo redondo de cuatro bocas, equipado con un agitador mecanico y condensador de reflujo. El contenido se purgo con nitrogeno durante 30 minutos a 80°C. Para formar la semilla, se adicionaron al recipiente 31.5 g de una solucion de MMA (66% en peso), MAA (33% en peso) y EGD (1% en peso) seguido 15 inmediatamente por la adicion de, respectivamente, K2HPO4 (3.15 g de solucion al 7 % en peso) y persulfato de amonio (APS, 3.5 g de solucion al 5 % en peso). La semilla se dejo en agitacion durante otros 30 minutos y la temperatura se elevo a 85°C. Los 218.5 g restantes de la mezcla de monomero (con las mismas proporciones que anteriormente) se adiciono uniformemente a lo largo de 90 minutos con una velocidad de aproximadamente 2.43 g/min. Despues de la adicion se adiciono otra porcion de APS (3.1 g de una solucion de 3% en peso) y la reaccion se continuo durante otras 2 20 horas. El producto se enfrio en agua frla con agitacion. Despues de la filtracion, los microgeles se dializaron en agua DI durante 14 dlas (el agua DI se cambio dos veces al dla).

Metodo 2 - Preparacion de partlculas de microgel poli (EA/MAA/BDDA) (utilizadas para formar composiciones de la invencion)

El microgel poli (EA/MAA/BDDA) se preparo utilizando el metodo de polimerizacion en emulsion de alimentacion de 25 semilla (alimentacion privada de). Se preparo una mezcla de monomeros que contiene EA (Aldrich, 99%, 143.5 g), MAA (Aldrich, 99%, 72.0 g) y BDDA (Aldrich, 98%, 2.2 g) y 12.5% de la mezcla se adiciona a un pre-purgado, se agito, la solucion de dodecilsulfato de sodio (BDH, 1.75 g en 500 g de agua), que se habla calentado a 80°C. Los monomeros se hicieron pasar por una columna de alumina antes de su uso para eliminar el inhibidor. Se adicionaron inmediatamente K2HPO4 (3 g de solucion de 7% en agua) y 2.95 g de una solucion de persulfato de amonio al 5% en agua mientras se 30 mantiene una atmosfera de nitrogeno. Despues de la aparicion de una ligera turbidez azul, se adiciono la mezcla de monomeros restantes a una velocidad continua durante un perlodo de 90 min. Se adiciono persulfato de amonio adicional (3.3 g de solucion al 5% en agua) y la temperatura se mantuvo a 80°C, durante otras 2 h. El microgel se dializo extensamente frente a agua de calidad Milli-Q.

Metodo 2A - Preparacion de partlculas de microgel poli (EA/MAA/BDDA) (utilizadas para formar composiciones de la 35 invencion)

El microgel poli (MMA/MAA/BDDA) tambien se preparo utilizando un metodo similar al Metodo 1A. Sin embargo, MMA y EGD fueron reemplazados por EA y BDD, respectivamente, al mismo % mol.

Metodo 3 - Funcionalizacion GMA de microgel poli(MMA/MAA/EGDMA) (utilizado para formar composiciones de la invencion)

40 Antes de la funcionalizacion de metacrilato de glicidilo (GMA, purum, >97.0% (GC)), microgel poli(MMA/MAA/EGDMA) [Metodo 1] se purifico extensivamente por dialisis con el cambio de agua desionizada dos veces al dla durante al menos dos semanas. Las dispersiones de microgel purificadas se mezclaron con GMA. Esto se hizo a una concentracion de 5 veces de GMA a la concentracion de carboxilato presente en el microgel. Las mezclas se diluyeron con agua DI a la concentracion de microgel 14.87% en peso, y el valor de pH se ajusto a 3.5 mediante la adicion de solucion acuosa de 45 HCl. El sistema se hizo reaccionar a 50°C en un bano de agua de agitacion durante 8 h. La mezcla de reaccion se lavo con acetato de etilo 4 veces para eliminar la mayor parte de GMA sin reaccionar, y se dializo adicionalmente 3 dlas para eliminar cualquier GMA sin reaccionar por completo.

Metodo 3A - Funcionalizacion GMA de microgel poli(MMA/MAA/EGDMA) y poli(EA/MAA/BDDA) (utilizado para formar composiciones de la invencion)

50 GM-M-EGD y GM-E-BDD se refieren a los microgeles M-EGD y E-BDD GM funcionalizados, respectivamente. El metodo utilizado para la funcionalizacion de M-EGD se describe brevemente en lo siguiente. El pH de una dispersion M- EGD con una fraccion de volumen de pollmero (□ p) de 0.15 que contiene 1.73 M de GM se ajusto a 3.5, y despues se calento a 50°C con agitacion mecanica durante 8 h. La dispersion se lavo cuatro veces con acetato de etilo y se dializo extensamente para obtener el GM-M-EGD purificado. Un procedimiento similar se utilizo para preparar partlculas de 55 GM-E-BDD. Sin embargo, en ese caso, el pH fue 5.1 durante la funcionalizacion y las partlculas se lavaron con

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cloroformo antes de la dialisis. Un pH de 5.1 tambien se utilizo para la preparacion de un microgel GM-M-EGD funcionalizado mas altamente, que se abrevia en este documento como GM(H)-M-EGD.

Metodo 3B - funcionalizacion AEMHCL de microgel poli(MMA/MAA/EGDMA) y poli(EA/MAA/BDDA) (utilizado para formar composiciones de la invencion)

Una preparacion tlpica se describe como sigue para la preparacion de funcionalizado AEM M-EGD con una relacion [AEM]/[MAA] de 0.40, esto es, AEM40-M-EGD. La relacion de concentracion de MAA:EDC:NHS:AEM fue de 1:0.5:0.4:0.4. EDC y NHS son N- (3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida clorhidrato y N-hidroxisuccinimida, respectivamente. Se colocaron 10.25 g de 29% en peso de M-EGD en un matraz de 100 ml de fondo redondo con un agitador magnetico y se diluye por 30 ml de solucion reguladora de pH = 6.6 (0.1 M). A continuacion, se disolvieron 0.53 g de NHS en 5 ml de solucion reguladora, se disolvieron 0.88 g de EDC en 5.25 ml de HCl 1 M. Se adicionaron entonces la solucion que contiene NHS y EDC a la dispersion de microgel y se dejo agitar durante 20 min. A continuacion, se disolvieron 0.76 g de clorhidrato de metacrilato de aminoetilo (AEMHCl) en 5 ml de solucion reguladora y se adicionaron. El pH final se ajusto a 6.5 por la adicion adicional de amortiguacion. La reaccion se dejo proceder durante 1 dla a RT. El producto se purifico por centrifugacion repetida y redispersion en agua de calidad Milli-Q. El estado parcialmente agregado de los microgeles facilito la centrifugacion utilizando una centrlfuga de alta velocidad convencional.

Microgeles funcionalizados de AEM-E-BDD se prepararon sustancialmente de la misma manera, excepto que el pH se ajusto a aproximadamente 7.0.

Metodo 4 -. Calculo del % en moles de GMA injertado en partlculas de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) en el Metodo 3

Estos datos se obtuvieron mediante la valoracion de los grupos acido carboxllico libres sobre las partlculas de microgel y calculo del % mol de esos grupos reaccionados. La comparacion con la composicion del microgel (Microgel 2B) permitio el calculo del % mol de GMA incorporado. Los resultados se muestran en la Tabla 1 a continuacion (ver Metodo 6).

Metodo 4A -. Calculo del % en moles de GMA injertado en las partlculas de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) y poli (EA/MAA/BDDA) en el Metodo 3A

Como en el Metodo 4 anteriormente, estos datos se obtuvieron mediante titulacion potenciometrica. El % en moles de GMA se determino a partir de la diferencia en el % mol de MAA mol en el microgel antes y despues de la funcionalizacion. Los resultados se muestran a continuacion en la Tabla A.

Tabla A

Codigo: % Mol. de MAAa % Mol. De GMAa

M-EGD: 35.9 -

E-BDD: 37.2 -

GM-M-EGD: 34.1 1.8

GM(H)-M-EGD: 35.9 5.8

GM-E-BDD: 26.5 7.8

a Determinado a partir de los datos de titulacion potenciometrica. El % mol de GMA se determino a partir de la diferencia en el % mol de MAN en el microgel antes y despues de funcionalizacion.

Metodo 4B -. Calculo del % en moles de AEMHCl injertado en las partlculas de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) y poli (EA/MAA/BDDA) en Metodo 3B

De acuerdo con el metodo 4, estos datos se obtuvieron mediante titulacion potenciometrica. El % mol de AEMHCL se determino a partir de la diferencia en el % mol de MAA en el microgel antes y despues de la funcionalizacion. Los resultados se muestran a continuacion, en la Tabla B.

Tabla B

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Codigo: [AEM]/ [MAA]a % Mol. de MAA (exp)b % Mol. AEM (exp)c

M-EGD: - 42.5 -

AEM5-M-EGD9: 0.05 38.7 3.0

AEM10-M-EGD: 0.10 38.5 4.1

AEM20-M-EGD9: 0.20 34.3 7.4

AEM30-M-EGD: 0.30 31.1 11.4

AEM40-M-EGD: 0.40 35.1 7.4

AEM50-M-EGD: 0.50 31.5 11.0

E-BDD: - 37.2 -

AEM20-E-BDD: 0.20

a Relacion de concentration de AEMHCl y MAA utilizada para preparar los microgeles funcionalizados. b % Mol. de MAA encontrado en los microgeles por titulacion. c Contenidos de AEM determinados a partir de los datos de titulacion del pH para los microgeles utilizando la diferencia entre los contenidos de MAA en el microgel original y el respectivo microgel funcionalizado de AEM.

Se utilizo la titulacion potenciometrica para determinar el contenido de MAA y de los valores efectivos de pKa para todos los microgeles estudiados. Vease la Tabla B anterior. Estos datos tambien permitieron el calculo de la % mol de AEM dentro de los microgeles funcionalizados.

La figura 5B-1 muestra la variacion de Mol. De AEM dentro de los microgeles AEM-M-EGD con [AEM]/[MAA]. La llnea discontinua representa los valores teoricos para una eficiencia del 100% de funcionalizacion.

Se puede observar de la Fig. 5B-1 que muy buena concordancia entre la teorla y la experimentacion se observo hasta que [AEM]/[MAA] supero 0.30. En niveles mas altos [AEM]/[MAA] se produjo una incorporacion mucho mas baja de la esperada y los valores se hicieron mas variables. De modo interesante, el % mol. maximo de AEM incorporado no excedio el valor determinado al final de la region lineal (11.4 % mol).

Se obtuvieron los datos de FTIR para los microgeles funcionalizados (Fig. 5B-2).

La figura 5B-2 muestra los espectros FTIR seleccionados para microgeles AEM-M-EGD. La leyenda muestra las relaciones [AEM]/[MAA] utilizadas. Los espectros se registraron en pellculas secas y bandas seleccionadas estan etiquetadas.

Muestran evidencia de incorporacion de grupo vinilo de una banda a 1020 cm'1, que esta presente para los microgeles funcionalizados de AEM, pero ausentes en el espectro de M-EGD. Las bandas17 de amida I (1647 cm-1) y amida II (1560 cm-1) tambien fueron evidentes en funcionalizacion. Los espectros apoyan nuestra interpretacion de que se produjo con exito la funcionalizacion de vinilo.

Los valores de pKa para los microgeles se calcularon en cada punto de neutralizacion de los datos de la valoracion utilizando:

pKa = pH- log

donde a es el grado de neutralizacion. Se han establecido que a medida que aumenta el contenido de MAA en partlculas de latex disminuye el pKa. Esto se ha atribuido (Pinprayoon, O.; Groves, R.; Saunders, B. R. J. Coll. Interf. Sci. 2008, 321, 315) a una disminucion de las interacciones hidrofobicas que se oponen a las partlculas de hinchazon como resultado de la ionizacion.

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La figura 5B-3 muestra la variacion de pKa con la neutralizacion de microgeles AEM-M-EGD. Las leyendas dan las relaciones [AEM]/[MAA] utilizadas para su preparation. Los datos muestran un aumento pronunciado en los valores de pKa para a <20% con el aumento de [AEM]/[MAA]. Esta es una fuerte indication de que funcionalizacion procede del exterior hacia el interior del microgel. Los grupos de AEM son relativamente hidrofobos en comparacion con MAA y esto conduce a un aumento de la pKa local. Estos datos proporcionan evidencia de una funcionalizacion AEM localmente alta en la periferia de microgel. Esto es consistente con las partlculas que son parcialmente hinchadas en las etapas iniciales del proceso de funcionalizacion. Es probable que las periferias de las partlculas se cierren a medida que avanza la funcionalizacion debido a un aumento de la hidrofobicidad y la perdida de carga en esa region. Esto serla cortar el suministro de AEM a las regiones interiores de los microgeles.

Metodo 5 - Mediciones del tamano de partlcula dependientes del pH para microgeles de los metodos 1 y 2

Las mediciones se realizaron con espectroscopla de correlation de fotones utilizando una concentration de partlculas en el intervalo de 0.001 a 0.1 % en peso de soluciones reguladoras patron, se utilizaron para estos experimentos. Estas mediciones se realizaron con un aparato de dispersion de luz Brookhaven BI-9000 equipado con un laser de 20 mW HeNe. El detector se fijo en un angulo de 90° de dispersion.

Los resultados se muestran en la figura 4 [Microgel 1 (rombos abiertos), 2A (triangulos abiertos), 2B (cuadrados abiertos), 2BG (cuadrados cerrados)].

Metodo 5A - Mediciones del tamano de partlcula dependientes del pH para microgeles a partir de los Metodos 1A, 2A y 3A

Las mediciones se realizaron con espectroscopla de correlacion de fotones utilizando dispersiones que contienen ^p = 3 x 10-4 microgel. Las soluciones reguladoras patron se utilizaron para estos experimentos. Estas mediciones se realizaron con un aparato de dispersion de luz Brookhaven BI-9000 equipado con un laser de 20 mW HeNe. El detector se fijo en un angulo de 90° de dispersion.

La figura 4A muestra la dependencia del pH del diametro hidrodinamico (dh) y valores de Q para los microgeles: a) y b) [M-EGD (rombos solidos), GM-M-ECD (cuadrados abiertos)]; c) y d) [E-BDD (rombos solidos), GM-E-BDD (cuadrados abiertos)], donde GM-prefijo se refiere a un microgel GMA funcionalizado.

Los datos seleccionados se muestran tambien en la Tabla 1. Los datos muestran hinchazon activado por el pH a un pH de aproximadamente 6.4. La hinchazon completa se habla producido por el pH de aproximadamente 7.4. Este ultimo corresponde al pKa del microgel. Se debe observar que no hay perfecta concordancia entre los valores de pKa y los datos de hinchazon de partlcula (Fig. 4A). El pKa para los geles polielectrolitos es fuertemente afectado por una serie de factores, que incluye pollmero y concentracion de electrolito18. Por lo tanto, las diferencias entre los valores de pKa y el intervalo de pH de fuerte hinchazon (Fig. 4A) se puede atribuir a las diferencias en la concentracion de electrolito y la concentracion de pollmero dentro de las partlculas de microgel para cada tecnica.

De modo interesante, se puede ver en la figura 4A que los microgeles GM-M-EGD se hinchan mucho mas que las partlculas de M-EGD. Esto se sospecha que es debido al procedimiento de lavado de acetato de etilo, que se utilizo para eliminar GMA residual de los microgeles. Para probar esta idea microgel no funcionalizado se lavo con acetato de etilo. El tamano de partlcula de M-EGD aumento de a 285 nm a pH = 8 despues de lavado de acetato de etilo (cf. 232 nm en la Tabla 1). Esta es una nueva observation de microgeles basados en MMA sensibles al pH e indica fuertemente que la asociacion hidrofoba reversible restringe la hinchazon de estos microgeles. El proceso de lavado debe eliminar reticulaciones flsicas, es de suponer que participan grupos de MMA. La presencia de enlaces cruzados hidrofobicos podrla ser ayudado por la baja movilidad de las cadenas de PMMA debido a su alto Tg. El acetato de etilo puede actuar como un plastificante para las partlculas de M-EGD. En contraste la hinchazon dependiente del pH para los microgeles EBDD y GM-E-BDD fueron casi identicos (Fig. 4A (b) y 4A (d)). Esto es probablemente porque los microgeles E-BDD estan compuestos por cadenas de pollmero con un Tg inferior y se ven menos afectadas por enlaces cruzados flsicos hidrofobos. Esto es apoyado por los valores Q mas altos obtenidos para los microgeles E-BDd (Fig. 4A).

La figura 4A-2 incluye datos adicionales que muestran la variacion de (a) diametro hidrodinamico y (b) relation de hinchazon con pH para los distintos microgeles, incluyendo el microgel GM(H) -M-EGD altamente funcionalizado.

Metodo 5B - Dependencia del pH y otras dependencias de mediciones del tamano de partlcula para microgeles a partir de Metodos 1A, 2A y 3B

Las mediciones se realizaron con espectroscopla de correlacion de fotones utilizando dispersiones que contienen ^p = 3 x 10'4 de microgel. Soluciones reguladoras de patron se utilizaron para estos experimentos. Estas mediciones se realizaron con un aparato de dispersion de luz Brookhaven BI-9000 equipado con un laser de 20 mW HeNe. El detector se fijo en un angulo de 90° de dispersion.

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La figura 4B-1 muestra la variacion de (a) diametro hidrodinamico, (b) relacion de hinchazon y (c) ^p* con pH para los microgeles M-EGD (rombos solidos) y E-BDD (triangulos abiertos). Los datos se midieron utilizando soluciones reguladoras 0.1 M.

Las partlculas de microgel se hinchan cuando el pH se aproxima a sus respectivos valores de pKa. Utilizando la ecuacion (1) los valores maximos de Q para M-EGD y E-BDD son 4 y 40, respectivamente. El microgel E-BDD se hincha muy fuertemente. La relativamente baja hinchazon de los microgeles M-EGd es porque tienen una contribution reticulation reversible, lo que restringe la hinchazon (Liu, R.; Milani, A. H.; Freemont, T. J.; Saunders, B. R. Manuscript submitted to Soft Matter 20l1). La hinchazon se puede aumentar en gran medida de los microgeles M-EGD utilizando el lavado de acetato de etilo.

La fraction de volumen de pollmero en donde las partlculas de microgel vecinas se solapan, ^p*, ya que da una indication de cuando la reticulacion interpartlculas puede ser eficaz. Ademas, estara relacionada con el punto en el que se produce la gelificacion flsica. En un trabajo reciente (Lally, S.; Cellesi, F.; Freemont, T.; Saunders, B. R. Coll. Polym. Sci. 2011, In Press), se encontro que ^p * podrla ser estimada para dispersiones de microgel E-BDD como el valor de ^p que es igual a la fraccion de volumen de pollmero interno dentro de las partlculas (hinchadas) de microgel (^mg). El enfoque para los microgeles se basa en la definition de las concentraciones de solapamiento de micelas de pollmero polimericas (van Ruymbeke, E.; Pamvouxoglou, A.; Vlassopoulos, D.; Petekidis, G.; Mountrichas, G.; Pispas, S. Soft Matter 2010, 6, 881). Se supone que la distribution del segmento radial dentro de cada partlcula es constante y hace caso omiso de los huecos intersticiales entre las partlculas, esto es, asume una eficiencia de empaquetamiento de 100%. Para partlculas de microgel de esfera duras una eficiencia de empaquetamiento de menos de 100% se espera3. Sin embargo, la eficiencia de embalaje precisa dependera de la composition microgel y no es capaz de ser pre- determinada. La siguiente ecuacion se utilizo para estimar ^p *.

imagen4

Los datos de ^p * se muestran en la figura 4B-1 (c). Estos datos se pueden utilizar para inferir superposition y tambien elasticidad al gel. Se espera que la superposicion y la elasticidad seran mas altas para los geles flsicos E-BDD si se utiliza un valor de ^p de 0.10 y el pH es mayor que 6.5.

La figura 4B-2 muestra la variacion de (a) diametro hidrodinamico con pH, (b) diametro con relacion [AEM]/[MAA] y (c) Q nominal con [AEM]/[MAA] para los microgeles AEM-M-EGD. El punto de datos en (b) para [aEm]/[MaA] = 0.30 y etiquetado como pH = 8 se midio a pH = 7.4. Los datos en (a) son para microgeles AEMHCL-M-EGD formados utilizando una relacion de concentration de [AEM]/[MAA] de 0.5 (triangulos abiertos), 0.1 (rombos solidos), 0 (rombos abiertos)], donde un AEMHCL- prefijo se refiere a un microgel AEMHCL funcionalizado.

PCS se utilizo para medir el tamano de las partlculas colapsadas (pH = 4) despues de la funcionalizacion. Los datos se muestran en la figura 4B-2 (a) y (b) datos de relacion de hinchazon se muestra en la figura 4B-2(c), donde el termino Qnom se ha utilizado para Q.

Los datos muestran un aumento lineal de diametro con relacion [AEM]/[MAA] para todos los microgeles M-EGD estudiados a pH = 4 y 8. Esto se atribuye a la agregacion. Los valores Q nominales a pH = 8 se calcularon utilizando la ecuacion (1), y se muestran en la figura 4B-1 (c). Estos valores, que estan sujetos a una considerable dispersion, se basan en la suposicion de que los agregados estan formados de forma irreversible durante la etapa de funcionalizacion de vinilo y no se descomponen cuando se aumenta el pH. El hecho de que Qnom no cambia significativamente con [AEM]/[MAA] indica que la hinchazon de las partlculas individuales no se ha visto afectada en gran medida por la funcionalizacion AEM. Es decir que han mantenido su sensibilidad al pH, incluso en el estado agregado. Vease tambien la figura 4B-1 (a). Esto es razonable teniendo en cuenta que la magnitud maxima de funcionalizacion afecta aproximadamente 1/3 de los grupos MAA presentes en el microgel principal (Tabla 1).

En contraste con un metodo de vinilo-funcionalizacion anteriormente (Ejemplo 3A) que implica GMA (metacrilato de glicidilo) el metodo utilizado en este documento involucro una alta concentracion de electrolito. Esto es debido a la utilizacion de AEMHCl. El pH utilizado en este metodo fue de aprox 6.6, lo que requiere la adicion de solution reguladora y NaOH. Este pH se utiliza para asegurar que las partlculas de microgel se hincharon al menos parcialmente durante la funcionalizacion. AEMHCl es un electrolito y fuerzas ionicas tan altos estaban presentes.

La figura 4B-3 muestra una variacion de (a) diametro hidrodinamico y (b) relacion de hinchazon (Q) con la concentracion de NaCl en solucion a pH = 6.6 para la dispersion de microgel M-EGD.

El efecto de la adicion de NaCl en el tamano de las partlculas del microgel se investigo a pH = 6.6 (Figura 4B-3). A este pH, las partlculas fueron ligeramente hinchadas (Q=1.5). Un ligero aumento en el tamano se produjo (a aproximadamente 170 nm, La figura 3S) a una concentracion de NaCl de 0.10 M que indica una ligera agregacion.

25

Estos datos muestran que se produjo funcionalizacion en condiciones en las que las partlculas eran (inicialmente) ligeramente hinchadas y que produjeron agregacion (parcial) limitada. La extension de la agregacion dependera en la medida de la hinchazon de la partlcula (y por lo tanto el pH). A modo de comparacion, el uso de funcionalizacion [AEM]/[MAA] = 0.40 implica la adicion de reactivos y solucion reguladora que dieron una contribucion de fuerza ionica de 5 0.28 M. Una contribucion adicional de las partlculas de microgel (grupos MAA) por si mismos habrla aumentado la

fuerza ionica. Por lo tanto, no es sorprendente que la agregacion parcial se produjo durante el proceso de funcionalizacion. Los datos de la figura 4B-2 muestran que se hizo progresivamente mas pronunciada a medida que aumenta [AEM]/[MAA]. Es importante tener en cuenta que el agregado de tamano de la figura 4B-2 esta a menos de 1 pm. Esto significa que estas dispersiones todavla serlan capaces de ser inyectadas a traves de estrechas agujas de 10 jeringa de calibre. Esto es importante para futuras aplicaciones potenciales que implican tecnicas mlnimamente invasivas (por ejemplo, inyeccion).

Metodo 6 - Caracterizacion de las partlculas de microgel preparadas en los Metodos 1, 1A, 2, 2A, 2B, 3, 3A, y 3B (utilizadas para formar composiciones de la invencion)

Los datos de caracterizacion se presentan, a continuacion, en la Tabla 1:

15 Tabla 1

No.: Metodo Composicion® dh(4/nmb dh(10)/ nmb qc pKa

1: 2 poli( EA66/MAA33/BD DA1.0) 75 309 70 6.70

2A: 1 poli(M MA66/MAA33/EGDMA1.0)d 104 205 7.7

2B: 1 poli(M MA66/MAA33/EGD MA1.0) 130 208 4.1 6.35

2BG: 3 poli(M MA66/MAA23/EGDMA1.0)-GMA0.018 131 3239 15h 7.1

3e: 1 poli(MMA66/MAA33/PEGDMA5501.0) 150

3Ge: 3 poli(MMA66/MAA33/PEGDMA5501.0)-GMAf

M-EGD: 1A poli(M MA66/MAA33/EGD MA1.0) 139 2329 4.7h 7.4

E-BDD: 2A poli( EA66/MAA33/BD DA1.0) 75 247g 35h 6.5

GM-M-EGD: 3A poli(M MA66/MAA33/EGDMA1.0)-GMA0.018 131 323g 15h 7.1

GM(H)-M- EGD: 1A poli(M MA66/MAA33/EGDMA1 0)-GMA0.058 133 315 13 6.0

GM-E-BDD: 3A poli(EA66/MAA33/BDDA1.0)-GMA0.078 77 243g 32h 6.1

M-EGD: 1A poli(M MA66/MAA33/EGD MA1.0) 134 2129 7.2

AEM5-M- EGD: 3B poli(M MA66/MAA33/EGDMA1 0)-AE M0.030 6.5

AEM10-M- EGD: 3B poli(M MA66/MAA33/EGDMA1 0)-AEM0.041 257 3069 6.6

AEM20-M- EGD: 3B poli(M MA66/MAA33/EGDMA1 0)-AEM0.074 6.7

AEM30-M- EGD: 3B poli(MMA66/MAA33/EGDMA1.0)-AEM0.114 653 9149 6.8

AEM40-M- EGD: 3B poli(M MA66/MAA33/EGDMA1 0)-AEM0.074 655 7429 6.7

AEM50-M- EGD: 3B poli(MM66/MAA33/EGDMA1.0)-AEM0.11 576 8519 6.9

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AEM20-E- BDD: 3B poli(MMA66/MAA33/EGDMA1.0)-AEM

m-BDD: 2 poli( EA66/MAA33/BD DA1.0) 108 310' 24J 6.7

a Los numeros de los subindices son las composiciones aproximadas nominales (% en peso) en base a las condiciones de preparacion. En el caso de GMA o AEM el numero se basa en datos de valoracion y se refiere a la composicion como un todo (vease Ejemplo 10).

bDiametro hidrodinamico medico a pH = 4 o 10.

c Relacion de hinchazon volumetrica calculada utilizando valores dh(10)y dh(4) de acuerdo con: q = (dh(io)/dh(4))3. d Este microgel se preparo utilizando alta cizalla.

e 3 y 3G se hicieron utilizando los metodos 1 y 3, respectivamente, la diferencia es que PEGDMA550 se utilizo en lugar de EGDMA. La concentracion % en peso fue la misma.

f La composicion de 3G debe ser similar a la del Microgel 2BG, pero no se ha establecido en la actualidad. g En estos casos, el diametro hidrodinamico se midio a pH 8, no 10.

h En estos casos, relaciones de hinchazon volumetrica se calculan utilizando valores dh(8) y dh(4) de acuerdo con: q =

(dh(8)/dh (4))3.

i En estos casos, el diametro hidrodinamico se midio a pH 7, no 10.

j En estos casos, relaciones de hinchazon volumetrico se calcula utilizando valores dh(7) y dh(4) de acuerdo con: q = (dh(7)/dh(4))3. El grado de funcionalizacion por GMA para GM-M-EGD (del metodo 3A) fue modesto (1.8 % mol en general, o 5% de los grupos MAA). Como se muestra a continuation esto era suficiente para formar geles DX. En el caso de la GM-E-BDD (de metodo 3A) la funcionalizacion fue mucho mas alta (7.8 % mol en general, o 21% de los grupos MAA). Para preparar dispersiones de microgel GM-E-BDD coloidalmente estables fue necesario utilizar un pH mas alto para la funcionalizacion para evitar la agregacion durante el proceso. El contenido de GMA relativamente alto para los microgeles GM-E-BDD no disminuyo el grado de hinchazon a juzgar por los valores de Q a pH = 8 (Tabla 1).

Ejemplo 1 - Reticulation de las partlculas de microgel por formation de una red de pollmero interpenetrante (para formar composiciones de la invencion)

Se utilizaron dos metodos:

Metodo A: En este metodo se adiciona en primer lugar el microgel. Por lo general, el sistema se preparo utilizando 10% en peso de Microgel (metodos 1 o 2) y 10% en peso de dispersion de PEGDMA550 stock. En ese caso, una mezcla de 0.2 ml de solution de persulfato de amonio (10% en peso en agua), se adicionaron 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M a una mezcla de 2.5 ml de microgel (16% en peso), 0.36 ml de PEGDMA550 y 0.44 ml de agua DI con agitation. El gel debil final como mezcla se mantuvo en un bano de agua y se dejo reaccionar a la temperatura deseada.

Metodo B: Se adiciona en primer lugar el reticulante. En este caso 2.5 ml de microgel (16% en peso) se adicionaron a una mezcla previamente preparada de 0.2 ml de solucion de persulfato de amonio (10% en peso en agua), 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M, 0.36 ml de PEGDMA550 y 0.44 ml de agua DI por agitacion. Antes se adiciono el microgel, la mezcla de todos los otros materiales se dejo mezclar durante medio minuto. El llquido final como mezcla se mantuvo en un bano de agua.

Caracterizacion

(i) Efecto de concentracion de Microgel 1 en modulo elastico dependiente de la tension (G') y tan8 (= G”/G') [Tener en cuenta que G" es el modulo de perdida].

El microgel reticulado se preparo utilizando el Ejemplo 1, Metodo A. Las dispersiones contenlan 10% en peso de PEGDMA (la masa molar fue 550 g/mol).

Las mediciones de reologla dinamica se realizaron utilizando un instrumento TA reometro con control de temperatura AR G2 con una camara ambiental. Los resultados se muestran en la figura 6.

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(ii) Variacion de (a) G' y (b) tan8 con tension para microgeles reticulados preparados utilizando Microgel 2A y PEGDMA550.

Las concentraciones de Microgel y PEGDMA utilizados fueron 10% en peso de cada uno. En este caso se llevo a cabo el metodo de reticulacion in situ dentro de la geometrla del reometro antes de la medicion. El instrumento se describio anteriormente. La preparacion se realizo de acuerdo con el Ejemplo 1, Metodo B. Los resultados se muestran en la figura 7.

(iii) Efecto de concentracion de Microgel 1 en modulo elastico dependiente de la tension (G') y tan8 (= G”/G') [Tener en cuenta que G" es el modulo de perdida]

Las partlculas de microgel reticuladas 1 se prepararon utilizando el Ejemplo 1, Metodo B. Las dispersiones contenlan 10% en peso PEGDMA550 (masa molar fue de 550 g/mol). El instrumento fue el mismo que el descrito anteriormente en (i) anterior. Los resultados se muestran en la figura 8.

Ejemplo 2 - La reticulacion de las partlculas de microgel por la formacion de una red de pollmero interpenetrante y estudio de las redes precursoras de microgel/reticulantes (para formar las composiciones de la invention)

Para un compuesto de hidrogel total que contiene una fraction de volumen total de pollmero (yrot) de 0.20, con una fraction de volumen de microgel con respecto al pollmero total (Om.) de 0.5, una mezcla de 0.02% en peso de persulfato de amonio se combino con una cantidad apropiada de hidroxido de sodio (Aldrich, 98%) para dar un pH de la solution final de 7.4. A esto se adiciono el monomero de reticulacion (X), con el mismo por ciento en moles como poli (etilenglicol)dimetacrilato (PEGD550). PEGD (promedio Mn 550, Aldrich) y luego se disolvio en esta solucion, a la que 10% en peso de microgel (Microgel m-BDD - obtiene a partir de Metodo 2 anterior) se adiciono gota a gota mientras que la mezcla utilizando un mezclador de vortice. A continuation, se calento la dispersion a 50°C durante 16 horas.

En este estudio utilizamos concentraciones molares constantes de comonomero de reticulacion adicionado. Es decir, para EGD y los diferentes monomeros de reticulacion PEGD se adiciona un % mol (xx) de monomero de reticulacion constante, cuando se comparan los datos. El valor de Xx es el % mol de X presente con respecto a todos los monomeros presentes en el material compuesto m-BDD/H-X. Por lo tanto, el % en moles de monomeros presentes en el microgel es 100 - xx. La consecuencia de esto es que hay diferentes fracciones de volumen de monomero de reticulacion presente.

Los microgeles son identificados como m-BDD donde m indica microgel y BDD identifica el monomero de reticulacion se utiliza (esto es, poli (EA/MAA/BDDA) como se obtiene a partir del Metodo 2). Cuando X se polimeriza para formar una fase de la red de hidrogel de este se identifica como H-X. Los sistemas (dispersiones o geles) contienen ya sea m-BDD y X: (esto es, m-BDD/X) o m-BDD y H-X: (m-BDD/H-X). La fraccion del volumen de pollmero de microgel en el m-BDD/X o mezcla m-BDD/H-X con respecto al pollmero y monomero o hidrogel presente es Om-BDD. La fraccion de volumen de monomero de reticulacion presente es ^x. En los compuestos microgel/hidrogel la fraccion de volumen del pollmero de hidrogel (formado por X) es ^h-x. En tanto las dispersiones m-BDD/X o geles compuestos de m-BDD/H-X de la fraccion total de volumen de pollmero y monomero de reticulacion es ^Tot. Se aplican las siguientes ecuaciones.

Para las dispersiones m-BDD/X:

t>Toi - <tVBDD +

Para los geles compuestos de m-BDD/H-X:

4*Tot “ ^ll-BDD +

(4)

(5)

La fraccion de volumen de microgel con respecto a microgel y monomero (o de hidrogel) es Om.

imagen5

<f>Tat

(6)

La primera parte del estudio investigo las propiedades de las mezclas m-BDD/X. Estas mezclas se utilizaron para preparar los hidrogeles. Era importante investigar cualquier cambio en las propiedades de microgel causado por la adicion de los monomeros. Con el fin de proporcionar un buen control de las mezclas se calentaron durante el mismo perlodo de tiempo que se utiliza para la formacion de hidrogel; Sin embargo, no se agrego APS.

Las mezclas de m-BDD/X se prepararon inicialmente utilizando un intervalo de valores de Om-BDD. Se encontro que el comportamiento de las mezclas fue dependiente del peso molecular de X. Si se utilizo EGD continuacion, las

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dispersiones se mantuvieron geles flsicos sobre los valores de Om-BDD de 0.05-0.15. Sin embargo, si se utiliza PEG550 entonces los geles flsicos cambian a fluidos (al juzgar por inversion del tubo) cuando Om-BDD fue inferior a 0.125. Las imagenes seleccionadas se muestran en la figura 9C. Basandose en un estudio anterior que investigo microgeles relacionados en presencia de homopollmeros PEG lineales9, este comportamiento se atribuye a deshinchamiento osmotico de los microgeles causado por la exclusion del PEGD550 de peso molecular mas alto. El EGD de peso molecular mas bajo fue capaz de migrar hacia el interior de las partlculas de microgel y no causo colapso de las partlculas. Tambien es posible ver la evidencia de esto visualmente a traves de cambios de turbidez (vease la figura 9C). La figura 9C muestra imagenes de dispersiones concentradas seleccionados. Se muestran los valores de Om-BDD y Xx. El pH fue de 7.4. La turbidez aparece independiente de Om-BDD para las dispersiones m-BDD/EGD. Sin embargo, se disminuye notablemente para las dispersiones m-BDD/PEGD con el aumento de Om-BDD. A altos valores de Om-BDD no hay suficiente PEGD550 excluido para deshinchar las partlculas.

Se probo el efecto del peso molecular de PEGD utilizando mediciones de reologla dinamica con el fin de investigar la evidencia de un valor de corte.

La figura 6C muestra una variacion de (a) G' y (b) tan8 con la tension para dispersiones m-BDD/X. El peso molecular de X se muestra en la leyenda. (c) Muestra los valores de G' y tan8 medidos a 1% de tension. (d) Muestra la variacion de la tension de rendimiento con el peso molecular de X. En todos los casos Om-BDD = 0.1 y pH = 7.4. El valor para xx utilizado fue 15 % mol

Las figuras 6C (a) - (c) muestran claramente que G' cae y tan8 incrementa con el peso molecular de X. En nuestra experiencia un G' de aproximadamente 100 Pa se requiere para un gel para sobrevivir la inversion de tubo. En consecuencia, los datos reologicos son consistentes con las imagenes de los tubos mostrados anteriormente. Se deduce de estos datos que el peso molecular de PEGD crltico para completar la exclusion del microgel es entre 550 y 750 g/mol. Esto corresponde a 9-13 unidades de EO. Bajo estas condiciones las partlculas de microgel se colapsaron suficientemente que los geles flsicos no son lo suficientemente fuertes como para soportar su propio peso cuando se someten a la inversion de tubo (Figura 9C).

La tension de rendimiento (g*) se define en este documento como la tension a la que G' cae al 95% de su valor en 1% de tension (Chougnet, A.; Audibert, A.; Moan, M. Rheol. Acta 2007, 46, 793). Esto marca la transicion a la averla de la red. Se puede ver en la figura 6C (d) que existe una variacion considerable con el peso molecular de X para estos valores. En general, los geles flsicos son materiales fragiles y g* no parece estar relacionada con G'.

Caracterizacion

(i) la relacion de volumen de hinchazon (Q) para microgeles reticulados formados de acuerdo con el Ejemplo 2 medidos despues de 7 dlas en funcion de la fraccion de volumen de m-BDD.

El comportamiento de hinchazon se investigo para los compuestos de hidrogel m-BDD/H-PEGD550 a pH = 7.4 despues de 7 dlas.

La figura 8C-1 muestra la relacion de hinchazon m-BDD/H-PEGD550 y la fraccion sol como una funcion de Om. Los insertos muestran geles m-BDD/H-PEGD550 seleccionados. Los compuestos se prepararon utilizando 9™ = 0.2. Tener en cuenta que Om-BDD = Om. x 9™. Los datos y las imagenes fueron pH 7.4. Q para el microgel m-BDD (Tabla 1) se muestra para comparacion. Las imagenes y los datos fueron obtenidos despues de 7 dlas.

Los geles se prepararon utilizando 9™ = 0.2 y un intervalo de valores de Om. Los valores de Q y SF fueron constantes hasta que Om supero 0.25. A mayores valores de Om Q aumenta mientras que SF disminuyo. Esto se atribuye a una disminucion en la matriz de PEGD550 que tenia un SF sustancial (de aproximadamente 0.5) y un peso molecular medio mas bajo entre reticulaciones. Las partlculas de microgel tenlan un valor de Q mas alto que el poli (PEGD), ya que solo contenlan aproximadamente 0.5% mol de BDD. Esto se puede ver mediante la comparacion de los puntos de datos en 9Tot = 0 y 1.0, respectivamente, para el poli (PEGD550) y partlculas de microgel m-BDD.

El cambio brusco en el comportamiento en Om = 0.25 es interesante. Puede ser que este es donde una red de partlculas de microgel percolada dentro de la matriz H-PEGD550 primero se forma. Tales como la red se esperarla que reduzca la eficacia global de la fase reticulada H-PEGD550 para restringir las partlculas de microgel. En valores Om mayores que o iguales a aproximadamente 0.63 del gel redispersado. Este valor de Om esta muy cerca de la fraccion de volumen de embalaje para un sistema de empaquetado hexagonal cerca de esferas monodispersas (0.64). Tambien se encuentra en la region de fracciones de volumen donde se espera un vaso atrapado (Debord, S. B.; Lyon, L. A. J. Phys. Chem. B. 2003, 107, 2927). Serla razonable esperar que la fase H-PEGD550 de encapsulacion se fragmenta (no continua) en estas condiciones. El punto en el cual m-BDD/H-PEGD550 re-dispersa (Om s 0.63) corresponde con el punto en el que las mezclas de m-BDD/PEGD550 originales forman geles flsicos (Figura 9C). Esto demuestra que la redispersion se debe a la incapacidad de PEGD550 para formar una membrana continua por toda la dispersion.

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(ii) Volumen relacion de hinchazon (Q) para microgeles reticulados formados de acuerdo con el Ejemplo 2 medido despues de 7 dias como una funcion del peso molecular de X (reticulante)

El efecto de peso molecular de X en la hinchazon tambien fue investigado (Vease La figura 8C-2).

La figura 8C-2 muestra el efecto de MW en la relacion de hinchazon y la fraccion sol de compuestos de hidrogel m- BDD/H-X. Los materiales compuestos se prepararon utilizando Om-BDD = 0.10 y Xx = 15% mol. Los geles se equilibraron luego a pH = 7.4 para 7 dias antes de la medicion.

Parece ser que Q aumenta y SF disminuye con MW del monomero de reticulacion. Se espera que el aumento de Q de un aumento en el peso molecular promedio entre reticulaciones. No esta claro por que el SF disminuye con MW para estos sistemas en esta etapa, aunque se puede esperar que las complicaciones se hagan mas importantes que la masa molar de X aumenta.

(iii) relacion de volumen de hinchazon (Q) para microgeles reticulados formados de acuerdo con el Ejemplo 2 medida despues de 7 dias como una funcion de pH

Los geles m-BDD/ H-PEGD550 y m-BDD/ H-EGD se les permitio alcanzar el equilibrio de hinchazon. Los valores de Q respectivos se muestran en la figura 8C-3.

La figura 8C-3 muestra una variacion de Q para materiales compuestos de hidrogel con el pH. Los compuestos se prepararon a pH 7.4, Om-BDD = 0.10 y Xx = 15% mol, colocado en solucion reguladora 0.1 M y se dejo equilibrar durante 7 dias. Tambien se muestran los datos para el m-BDD obtenidos a partir de PCS.

En general, existe un acuerdo entre los valores de Q para los geles y las particulas de microgel m-BDD. Sin embargo, existe una dispersion considerable de los datos de gel que impide un analisis mas detallado.

(iv) Efecto de la concentracion Microgel m-BDD en el Ejemplo 2 en modulo elastico (G') dependiente de la tension y tan8 (= G”/G') [Tener en cuenta que G" es el modulo de perdida]

Los hidrogeles compuestos (m-BDD/H-X) se prepararon mediante la adicion de iniciador (APS) a las dispersiones concentradas descritas anteriormente en el Ejemplo 1C. El resultado de la reticulacion era geles que eran mas resistentes a redispersion (mas adelante). Tambien hubo un aumento en el modulo. El aumento fue mas pronunciado para el sistema m-BDD/H-PEGD550.

La figura 7C muestra el efecto de la variacion de Om-BDD para compuestos de hidrogel m-BDD/ H-EGD y m-BDD/H- PEGD550. Los datos seleccionados para las respectivas dispersiones m-BDD/EGD tambien se muestran para la comparacion. Tambien se muestran los valores para xx. Todos los sistemas se midieron a pH 7.4. Estos datos ilustran la brecha en valores G' que se convierten cada vez mas pronunciada en la region Om-BDD de aproximadamente 0.10 a 0.17. Esto indica un intervalo optimo para deshinchazon osmotica de las particulas m-BDD en presencia de PEGD550 antes de la reticulacion.

(v) Efecto del peso molecular del monomero de reticulacion (X) sobre las propiedades mecanicas de los geles compuestos del Ejemplo 2

El efecto del peso molecular del monomero de reticulacion sobre las propiedades mecanicas de los geles compuestos preparados utilizando Om-BDD = 0.1 y Xx = 15% mol se investigo con mas detalle. Los resultados de estos datos se muestran en los estudios de amplitud de tension realizados.

La figura 8C-4 muestra los datos para geles compuestos de m-BDD/H-x: Efecto del peso molecular de X en (a) G', (b) tan8 y (c) g* Se obtuvieron los datos mediante Om-BDD = 0.10 y Xx = 15% en moles. Los datos para (a) y (b) se midieron utilizando 1% de tension y 1 Hz. Tener en cuenta que el punto en el MW de 0 corresponde a Om-BDD = 0.20. Estos datos muestran evidencia de un cambio claro en G' y g* con MW de X. Se puede observar que el MW de 330 g/mol marca un cambio en la velocidad de disminucion de G' con MW y tambien un valor maximo de g* (de 19%). Esto es una indicacion de una masa molar relativamente grande entre los puntos de reticulacion en la periferia de las particulas. Los datos tambien muestran (Figura 8C-4 (b)) que hay un aumento brusco de tan8 a valores de MW altos. Esto es una indicacion de aumento de la disipacion debido a una red debil que rodea las particulas deshinchado.

La comparacion de los datos que se muestran en las Figs. 6C (vease el Ejemplo 1C) y 8C-4 muestra que el mayor incremento de G' despues de la formacion de compuesto se produce cuando X es excluido a partir de microgel interior; en ese caso el fluido (mezcla) cambia a un gel solido. No existe una gran diferencia para los valores G' para los monomeros de reticulacion de bajo peso molecular.

(vi) Efecto de Om-BDD en G', tan8 y g* de los productos del Ejemplo 2

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El efecto de Op-bdd en G', tan8 y g* fueron investigados y que los datos aparecen en la figura 8C-5.

La figura 8C-5 muestra el efecto de O^-bdd en (a) G', (b) tan8 y (c) g* para compuestos de hidrogel p-BDD/H-EGD y p- BDD/H-PEGD550. El valor para xx era 15% mol en cada caso.

Se puede ver que un Op-bdd mlnimo de aproximadamente 0.05 se requiere para los sistemas p-BDD /H-PEGD550 con el fin de formar un gel con elasticidad y tan8 <1.0 significativa. En el caso de p-BDD/H-EGD el mlnimo es mucho mas baja (menos de 0.025). Las relaciones exponenciales (Figura 8C-5 (a)) implican capacidad de ajuste a traves del control de O^bdd es interesante que para ambos sistemas parece que hay un O^-bdd a la que los valores G' y tan8 se vuelven identicos y esto es 0.125. Las propiedades reologicas de los compuestos son identicos lo que implica que no hay diferencia entre la distribucion de la carga dentro de cada tipo de red en que el valor de O^-bdd.

Los datos anteriores demuestran la capacidad de ajuste considerable para los compuestos. Los mayores cambios durante la reticulacion covalente se producen durante los geles p-BDD/H-PEGD550. Cuando O^-bdd = 0.1, cambian de un fluido a un gel. Esto indica un buen potencial para una dispersion inyectable.

(vii) Efecto del pH sobre modulo elastico dependiente de la tension (G') y tan8 (= G''/G') [Tener en cuenta que G" es el modulo de perdida] para el Ejemplo 2

Tambien se investigaron las propiedades reologicas de los geles hinchados de equilibrio.

La figura 8C-6 muestra la variacion de (a) G'y (b) tan8 con pH para hidrogeles compuestos p-BDD /X. Estos fueron los mismos geles utilizados para los experimentos de hinchazon que se muestran en la figura 8C-3.

Se puede observar que en el intervalo de pH fisiologico de los geles compuestos tienen valores G' bajos. Ellos tambien fueron bastante fragiles con los valores g* menores del 5%. Ambos efectos se pueden atribuir a las cadenas altamente hinchadas. Los valores Q se encuentran en el entorno de 30 a 40 de la figura 8C-3 en estos intervalos de pH (de 7 a 7.4). Esto corresponde a un valor ^p de solo el 0.02 hasta 0.03. Por lo tanto, en el estado totalmente hinchado estos compuestos son geles debiles. Sin embargo, los datos de la figura 8C-5 muestran que se pueden lograr geles mucho mas elasticos mediante la limitacion de la inflamacion a un intervalo en donde los valores ^p son mas grandes.

Conclusiones

El tipo de compuesto de hidrogel que se obtiene depende del MW del monomero de reticulacion adicionado. Si el MW es menor que el llmite de exclusion (ca. 550 g/mol), entonces penetra los microgeles hinchados y refuerza los geles flsicos para producir microgeles roscados de la red. Si el MW es mayor que este valor se excluye el monomero y se reticula alrededor de las partlculas de microgel, encapsulacion de los mismos, para formar un hidrogel reforzado con microgel. En el ultimo caso, el monomero de reticulacion excluido causo deshinchamiento y esto resulto en un fluido en lugar de un gel flsico. El fluido de p-BDD/X cambio a un gel durante la reticulacion. Este es un resultado ventajoso desde el punto de vista de aplicacion potencial porque los ultimos sistemas son inyectables antes de la gelificacion. El trabajo tambien ha demostrado que las propiedades mecanicas de los compuestos de hidrogel se pueden sintonizar por la composicion utilizada para su preparacion. Los valores del modulo obtenidos en este trabajo (1000-30,000 Pa) coinciden con los de un intervalo de tejidos blandos del cuerpo. Ademas, la capacidad de ajustar los valores de modulo sugiere que las propiedades mecanicas de estos compuestos de hidrogel seran apropiadas para aplicacion en la reparacion del disco intervertebral.

Ejemplo 3 - La reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado (para formar composiciones de la invencion)

Se adicionaron 2.5 ml de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA)-GMA (16% en peso) a una mezcla de 0.2 ml de solucion de persulfato de amonio (10% en peso en agua), 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M y 0.8 ml de agua DI por agitacion. El pH final se mantuvo entre 7.5 y 8.5. La dispersion se calento a la temperatura deseada. En el caso de preparaciones realizadas a 37°C, se adiciono TEMED a concentraciones entre (2 y 50 mM).

La figura 9 muestra una imagen fotografica de: (a) una dispersion de microgel 2B (a pH = 7.3); (b) un microgel 2BG reticulado; y (c) un microgel 2BG reticulado que se ha hinchado en agua de pH neutro. Para cada gel mostrado en la figura 9, la concentracion inicial de microgel correspondio a 7% en peso. Los geles se prepararon utilizando el procedimiento descrito anteriormente en el Ejemplo 2 a una temperatura de 50°C, y en ausencia de TEMED adicionado.

La figura 10 muestra las imagenes de micrografla por barrido electronico de: (a) un microgel 2BG reticulado y (b) una dispersion de microgel no reticulado (Microgel 2B), ambas a la misma concentracion de partlculas (10% en peso). La imagen SEM se obtuvo utilizando un instrumento Philips FEGSEM. La muestra (a) se preparo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 2 anterior y la muestra (b) se preparo utilizando el procedimiento descrito en el Metodo 1. En el caso de la muestra (a) no se adiciono TEMED y la reaccion se realizo a 50°C.

Caracterizacion

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(i) Relacion de volumen de hinchazon (qgei) para geles reticulados de Microgel 2BG medida despues de 7 dlas como una funcion del pH.

Tambien se muestran los datos medidos en una solucion salina estandarizada con fosfato (PBS). El valor para qgel se midio utilizando la relacion del volumen de gel a un pH dado para el volumen del gel libre de agua (en seco). Esto se hizo gravimetricamente despues de secar el exceso de agua del gel hinchado utilizando papel de seda.

El microgel reticulado doble se preparo utilizando calentamiento a 50°C como se describe para el Ejemplo 2. Sin embargo, en este caso no se adiciono TEMED.

Los resultados se muestran en la figura 11.

(ii) Efecto de la concentracion de partlculas de microgel 2BG utilizado durante la reticulacion en (a) G' y (b) tan8 como una funcion de la tension.

El microgel reticulado doble se preparo utilizando calentamiento a 50°C utilizando el Ejemplo 2 en ausencia de TEMED adicionado. Los valores de g* se determinaron como se ha descrito anteriormente. La instrumentacion de la reologla tambien fue descrita anteriormente.

Los resultados se muestran en la figura 13. La fraccion de volumen de pollmero utilizada durante la preparation se muestra en la leyenda. [Multiplicar por un factor de 100 para convertir a % en peso] La variation de G', g* y tan8 con la fraccion de volumen de pollmero se muestran en (c) y (d). El pH de estos datos fue 7.8. En estas mediciones, y las otras dadas en los ejemplos, se utilizo la frecuencia de oscilacion 6.3 rad/s a menos que se indique lo contrario.

(iii) Variacion de (a) G' y (b) tan8 con la tension para microgeles reticulados preparados.

Los datos se obtuvieron utilizando Microgel 2BG (rombos abiertos) y 3G (rombos cerrados). La doble reticulacion se realizo a 37°C utilizando persulfato de amonio (22 mM) y 10% en peso De la microgel durante 17 h utilizando el Ejemplo 2 en ausencia de TEMED adicionado. El valor de g* para 3G doblemente reticulado esta en la vecindad de 500%. Para estos experimentos el hidrogel se preparo in situ en el reometro justo antes de que se produzcan las mediciones utilizando el Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 14.

(iv) Variacion de (a) G'y (b) tan8 con la tension para microgeles doblemente reticulados preparados a partir de Microgel 2BG y TEMED (7.98 mM).

La reticulacion se realizo a 37°C. Se muestra el tiempo de reaction. Los valores estimados para g* es de 195% para el sistema despues de 120 minutos de reaccion. El sistema se preparo utilizando 10% en peso de Microgel 2BG.

Esta se midio despues reticulacion in situ dentro del reometro utilizando el procedimiento del Ejemplo 2. Los resultados se muestran en la figura 15.

Ejemplo 4 - La reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado (para formar composiciones de la invention)

En general, se preparo la composition de partlculas de microgel doblemente reticulado (microgel DX) utilizando ^p = 0.10, pH = 7.8, 22 mM de APS y una temperatura de reaccion de 50°C. Se adiciono el microgel GM-funcionalizado (por ejemplo, Microgel GM-MEGD del Metodo 3A) a la solucion de NaOH/APS con la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 5 minutos para formar un gel flsico a temperatura ambiente. Despues de mezclar completamente la dispersion gelificada flsicamente se calento a 50°C, durante 8 h, y se dejo reaccionar para producir DX GM-M-EGD.

Para las mediciones realizadas utilizando reologla de la reticulacion se llevo a cabo in situ dentro del reometro durante al menos 1 h antes de comenzar las mediciones. Para las muestras mas grandes preparadas para mediciones de hinchazon el tiempo de reaccion fue de 8 h.

La figura 9A muestra una imagen fotografica SEM de: (a) Microgel M-EGD (del Metodo 1A); (b) microgel GM-MEGD (del Metodo 3A). Las partlculas son esfericas, aunque las polidispersidades son significativas. La Tabla 2 muestra que los tamanos de partlculas promedio en numero para estos dos microgeles fueron aproximadamente 130 nm y no afectadas significativamente por la funcionalizacion. La comparacion de los diametros medidos por SEM y tambien PCS (a pH = 4) muestra que son similares. Esto indica que no habla agregacion insignificante de las partlculas en la dispersion.

Tabla 2

Codigo: % Mol. de MAAa % Mol. GMAa dn(sem)/ nm (CV)^ dh(4)c/ nm dh(8) c/nm Q(8) d pKa e

M-EGD: 35.9 - 131 (14) 139 232 4.7 7.4

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GM-M-EGD: 34.1 1.8 133 (20) 131 323 15 7.1

GM(H)-M-EGD: 35.9 5.8 133 315 13 6.0

a Determinado a partir de los datos de titulacion potenciometrica. El % mol de GMA se determino a partir de la diferencia en el% molde mAa en el microgel antes y despues de la funcionalizacion.

b Diametros promedio en numero determinados a partir de imagenes SEM. El numero entre parentesis es el coeficiente de variacion.

c Diametro hidrodinamico a valores de pH de 4 y 8.

d Relacion calculada utilizando valores dh(8) y d(4) de microgel original de acuerdo con la ecuacion (1) - vease el texto. e Valores de pKa aparentes. Estos son los valores de pH que corresponden a 50% de neutralization.

La figura 10A muestra las imagenes de micrografla por barrido electronico de las muestras liofilizadas de: (a) DX GM-M- EGD y (b) M-EGD (esto es, la muestra se preparo utilizando ^p = 0.10 y pH = 7.8. Las inserciones para (a) y (b) muestran unas imagenes de un microgel independiente DX GM-M-EGD y una dispersion M-EGD gelificado flsicamente, respectivamente. Se obtiene una imagen SEM utilizando un instrumento Philips FEGSEM. La muestra (a) se preparo utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 2A anterior y la muestra (b) se preparo utilizando el procedimiento descrito en el metodo 1A. La liofilizacion tiene una tendencia a producir huecos de tamano micrometrico como consecuencia de la formation de hielo durante la inmersion de la muestra en nitrogeno llquido. Sin embargo, se encontro que caracterlsticas en la escala de las partlculas individuales fueron menos comunes con los geles de DX (Figura 10A (a)) en comparacion con el gel SX M-EGd original (Figura 10A (b)), lo que puede indicar un mayor grado de interpenetration entre partlculas. Las partlculas de GM-M-EGD tuvieron una mayor tendencia a hincharse de las partlculas de M-EGD (vease mas adelante).

Caracterizacion

(i) Relacion de volumen de hinchazon (Q) para geles reticulados de Microgel DX GM-M-EGD como se prepara en el Ejemplo 4 despues de 8 dlas en funcion del pH.

Este microgel doble reticulado fue DX GM-M-EGD como se preparo en el Ejemplo 2A.

Las mediciones flsicas se llevaron a cabo como se describe anteriormente.

En el siguiente estudio se estudiaron las propiedades mecanicas de los microgeles DX que se les permitio alcanzar el equilibrio de hinchazon. Utilizamos las condiciones justo por debajo del valor ^p crltico de 0.10 porque esto fue una prueba mas rigurosa de si microgeles DX de hecho podrlan sobrevivir la hinchazon sin desintegracion. Ademas, el gel SX tenia valores G' suficientemente bajos que eran fluidos cuando fueron cizallados por inversion del tubo. Esto significa que estas mezclas serian inyectables a traves de una jeringa de calibre estrecho. Eso seria ventajoso para la reparation de tejidos blandos si se utilizo reticulation a temperatura baja.

Los microgeles DX hinchados fuertemente en solution reguladora o agua. El microgel DX GM-M-EGD se hincho tan fuertemente en el agua que se fragmento macroscopicamente despues de varios dias. Esto demuestra que la reticulacion entre partlculas no era lo suficientemente fuerte como para soportar la presion de hinchazon dentro de las partlculas. Si el microgel DX se coloco en soluciones solucion reguladora (fuerza ionica de aproximadamente 0.1 M) dieron geles solidos que no se fragmentan. La fuerza ionica alta reduce el grado de hinchazon y muestra la importancia de la repulsion electrostatica en la hinchazon de estos microgeles DX.

Los valores Qdx para los microgeles DX se midio como una funcion del tiempo (Figura 12A).

La figura 12A. Muestra (a) relaciones de hinchazon como una funcion del tiempo para DX GM-M-EGD preparados utilizando ^p = 0.08. Las lineas son guias para los ojos. (b) Variacion de relaciones de hinchazon medido despues de 8 dias con pH para los microgeles DX GM-M-EGD (cuadrados solidos), DX GM-EGD (PBS) (cuadrados abiertos) y SX GM-M-EGD (rombos abiertos - esto es producto de metodo 3A, microgel originales). El pH inicial fue de 7.8. Las ecuaciones utilizadas para estos datos fueron (1) y (2).

La hinchazon fue lenta debido a la naturaleza compactada cerca de estos geles doblemente reticulados. Tenemos la hipotesis de que una estrecha disposition por paquetes de partlculas era un requisito para la preparation de geles de soporte de carga. Los microgeles DX de Cho et al.8 se formaron mediante un procedimiento diferente (interacciones atractivas) y mucho mas rapido habia hinchazon cinetica debido a su morfologia mas abierta. Los datos mostrados en la figura 12A revela una diferencia significativa entre los valores Qdx y los valores de Q para los microgeles SX GM-M-

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EGD. La causa del aumento de la hinchazon de los microgeles DX GM-M-EGD se debe aumentar la hinchazon entre las partlculas, esto es, una densidad de reticulacion entre partlculas inferior. Esto sugerirla un Mc superior en la periferia de las partlculas (que une las partlculas) que en el interior de las partlculas. Esto parecerla razonable teniendo en cuenta

(a) la funcionalizacion GMA bajo (1.8% mol) para el microgel DX GM-M-EGD y (b) la fragmentacion que se produjo para este sistema cuando se hincha por el agua.

La figura 12A.1 muestra relaciones de hinchazon para (a) microgeles DX GM-M-EGD y DX GM (H)-M-EGD, as! como

(b) microgel DX GM-E-BDD como una funcion del tiempo medido a diferentes valores de pH. Las llneas son gulas para los ojos. Los microgeles DX se hincharon en soluciones de solucion reguladora cuando el pH era mayor que o igual a 7.4 y dio geles robustos que no fragmentan. Los microgeles DX necesarios al menos 1 dla para llegar a la hinchazon completa. Este es el soporte para una morfologla que llena el espacio que esta libre de microporosidad significativa y es consistente con las imagenes de SEM (Figuras 10A). Esta hinchazon mas lenta es diferente a la hinchazon rapida (minutos) observada para microgeles DX preparados por una agregacion en puente. Se sugiere que la morfologla libre de poros (en la escala micrometrica) de estos microgeles DX contribuye a sus altos valores de G'.

Como un estudio final, se probaron los comportamientos reologicos de los geles de equilibrio DX hinchados (Figura 12A- 1). Se seleccionaron microgeles DX preparados en valores ^p bastante bajos con el fin de obtener altas relaciones de hinchazon. Los datos de amplitud de tension aparecen en la figura 12A-2. Los geles utilizados para esta figura fueron los de la figura 12A.

La figura 12A-1 muestra (a) Variacion de G' y tan8 con pH para microgeles DX GM-M-EGD. Los triangulos y rombos son G' y tan8, respectivamente. Los slmbolos cerrados muestran puntos de datos obtenidos utilizando PBS. (b) Variacion de g* con el pH de los microgeles DX. La doble reticulacion se realizo utilizando ^p = 0.08 (pH = 7.8) y las muestras se hincharon en los valores de pH que se muestran durante 8 dlas antes de la medicion.

La figura 12A-2 muestra la variacion de (a) G' y (b) tan8 con la tension para microgeles DX GM-M-EGD despues de la hinchazon a diferentes valores de pH (o en solucion salina estandarizada con fosfato, PBS) durante 8 dlas. La frecuencia utilizada fue de 1 Hz. Las relaciones de hinchazon de estos microgeles DX se muestran en la figura 12A-1.

De modo interesante, los valores G' alcanzaron ca. 106 Pa al pH mas bajo (3.8). Este proceso de mejora de G' comenzo una vez que el pH se disminuyo a menos de o igual a 5.8. Una disminucion en el valor de Mc se produce cuando el pH disminuye. El enlace de hidrogeno entre los grupos RCOOH cercanos tambien puede contribuir a la disminucion de Mc. A pH = 3.8 el microgel DX era fragil y valor g* disminuyo a aproximadamente 2% (Figura 10 (b)). A pH = 7.4 estos microgeles DX contienen aproximadamente 98% de agua en el equilibrio de hinchazon y tienen un modulo de aproximadamente 103 Pa con g* de 8.4%. Estos valores pueden ser apropiados para la aplicacion potencial como dispersiones inyectables para la reparacion de tejidos blandos. La capacidad de ajuste de estas propiedades debe ser alcanzable a traves del valor ^p utilizado durante la formation del microgel DX y tambien a traves de la selection de monomeros.

(ii) Variacion de (a) G' y (b) tan8 con la tension para microgeles reticulados preparados.

La siguiente ecuacion, que se origina a partir de la teorla de la elasticidad del caucho, se puede utilizar para describir el modulo de una red2021.

imagen6

Para la ecuacion (7) G es el modulo de cizallamiento, p es la densidad del pollmero, R y T tienen sus significados usuales y Mc es el peso molecular promedio en numero entre reticulaciones. Este ultimo es el peso molecular de las cadenas elasticamente eficaces. El valor para G' debe aumentar con la disminucion de Mc. Esto tendra dos contribuciones de microgeles DX; reticulaciones intra-partlculas e inter-partlculas.

La reologla dinamica se utilizo para investigar las propiedades mecanicas de los geles DX. Los datos de amplitud de tension se muestran en la figura 14A-1. Estos datos consisten en los dos geles flsicos SX originales (M-EGD o E-BDD y GM-M-EGD o GME- BDD) y los respectivos microgeles DX (DX GM-M-EGD o DX GM-E-BDD). La figura 14A-1 muestra una comparacion de las mediciones de amplitud de tension para microgeles DX y SX basados en M-EGD ((a) y (b)) y E- BDD ((c) y (d)). Los datos se obtuvieron en la misma fraction de volumen de partlcula (0.10) y pH (7.8). La frecuencia utilizada fue de 1 Hz. Las flechas en (c) y (d) muestran el cambio brusco en los valores que se produjeron de G' y tan8.

Se puede observar que se ha producido un ligero aumento en G' tanto de geles flsicos funcionalizados GM en comparacion con los microgeles originales respectivos. Esto se atribuye a la mayor hidrofobicidad de microgeles funcionalizados de GM. Es importante destacar que hay un aumento importante en G' bajo doble reticulacion. Por otra

parte, las tendencias para los valores G' (Figura (14A-1 (a) y (c)) para disminuir y los valores tan8 (Figura 14A-1 (b) y (d)) para aumentar a alta tension son muy disminuidos como consecuencia de la doble reticulacion. Ambos de estos comportamientos son evidencia indirecta de reticulacion inter-partlculas.

Se puede observar en la figura 14A-1 (d) que los valores tan8 son excepcionalmente bajos para microgel DX GM-E-BDD 5 con un promedio de tan8 ca. 0.01. Esto significa que la perdida de energla de disipacion era menos de 1% de la energla almacenada en esta red microgel DX. Las propiedades mecanicas del microgel DX GM-E-BDD fue casi completamente elastico. De modo interesante, este microgel Dx no muestra averla de la red inducida por tension hasta que la tension alcanza 50% (Figura 14A-1 (c)). Todos los microgeles estudiados en este documento en general, satisfacen un criterio clave para ser considerados como geles2223, esto es, tan8 <1.0. Sin embargo, para el microgel DX GM-E-BDD tan8 10 tambien es independiente de la frecuencia, que es un segundo criterio que muchos geles no satisfacen.

La figura 14A-.1.1 muestra amplitud de tension ((a) y (b)) y barrido de frecuencia ((c) y datos dinamicos de la reologla (d)) para DX GM (H) -M-EGD, DX GM-E-BDD y microgeles DX GM-M-EGD, donde los microgeles DX se prepararon a 9p = 0.10 y pH = 7.8.

Se esperaba que Mc fuera inversamente proporcional al grado de funcionalizacion. Por lo tanto, se esperaba que G' 15 aumente con funcionalizacion de acuerdo con la ecuacion (7). Esto se investigo mediante microgeles DX GM-M-EGD y DX GM (H) -M-EGD. Estos ultimos tenlan una mayor funcionalizacion GM (5.8% mol cf. 1.8% mol). La amplitud de la tension y los datos de reologla de barrido de frecuencia para los microgeles DX GM(H) -M-EGD y GM-M-EGD se muestran en la figura 14A-1.1. La comparacion de los datos que se muestran en las figuras 14A-1.1 (a) y (b), es evidente que los valores de G' para DX GM (H) -M-EGD son mucho mas altos que los de GM DX-M-EGD. En una 20 tension del 1% del valor de G' para DX GM (H) -M-EGD fue 18,800 Pa, y es seis veces el valor de DX GM-M-EGD. Este es un modulo alto para un gel que solo ocupa 10% vol. del volumen total. Ademas, el valor de tan8 disminuyo a 0.045. La dependencia de la frecuencia de G' y tambien tan8 se redujo en gran medida (Figura 14A-1.1 (c) y (d)). El microgel DX GM (H) -M-EGD es menos ductil ya que tan8 aumenta mas a una tension inferior (Figura 14A-1.1 (b)). El valor de g* es de 8.0%. Todos estos cambios son indicativos de un valor Mc mas pequeno como consecuencia de un mayor grado 25 de funcionalizacion de GM para DX GM (H) -M-EGD. Los cambios de G' y g* para este sistema se ajustan generalmente lo que se espera de un hidrogel convencional y que atribuyen estos cambios en el aumento de la reticulacion entre partlculas. Estos datos muestran que el modulo y ductilidad para los microgeles DX GM-M-EGD son ajustables utilizando la medida de funcionalizacion GM.

(iii) Variacion de (a) G' y tan8, as! como (b) g* con fraccion de volumen de partlculas de microgel de microgeles 30 doblemente reticulados del Ejemplo 4

Tambien se investigo el efecto de la fraccion de volumen de GM-M-EGD utilizado durante la doble reticulacion.

La figura 16A muestra (a) Efecto de la fraccion de volumen de GM-M-EGD utilizada durante doble reticulacion en G' y tan8. (b) La variacion de g* con la fraccion de volumen de pollmero. El pH utilizado para obtener estos datos fue 7.8. Una tension y frecuencia de 1% y 1 Hz se utilizo para obtener los datos mostrados en (a).

35 Los datos muestran un aumento de G' con ^p. Por otra parte, tan5 aumenta con ^p lo que sugiere un aumento de la disipacion con concentraciones altas de microgel. La figura 16A (a) muestra un incremento de G' cuando ^p alcanza 0.10. La figura 16A (b) muestra que esa g * aumenta fuertemente cuando ^p alcanza 0.10. Estos datos sugieren un valor 9p crltico de aproximadamente 0.10, donde el reticulacion entre partlculas se hace cada vez mas pronunciada. Presumiblemente, los valores mas altos ^p resultan en interpenetracion mas extensa en la periferia de las partlculas. 40 Estos datos muestran que el G' del microgel DX puede ser facilmente ajustado simplemente mediante el uso de la concentracion de partlculas de microgel.

(iv) Variacion de (a) G' y tan8, as! como (b) g* con pH utilizado durante la reticulacion en el Ejemplo 4.

Se investigo el efecto de pH utilizado durante doble reticulacion. Se utilizo una concentracion de partlculas de ^p = 0.10 para estos experimentos. Consideremos en primer lugar los datos de los experimentos amplitud de tension (Figura 14A- 45 2).

La figura 14A-2 muestra los datos de amplitud de tension para microgeles DX GM-M-EGD preparados y medidos en diferentes valores de pH (que se muestran en la leyenda). El valor para ^p fue de 0.10. Los datos representados se obtuvieron utilizando 1 Hz.

Se puede observar que G' no cambia significativamente con la tension (g) en el intervalo de tension de 0.1 a 10% para 50 los valores de pH entre 7.3 y 8.3. Este, sin embargo, comienza a disminuir a valores de tension mas altos. Estos datos muestran que el aumento del pH durante la preparacion (hasta 8.3), aumenta tanto G' como tambien la tension requerida para interrumpir la red. Mas alla de un pH de 8,3 a continuation, ambos parametros disminuyen. Cuando el pH fue mayor que o igual a 9.6, tan8 es mayor que 1.0 y el material sigue siendo fluido.

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La figura 14A-3 muestra los datos tomados de los espectros mecanicos (promedio de la tension y frecuencia de barrido). Observar para (c) que solo se muestran los datos de los geles (tan8 <1.0). Los datos utilizados son de 1% de tension y 1 Hz. Las llneas verticales que se muestran en (a) y (b) son el valor de pKa para GM-M-EGD. La curva en (c) es una gula para el ojo.

Se puede observar en la figura 14A-3 que los valores de G' aumentaron en aproximadamente factores de 2 y 7, respectivamente, para los microgeles DX GM-M-EGD y GM-E-BDD. Esto implica que Mc disminuyo en un factor de 2 para el DX GM-MEGD. Para la serie DX GM-E-BDD Mc debe haber disminuido por un factor de aproximadamente 7. Estos cambios de datos son generalmente consistentes con la ecuacion (3), ya que el primero debe tener un Mc mucho mas bajo debido al % mol de GMA mucho mayor incorporado (Tabla 1).

La tension rendimiento (g*) se define en este documento como la tension a la que G' disminuye al 95% de su valor en 1% de tension24. Esto aumenta de aproximadamente 8% para los geles SX (Figura 14A-3 (c)) hasta mas del 30% para el gel DX GM-M-EGD y 55% para el gel DX GM-E-BDD. El aumento de este valor es una indicacion de las cadenas relativamente flexibles que unen los microgeles juntos. Esto podrla ser debido a las cadenas extendidas de las partlculas en la periferia que han interpenetrado y reticulado con cadenas de partlculas vecinas.

Los geles flsicos deben formar primero en orden para una red de microgel unido covalentemente para formar posteriormente. Se puede ver en la figura 14A-3 que los microgeles DX con los valores de G' mas altos y valores de tan8 mas bajos se producen a valores de pH entre 7.3 y 8.3. De hecho, en este intervalo de pH (que incluye el pH fisiologico) tanto G' como g* aumentan con pH utilizado para preparar los microgeles DX. A valores de pH mas altos g* aumenta (La fig 14A-3 (c).); sin embargo, G' disminuye y tan8 aumento por encima de 1.0 lo que indica que un fluido esta presente. Esto es sugerente de un aumento de la masa molar entre puntos de reticulacion en la periferia de las partlculas. A valores de pH altos esto se convierte en insuficiente para permitir la formacion de gel.

El valor de g* sera sensible a los valores Mc dentro y entre las partlculas de microgel. El aumento de g* con pH para los microgeles DX GM-M-EGD (Figura 14A-3 (c)) sugiere que cadenas eficaces elasticamente ya estan presentes en la periferia de las partlculas a pH alto. A pH = 9.6, el gel se aproxima el estado fluido (tan8 cercano a 1.0). El valor de G' fue bajo (96 Pa). Sin embargo, ese sistema tenia el valor mas alto de g* 64%. Por otra parte, que la muestra fue completamente transparente (sin turbidez). A valores de pH mas altos de las dispersiones no formaron geles fisicos o unidos covalentemente. Es probable que el electrolito provocara colapso de partlculas a pH alto (debido a la detection) redujo la extension de la inter-penetracion de la particula hasta el punto que no se produjo la gelificacion fisica.

Conclusiones

En este trabajo, ha sido demostrado un nuevo metodo general para preparar microgeles DX. Este metodo utiliza solo microgeles funcionalizadas y se ha utilizado para preparar dos nuevas familias de microgeles DX sensibles a pH; DX- GM MEGD y DX GM-E-BDD. Estos microgeles DX no se vuelven a dispersar en soluciones reguladoras 0.1 M en el intervalo de pH 3.8 y 9.2 o PBS (0.15 M). Las propiedades mecanicas de los geles DX como hechos son fuertemente dependientes de pH y tambien se utiliza para la preparation ^p. Esto ofrece una oportunidad considerable para la sintonizacion de estas propiedades para aplicaciones especificas, por ejemplo, para la reparation de los tejidos blandos y/o soportar carga. Este estudio ha demostrado que la tension de modulo y rendimiento se puede controlar mediante las condiciones de preparacion.

Las propiedades mecanicas de los microgeles DX parecen estar determinado fuertemente por las del microgel original y tambien el grado de funcionalizacion. Los datos revelan que de alto modulo de los geles fisicos dara lugar a valores de varios modulos para la respectiva microgel DX. Sin embargo, el grado de aumento del modulo en dobles de reticulacion aumenta con el % mol de GMA incorporado. La ductilidad de los microgeles, como se juzga por g*, depende de la reticulacion inter-particulas y aumenta considerablemente cuando un ^p mayor que o igual a 0.10 se utiliza durante la preparacion DX. El estudio ha demostrado que las dispersiones inyectables que pueden formar microgeles DX se puede lograr utilizando ^p = 0.08. Si se requieren alto G' y rendimiento de tension, se deben utilizar valores de ^p mas altos.

El microgel DX GM-E-BDD utilizado en este estudio para demostrar la generalidad se demostro que era notable en terminos de sus propiedades elasticas. Se encontro que comportarse como un gel reologicamente casi perfecto (tan8 cercano a cero e invariante con frecuencia y alto g*) y componente viscoso excepcionalmente bajo. Esto podria ser un gel nuevo importante para la reparacion de tejidos blandos.

Ejemplo 5 - La reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado (para formar composiciones de la invention)

Dos tipos de microgeles que contienen MAA fueron preparados en este trabajo; M-EGD y E-BDD. La mayor parte del trabajo fue realizado en la serie M-EGD porque este sistema tiene mayor potencial aplicacion en la reparacion de tejidos blandos. M-EGD contiene comonomeros que han sido investigados para su aplicacion en el cemento oseo (Hiratani, H.; Alvarez- Lorenzo, C. Biomaterials 2004, 25, 1105.) y lentes de contacto (Zhang, X. S.; Revell, P. A.; Evans, S. L.; Tuke, M. A.; Gregson, P. J. J. Biomed. Mater. Res. 1999, 46, 279). El monomero fundamental (MMA) es un componente

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importante del cemento oseo. Los microgeles E-BDD se utilizaron para demostrar la generalidad de nuestro nuevo enfoque.

Los microgeles DX se prepararon utilizando una fraccion de volumen de polimero de ^p = 0.10, pH = 7.8 y en presencia de 22 mM de APS a menos que se indique lo contrario. Se adiciono el microgel funcionalizado-AEM (Microgel AEM10- M-EGD obtenido de Metodo 3B) a una solucion de NaOH/APS y luego se mezcla vigorosamente durante unos tres minutos. Despues de mezclar completamente la dispersion gelificada fisicamente se calento a 50°C durante 8 horas para producir DX AEM-M-EGD.

En el caso de microgeles investigados utilizando reologia, la reaccion DX se realizo durante al menos 1 hora en el reometro antes de que el sistema se enfrio a temperatura ambiente y los experimentos de reologia realizados.

La figura 9B muestra una imagen fotografica SEM de: (a) Microgel M-EGD (del Metodo 1A); (b) microgel E-BDD (del Metodo 2A). Imagenes de SEM representativas para los microgeles se muestran en la figura 1. Las particulas esfericas son evidentes.

La figura 10B muestra las imagenes de micrografia por barrido electronico de las muestras secadas con aire (a temperatura ambiente) de: (a) DX AEM-M-EGD y (b) DX AEM-M-EGD (soplado encima de la imagen de la figura 10B (a)). La muestra se preparo utilizando ^p ([AEM]/[MAA]) = 0.10 y pH = 7.8. La imagen SEM se obtuvo utilizando un instrumento Philips FEGSEM.

Estas muestras se secaron al aire (a RT) antes de SEM. Muestran evidencia de grietas de tamano micrometricas y nanometricas. De modo interesante, algunas particulas de microgel se pueden ver en la superficie obtenida utilizando una gran ampliacion. La similitud del tamano de las particulas de microgel M-EGD originales con las caracteristicas rodeadas de grietas en la figura 10B (b) conduce a la sugerencia de que las grietas se forman en las interfaces entre los agregados vecinos. Si se confirma, esto indicaria que la periferia entre los agregados es el punto mas debil de la matriz microgel DX.

Caracterizacion

(i) Variacion de (a) G' y (b) tan8 con la tension para microgeles reticulados preparados de acuerdo con el ejemplo 5.

Los microgeles DX se prepararon a partir microgeles gelificados fisicamente. Por lo tanto, el comportamiento reologico de las dispersiones de microgel reticuladas por separado se estudio en los mismos valores de pH y ^p utilizados para doble reticulacion.

La figura 14B-1 muestra barridos de amplitud de tension ((a) y (b)) y barridos de frecuencia ((c) y (d)) para dispersiones concentradas de microgel SX AEM-M-EGD. Las leyendas dan las relaciones [AEM]/[MAA] utilizadas para la preparacion de los microgeles AEM funcionalizados. Tambien se muestran los datos para microgel E-BDD. Las mediciones se hicieron utilizando 1 Hz (amplitud de tension) o 1% de tension (barrido de frecuencia) utilizando ^p = 0.1 y pH = 8.4.

En la figura 14B-1 se puede ver que hay una gran diferencia entre el comportamiento reologico dinamico para los microgeles M-EGD y E-BDD concentrados. El primero es un gel debil; mientras que, el ultimo tiene una elasticidad y una tension de rendimiento mucho mayor. Tras el trabajo relacionado (Chougnet, A.; Audibert, A.; Moan, M. Rheol. Acta 2007, 46, 793), la tension de rendimiento (g*) se define en este documento como la tension a la que G' se ha reducido a un 95% de su valor en 1% de tension. La variacion de G' y g* se muestran en la figura 14B-2.

La figura 14B-2 muestra la variacion de la tension de rendimiento de (a) G'y (b) con una relacion [AEM] /[MAA] para dispersiones concentradas de microgel reticuladas por separado. Los datos se obtuvieron utilizando ^p = 0.1 y pH = 8.4. Los puntos de datos para E-BDD se obtuvieron utilizando pH = 7.8. Se obtuvieron los datos para (a) al 1% de tension y 1 Hz.

Basandose en la ecuacion (3) se sugiere que el principal aumento de G' para E-BDD en comparacion con M-EGD (factor de 50) se debe a la mayor superposicion e inter-penetracion del microgel. Esto probablemente tambien explica el mayor valor para g* (factor 2.5 veces mayor).

Tambien se puede ver en la figura 14B-2 que el G' aumenta sustancialmente con relacion [AEM]/[MAA] utilizada para la preparacion. El aumento maximo es tambien un factor de aproximadamente 50. Sin embargo, en este caso g* no ha aumentado, pero es aproximadamente el mismo. Esto sugiere que no hay una mejora en la superposicion para el gel en su conjunto. Los datos PCS (Figura 2) indican que no se produjo inflamacion adicional como resultado de funcionalizacion como se esperaba, ya que hay menos grupos MAA presentes en el microgel funcionalizado. Por lo tanto, se puede concluir que los aumentos en G' observados para estos geles fisicos de funcionalizacion es debido a un aumento de la tendencia de los agregados de la particula para formar contactos fisicos a traves de la asociacion hidrofoba. De hecho, se observo que las dispersiones de microgel funcionalizado tenian una tendencia a la separacion de fases si se deja durante largos periodos de tiempo (mes) los que indica que se ha producido la agregacion. Estos

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datos a continuation, muestran que el aumento de la hidrofobicidad de las partlculas de microgel se agrega un componente hidrofobo a los contactos de partlcula-partlcula que se producen durante la doble reticulation. Este componente domina el comportamiento del gel para los microgeles M-EGD AEM funcionalizados. Se puede sugerir que estas dispersiones concentradas constan de hinchado, los agregados con una periferia hidrofobo que es rica en grupos de AEM.

Mediciones de reologla dinamica se hicieron utilizando los microgeles DX como se han obtenido a partir del Ejemplo 2.

La figura 14B-3 muestra barridos de amplitud de tension ((a) y (b)) y barridos de frecuencia ((c) y (d)) para microgeles DX AEM-MEGD. Las leyendas dan las relaciones [AEM]/[MAA] utilizadas para la preparation. Las mediciones se hicieron utilizando 1 Hz (amplitud de tension) o 1% de tension (barrido de frecuencia) utilizando ^p = 0.1 y pH = 8.4. Los datos para un microgel funcionalizado GM (DX GM-M-EGD) doblemente reticulado tambien se muestran para comparacion.

Los datos mostrados en la figura 14B-3 revelan que los microgeles DX tenlan valores G' consistentemente mas altos que los microgeles SX (Comparese con la figura 14B-1). Tanto los sistemas de microgel SX y DX tendlan a sufrir una disminucion importante en el aumento de G' y en tan8 cuando la tension supero aproximadamente el 10%. Los datos tambien permiten la comparacion entre los dos metodos de funcionalizacion. El valor de G' maximo alcanzado por los microgeles DX AEM-M-EGD ([AEM/[MAA] = 0.5) es de aproximadamente un factor de 4,5 que consigue utilizando el metodo de GMA-funcionalizacion. Estos datos sugieren que el metodo de funcionalizacion AEM proporciona microgeles DX con mayor elasticidad que los obtenidos utilizando funcionalizacion GM1.

Los datos de G" y tan8 dependiente de la frecuencia se muestran en la figura 9 (c) y (d). Los gradientes son muy bajos (especialmente para tan8 frente a la frecuencia) que indica el comportamiento similar a un gel como se identifica por los criterios de Winter and Chambon20'21. El intervalo de valores son los mismos que para los geles flsicos que contienen partlculas funcionalizadas AEM (Figura 5 (c) y (d)) y confirma que los microgeles DX preservan los componentes de disipacion bajos de sus propiedades reologicas.

(ii) Variation de (a) G' y tan 8 as! como (b) g* con condiciones de preparacion de microgeles doblemente reticulados del Ejemplo 5

La figura 14B-4 muestra el efecto de las condiciones de preparacion en las propiedades mecanicas de microgeles DX. Los valores G' y tan8 para microgeles DX y SX como una funcion de relation [AEM]/[MAA] utilizado para preparar los microgeles funcionalizados se muestran en (a) y (b). Los valores G' y g* se representan como una funcion de % mol de AEM presente dentro de los microgeles funcionalizados en (c) y (d). Los valores para el microgel DX GM-M-EGD se muestran como las llneas horizontales. Los datos se midieron a 1% de tension. Se obtuvieron los datos mediante ^p = 0.10 y pH = 8.4.

Los datos de G y tan8 dependientes de la frecuencia se muestran en la figura 9 (c) y (d). Los gradientes son muy bajos (especialmente para tan8 frente a la frecuencia) que indica el comportamiento similar a un gel como se identifican por los criterios de Winter and Chambon (Winter, H. H. Polim. Eng. Sci. 1987, 27, 1698; y Winter, H. H.; Chambon, F. J. Rheol. 1986, 30, 367). El intervalo de valores son los mismos que para los geles flsicos que contienen partlculas funcionalizadas AEM (Figura 14B-1 (c) y (d)) y confirma que los microgeles DX preservan los componentes de disipacion bajos de sus propiedades reologicas.

Los datos tomados de la figura 14B-3 a una frecuencia y tension de 1 Hz y 1%, respectivamente, se muestran en la figura 14B-4. El contraste entre microgeles DX y SX es muy claro en mayores grados de funcionalizacion. La comparacion de estos datos para los microgeles DX y SX respectivos (Figura 14B-4 (a) y (c)) muestra claramente que la reticulacion proporciona un aumento de G' ademas a la contribution hidrofoba discutida anteriormente. El aumento de los valores de G' se puede atribuir a reticulacion covalente adicional de los grupos de AEM. Por otra parte, G' para microgeles DX parece ser proporcional a la cantidad de AEM incorporado cuando el % mol AEM (exp) supera 3%. Los valores G' para los microgeles DX de hasta 104 Pa son valores respetables, dado que ^p solo 0.10. El uso de los valores mas altos ^p sin duda permitira valores G' mucho mas altos que se logran1.

Un punto interesante se refiere a la capacidad de estos microgeles DX para soportar la tension. Los valores de g* se muestran en la figura 14B-4 (d). Estos valores se encuentran entre 2.5 y 4.5% y no son significativamente diferentes a los de los respectivos microgeles SX AEM-M-EGD. El valor de g* para el microgel DX GM-M-EGD fue del 6.0%. Este fue un factor de 2 mas alto que los valores de g* para el microgel original (M-EGD) y tambien significativamente mayores que los de los microgeles DX AEM-M-EGD. Aunque el metodo de funcionalizacion AEM ha dado lugar a un aumento importante en G' para los microgeles DX M-EGD, estos geles son inherentemente mas fragiles. Presumiblemente, esto se debe a que la masa molar de las cadenas elasticamente eficaces en la periferia es baja. Esto podrla indicar reducida inter-penetracion de las periferias de los agregados en los geles flsicos.

Conclusiones

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En este estudio se investigo un nuevo metodo, que implica el acoplamiento EDC, para la preparacion de microgeles funcionalizadas de vinilo con el fin de aumentar el modulo de microgeles DX. Los datos de la valoracion indican que la funcionalizacion procede del exterior de los microgeles hacia el interior. La agregacion parcial efectuada durante el proceso de funcionalizacion. Esto parece desempenar un papel en la limitacion del grado maximo de funcionalizacion que se puede lograr a aproximadamente 12% mol en total, esto es, aproximadamente 1/tercero de los grupos RCOOH. Los geles flsicos (microgeles SX) formados en dispersiones concentradas que tuvieron una contribucion hidrofoba para su elasticidad. La doble reticulacion de las dispersiones parcialmente agregadas dio geles con alta elasticidad y esto es consistente con un grado relativamente alto de funcionalizacion. El modulo de los microgeles DX parece ser ajustable utilizando el % mol de AEM incorporado. Los resultados apoyan la sugerencia de que el acoplamiento EDC aumentarla la funcionalizacion y el modulo elastico. Las propiedades mecanicas de estos microgeles DX pueden ser controladas por su composicion. En el trabajo anterior (Liu, R.; Milani, A. H.; Freemont, T. J.; Saunders, B. R. Manuscript submitted to Soft Matter 2011) el maximo G' alcanzado fue de 2,800 Pa. Una mejora de modulo elastico por aproximadamente un factor de 4.5 en comparacion con el metodo anterior se encontro para el microgel DX AEM50-M-EGD. Sin embargo, estos microgeles DX son mas fragiles, con una tension de rendimiento que disminuye en aproximadamente un factor de 2. Esto es mas probable debido a la superposicion reducida entre los agregados debido a las periferias de partlculas de microgel mas hidrofobas. El trabajo futuro incluira el lavado de los microgeles M-EGD con acetato de etilo antes de la funcionalizacion con el fin de aumentar la hinchazon y la superposicion durante la doble reticulacion. Se espera que la tecnica aplique tambien a los microgeles AEM-E-BDD y esto es actualmente objeto de estudio. Un resultado exitoso muestra que la tecnica es ampliamente aplicable a microgeles que contienen RCOOH.

Ejemplo 6 - La reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado por irradiacion UV (para formar composiciones de la invencion)

Se adicionaron 2.5 ml de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) -GMA (16% en peso) a una mezcla de 0.2 ml de Irgacure 2959 (10 % en peso en etanol), 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M y 0.8 ml de agua DI por agitacion. El pH final se mantuvo entre 7.5 y 8.5. La dispersion se expone a la luz UV durante 2.5 horas.

Caracterizacion

(i) Variacion de (a) G' y tan8, as! como (b) g* con fraccion de volumen de partlculas de microgel para microgel 2BG doblemente reticulado.

Los resultados se muestran en la figura 16. Para convertir a % en peso se multiplican por ^p 100. La doble reticulacion se realizo en el uso de la irradiacion UV utilizando Microgel 2BG utilizando el metodo descrito en el Ejemplo 6.

Ejemplo 7 - La reticulacion de las partlculas de microgel de vinilo injertado mediante la formacion de una red de pollmero interpenetrante (para formar composiciones de la invencion)

Se utilizaron tres metodos:

Metodo A: En primer lugar, se adiciona el microgel. Por lo general, el sistema contenla 10% en peso de Microgel y 10% en peso de PEGDMA550, se adiciono una mezcla de 0.2 ml de solucion de persulfato de amonio (10% en peso en agua), 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M a una mezcla de 2.5 ml de microgel poli (mMa/MAA/EGDMA) -GMA (16% en peso), 0.36 ml de PEGDMA550 y 0.44 ml de agua DI por agitacion. El gel debil final como mezcla se mantuvo en un bano de agua y se dejo reaccionar a la temperatura deseada.

Metodo B: En primer lugar, se adiciona el reticulante. En este caso, se adicionan 2.5 ml de poli (MMA/MAA/EGDMA) microgel -GMA (16% en peso) a una mezcla pre-preparada de 0.2 ml de solucion de persulfato de amonio (10% en peso en agua), 0.5 ml de NaOH acuosa 2 M, 0.36 ml de PEGDMA550 y 0.34 ml de agua DI por agitacion. Antes de que el microgel se adicione la mezcla de todos los otros materiales se mezclaron durante medio minuto. El llquido final como mezcla se mantuvo en un bano de agua y se dejo reaccionar a la temperatura deseada.

Cuando se requiera, se adiciono acelerador, TEMED, a la mezcla de persulfato de amonio y una solucion de NaOH antes de microgel o se adiciono PEGDMA dentro del Metodo 6A y Metodo 6B. La adicion de TEMED disminuyo el tiempo de reticulacion y activar una temperatura de 37°C que es utilizado.

Metodo C: irradiacion UV

En el caso de iniciacion de luz UV, se adicionaron 2.5 ml de microgel poli (MMA/MAA/EGDMA) -GMA (16% en peso) a una mezcla de 0.2 ml de una solucion de Irgacure 2959 (10% en peso en etanol), 0.5 ml de NaOH acuoso 2 M, 0.36 ml de PEGDMA550 y 0.44 ml de agua DI por agitacion. Antes de que el microgel se adicionara la mezcla de todos los otros materiales se mezclaron durante medio minuto. El gel debil final como mezcla se coloca bajo luz UV durante 3 horas

Caracterizacion

Una composicion de microgel reticulado de la invencion formado por el metodo del Ejemplo 7, Metodo B (y en presencia de TEMED) se muestra en la figura 17. El material se preparo utilizando 10% en peso de PEGDMA550 y 10% en peso de microgel 2BG. El gel se preparo a 37°C. La barra de escala es en centlmetros.

Variacion de (a) G' y tan8, as! como (b) g* con % en peso de PEGDMA550 utilizada para preparar microgeles 5 doblemente reticulados.

La concentracion total de microgel 2BG y PEGDMA550 fue de 20% en peso. Cabe senalar que el unico sistema PEGDMA550 no se formo un gel de relleno de espacio; mientras que, los otros sistemas hicieron. Los microgeles doblemente reticulados se prepararon utilizando reticulacion UV, utilizando el proceso descrito en el Ejemplo 4, Metodo C. Los resultados se muestran en la figura 18.

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Claims

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Reivindicaciones

1. Una composicion que comprende una pluralidad de partlcuias de microgel, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si por cualquiera de

(i) un enlace cruzado covalente formado por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y/o

(ii) una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde la red de pollmero se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.
2. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las partlculas de microgel son sensibles al pH; y/o en donde las partlculas de microgel comprenden un pollmero seleccionado de poli(EA/MAA/EGDMA), poli(MMA/MAA/EGDMA), poli(EA/MAA/BDDA) o poli(MMA/MAA/BDDA).
3. Una composicion de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas covalentemente entre si, por enlaces cruzados covalentes formados por la reaccion de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel.
4. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde la unidad estructural que contiene vinilo es un grupo de la formula -L-B, en donde L es un enlace o grupo de union; y B es un grupo que comprende un grupo funcional de vinilo;

O

en donde la unidad estructural de vinilo tiene la formula:

imagen1

en donde L es un enlace o un grupo de union y Ri, R2 y R3 se seleccionan de H o alquilo (C1-3).
5. Una composicion de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si por una red de pollmero reticulado que interpenetra las partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde la red de pollmero se forma mediante la polimerizacion de una soluble en agua de monomeros de reticulacion que comprende dos o mas grupos vinilo.
6. Una composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, en donde el monomero de reticulacion tiene la siguiente formula:

R-- R-- R-

\ / \

/c=cx y

R-1

imagen2

imagen3

en donde:

(a) R21, R22, R23, R31, R32 y R33 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo lineal o ramificado; o un grupo N-alquilo de hasta 10 unidades de C; y

en donde (b) R24 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en :-

(i) -C(=O)-O-R34-O-C(=O)-, en donde R34 puede comprender -CH2-, -CH2CH2- o un grupo alquilo lineal o ramificado, tal como una cadena de metileno, que puede tener hasta 20 cadenas de C de longitud; o -C6H4-; o C6H3R35, en donde R35 comprende sustituyentes tales alquilo, por ejemplo, CH3; un grupo halogeno; o un grupo amida; u otros grupos di- o tri- fenilo sustituidos que contienen mas de uno de estos sustituyentes;

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(ii) -C(=O)-O-R36-C(=O)-, en donde R36 puede ser -(CH2CH2O)n-en donde n puede ser de 1 a 30;

(iii) -C(=O)-O-R37R38R37-, en donde R37 puede comprender enlaces ester degradables, por ejemplo, lactona, - [(CH2)5C(=O)-O]m-, lactida, -[CH(CH3)C(=O)-O]m-, glicolido, -[CH2C(=O)-O]m-, en donde m puede ser de 1 a 50, y en donde R38 puede ser -(CH2CH2O)n-, en donde n puede ser de 1 a 30;

(iv) -C(=O)-O-R39-, en donde R39 puede comprender enlaces ester degradables, por ejemplo, lactona, [(CH2)5C(=O)-O]m- , lactida, [Ch(CH3) C(=O)-O]m-, glicolido, [CH2C(=O)-O]m-, en donde m es entre 1 a 100;

(v) alilacrilatos, por ejemplo -C(=O)-O-R40-, en donde R40 puede ser -CH2-, -CH2CH2- o una cadena de metileno lineal, o ramificada hasta 20 cadenas de C de longitud, o-C6H4-, C6H3R41, en donde R41 puede comprender sustituyentes, tales como alquilo, CH3, un halogeno o un grupo amida u otros grupos fenilo di- o tri-sustituidos que contiene mas de uno de estos sustituyentes;

(vi) vinilbencenos, por ejemplo, C6H4 o C6H3R42 en donde R42 comprende sustituyentes, tales como alquilo; CH3; un halogeno o un grupo amida (vease (iii) arriba); u otros grupos fenilo sustituidos que contienen mas de uno de estos sustituyentes;

(vii) acrilamidas, por ejemplo C(=O)-NR43-R44-NR45C(-O)-, en donde R43 y R44 se pueden seleccionar independientemente de un grupo que consiste en H; CH3; un grupo alquilo lineal o ramificado; a grupo dialquilo; un grupo N-alquilo, de hasta 10 unidades de C; y en donde R44 puede comprender -CH2-, - CH2CH2- o una cadena de metileno lineal, o ramificada de hasta 20 cadenas de C de longitud; o -C6H4-, C6H3R41 en donde R41 comprende sustituyentes, tales como alquilo; CH3; un halogeno o un grupo amida u otro grupos fenilo di- o tri-sustituidos que contiene mas de uno de estos sustituyentes;

(viii) monomeros de reticulacion trifuncional, en donde R24 comprende cualquiera de los grupos enumerados en (b), as! como R21R22C=CR23, donde R21, R22 y R23 se describen en (a);

(ix) monomeros de reticulacion tetrafuncional, en donde R24 comprende cualquiera de los grupos enumerados en (b), as! como R21R22C=CR23 y R31R32C=CR33, en donde R21, R22, R23, R31, R32 y R33 se describen en (a); y

(x) en donde R24 puede contener cualquier combinacion de los grupos enumerados en (b).
7. La composition de acuerdo con cualquier reivindicacion precedente, en donde las partlculas de microgel adyacentes estan unidas entre si por ambos:

(i) un enlace cruzado covalente formado por la reaction de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y

(ii) una red de pollmero reticulado que interpenetra partlculas de microgel adyacentes y de este modo une las partlculas entre si, en donde la red de pollmero se forma por la polimerizacion de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo.
8. Un proceso para la preparation de una composicion de acuerdo con la reivindicacion 3, comprendiendo el proceso:

(i) proporcionar, en un medio acuoso, una pluralidad de partlculas de microgel que comprenden unidades estructurales funcionales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y (ii) * * * * * * * * * * *

(ii) hacer que las partlculas de microgel se hinchen de manera que las partlculas de microgel adyacentes se ponen en

contacto una con la otra y facilitan el acoplamiento de radicales libres de los grupos vinilo de unir de forma covalente

partlculas de microgel adyacentes entre si.
9. Un proceso para la preparacion de una composicion de acuerdo con la reivindicacion 5, comprendiendo el proceso:

(i) proporcionar, en un medio acuoso, una pluralidad de partlculas de microgel; y

(ii) hacer que las partlculas de microgel se hinchen en presencia de un monomero de reticulacion soluble en agua que

comprende dos o mas grupos vinilo tales que las partlculas de microgel adyacentes se ponen en contacto una con la

otra y facilitar la polimerizacion del monomero de reticulacion para formar una red de pollmero reticulado que

interpenetra las partlculas y une las partlculas de microgel adyacentes.
10. Un proceso para la preparacion de una composicion de acuerdo con la reivindicacion 7, comprendiendo el proceso:

(i) proporcionar, en un medio acuoso, una pluralidad de partlculas de microgel que comprenden unidades estructurales

funcionales que contienen vinilo injertadas sobre las superficies de las partlculas de microgel; y

(ii) hacer que las partlcuias de microgel se hinchen en presencia de un monomero de reticulacion soluble en agua que comprende dos o mas grupos vinilo tales que las partlculas de microgel adyacentes se ponen en contacto una con la otra; y

(iii) facilitando ambos:

5 (a) el acoplamiento de radicales libres de los grupos vinilo que unen

adyacentes entre si; y

(b) la polimerizacion del monomero de reticulacion para formar una red partlculas y une partlculas de microgel adyacentes entre si.
11. El proceso de acuerdo con la reivindicacion 10, en donde facilitar la etapa (iii) comprende facilitar ambos (a) y (b) de 10 forma simultanea.
12. Un proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 o la reivindicacion 11, en donde las partlculas de microgel son causadas al hincharse por un cambio en el pH.
13. Un proceso de preparacion de una partlcula de microgel que comprende una pluralidad de unidades estructurales que contienen vinilo injertadas sobre la superficie de la partlcula de microgel, el proceso que comprende hacer

15 reaccionar una partlcula de microgel con un compuesto de la formula:

Z-L-B

en donde L y B son como se definen en la reivindicacion 4, y Z es un grupo reactivo adaptado para reaccionar con los grupos de funcion de la partlcula de microgel.
14. Una composicion como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para uso en el tratamiento del 20 tejido blando danado o degenerado.

de forma covalente partlculas de microgel de pollmero reticulado que interpenetra las