ES2588778T3 - Moduladores de la interacción de astrina y raptor, y usos de los mismos en la terapia del cáncer - Google Patents

Abstract

Un método de identificación de un compuesto que modula la interacción de astrina con raptor en una célula, que comprende las etapas de a) poner en contacto al menos uno de astrina, un fragmento de unión a raptor de astrina y/o una célula que expresa astrina o un fragmento de unión a raptor de la misma con al menos un compuesto que posiblemente modula la interacción de astrina con raptor en una célula, y b) identificar una modulación de la unión de astrina o dicho fragmento a raptor en presencia de dicho al menos un compuesto.

Description

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mTOR se produce en dos complejos multiproteína distintos, llamados complejo 1 de mTOR (mTORC1) y mTORC2. El control traduccional por mTORC1 se produce a varios niveles, a corto plazo por la regulación de varios factores de iniciación de la traducción que incluyen la proteína de unión a 4E (4E-BP1), y a largo plazo por el control de la traducción de componentes ribosómicos, y por el procesamiento de pre-ARNr (Grzmil, M. y Hemmings, B.A. (2012). Translation regulation as a therapeutic target in cancer. Cancer Res 72, 3891-3900; Iadevaia, V., Wang, X., Yao, Z., Foster, L.J. y Proud, C.G. (2012a). Evaluation of mTOR-regulated mRNA translation. Methods Mol Biol 821, 171185; Iadevaia, V., Zhang, Z., Jan, E. y Proud, C.G. (2012b). mTOR signaling regulates the processing of pre-rRNA in human cells. Nucleic Acids Res 40, 2527-2539; Thedieck, K. y Hall, M.N. (2009). Translational Control by Amino Acids and Energy. En The Handbook of Cell Signaling, R.B.a.E. Dennis, ed., pp. 2285-2293).

El estrés oxidativo y ROS inducen a los gránulos de estrés (SG) y cuerpos p (PB), que son estructuras dependientes de microtúbulos altamente dinámicas, que regulan la renovación y la traducción de ARNm y contribuyen a la supervivencia celular (revisado por Thomas et al. (Thomas, M.G., Loschi, M., Desbats, M.A. y Boccaccio, G.L. (2011). RNA granules: the good, the bad and the ugly. Cell Signal 23, 324-334; y Anderson, P., y Kedersha, N. (2009b). Stress granules. Curr Biol 19, R397-398)). Los SG y los PB son gránulos de ARN evolutivamente conservados. Están en intercambio constante entre sí y comparten varios componentes que incluyen la proteína marcadora de PB y SG p54/DDX6. Los PB son componentes celulares constitutivos, y son sitios de degradación de ARNm mediante miARN, iARN, o degradación mediada por no sentido. A diferencia, los SG son sitios de almacenamiento de ARNm que se forman bajo estrés. La respuesta celular a la temperatura, estrés por nutrientes, estrés oxidativo o irradiación activa varios mecanismos para la represión traduccional, entre ellos la fosforilación e inhibición de eIF2alfa-S51, que conduce a la acumulación de ARNm poliadenilado no polisómico y factores de iniciación de la traducción dentro de gránulos de ARN. Estos complejos de ARNm-proteína pueden ensamblarse en SG, junto con componentes de SG de auto-asociación, que incluyen la proteína de unión a ARN asociada a gránulos citotóxicos TIA1, la proteína relacionada con TIA-1 TIAR, y la proteína de unión a RasGAP SH3 G3BP1. En particular, la expresión en exceso de estos últimos componentes es frecuentemente suficiente para inducir SG. Los ARNm en SG se clasifican por la degradación en PB, o se guardan para el reinicio de la traducción tras el alivio del estrés.

Aunque tanto los SG como mTOR están estrechamente conectados al estrés por redox y a la regulación traduccional, no hay evidencia de conexiones entre los dos en mamíferos, y los enlaces moleculares directos siguen siendo imprecisos. En la presente invención, los inventores establecen la astrina como un componente crítico de la señalización de mTORC1, que acopla la actividad de mTORC1 con el ensamblaje de SG y la susceptibilidad a la apoptosis de células cancerosas. Podrían demostrar que la astrina recluta el componente de mTORC1 raptor a SG y disocia el complejo de mTOR-raptor para limitar la activación de mTORC1 tras el desafío metabólico y la inducción de estrés por redox. Además, los datos indican que la astrina media en las funciones de SG antiapoptósicas dependientes de mTORC1. Como la astrina se expresa altamente en células cancerosas, y el estrés por redox inducido por hipoxia es una condición común en tumores, la astrina es una diana prometedora para la intervención terapéutica para controlar la actividad de mTORC1 y sensibilizar células tumorales a la apoptosis.

Las siguientes figuras, secuencias y ejemplos simplemente sirven para ilustrar la invención y no debe interpretarse que limiten el alcance de la invención a las realizaciones particulares de la invención descritas en los ejemplos.

La SEQ ID NO 1 muestra la secuencia de aminoácidos de astrina humana.

La Figura 1 muestra esquemáticamente que la astrina se induce y la NFL se inhibe en líneas celulares de tumores de mama y pulmón agresivas.

La Figura 2 muestra la unión de astrina a raptor.

La Figura 3 muestra que la deficiencia de astrina induce al complejo 1 de mTOR.

La Figura 4 muestra que el arsenito induce estrés y la posterior unión astrina-raptor.

La Figura 5 muestra construcciones de astrina como se usan en el contexto de la presente invención, y para su uso como herramientas de cribado.

La Figura 6 muestra los hallazgos como se usan en el contexto de la presente invención en una visión general.

Ejemplos

Procedimientos experimentales

Construcciones, reactivos, líneas celulares y cultivo de tejido. Se compró pCMV6-AC-FLAG-astrina (N.º de pedido RC201783) de Origen, Rockville, MD, EE.UU. La secuencia de ADNc de longitud completa de la astrina se transfirió dentro de los siguientes plásmidos según el protocolo del fabricante: pCMV6-AC-GFP, pCMV6-AN-GFP, pCMV6-AN-FLAG, pCMV6-entry. Las transfecciones de ADN se hicieron con JetPEI, PolyPlus, Estrasburgo, Francia, como se describe (Sonntag, A.G., Dalle Pezze, P., Shanley, D.P. y Thedieck, K. (2012). A modelling-experimental approach reveals IRS dependent regulation of AMPK by Insulin. FEBS J).

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trataron con 0,5 % de saponina en PBS durante 15 minutos a 4 ºC y 15 minutos a TA, y se bloquearon en 5 % de BSA en PBS durante 60 minutos a 37 ºC. Las células se incubaron con anticuerpos primarios (auto-producidos contra componentes del complejo de mTOR y astrina, dilución 1:50 en diluyente de anticuerpo) durante la noche a 4 ºC. Al día siguiente, las células se incubaron con las sondas de PLA correspondientes (anticuerpos secundarios conjugados con sondas de ADN únicas para anti-ratón, anti-conejo o anti-rata, respectivamente) durante 60 minutos a 37 ºC. Para la ligación y circularización de los oligos de ADN, las células se incubaron con disolución de ligasa durante 30 minutos a 37 ºC. Para la amplificación por círculo rodante, las células se incubaron con disolución de amplificación, que contenía un conector de ADN marcado con Alexa 555 complementario como fluoróforo detectable durante 120 minutos a 37 ºC. Las células se montaron con un cubreobjetos (24x50 mm) usando un volumen mínimo de medio Duolink In Situ Mounting con DAPI y se analizaron por microscopía confocal (microscopio de barrido láser LSM 510 o LSM 780 META de Zeiss con un objetivo 63x/1.4 oil DIC), (Zeiss, Jena, Alemania). Las fotografías se tomaron con tamaño de marco óptimo de 1024x1024 (1764x1764) píxeles, velocidad de barrido 7 para las imágenes superiores y con intervalo dinámico de 12 bit (8 bit). El desplazamiento del amplificador y la ganancia del detector se ajustaron en primer lugar y nunca se cambiaron durante una sesión experimental. La relación señal por célula (números de puntos de PLA rojos por célula) se analizó con el software BlobFinder libremente distribuido (Centro de Análisis de la Imagen, Universidad de Uppsala, Suecia) que cuenta señales de PLA y núcleos como tamaño de píxel definido para cada célula individual.

Cuantificaciones y estadística. Todos los experimentos se realizaron en al menos N=3 duplicados. Las señales en IB se cuantificaron y se normalizaron como se describió (Dalle Pezze et al., 2012b). Para el análisis de datos de IB y PLA se usó la prueba de la t de Student bilateral no paramétrica que supone varianzas desiguales. El análisis estadístico se realizó con un intervalo de confianza de p < 0,05. Se eligió el error estándar de la media (EEM) para estimar la variabilidad estadística. Se calcularon diagramas de caja y bigotes con el software GraphPad Prism 6.01. Se calcularon los percentiles según la siguiente fórmula: Resultado = percentil * [n(valores)+1/100]. Se indica la mediana (centil 50), el centil 25 a 75 (caja) y el centil 5 a 95 (bigotes).

La astrina es un interactor de raptor específico que inhibe el ensamblaje de mTORC1

Para identificar novedosos reguladores de mTOR, los inventores inmunopurificaron mTOR endógeno, raptor (mTORC1) y Rictor (mTORC2) de células HeLa y analizaron los inmunoprecipitados (IP) por espectrometría de masas (EM) como se describió (Thedieck et al., 2007). Sorprendentemente, aunque generalmente se cree que raptor actúa en complejo con mTOR (Laplante, M. y Sabatini, D.M. (2012). mTOR Signaling in Growth Control and Disease. Cell 149, 274-293), los inventores identificaron astrina en IP de raptor (Fig. 2, cobertura de secuencia del 12 %), pero no IP de mTOR o Rictor. Esto sugirió que la astrina se une a raptor, cuando la última no está en un complejo con mTOR (mTORC1).

La astrina (UniProtKB: Q96R06) es una proteína grande de 160 y 140 kDa, la isoforma más pequeña que posiblemente surge de la escisión proteolítica. Los altos niveles de ARNm de astrina se correlacionan con pronóstico negativo en cáncer de mama y de pulmón (Buechler, S. (2009). Low expression of a few genes indicates good prognosis in estrogen receptor positive breast cancer. BMC Cancer 9, 243; Valk, K., Vooder, T., Kolde, R., Reintam, M.A., Petzold, C., Vilo, J. y Metspalu, A. (2010). Gene expression profiles of non-small cell lung cancer: survival prediction and new biomarkers. Oncology 79, 283-292). Por tanto, los inventores analizaron la expresión de proteínas de astrina en tres líneas de células de cáncer de mama. Los niveles de proteína de astrina se correlacionaron positivamente con la actividad de Akt, y se correlacionaron negativamente con la fosforilación de los sustratos de mTORC1, PRAS40-S183 y p70-S6K1-T389.

La expresión en exceso de FLAG-astrina en células HeLa aumentó el nivel de raptor, reforzando la noción de una posible conexión funcional entre astrina y raptor. FLAG-astrina co-inmunoprecipitó con raptor, pero no con mTOR o el componente de mTORC2, Rictor, confirmando los datos de EM. Por tanto, la astrina endógena se coinmunopurificó con raptor, pero no con mTOR (Fig. 2). Así, la astrina es un interactor específico del componente de mTORC1 esencial raptor, pero no de la propia cinasa de mTOR. Tras la incubación de células con el inhibidor de mTORC1 alostérico, rapamicina, durante 30 minutos seguido de IP, se observó que raptor se disociaba del complejo de mTOR-raptor, pero no se observó efecto sobre la unión astrina-raptor. Así, la actividad de mTORC1 no afecta la unión raptor-astrina. A diferencia, la inhibición de astrina afecta el ensamblaje de mTORC1, ya que la inactivación de ARNip de astrina produjo el aumento de las cantidades de mTOR en IP de raptor. Asimismo, la medición in situ de la asociación de mTOR-raptor por ensayo de ligación por proximidad (PLA) (Soderberg, O., Leuchowius, K.J., Gullberg, M., Jarvius, M., Weibrecht, I., Larsson, L.G. y Landegren, U. (2008). Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods 45, 227-232) revelaron la drástica inducción del ensamblaje de mTORC1 tras la inactivación de astrina (Figs. 3 y 4). Los inventores llegan a la conclusión de que la astrina compite con mTOR por la unión a raptor, produciendo elevada formación de mTORC1 en ausencia de astrina.

La astrina inhibe la señalización de mTORC1

La astrina se ha descrito como un regulador de la progresión mitótica, y se ha propuesto para mTORC1 una función en la mitosis. Por tanto, los inventores probaron si la deficiencia de astrina alteraba la actividad de mTORC1 durante la mitosis. En células HeLa se detuvo en G2/M con nocodazol y -tras la liberación del bloque mitótico -se observó

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La represión de mTORC1 dependiente de SG y de astrina protege a las células cancerosas de la apoptosis inducida por el estrés oxidativo

Para la implicaciones médicas de los presentes hallazgos, se correlacionan altos niveles de astrina con agresividad de células cancerosas (Buechler, 2009; Valk et al., 2010), además de alta señalización de Akt y baja de mTORC1 en células de tumor de mama. El estrés por rédox debido a hipoxia es una condición común en tumores, y las células tumorales necesitan evadirse de la apoptosis en respuesta a ataques oxidativos (Fruehauf, J.P. y Meyskens, F.L., Jr. (2007). Reactive oxygen species: a breath of life or death? Clin Cancer Res 13, 789-794; Sosa et al., 2012). En línea, la quimiorresistencia de células cancerosas frecuentemente se basa en su elevada capacidad para suprimir la apoptosis (Ajabnoor, G.M., Crook, T. y Coley, H.M. (2012). Paclitaxel resistance is associated with switch from apoptotic to autophagic cell death in MCF-7 breast cancer cells. Cell Death Dis 3, e260). Aunque se cree que mTOR activo promueve el crecimiento celular y así inhibe la apoptosis, la señalización de mTORC1 hiperactivo sensibiliza a las células para la apoptosis (Thedieck et al., 2007). De forma interesante, la deficiencia de astrina facilita la apoptosis, y los inventores encontraron que la siAstrina sensibilizó las células HeLa a la apoptosis inducida por H2O2, como se mide por PAR escindido). Y, lo que es más importante, la inducción de apoptosis dependiente de astrina se inhibió por la inhibición de mTORC1 mediada por shRaptor, y los inventores llegan a la conclusión de que la supresión de mTORC1 por astrina protege a las células HeLa del estrés oxidativo contra la apoptosis. Estos hallazgos también se traducen en otras células cancerosas, como se mostró en varias líneas de células de cáncer de mama, tales como células de cáncer de mama MCF-7. En resumen, la astrina inhibe la apoptosis en células cancerosas previniendo la hiperactivación de mTORC1 bajo estrés oxidativo (véase la Fig. 6).

En el contexto de la presente invención, la astrina y su interacción con raptor se identificaron como componentes críticos novedosos de la red de mTORC1. La astrina recluta raptor a SG, conduciendo al desensamblaje de mTORC1 que limita la actividad de mTORC1 en condiciones que inducen mTORC1, que incluyen la estimulación de nutrientes y de insulina, además de estrés oxidativo y por calor. La presente invención desenreda la astrina como el enlace clave que disocia mTORC1 y limita su actividad en células metabólicamente expuestas. La inhibición de tanto astrina como SG bajo estrés transitorio produce células que se someten a apoptosis debido a la hiperactivación de mTORC1, subrayando la importancia crítica de la astrina y SG en limitar la actividad de mTORC1. El inhibidor de mTORC1, rapamicina, prolonga la vida (Harrison, D.E., Strong, R., Sharp, Z.D., Nelson, J.F., Astle, C.M., Flurkey, K., Nadon, N.L., Wilkinson, J.E., Frenkel, K., Carter, C.S., et al. (2009). Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature 460, 392-395) y previene el desarrollo del cáncer (Anisimov, V.N., Zabezhinski, M.A., Popovich, I.G., Piskunova, T.S., Semenchenko, A.V., Tyndyk, M.L., Yurova, M.N., Antoch, M.P., y Blagosklonny, M.V. (2010). Rapamycin extends maximal lifespan in cancer-prone mice. Am J Pathol 176, 20922097). Así, la activación de mTORC1 mediada por ROS puede ser importante para la función celular normal, y también puede participar en el envejecimiento y el desarrollo de cáncer. Los datos de los presentes inventores soportan esta función dual, ya que el agotamiento de astrina y la hiperactivación de mTORC1 resultante fomentan la muerte celular bajo estrés transitorio, pero el aumento de los niveles de astrina se correlacionó positivamente con la progresión del cáncer (Buechler, 2009; Valk et al., 2010).

Un efecto de la inhibición de mTORC1 mediada por astrina es la inactivación de NFL dependiente de mTORC1 hacia Akt. La activación de Akt produce elevada fosforilación e inactivación de FoxO-1/3A, un mecanismo que es muy conocido para prevenir la apoptosis (Appenzeller-Herzog, C. y Hall, M.N. (2012). Bidirectional crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling. Trends Cell Biol 22, 274-282). En células sanas, la supresión mediada por astrina puede ser beneficiosa, ya que previene que las células experimenten apoptosis tras los estreses transitorios o desafío metabólico. A diferencia, en células cancerosas, la supresión de mTORC1 y de la apoptosis mediada por astrina puede llegar a ser perjudicial, ya que previene que las células que crecen demasiado experimenten muerte celular programada. El entendimiento de este proceso abre nuevas vías a la terapia del cáncer. En particular, la astrina es altamente expresada en células tumorales (Buechler, 2009; Valk et al., 2010) y espermatocitos, mientras que aparece solo a bajos niveles en todos los otros tejidos no de cáncer (análisis GeneNote, www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=SPAG5). Por tanto, la inhibición de astrina puede permitir modular la actividad de la red de mTOR específicamente en células tumorales, y esto puede ser particularmente beneficioso para restaurar NFL y lograr la sensibilización a la apoptosis cuando Akt es hiperactiva, una condición frecuentemente encontrada en cánceres agresivos (Spears, M., Cunningham, C.A., Taylor, K.J., Mallon, E.A., Thomas, J.S., Kerr, G.R., Jack, W.J., Kunkler, I.H., Cameron, D.A., Chetty, U., et al. (2012). Proximity ligation assays for isoform-specific Akt activation in breast cancer identify activated Akt1 as a driver of progression. J Pathol 227, 481-489). La progresión del ciclo celular defectuosa en células deficientes en astrina podría limitar la idoneidad de la astrina como diana terapéutica, pero ratones deficientes en astrina (Xue, J., Tarnasky, H.A., Rancourt, D.E. y van Der Hoorn, F.A. (2002). Targeted disruption of the testicular SPAG5/deepest protein does not affect spermatogenesis or fertility. Mol Cell Biol 22, 1993-1997) y ratas (Yagi, M., Takenaka, M., Suzuki, K. y Suzuki, H. (2007). Reduced mitotic activity and increased apoptosis of fetal sertoli cells in rat hypogonadic (hgn/hgn) testes. J Reprod Dev 53, 581-589) son viables, sin presentar fenotipos importantes. Así, es concebible elegir como diana la astrina en enfermedad humana sin afectar las funciones vitales.

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Claims (1)

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