ES2586120T3 - Composiciones de proteína A y procedimientos de utilización - Google Patents

Abstract

Composición que comprende una cantidad eficaz de proteína A monomérica (PA) suficiente para tratar un trastorno autoinmunitario para su utilización en el tratamiento del trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario.

Description

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DESCRIPCION

Composiciones de protefna A y procedimientos de utilizacion.

Campo tecnico

La invencion se refiere al tratamiento de trastornos inmunitarios y patologfas asociadas con o provocadas por trastornos inmunitarios tal como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes

La protefna A es una glicoprotefna de 40.000 Da extrafda de la pared celular de diversas bacterias. Las bacterias utilizan PA como sitio de direccionamiento y union para la fijacion a tejido. La protefna A presenta una alta afinidad por la parte Fc de determinadas clases de inmunoglobulinas y una afinidad incluso superior por esas inmunoglobulinas una vez que se han unido a antfgeno. Esta propiedad bioqufmica de PA se ha utilizado en un gran numero de aplicaciones. Estas aplicaciones de PA reflejan una utilizacion de las propiedades de union a Fc de la molecula o la capacidad de la Pa para estimular la inmunidad humoral en ausencia de induccion de antfgeno especffico (aplicaciones de superantfgeno).

Por ejemplo, se ha descrito que puede utilizarse la protefna A en el control terapeutico y profilactico de infeccion por Leishmania donovani en animales para experimentacion. El efecto antileishmaniasico de PA se atribuyo a la activacion de macrofagos que conducen a una potenciacion de sus actividades fagocitarias y leishmaniacida (Ghose et al., 1999; Immunology Letters vol. 56, n.° 3, pag. 175-181). Ademas, se notifico que las composiciones que comprenden formas reticuladas de protefna A pueden utilizarse en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias o neoplasicas (documento WO 97/36614).

Sumario

La invencion se basa por lo menos en parte en una(s) caracterfstica(s) de PA que es/son distinta(s) de sus caracterfsticas de union a Fc y propiedades de superantfgeno. Esta caracterfstica confiere una o mas de las siguientes actividades en animales: una capacidad para regular proceso(s) aberrante(s) e inhibir el dano tisular o revertir por lo menos una parte de dano tisular existente provocado por el/los proceso(s) sin regular; una capacidad para volver a regular proceso(s) inmunitario(s) aberrante(s) o indeseado(s).

La presente invencion se define por las reivindicaciones. En mas detalle, la presente invencion se refiere a una composicion que comprende una cantidad eficaz de protefna A monomerica (PA) suficiente para tratar un trastorno autoinmunitario para su utilizacion en el tratamiento del trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario.

Tambien se describen en la presente memoria procedimientos para modular una respuesta inmunitaria en un sujeto. Un procedimiento puede incluir administrar al sujeto una composicion que comprende una cantidad eficaz de un factor de diferenciacion de linfocitos suficiente para modular la respuesta inmunitaria. El factor de diferenciacion de linfocitos comprende protefna A (PA).

La presente invencion proporciona composiciones para su utilizacion en el tratamiento de una disfuncion inmunitaria en un sujeto con o con riesgo de una disfuncion inmunitaria tal como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas. Segun la invencion, la composicion comprende una cantidad eficaz de protefna A (PA) suficiente para tratar la disfuncion inmunitaria. Segun la presente invencion, la disfuncion inmunitaria es un trastorno autoinmunitario (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriasica, diabetes mellitus, esclerosis multiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso sistemico (sLe), tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis atopica, dermatitis eccematosa, psoriasis, sfndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso cutaneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, eritema nudoso leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alergica, encefalopatfa hemorragica necrotizante aguda, perdida de audicion neurosensorial progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia de globulos rojos puros, trombocitopenia idiopatica, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa cronica, sfndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, fibrosis pulmonar intersticial , tiroiditis de Hashimoto, sfndrome poliglandular autoinmunitario, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes mellitus resistente a insulina, esterilidad mediada por el sistema inmunitario, enfermedad de Addison autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, dermatitis herpetiforme, alopecia autoinmunitaria, vitiligo, anemia hemolftica autoinmunitaria, purpura trombocitopenica autoinmunitaria, anemia perniciosa, sfndrome de Guillain-Barre, sfndrome del hombre rfgido, fiebre reumatica aguda, oftalmia simpatica, sfndrome de Goodpasture, vasculitis necrotizante sistemica, sfndrome antifosfolipfdico o una alergia).

La invencion tambien se basa por lo menos en parte en las bajas cantidades de PA requeridas para lograr las actividades. En particular, PA presenta las actividades mencionadas anteriormente a bajas concentraciones, normalmente inferiores a las cantidades utilizadas para aplicaciones de superantfgeno.

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Por tanto, los procedimientos descritos en la presente memoria pueden ponerse en practica con PA en cantidades eficaces para provocar una o mas de las actividades dadas a conocer en la presente memoria, pero sin actividad de superantfgeno sustancial, actividad de union a Fc o estimulacion sustancial de la inmunidad humoral. Una cantidad puede ser una dosis de aproximadamente 1 picogramo a aproximadamente 1 microgramo de PA. Una cantidad puede ser una dosis individual de aproximadamente 1 picogramo a aproximadamente 1 microgramo de PA administrada de manera intermitente a lo largo de aproximadamente 1 a 15 semanas. Una cantidad puede ser una dosis individual de aproximadamente 1 picogramo a aproximadamente 1 microgramo de PA administrada en dfas alternos a lo largo de aproximadamente 7 a 21 dfas.

Ademas, en la presente memoria se describen composiciones que provocan una o mas de las actividades dadas a conocer en la presente memoria en forma de dosificacion unitaria. Una composicion puede comprender una forma de dosificacion unitaria de PA de desde aproximadamente 0,5-5, 5-10, 10-20, 20-50 o 50-100, 100-500, 100-1000 picogramos. Una composicion puede comprender una forma de dosificacion unitaria de PA de desde aproximadamente 1-10, 10-100, 100-500 o aproximadamente 500-1000 nanogramos. Una composicion puede comprender una forma de dosificacion unitaria de PA suficiente para reducir una respuesta inflamatoria o inflamacion en un sujeto.

En la presente memoria se describen composiciones farmaceuticas que incluyen una forma de dosificacion unitaria de PA (por ejemplo, 0,5-5, 5-10, 10-20, 20-50 o 50-100, 100-500, 100-1000 picogramos; 1-10, 10-100, 100-500 o aproximadamente 500-1000 nanogramos). En la presente memoria se describen composiciones farmaceuticas que incluyen una forma de dosificacion unitaria de PA que provoca una o mas de las actividades dadas a conocer en la presente memoria (por ejemplo, reduce una respuesta inflamatoria o inflamacion en un sujeto).

En la presente memoria tambien se describen kits que incluyen una forma de dosificacion unitaria de PA (o composiciones farmaceuticas), incluyendo opcionalmente ademas tales kits instrucciones de utilizacion en un procedimiento descrito en la presente memoria (por ejemplo, reduccion de una respuesta inflamatoria, inflamacion o dano tisular o celular provocado por una respuesta inflamatoria o inflamacion en un sujeto). Un kit puede incluir una pluralidad de formas de dosificacion unitaria de PA. Un kit puede incluir ademas un farmaco (por ejemplo, que reduce una respuesta inflamatoria o inflamacion).

Descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra el aumento de peso y la cinetica de crecimiento de A) ratones normales de control sin tratar

(C57BL/6J); B) ratones BXSB sin tratar; y C) ratones BXSB con tratamiento con PA.

Descripcion detallada

La presente invencion se define por las reivindicaciones. La invencion se basa por lo menos en parte en la caracterizacion de una o mas actividades de protefna A (PA) que parecen ser distintas de sus propiedades de superantfgeno, actividad de union a Fc o su capacidad para estimular la inmunidad humoral. Se cree que estas actividades de PA distintas pueden atribuirse por lo menos en parte a la capacidad de las PA para volver a regular o normalizar proceso(s) fisiologico(s) indeseado(s) o aberrante(s) tales como disfuncion inmunitaria. La capacidad de la PA para volver a regular o normalizar proceso(s) fisiologico(s) da como resultado muchas actividades beneficiosas diferentes incluyendo, por ejemplo, modular la respuesta inmunitaria aberrante o indeseada (por ejemplo, volver a regularla o normalizarla), mejorar o reducir la autoinmunidad, reducir la inflamacion o una respuesta inflamatoria, inhibir o revertir por lo menos una parte de dano tisular provocado por un(os) proceso(s) no regulado(s) tales como una respuesta inmunitaria indeseada o aberrante.

Mas particularmente, la eficacia de PA se demuestra mediante la utilizacion de un modelo de inflamacion murino de artritis inducida por colageno (CIA). La respuesta inmunitaria inducida frente a colageno tipo II esta mediada por anticuerpos, provocando una respuesta inflamatoria que progresa rapidamente que puede evaluarse midiendo la inflamacion en articulaciones afectadas y tambien aplicando una evaluacion clfnica normalizada para las articulaciones afectadas (denominada “fndice clfnico” o “Cl”). La evaluacion mediante CI implica medidas tanto del hinchamiento como de la movilidad. Tal como se muestra en el ejemplo 1, la PA a bajas concentraciones inhibe una respuesta inflamatoria aguda en el modelo murino de CIA. La exploracion histologica de articulaciones de rodilla y tobillo revelo una reduccion del dano tisular asf como de la infiltracion de celulas inmunitarias de la capsula sinovial.

La eficacia de PA tambien se demuestra en un modelo animal BXSB, que representa una enfermedad de deficiencia autoinmunitaria combinada que presenta una base genetica que da como resultado la muerte temprana de los animales machos. Tal como se muestra en los ejemplos 3 a 8, la PA a bajas concentraciones modifica muchas caracterfsticas de la enfermedad en el animal BXSB, en muchos casos volviendo a regular las diversas manifestaciones de la enfermedad (celulares e histologicas) hacia niveles de niveles iniciales (es decir, hacia la normalizacion). Por ejemplo, la PA inhibe o previene la aparicion temprana de la demacracion (perdida de peso); regula la expansion del compartimento esplenico; inhibe la sobreexpresion o sobreactividad de inmunidad humoral; inhibe la sobreexpresion o sobreactividad de inmunidad celular; modula la diferenciacion de celulas de linaje celular

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linfoide; y mejora, reduce o revierte el dano tisular provocado por, o asociado con, los procesos patologicos. Los datos indican ademas que la PA presenta el mismo patron de respuesta a la dosis que en el modelo de CIA.

Por tanto, las actividades de PA a bajas concentraciones incluyen, por ejemplo, una o mas de regular la expansion del compartimento esplenico (modular la proliferacion, apoptosis o diferenciacion), regular la inmunidad humoral aberrante o indeseada (inhibir la produccion de autoanticuerpos o inhibir celulas que producen autoanticuerpos), regular la inmunidad celular aberrante o indeseada (normalizar el equilibrio TH1/TH2, inhibir las respuestas de citotoxicidad), modular la proliferacion, apoptosis o diferenciacion de celulas dentro del linaje celular linfoide (por ejemplo, normalizar poblaciones de celulas T tal como aumentar los numeros de celulas T maduras, por ejemplo, CD69-CD4+), inhibir o revertir el dano celular o tisular provocado por la respuesta inmunitaria indeseada o aberrante (inhibir o prevenir la progresion de la enfermedad, fomentar o potenciar la reversion de la enfermedad o regeneracion tisular), y normalizar los numeros de esplenocitos T o B o su respuesta frente a uno o mas mitogenos.

Por tanto, la PA es util en el tratamiento de un sujeto que necesita una o mas de las actividades anteriormente mencionadas asociadas con PA. En la presente memoria tambien se describen, entre otras cosas, procedimientos para modular una respuesta inmunitaria (celular o humoral), procedimientos para tratar una respuesta inmunitaria indeseada o aberrante (por ejemplo, disfuncion inmunitaria) y procedimientos para inhibir, prevenir o revertir un efecto fisiologico provocado por, o asociado con, una respuesta inmunitaria en un sujeto. El procedimiento puede incluir administrar a un sujeto una composicion que comprende una cantidad eficaz de un factor de diferenciacion de linfocitos suficiente para modular la respuesta inmunitaria. El procedimiento puede incluir administrar a un sujeto una composicion que comprende una cantidad eficaz de PA suficiente para modular la respuesta inmunitaria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “modular” significa un cambio detectable en una actividad o funcion o efecto al que se refiere el termino. Modular puede significar cualquier aumento, disminucion, reduccion, inhibicion, prevencion, estimulacion, fomento, potenciacion en la actividad o funcion o efecto al que se refiere el termino. Por ejemplo, modular una respuesta inmunitaria significa que se cambia de manera detectable una actividad o funcion o efecto de la respuesta inmunitaria, por ejemplo, un aumento, disminucion, reduccion, inhibicion, prevencion, estimulacion, fomento o potenciacion de inmunidad humoral o mediada por celulas. Los cambios en una respuesta inmunitaria que indican modulacion, incluyendo, por ejemplo, numeros de celulas T y B, proliferacion, apoptosis, diferenciacion, citotoxicidad, produccion de anticuerpos o numeros de celulas productoras de anticuerpos (por ejemplo, autoanticuerpos), reactividad frente a mitogenos, inflamacion, dano celular o tisular, o sfntomas de los mismos, pueden medirse mediante una variedad de procedimientos dados a conocer en la presente memoria o conocidos en la materia. Una “cantidad eficaz” o “cantidad suficiente” significa una cantidad necesaria para lograr la actividad o el efecto.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los terminos “volver a regular”, “normalizar” y variaciones gramaticales de los mismos significan un desplazamiento hacia niveles iniciales. Un desplazamiento hacia niveles iniciales puede incluir, por ejemplo, cambios en numeros de celulas, estado de diferenciacion, produccion de anticuerpos o cantidades de anticuerpo (por ejemplo, autoanticuerpos en circulacion), citotoxicidad o respuesta frente a un mitogeno. Por tanto, volver a regular o normalizar numeros de esplenocitos en el bazo de ratones BXSB, por ejemplo, significa un retorno hacia el numero de esplenocitos normalmente encontrado en un bazo de animal normal (por ejemplo, libre de enfermedad), por ejemplo, C57BL/6. Asimismo, volver a regular o normalizar autoanticuerpos significa reducir la cantidad de tales anticuerpos a aquella mas normalmente encontrada en un animal normal (por ejemplo, libre de enfermedad). Volver a regular o normalizar poblaciones de celulas T en ratones BXSB significa, por ejemplo, desplazar la poblacion de celulas T hacia la observada normalmente en ratones C57BL/6, por ejemplo, un cambio de una poblacion de celulas T inmaduras a maduras.

La cantidad de nueva regulacion o normalizacion que puede producirse puede ser un retorno a o casi a niveles iniciales tfpicos para un animal normal (dentro del 5-25% del nivel inicial), pero puede ser menor, por ejemplo, un desplazamiento detectable hacia niveles iniciales aunque el desplazamiento no regrese a los niveles a o cerca del nivel inicial (por ejemplo, dentro del 25-100% o el 25-200% del nivel inicial). El desplazamiento dependera del grado de desviacion con respecto al nivel inicial en el estado sin tratar, la cantidad de PA administrada y lo que esta devolviendose al nivel inicial. Por ejemplo, los numeros de esplenocitos para ratones BXSB son de 5 a 6 veces mayores que en ratones C57BL/6. Una nueva regulacion o normalizacion de los numeros de esplenocitos para ratones BXSB significara por tanto que los numeros de esplenocitos se redujeron en ratones BXSB tras el tratamiento. Por ejemplo, una reduccion desde de 5 a 6 veces mayor que en ratones C57BL/6 hasta de 1 a 3 veces mayor que en ratones C57BL/6, o mas, tal como dentro de aproximadamente el 10-50% de los numeros de esplenocitos normalmente observados en ratones C57BL/6. De manera similar, en ratones BXSB hay un aumento del 200% de ANA a las 5 semanas y un aumento del 1000% de ANA a las 11 semanas. Una nueva regulacion o normalizacion de autoanticuerpos para ratones BXSB significara por tanto que los numeros de autoanticuerpos (por ejemplo, ANA) se redujeron tras el tratamiento. Por ejemplo, el tratamiento con 0,01 mg de PA devolvio esos valores a o cerca del nivel inicial (por ejemplo, dentro del 25% del nivel inicial). Por tanto, los numeros de autoanticuerpos pueden disminuir desde 10 veces mayores que en ratones C57BL/6 hasta de 5 a 8 veces mayores que en ratones C57BL/6 o hasta de 1 a 5 veces mayores que en ratones C57BL/6, o mas, tal como dentro de aproximadamente el 10-50% de los numeros de autoanticuerpos en ratones C57BL/6.

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La invencion proporciona composiciones para su utilizacion en el tratamiento de una disfuncion inmunitaria en un sujeto con o con riesgo de una disfuncion inmunitaria tal como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas. Segun la invencion, se utiliza una composicion que comprende una cantidad eficaz de protefna A (PA) suficiente para tratar la disfuncion inmunitaria. Segun la presente invencion, la disfuncion inmunitaria es un trastorno autoinmunitario.

Tal como se utiliza en la presente memoria, “disfuncion inmunitaria” o “trastorno inmunitario” significa una respuesta inmunitaria, funcion o actividad indeseada, que es mayor (por ejemplo, autoinmunidad) o menor (por ejemplo, inmunodeficiencia) que la deseada. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad indeseada puede ser una respuesta, funcion o actividad normal. Por tanto, dentro del significado de estos terminos se incluyen respuestas inmunitarias normales que no se consideran aberrantes siempre que sean indeseadas. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad indeseada tambien puede ser una respuesta, funcion o actividad anomala. Una respuesta inmunitaria, funcion o actividad anomala o aberrante se desvfa de la normal. La disfuncion o el trastorno inmunitario puede ser principalmente de naturaleza humoral o celular, o ambos, o bien cronico o bien agudo.

La disfuncion o los trastornos inmunitarios incluyen trastornos caracterizados por muchas anomalfas o sfntomas fisiologicos diferentes. Tal como se da a conocer en la presente memoria, el modelo de raton BXSB es un trastorno inmunitario caracterizado por una amplia variedad de anomalfas y sfntomas fisiologicos que pueden tratarse segun la invencion (veanse, por ejemplo, los ejemplos 4 a 9). Por tanto, la invencion es util en el tratamiento de cualquier disfuncion o trastorno inmunitario caracterizado por muchas anomalfas o sfntomas fisiologicos diferentes incluyendo trastornos que tienen una o mas anomalfas o sfntomas fisiologicos similares al modelo de raton BXSB, o trastornos equivalentes en diferentes especies. Por ejemplo, el raton BXSB se caracteriza por proliferacion, apoptosis o diferenciacion de esplenocitos aberrantes que conducen a la expansion del compartimento esplenico y un consiguiente aumento en los numeros de esplenocitos inmaduros. Por tanto, aunque los tipos particulares de esplenocitos cuyos numeros aumentan en el raton BXSB pueden ser diferentes de los de otras especies con un trastorno inmunitario (por ejemplo, con respecto a sus marcadores CD), la invencion es aplicable a cualquier trastorno caracterizado por tener numeros indeseados de esplenocitos inmaduros (provocados por un exceso de proliferacion, supervivencia o fallo de apoptosis de celulas) o numeros reducidos de esplenocitos maduros en un sujeto.

Por tanto, dado que la invencion es util para volver a regular o normalizar muchas facetas de una respuesta inmunitaria, lo que conduce a mejorar o reducir una o mas de las muchas anomalfas y sfntomas diferentes del trastorno inmunitario, la invencion puede aplicarse ampliamente a trastornos que son diferentes de lo que se produce en el raton BXSB tal como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas. Evidentemente, los trastornos que pueden tratarse segun la invencion incluyen aquellos caracterizados por tener una o mas caracterfsticas, sfntomas o anomalfas del raton BXSB aunque sean menos intensas que las presentes en el raton BXSB.

Tal como resulta evidente a partir de las reivindicaciones adjuntas, los trastornos inmunitarios a los que se aplica la invencion son trastornos autoinmunitarios. Los trastornos autoinmunitarios se caracterizan generalmente como una respuesta, actividad o funcion indeseada o aberrante del sistema inmunitario. Las inmunodeficiencias se caracterizan generalmente por memoria o capacidad de respuesta inmunitaria humoral o mediada por celulas reducida o insuficiente, o una tolerancia aumentada o indeseada. Tales trastornos que pueden tratarse segun la invencion incluyen, pero no se limitan a, trastornos que provocan dano celular o tisular/de organos en el sujeto.

Por tanto, la invencion proporciona composiciones tal como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo de un trastorno autoinmunitario. La composicion que va a administrarse a un sujeto segun la invencion comprende una cantidad eficaz de protefna A (PA) suficiente para tratar el trastorno autoinmunitario. En diversos aspectos, el trastorno autoinmunitario comprende artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriasica, diabetes mellitus, esclerosis multiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso sistemico (SLE), tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis atopica, dermatitis eccematosa, psoriasis, sfndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso cutaneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, eritema nudoso leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alergica, encefalopatfa hemorragica necrotizante aguda, perdida de audicion neurosensorial progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia de globulos rojos puros, trombocitopenia idiopatica, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa cronica, sfndrome de Stevens-Johnson, esprue idiopatico, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, fibrosis pulmonar intersticial, tiroiditis de Hashimoto, sfndrome poliglandular autoinmunitario, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes mellitus resistente a insulina, esterilidad mediada por el sistema inmunitario, enfermedad de Addison autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, dermatitis herpetiforme, alopecia autoinmunitaria, vitiligo, anemia hemolftica autoinmunitaria, purpura trombocitopenica autoinmunitaria, anemia perniciosa, sfndrome de Guillain-Barre, sfndrome del hombre rfgido, fiebre reumatica aguda, oftalmia simpatica, sfndrome de Goodpasture, vasculitis necrotizante sistemica, sfndrome antifosfolipfdico o una alergia.

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El termino “poner en contacto” significa la union o interaccion directa o indirecta entre dos o mas entidades (por ejemplo, entre PA y una celula o molecula). Poner en contacto tal como se utiliza en la presente memoria incluye en disolucion, en fase solida, in vitro, en una celula e in vivo.

Los ensayos para detectar una actividad de PA incluyen; cambios celulares en los numeros, proliferacion, apoptosis o supervivencia y diferenciacion de linfocitos e incluyen exclusion con azul de tripano (viabilidad); cambios en marcadores CD celulares u otras moleculas (diferenciacion); cantidades de anticuerpo (por ejemplo, autoanticuerpos circulantes que pueden medirse utilizando ELISA u otros ensayos de deteccion de anticuerpos); mejora de tejidos u organos incluyendo inhibicion de dano adicional o reversion de dano tisular existente (histologfa, funcion de tejidos u organos, o niveles de enzimas indicativos de una funcion mejorada); efectos sobre todo el organismo (aumento de peso o una disminucion en la perdida de peso o demacracion, movilidad mejorada); y expansion del bazo (histologfa, numeros de linfocitos y su estado de diferenciacion) tal como se da a conocer en la presente memoria y se conoce adicionalmente en la materia.

Tal como se utilizan en la presente memoria, el termino “trasplante” y variaciones gramaticales del mismo significan injertar, implantar o trasplantar una celula, tejido u organo de una parte del organismo a otra parte, o de un individuo/animal a otro individuo/animal. El termino tambien incluye celulas, tejidos y organos geneticamente modificados, por ejemplo, mediante terapia genica ex vivo en la que las celulas, tejidos y organos transformados se obtienen o derivan de la persona que despues recibe el trasplante, o de una persona/animal diferente.

Los procedimientos y las composiciones descritos en la presente memoria pueden utilizarse in vitro, ex vivo o in vivo. Las composiciones pueden administrarse como una forma de dosificacion individual o multiple, en dfas consecutivos o alternos o de manera intermitente. Por ejemplo, pueden administrarse formas de dosificacion individuales o multiples en dfas alternos o de manera intermitente, a lo largo de aproximadamente 7 a 45 dfas o a lo largo de aproximadamente 1 a 15 semanas. Una composicion puede administrarse como una dosis individual en dfas alternos durante entre 3 y 5 semanas.

El tratamiento da habitualmente como resultado una mejora en el estado del sujeto, que es un cambio beneficioso para el sujeto, tejido o celula o poblacion celular en el sujeto que es detectable. Por tanto, el tratamiento puede dar como resultado la inhibicion, reduccion o prevencion de una progresion o empeoramiento del estado o trastorno o sfntomas, o deterioro adicional o aparicion de uno o mas sfntomas adicionales del estado o trastorno. Por tanto, un desenlace de tratamiento satisfactorio conduce a un “efecto terapeutico”, o la inhibicion, reduccion o prevencion de la intensidad o frecuencia de sfntomas o causas subyacentes de un trastorno o estado en el sujeto. La estabilizacion de un trastorno o estado tambien es un desenlace de tratamiento satisfactorio. Por tanto, el tratamiento puede reducir o prevenir la intensidad o frecuencia de uno o mas sfntomas del estado o trastorno, inhibir la progresion o empeoramiento del estado o trastorno, y en algunos casos, revertir el estado o trastorno. Por tanto, en el caso de un trastorno inmunitario, por ejemplo, el tratamiento puede conducir a una mejora de un cambio histopatologico provocado por, o asociado con, el trastorno inmunitario, por ejemplo, prevenir el aumento o reducir o regenerar la destruccion de tejido o la infiltracion en articulaciones del esqueleto, o la destruccion de tejido o la infiltracion en tejido del timo, rinon, hfgado, bazo o piel.

El tratamiento tambien incluye afectar a las causas subyacentes del estado o trastorno o sfntomas de los mismos. Por tanto, en el caso de un trastorno inmunitario, por ejemplo, se considera que volver a regular o normalizar los numeros de linfocitos absolutos (por ejemplo, esplenocitos) o numeros de linfocitos maduros hacia el nivel inicial normal es un desenlace de tratamiento satisfactorio. De manera similar, se considera que una reduccion de anticuerpos circulantes (por ejemplo, autoanticuerpos) hacia el nivel inicial normal es un desenlace de tratamiento satisfactorio.

El termino “mejorar” significa una mejora detectable en el estado global del sujeto. Una mejora detectable incluye una reduccion subjetiva en la intensidad o frecuencia de los sfntomas provocados por, o asociados con, el trastorno o estado, una mejora en las causas subyacentes del trastorno o estado, o una reversion del trastorno o estado, que puede detectarse utilizando un ensayo.

Los procedimientos descritos en la presente memoria pueden ponerse en practica antes (es decir profilaxis) o despues de que comiencen los sfntomas, antes o despues de que se desarrollen los sfntomas o el trastorno (por ejemplo, antes del trasplante de celulas, tejido u organo). Administrar una composicion antes o inmediatamente despues del desarrollo de sfntomas puede disminuir la intensidad o frecuencia de los sfntomas en el sujeto. Ademas, administrar una composicion antes o inmediatamente despues del desarrollo de los sfntomas puede disminuir o prevenir el dano a celulas, tejidos y organos que se produce, por ejemplo, durante la disfuncion inmunitaria (por ejemplo, autoinmunidad).

El termino “sujeto” se refiere a animales, normalmente animales mamfferos, tales como un primate no humano (gorilas, chimpances, orangutanes, macacos, gibones), un animal domestico (perros y gatos), un animal de granja (caballos, vacas, cabras, ovejas, cerdos), animal para experimentacion (raton, rata, conejo, cobaya) y seres humanos. Los sujetos humanos incluyen adultos y ninos. Los sujetos humanos incluyen aquellos que tienen o con riesgo de tener disfuncion inmunitaria. Los sujetos con riesgo pueden identificarse mediante examen genetico. Los

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ejemplos particulares de trastornos inmunitarios con asociacion genetica que pueden identificarse incluyen inmunodeficiencia combinada intensa asociada con el cromosoma X, deficiencia de adenosina desaminasa, anomalfa de DiGeorge, ataxia-telangiectasia, sfndrome de Wiscott-Aldrich, deficiencia de adhesion de leucocitos y distrofia miotonica. Estos y otros trastornos pueden detectarse mediante sangre fetal o celulas amnioticas, o mediante muestras de tejido de adulto tal como se describe en Samter's Immunologic Diseases; MM Frank, KF Austen, HN Claman, and ER Unanue editors; Little, Brown and Company. Puede utilizarse la revision de la historia familiar para detectar patrones de herencia o un riesgo aumentado (predisposicion) de desarrollar el trastorno (por ejemplo, autoinmunidad o inmunodeficiencia). Tambien pueden identificarse sujetos con riesgo examinando para detectar una caracterfstica especffica, tal como la presencia de poblaciones indeseadas o aberrantes de linfocitos (por ejemplo, esplenocitos) o autoanticuerpos. Los sujetos con riesgo incluyen aquellos que necesitan un trasplante de celulas, tejido u organo. Los sujetos incluyen ademas animales de modelo de enfermedad (por ejemplo, tales como ratones y primates no humanos) para someter a prueba la eficacia in vivo de las composiciones de la invencion (por ejemplo, modelos murinos ClA, BXSB, EAE y SCID).

La divulgacion se pone en practica con compuestos conocidos como “factores de diferenciacion de linfocitos”, que son moleculas que pueden regular o modular la senalizacion celular o respuesta frente a la senalizacion, que a su vez pueden volver a regular, normalizar o modular el comportamiento celular de la propia celula, de otras celulas o procesos en los que participan las celulas (por ejemplo, funcion del sistema inmunitario). Tal como se expone en la presente memoria, un ejemplo especffico de un factor de diferenciacion de linfocitos es PA. Los factores de diferenciacion de linfocitos pueden utilizarse segun la divulgacion en bajas cantidades tal como se expone en la presente memoria para PA.

La invencion tambien se basa por lo menos en parte en las bajas cantidades de PA que pueden producir una o mas de las actividades dadas a conocer en la presente memoria. Por ejemplo, PA a 1x10-5 mg (1x10-11 g) por dosis administrada en dfas alternos (M/W/F) comenzando en el momento de la induccion de antfgeno secundario regulo la expresion y/o progresion de la respuesta inflamatoria resultante y regulo la expresion y/o revirtio el dano tisular provocado por la respuesta inflamatoria. Sin embargo, a esta cantidad de PA, no hubo ninguna actividad de superantfgeno sustancial o estimulacion de la inmunidad humoral.

En la presente memoria tambien se describen composiciones, que incluyen PA en una cantidad que puede producir una o mas de las actividades asociadas con PA, sin producir actividad de superantfgeno sustancial, estimulacion sustancial de inmunidad humoral o es sustancialmente independiente de la union a Fc. Las actividades de PA en tales cantidades incluyen, por ejemplo, volver a regular o normalizar la respuesta inmunitaria humoral o celular aberrante o indeseada (modular la proliferacion, apoptosis o diferenciacion de linfocitos), inhibir, revertir, mejorar o reducir la autoinmunidad, inflamacion o una respuesta inflamatoria, o por lo menos una parte de dano tisular provocado por una respuesta inmunitaria indeseada o aberrante (inhibir o prevenir la progresion de la enfermedad, fomentar o potenciar la reversion de la enfermedad o regeneracion tisular), y normalizar los numeros de esplenocitos T o B o su patron de respuesta rente a uno o mas mitogenos.

Una composicion puede incluir PA en una cantidad suficiente para modular la proliferacion, apoptosis o diferenciacion de linfocitos. Una composicion puede incluir una cantidad de PA en una cantidad suficiente para inhibir, revertir, mejorar o reducir la autoinmunidad, inflamacion o una respuesta inflamatoria. Una composicion puede incluir una cantidad de PA en una cantidad suficiente para inhibir, revertir, mejorar o reducir por lo menos una parte del dano celular, tisular o a organos provocado por una respuesta inmunitaria indeseada o aberrante. Una composicion puede incluir una cantidad de PA en una cantidad suficiente para volver a regular o normalizar los numeros de esplenocitos T o B o su respuesta frente a uno o mas mitogenos. La cantidad de PA puede ser inferior a 1 mg. La cantidad de PA puede ser inferior a 1 mg pero superior a 0,01 picogramos (pg). La cantidad de PA puede ser inferior a de 0,5 a 0,1 mg pero superior a 0,1 pg. La cantidad de PA puede ser inferior a de 0,1 a 0,01 mg pero superior a 1 pg. La cantidad de PA puede ser inferior a de 1 a 0,1 mg pero superior a 1 pg; inferior a de 0,1 a 0,01 mg pero superior a 1 pg; inferior a de 0,01 a 0,001 mg pero superior a 1 pg; inferior a de 1 a 0,5 ng pero superior a 1 pg; inferior a de 500 a 250 pg pero superior a 1 pg; inferior a de 250 a 50 pg pero superior a 5 pg; e inferior a de 50 a 25 pg pero superior a 5 pg, por ejemplo, 20, 15 o aproximadamente 10 pg. La cantidad de PA puede no producir actividad de superantfgeno sustancial, estimulacion sustancial de inmunidad humoral o es sustancialmente independiente de la union a Fc.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las frases “sin sustancial” o “sustancialmente independiente”, cuando se utilizan en referencia a la actividad de superantfgeno, estimulacion de la inmunidad humoral o union a Fc de PA, significan que la caracterfstica a la que se hace referencia no contribuye significativamente a la actividad observada de PA a esa cantidad. Por tanto, una cantidad de PA que no produce actividad de superantfgeno sustancial significa que la actividad de superantfgeno de PA no contribuye significativamente a la actividad de la cantidad de PA. De manera similar, una cantidad de PA que no produce estimulacion sustancial de inmunidad humoral puede producir una pequena cantidad de actividad humoral, pero de nuevo la inmunidad producida no contribuye significativamente a la actividad de la PA a la cantidad de PA utilizada. Asimismo, una cantidad de PA que es sustancialmente independiente de la union a Fc significa que la union a Fc no contribuye significativamente a la actividad de PA a la cantidad de PA utilizada. En otras palabras, eliminar o alterar la funcion con respecto a Fc de la PA no destruira la

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actividad de la PA a la cantidad utilizada. En general, a las bajas cantidades de PA utilizadas, la actividad de superantfgeno, estimulacion de la inmunidad humoral o union a Fc de PA no contribuyen significativamente a la actividad de la PA.

La actividad de superantfgeno se caracteriza normalmente por la estimulacion de subconjuntos no especfficos de celulas T para que proliferen. Es decir, la proliferacion de celulas T es en gran medida independiente de la especificidad de epftopo. Normalmente la actividad de superantfgeno estimula aproximadamente el 5-10% de las celulas T para que proliferen, mientras que un antfgeno convencional puede estimular aproximadamente 1 de cada 106 celulas en un individuo. Por tanto, la actividad de superantfgeno puede someterse a ensayo determinando los numeros de celulas T que se estimulan para que proliferen. Se describen ejemplos de tales ensayos, por ejemplo, en Johnson et al., Scientific American, abril de 1992. pags. 92-101; y Kotzin et al., Adv. Immunol. 54:99 (1993). Se describen ensayos de superantfgeno y union a FC, por ejemplo, en Romagnani et al., J. Immunol. 129:596 (1982). Se describen ensayos de union a FC, por ejemplo, en Langone JJ, Adv. Immunol. 32:157 (1982). Se describen ensayos de estimulacion de la inmunidad humoral, por ejemplo, en Leonetti et al., J. Exp. Med. 189:1217 (1999).

Por tanto, los procedimientos descritos en la presente memoria pueden ponerse en practica utilizando las composiciones descritas en la presente memoria. Por ejemplo, una cantidad eficaz de PA puede ser una dosis de aproximadamente 0,1 picogramos a aproximadamente 1 microgramo. Una cantidad eficaz de PA puede ser una dosis de aproximadamente 1 picogramo a aproximadamente 1 microgramo. Una cantidad eficaz de PA puede ser una dosis de aproximadamente 10 picogramos a aproximadamente 1 microgramo. Una cantidad eficaz de PA puede ser una dosis de aproximadamente 10 picogramos a aproximadamente 0,1 microgramos. Una cantidad eficaz de PA puede ser una dosis individual de aproximadamente 10 picogramos a aproximadamente 0,1 microgramos.

Las composiciones pueden administrarse de manera sistemica o local por cualquier via. Por ejemplo, puede administrarse PA por via intravenosa, oral (por ejemplo, ingestion o inhalacion), intramuscular, intraperitoneal, intradermica, subcutanea, intracavitaria, intracraneal, transdermica (topica), parenteral, por ejemplo transmucosa y rectal. Las composiciones de la invencion que incluyen formulaciones farmaceuticas pueden administrarse por medio de un sistema de administracion microencapsulado o acondicionadas en un implante para su administracion.

Las composiciones incluyen ademas formulaciones farmaceuticas que contienen PA en una cantidad que tiene una o mas de las actividades dadas a conocer en la presente memoria. Una formulacion farmaceutica puede incluir PA en una cantidad suficiente para volver a regular o normalizar una respuesta inmunitaria humoral o celular aberrante o indeseada (modular la proliferacion, apoptosis o diferenciacion de linfocitos), inhibir, revertir, mejorar o reducir la autoinmunidad, inflamacion o una respuesta inflamatoria, o por lo menos una parte de dano tisular provocado por una respuesta inmunitaria indeseada o aberrante (inhibir o prevenir la progresion de la enfermedad, fomentar o potenciar la reversion de la enfermedad o regeneracion tisular), normalizar los numeros de esplenocitos T o B o su respuesta frente a uno o mas mitogenos, sin actividad de superantfgeno sustancial, sin estimulacion sustancial de inmunidad humoral o sustancialmente independiente de la union a Fc, y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable.

Tal como se utilizan en la presente memoria, los terminos “farmaceuticamente aceptable” y “fisiologicamente aceptable” se refieren a portadores, excipientes, diluyentes y similares que pueden administrarse a un sujeto, preferentemente sin producir efectos secundarios adversos excesivos (por ejemplo, nauseas, dolor abdominal, cefalea, etc.). Tales preparaciones para administracion incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones esteriles acuosas o no acuosas.

Pueden prepararse formulaciones farmaceuticas a partir de portadores, diluyentes, excipientes, disolventes, medios de dispersion, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y de retraso de la absorcion, y similares, compatibles con la administracion a un sujeto. Tales formulaciones pueden contenerse en un comprimido (recubierto o no recubierto), capsula (dura o blanda), microperla, emulsion, polvo, granulo, cristal, suspension, jarabe o elixir. Tambien pueden estar presentes compuestos activos complementarios y conservantes, entre otros aditivos, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Una formulacion farmaceutica puede formularse para ser compatible con su via de administracion prevista. Por tanto, las formulaciones farmaceuticas incluyen portadores, diluyentes o excipientes adecuadas para su administracion por vfas incluyendo intraperitoneal, intradermica, subcutanea, oral (por ejemplo, ingestion o inhalacion), intravenosa, intracavitaria, intracraneal, transdermica (topica), parenteral, por ejemplo transmucosa y rectal.

Las disoluciones o suspensiones utilizadas para aplicacion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir lo siguiente: un diluyente esteril tal como agua para inyeccion, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sinteticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencflico o metilparabenos; antioxidantes tales como acido ascorbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como acido etilendiaminatetraacetico; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH puede ajustarse con acidos o bases, tales como acido clorhfdrico o

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hidroxido de sodio. La preparacion parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de multiples dosis fabricados de vidrio o plastico.

Las formulaciones farmaceuticas adecuadas para inyeccion incluyen disoluciones acuosas esteriles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos esteriles para preparacion extemporanea de dispersion o disoluciones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, los portadores adecuados incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o solucion salina tamponada con fosfato (PBS). El portador puede ser un disolvente o medio de dispersion que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol lfquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo, mediante la utilizacion de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamano de partfcula requerido en el caso de dispersion y mediante la utilizacion de tensioactivos. La prevencion de la accion de microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifungicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico, timerosal, y similares. Pueden incluirse agentes isotonicos, por ejemplo, azucares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composicion. La absorcion prolongada de formulaciones inyectables puede lograrse incluyendo un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo, monoestearato de aluminio o gelatina.

Para la administracion oral, puede incorporarse una composicion con excipientes en forma de comprimidos, trociscos o capsulas, por ejemplo, capsulas de gelatina. Pueden incluirse agentes aglutinantes y/o materiales adyuvantes farmaceuticamente compatibles en las formulaciones orales. Los comprimidos, pastillas, capsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes componentes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidon o lactosa, un agente disgregante tal como acido algfnico, Primogel, o almidon de mafz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotex; un deslizante tal como dioxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aromatizante.

Las formulaciones tambien pueden incluir portadores para proteger la composicion frente a la rapida degradacion o eliminacion del organismo, tal como una formulacion de liberacion controlada, que incluye materiales que ralentizan la degradacion dentro del organismo y a su vez liberan el/los principio(s) activo(s). Por ejemplo, puede emplearse un material de retraso en el tiempo tal como monoestearato de glicerilo o estearato de glicerilo solo, o en combinacion con una cera.

Las formulaciones adicionales incluyen partfculas biodegradables o biocompatibles o una sustancia polimerica tal como poliesteres, poliaminoacidos, hidrogel, polivinilpirrolidona, polianhfdridos, poli(acido glicolico), etileno-acetato de vinilo, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, sulfato de protamina, o copolfmeros de lactida/glicolida, copolfmeros de poli(lactida/glicolida), o copolfmeros de etileno-acetato de vinilo con el fin de controlar el suministro de una composicion administrada. Procedimientos para la preparacion de tales formulaciones resultaran evidentes para los expertos en la materia. Los materiales tambien pueden obtenerse comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc., por ejemplo.

La velocidad de liberacion de una composicion puede controlarse alterando la concentracion o composicion de tales macromoleculas. Por ejemplo, la composicion puede atraparse en microcapsulas preparadas mediante tecnicas de coacervacion o mediante polimerizacion interfacial, por ejemplo, mediante la utilizacion de hidroximetilcelulosa o microcapsulas de gelatina o microcapsulas de poli(metacrilato de metilo), respectivamente, o en un sistema de administracion de farmaco coloidal. Los sistemas de dispersion coloidal incluyen complejos macromoleculares, nanocapsulas, microesferas, microperlas y sistemas a base de lfpidos incluyendo emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Estos pueden prepararse segun procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, tal como se describe en la patente estadounidense n.° 4.522.811.

En la materia se conocen formulaciones farmaceuticas adicionales apropiadas para la administracion y son aplicables en los procedimientos y las composiciones descritos en la presente memoria (vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; y Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., (1993)).

Las composiciones descritas en la presente memoria pueden incluir combinaciones de otras composiciones, e incluirse en las composiciones farmaceuticas de la invencion. Por ejemplo, un farmaco que reduce una respuesta inflamatoria o inflamacion o que estimula la diferenciacion de una celula puede incluirse con una baja cantidad de PA. Los farmacos a modo de ejemplo incluyen farmacos antiinflamatorios esteroideos (SAI) y no esteroideos (NSAI), por ejemplo, un corticosteroide, un inhibidor de cox-2 o farmacos que afectan al sistema inmunitario tales como quimiocinas y citocinas tales como interleucinas e interferones.

Las composiciones descritas en la presente memoria, incluyendo formulaciones farmaceuticas, pueden acondicionarse en kits, que opcionalmente pueden contener instrucciones de utilizacion, por ejemplo, que ponen en practica un procedimiento descrito en la presente memoria. En la presente memoria tambien se describen kits. Un kit puede incluir una o mas composiciones de la invencion (por ejemplo, PA), incluyendo formulaciones farmaceuticas,

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acondicionadas en un material de acondicionamiento adecuado. Un kit puede incluir una etiqueta o prospecto para poner en practica un procedimiento descrito en la presente memoria. Por tanto, un kit puede incluir instrucciones para tratar a un sujeto que tiene o con riesgo de tener un trastorno inmunitario o disfuncion, in vitro, in vivo o ex vivo. Un kit puede incluir una etiqueta o prospecto que incluye instrucciones para tratar a un sujeto que tiene un trastorno autoinmunitario con bajas cantidades de PA in vivo o ex vivo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino “material de acondicionamiento” se refiere a una estructura ffsica que aloja los componentes del kit. El material de acondicionamiento puede mantener los componentes de manera esteril, y puede fabricarse de material comunmente utilizado para tales fines (por ejemplo, papel, fibra corrugada, vidrio, plastico, lamina metalica, ampollas, etc.). La etiqueta o el prospecto pueden incluir instrucciones escritas apropiadas, por ejemplo, que ponen en practica un procedimiento descrito en la presente memoria. Por tanto, los kits pueden incluir adicionalmente instrucciones para utilizar los componentes del kit en un procedimiento descrito en la presente memoria.

Las instrucciones pueden incluir instrucciones para poner en practica cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria. Por tanto, las composiciones farmaceuticas descritas en la presente memoria pueden incluirse en un recipiente, envase o dispensador junto con instrucciones para la administracion a un sujeto. Las instrucciones pueden incluir adicionalmente indicaciones, un criterio de valoracion clfnico satisfactorio, cualquier sfntoma adverso que pueda producirse o informacion adicional requerida por la Food and Drug Administration para su utilizacion con un sujeto humano.

Las instrucciones pueden estar en “material impreso”, por ejemplo, en papel o carton dentro del kit, en una etiqueta adjuntada al kit o material de acondicionamiento, o unirse a un vial o tubo que contiene un componente del kit. Las instrucciones pueden comprender una cinta de voz o video que puede incluirse opcionalmente en un medio legible por ordenador, tal como un disco (disco flexible o disco duro), CD optico tal como CD- o DVD-ROM/RAM, cinta magnetica, medio de almacenamiento electrico tal como RAM y ROM e hibridos de los mismos tales como medios de almacenamiento magneticos/opticos.

Los kits tambien pueden incluir uno o mas farmacos que proporcionan un efecto sinergico o aditivo o que reducen o mejoran uno o mas sintomas de un farmaco o trastorno. Por ejemplo, puede incluirse un farmaco que reduce una respuesta inflamatoria o inflamacion. Los farmacos a modo de ejemplo incluyen farmacos antiinflamatorios esteroideos (SAI) y no esteroideos (NSAI), por ejemplo, un corticosteroide, o un inhibidor de cox-2. Los kits pueden incluir adicionalmente un agente tamponante, un conservante o un agente estabilizante. El kit puede incluir ademas componentes de control para someter a ensayo una actividad o efecto de tratamiento. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un recipiente individual separado. Por ejemplo, un kit puede incluir una dosificacion unitaria individual de una baja cantidad de PA tal como se expone en la presente memoria (por ejemplo, desde menos de 1 mg hasta 1 pg). Alternativamente, un kit puede incluir multiples formas de dosificacion unitaria de una baja cantidad de PA. Por ejemplo, cada una de las multiples formas de dosificacion unitaria contendra una baja cantidad de PA en un recipiente individual separado (por ejemplo, cada dosis unitaria de PA sera de desde menos de 1 mg hasta 1 pg por dosis). Los componentes del kit pueden estar en una mezcla de uno o mas recipientes y todos los diversos recipientes pueden estar dentro de envases individuales o multiples.

A menos que se defina lo contrario, todos los terminos tecnicos y cientificos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que el entendido comunmente por un experto habitual en la materia a la que pertenece esta invencion. En caso de conflicto, regira la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.

Tal como se utiliza en la presente memoria, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un linfocito” incluye una pluralidad de tales celulas.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren, pero no limiten, el alcance de invencion descrito en las reivindicaciones.

Ejemplo 1

Este ejemplo describe un modelo de inflamacion (artritis) de animal y datos histologicos que indican que PA administrada a concentraciones muy bajas puede reducir la inflamacion e inhibir o revertir el dano tisular provocado por la inflamacion.

Tres estudios separados con tres grupos de cinco animales cada uno (un total de 15 animales por grupo de tratamiento). El primer grupo es el control, al que se le inyecta solucion salina tamponada con fosfato, portador de PBS. El segundo grupo recibio 100 mg de Enbrel por raton al dia. Esto era la dosis optima de Enbrel segun lo describe el fabricante (Immunex, Corp., Seattle, WA). Al tercer grupo se le inyectaron 10 picogramos (pg) de PA en portador de PBS los lunes, miercoles y viernes durante el periodo de tratamiento (Amersham/Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Tambien puede obtenerse PA de Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Pierce Chemical Co., Pittsburgh, PA; y Calbiochem, San Diego, CA.

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La tabla 1 a continuacion resume los datos de fndice clfnico para el grupo de control que indican una respuesta inflamatoria progresiva en estos animales sensibles. La respuesta no presenta ningun pico o meseta dentro de los lfmites de tiempo utilizados y los animales de control se sacrificaron cuando la respuesta puso en peligro su estado de salud.

Tabla 1: Lectura del fndice clfnico del control - modelo de CIA

Media

D.E. EEM N Dfa

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0

0

0

0

0

0

0

30 1

0,00

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5,00 2

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25,00 3

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0,50 0,25 4,00 4

0,08

0,28 0,06 25,00 5

1,00

0,94 0,30 10,00 7

0,96

1,06 0,21 25,00 8

1,60

1,51 0,48 10,00 9

1,40

1,35 0,30 20,00 10

3,52

3,44 0,69 25,00 15

7,80

5,63 2,52 5,00 16

10,80

3,11 1,39 5,00 18

2,25

1,59 0,35 20,00 19

2,58

1,50 0,34 19,00 23

Tabla 1: Datos sin procesar de medidas de fndice clfnico medio para 15 animales de control tratados mediante el protocolo de CIA. Estos datos son datos combinados de 3 estudios separados.

La tabla 2 muestra datos similares para las medidas con calibre de las patas del grupo de animales de control durante el mismo periodo de tiempo. Estos datos reflejan los datos de fndice clfnico con la excepcion de que aparece una meseta en la respuesta tras el dfa 10. Esta meseta de respuesta se corresponde con la cinetica de respuestas inflamatorias inducidas por anticuerpos tfpicas.

Tabla 2: Medidas de patas de control - modelo de CIA

Media

D.E. EEM N

165,80

9,31 2,08 20,00 0

164,95

11,91 1,52 61,00 1

168,50

6,13 1,37 20,00 2

168,50

8,90 1,41 40,00 3

172,30

4,75 1,06 20,00 4

171,38

7,26 1,15 40,00 5

167,00

16,12 2,55 40,00 7

182,35

19,06 3,01 40,00 8

176,44

19,56 3,05 41,00 9

207,45

36,93 8,26 20,00 10

212,28

38,03 6,01 40,00 15

204,30

31,25 6,99 20,00 16

212,95

36,18 8,09 20,00 18

217,40

44,90 10,04 20,00 19

224,30

44,01 9,84 20,00 23

Tabla 2: Datos sin procesar de medidas de patas con calibre medias para 15 animales de control tratados mediante el protocolo de CIA. Estos datos son datos combinados de 3 estudios separados.

El analisis histologico de rodilla y tobillo de un animal de control tomado en el dfa 15 de la respuesta inflamatoria indico una extensa infiltracion inmunitaria y destruccion tisular. Se acumularon inmunocitos en la capsula sinovial del animal de control. Los animales tratados con Enbrel en el dfa 35 mostraron una infiltracion inmunitaria continuada en la capsula sinovial de rodilla y tobillo y evidencias de destruccion tisular continuada.

La tabla 3 resume los resultados de exploracion histologica de las articulaciones de rodilla y tobillo de animales DBA/1 de control, sin tratar. Estas clasificaciones se asignan de manera enmascarada por el histologo en una escala continua de desde 1 hasta 10, representando 1 un aspecto histologico “normal” y 10 un alto grado de dano. Las

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articulaciones de rodilla y tobillo de los animales de control tras la induccion con colageno muestran dano tisular maximo (“10”). Esto se correlaciona con los datos tanto de mdice clmico (tabla 1) como de medida ffsica (tabla 2).

Tabla 3: Clasificacion de histologfa de modelo de CIA - Animales de control

Tejido

Clasificacion de histologfa N

Tobillo

10 15

Rodilla

10 15

Los animales tratados con PA en el dfa 35 de la respuesta inflamatoria mostraron muchas menos evidencias de infiltracion inmunitaria y solo una ligera evidencia de destruccion tisular. Solo estaban presentes unos pocos inmunocitos del huesped en la capsula sinovial y no habfa ninguna evidencia de fragmentos de tejido o destruccion tisular. Por tanto, estos datos demuestran que PA reduce la inflamacion aguda en el modelo de CIA. Estos datos tambien demuestran que PA reduce el dano tisular o fomenta la reparacion tisular mas que Enbrel.

Las tablas 4 y 5 muestran los resultados de 3 estudios separados que sometieron a prueba el efecto de PA (10 pg/inyeccion, M/W/F). Se sometio a prueba Enbrel para comparacion; los resultados obtenidos eran comparables con resultados publicados. El tratamiento con PA fue muy eficaz, alcanzando significacion a aproximadamente el 10% del numero de animales requeridos para el patron de Enbrel. Los resultados para el mdice clmico total (tabla 4) y las medidas ffsicas (tabla 5) son comparables.

Tabla 4: Tratamiento con PA en el modelo de CIA (mdice clmico total)

Datos combinados: C.I.

Tratamiento

Dfa Media N P [unilaterall

Control

15 3,52 25

17 3,88 25

19 2,25 20

Protema A

15 1,92 25 0,03

17 1,95 24 0,02

19 1,40 20 0,04

Enbrel

15 2,79 24 0,17

17 3,41 24 0,30

19 2,85 20 0,11

Tabla 5: Tratamiento con PA en el modelo de CIA (medida)

Datos combinados: Medida

Tratamiento

Dfa Media N P [unilaterall

Control

15 212,3 40

17 218,1 40

19 217,4 20

Protema A

15 195,4 36 0,02

17 191,4 36 0,001

19 197,2 20 0,05

Enbrel

15 204,2 36 0,18

17 209,1 36 0,18

19 230,3 20 0,19

La tabla 6 muestra los resultados de una evaluacion histologica de ratones DBA/1 sacrificados a las 1, 2 y 3 semanas durante su regimen de tratamiento. Los tratamientos tanto con PA como con Enbrel muestran dano significativo a nivel tisular. Estos datos demuestran que a pesar de las disminuciones significativas en el mdice clmico total y las medidas de patas (tablas 4 y 5) todavfa hay dano a nivel tisular. El tratamiento con PA parece retrasar el dano tisular (semana de tratamiento uno frente al control) pero no previene el dano.

Tabla 6: Tratamiento con PA y dano histologico

Control PA Enbrel

1 sem.

Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 8 Rodilla: 0-5 Tobillo: 1-5 Rodilla: 0-10

5

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2 sem.

Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 10 Rodilla: 10

3 sem.

Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 10 Rodilla: 10

Los ratones DBA/1 a los que se indujo con colageno tipo II segun el protocolo de modelo de CIA se trataron inmediatamente tras la segunda inyeccion de antfgeno, portador de disolvente (PBS) para el control, PA (a 10 pg por inyeccion M/W/F) y Enbrel (100 ug/inyeccion cada dfa).

La tabla 7 muestra los resultados histologicos tras prolongar el tratamiento a 35 dfas. Se sacrificaron los ratones de control a los 18 dfas por motivos humanitarios y se incluyen sus datos a los 18 dfas para comparacion. El tratamiento con Enbrel no mostro ninguna mejora del dano histologico. En cambio, el tratamiento con Pa revirtio el dano histologico a los 14-21 dfas. Estos datos histologicos se correlacionan con el fndice clfnico total de estos animales. Por tanto, el tratamiento con PA redujo significativamente la intensidad de la respuesta inflamatoria aguda y continuar el tratamiento revirtio el dano tisular existente provocado por la respuesta.

Tabla 7: Tratamiento con PA prolongado y evaluacion histologica

Control a los 18 dfas PA a los 35 dfas Enbrel a los 35 dfas

clasificacion

Tobillo: 10 Rodilla: 10 Tobillo: 0-1 Rodilla: 0-1 Tobillo: 10 Rodilla: 10

La evaluacion histologica de estos tejidos incluyo una evaluacion a bajo, medio y alto aumento. En los grupos tanto de control (a los 18 dfas, momento del sacrificio) como de tratamiento con Enbrel, la capsula sinovial tenia grandes numeros de linfocitos activados, mientras que el grupo de PA en el dfa 35 de tratamiento tenia pocas celulas linfoides pequenas que eran similares en cuanto al numero y la morfologfa a las de los animales DBA/1 antes de la induccion con antfgeno de colageno tipo II.

En resumen, estos datos demuestran que las medidas de patas y las evaluaciones del fndice clfnico documentan la respuesta inflamatoria inducida en el modelo animal de CIA; que PA reduce la respuesta inflamatoria durante la fase aguda (valores de P frente al < 0,05) y revierte el dano histologico provocado por la respuesta en el dfa 35 del tratamiento; que PA tiene un efecto de mejora a concentraciones y calendarios de dosificacion predichos por el modelo animal BXSB y las evaluaciones de cultivo tisular (comentadas a continuacion); y que Enbrel reduce la inflamacion en el dfa 14 (de manera no significativa con N=15) pero no reduce el dano inflamatorio observado en el dfa 35, lo que indica que PA es mas eficaz que Enbrel.

Ejemplo 2

Este ejemplo describe datos que indican que el mecanismo de accion (MOA) de PA parece ser distinto del de Enbrel.

El MOA aceptado para el modelo animal de CIA es la inhibicion competitiva de la expresion de a-TNF. Enbrel es un inhibidor de a-TNF conocido. El analisis de regresion de los datos de Enbrel indico un retraso en la aparicion de la respuesta inflamatoria. En cambio, el analisis de regresion de los datos de PA sugirio una alteracion en el propio proceso inflamatorio. Por tanto, el MOA de PA no parece ser principalmente mediante inhibicion de a-TNF. Ademas, PA no solo es mas eficaz que Enbrel en la reduccion de la respuesta inflamatoria inducida en animales tratados, sino que ademas puede revertir el dano tisular preexistente provocado por esa respuesta.

Por tanto, sin desear limitarse a ninguna teorfa, PA puede “modular” un mecanismo de control basal responsable de integrar respuestas dependientes del sistema inmunitario. Este MOA abarcara la inhibicion de a-TNF pero desde una perspectiva autorreguladora en lugar de una simple inhibicion competitiva de molecula diana. Se predice que un MOA de este tipo tiene las siguientes propiedades:

1) se requieren pequenas cantidades - un efecto regulador sobre un mecanismo de control primitivo que se “bifurca” para influir sobre mecanismos adicionales;

2) autorregulador - si PA actua en un punto de control temprano en el sistema, tendra la capacidad de regular la intensidad y direccion del mecanismo dando como resultado pocos efectos secundarios, si los hay;

3) diana pleiotropica, es decir, no especffica de linaje celular - si el punto de control de PA esta en el inicio, entonces el control posterior debe ser diverso, y la concentracion de PA y el calendario de dosificacion deben ser constantes; y

4) debe encontrarse una estructura de molecula efectora de PA en asociacion con varias estructuras mas complejas.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Ejemplo 3

Este ejemplo describe datos que indican que PA tiene multiples actividades moduladoras en un modelo animal caracterizado por una enfermedad de deficiencia autoinmunitaria combinada que tiene una base genetica que da como resultado muerte temprana. En particular, PA previene la aparicion temprana de demacracion, expansion del compartimento esplenico, regula la inmunidad humoral (autoanticuerpos), inmunidad celular (equilibrio TH1/TH2) y la diferenciacion de celulas linfoides asf como mejora el dano tisular provocado por los procesos patologicos.

El modelo murino BXSB es un modelo animal basado en genes (Yaa) que se manifiesta con muerte temprana en machos, normalmente debido a insuficiencia renal. Este modelo se considera en la bibliograffa como un analogo para el lupus sistemico humano. El defecto genico expresa una serie de enfermedades autoinmunitarias sistemicas progresivas interrelacionadas que tienen el siguiente patron: atrofia tfmica, anticuerpo antinuclear, enfermedad hepatica, enfermedad artrftica, enfermedad renal y muerte temprana.

Dado que es un modelo genetico con multiples desenlaces, estudios anteriores de otros investigadores se han centrado en aspectos individuales de la enfermedad. El efecto de PA sobre multiples aspectos del proceso patologico estudiado en la presente memoria incluyen:

1. efecto global sobre la fisiologfa del animal

a. curvas de crecimiento

b. histologfa del timo, hfgado, cerebro, rinon, tobillo y rodilla

2. regulacion inmunitaria - proliferacion/apoptosis celular

a. tamano del bazo, y

b. recuento celular

3. dinamica de linfocitos

a. respuestas T/B frente a estfmulos mitogenicos

4. funcion de linfocitos

a. Inmunidad humoral

i. Produccion de Ig-PFC

ii. Autoanticuerpo: ANA, anticardiolipina

b. Inmunidad celular

i. Linfocito citolftico natural

c. Marcadores de superficie celular

d. Citocinas celulares

Diseno del estudio:

1. Tratamiento cronico, anomalo: se trataron grupos de 25 ratones BXSB macho (control + 4 grupos de tratamiento) con PA los M/W/F a lo largo de un periodo de 15 semanas con sacrificios para reducir el grupo periodicos (habitualmente cada 3 semanas de tratamiento)

2. Tratamiento cronico, normal: se trataron grupos de 15 ratones C57BL/6J macho con PA los M/W/F a lo largo de un periodo de 15 semanas con sacrificios periodicos para reducir el grupo (habitualmente cada 3 semanas de tratamiento)

3. Tratamiento agudo, anomalo: se trataron grupos de 15 ratones BXSB macho durante 3 semanas con cantidades de PA determinadas anteriormente, y despues se sacrificaron los animales 3, 6 y 9 semanas tras el tratamiento.

4. Tratamiento agudo, normal: se trataron grupos de 15 ratones C57BL/6J macho durante 3 semanas con cantidades de PA determinadas anteriormente, y despues se sacrificaron los animales 3, 6 y 9 semanas tras el tratamiento.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Determinacion de la concentracion de PA:

Se administraron cantidades de PA a ratones BXSB a lo largo de ocho logaritmos de concentracion, desde 1 mg/inyeccion hasta 10-7 mg/inyeccion. Los resultados indican dos optimos de PA, uno a 0,01 mg/inyeccion y otro a 10-5 mg/inyeccion. La forma de las curvas de dosis-respuesta es gaussiana. Por motivos de claridad, los datos presentados son para 10-5 mg/inyeccion (figura 1).

La figura 1 muestra el aumento de peso de ratones BXSB macho tras la administracion de PA. Los pesos se tomaron cada ver que se les inyecto a los animales o bien portador o bien PA. El panel A es la curva de crecimiento de aumento de peso para una raza de raton C57BL/6J normal, y se presenta para mostrar la forma tfpica de una curva de crecimiento de aumento de peso normal. El panel B muestra la suma acumulativa de datos de aumento de peso de 25 ratones BXSB macho de control. Esta curva muestra un pico de peso a aproximadamente 4 meses de edad, seguido por una disminucion del peso corporal, que corresponde a la aparicion notificada de la enfermedad autoinmunitaria de ratones BSXB. La disminucion en el peso corporal conduce al sfndrome de “demacracion” asociado con la deposicion de complejo inmunitario en el rinon.

El panel C muestra el efecto de la administracion cronica de PA a las dos concentraciones optimas (8 concentraciones estudiadas). Tanto 0,01 mg/inyeccion como 0,00001 mg/inyeccion muestran cambios significativos tanto en la forma de la curva de crecimiento de aumento de peso siendo mejores en comparacion con la forma logfstica normal que con el control de ratones BXSB como en el peso promedio de ambos grupos de animales tratados que es significativamente superior al control (X = 24,16, P = 0,0002, para la dosis de 10-5 mg).

Con el fin de analizar estas curvas de crecimiento y compararlas cuando se tratan grupos de animales BXSB con PA se realizo un analisis de regresion con los datos. Los datos de crecimiento de ratones C57BL/6J presentados anteriormente se representan mejor mediante la siguiente ecuacion cubica:

Control de ratones C57BL/6J -- y = -0,0286x3 + 0,4067x2 - 0,8452x + 16,816 [R2 = 0,9886]

El valor de R al cuadrado indica un ajuste extremadamente bueno entre los datos reales y la ecuacion lineal. La propia ecuacion es una extraccion relativamente sencilla de una curva de forma “logfstica”, que es tfpica de curvas de crecimiento normales (figura 1).

Hay cuatro conjuntos de datos separados para la curva de crecimiento de ratones BXSB de control. Todos los conjuntos de datos concuerdan internamente y la ecuacion global para los datos combinados es la siguiente:

Ratones BXSB combinados -- y = -0,0001x3 + 0,0034x2 + 0,1851x + 18,746 [R2 = 0,9384]

Esta ecuacion es una representacion cuantitativa de las diferencias en la forma de la curva constatadas entre los paneles A y B de la figura 1. La funcion cubica y cuadratica define la forma global y los valores muy bajos definen la velocidad de aumento de peso y la fase de “demacracion” cuando se observa que los pesos disminuyen en funcion del tiempo. En este estudio el objetivo no es hacer que la curva de crecimiento de ratones BXSB “se parezca” a la curva de ratones C57BL/6J, ya que cada raza tiene sus propias caracterfsticas de crecimiento especfficas, sino mas bien aumentar la velocidad de crecimiento inicialmente y disminuir o eliminar la “fase de demacracion” evidente en la figura 1, panel D.

La tabla 8 muestra las ecuaciones ajustadas para los diversos grupos de tratamiento con PA de animales BXSB. La pendiente de la curva de crecimiento inicial, que indica la velocidad de crecimiento, se ve gravemente limitada en animales BXSB de control. El punto de inflexion en animales BXSB de control indica el efecto letal del proceso patologico. Los resultados indican que el tratamiento con PA tiene un efecto positivo tanto sobre la velocidad de crecimiento como sobre la letalidad de una manera dependiente de la dosis.

Tabla 8: Efecto de PA sobre la cinetica de crecimiento de ratones BXSB

Tratamiento

Ecuacion de crecimiento

Ratones BXSB combinados

y = -0,0001x3 + 0,0034x2 + 0,1851x + 18,746 R2 = 0,9384

Rx 1,0 PA

y = 4E-06x3 - 0,4942x2 + 18171x - 2E+08 R2 = 0,9087

Rx 0,1 PA

y = -1 E-04x3 + 10,697x2 - 392306x + 5E+09 R2 = 0,9463

Rx 0,01 PA

y = 3E-05x3 - 2,8056x2 + 102980x - 1E+09 R2 = 0,918

Rx 0,001 PA

y= 1 E-05x3 - 1,3946x2 + 51161x - 6E+08 R2 = 0,9773

Rx 0,0001 PA

y = -4E-05x3 + 4,2053x2 - 154454x + 2E+09

Tratamiento

Ecuacion de crecimiento

R2 = 0,9487

Rx 0,00001 PA

y = -1 E-05x3 + 1,4883x2 - 54653x + 7E+08 R2 = 0,8665

Rx 0,000001 PA

y = 3E-05x3 - 2,9251x2 + 107455x - 1E+09 R2 = 0,8682

Rx 0,0000001 PA

y = -5E-06x3 + 0,5628x2 - 20666x + 3E+08 R2 = 0,9474

Analisis histoloaico:

El deterioro histologico de diversos organos del modelo de raton BXSB es el rasgo caracterfstico de una enfermedad 5 de deficiencia autoinmunitaria combinada. Este sfndrome presenta multiples facetas e implica varios organos. El dano a organos es progresivo y el dano individual puede variar segun el tipo de tejido.

La tabla 9 muestra los resultados del analisis histologico de cantidades mayores de PA (de 1 a 0,001 mg/inyeccion) e indica que PA cambio la aparicion y/o intensidad de los cambios histologicos de una manera dependiente de la 10 dosis. La tabla 10 muestra datos similares para cantidades menores de PA (de 0,00001 a 0,0000001 mg/inyeccion). Ambas dosis de PA mostraron la mayor mejora en la histologia de organos.

Tablas 9 y 10: Histologia de ratones BXSB

Tejido

Control de ratones BXSB Rx 1 mg de PA Rx 0,1 mg de PA Rx 0,01 mg de PA Rx 0,001 mg de PA

Timo

4+ (10-20 sem) 4+ (16-20 sem) 4+ (10-20 sem) 4+ (16-20 sem) 4+ (12-13 sem)

Hfgado (nucleos dobles)

inflamacion local 20 sem N/A inflamacion local 19 sem inflamacion local 10 sem inflamacion local 20 sem

Rinon

normal normal normal normal normal

Rodilla

normal normal normal inflamacion 16 sem normal

Tobillo

fibras que se disgregan 20 sem inflamacion 19 sem inflamacion 10 sem inflamacion 16 sem normal

15

Tejido

Control de ratones BXSB Rx 0,0001 mg de PA Rx 0,00001 mg de PA Rx 0,000001 mg de PA Rx 0,0000001 mg de PA

Timo

4+ (11-22 sem) normal 4+ (11-22 sem) 4+ (22 sem) 4+ (22 sem)

Hfgado (nucleos dobles)

inflamacion local 20 sem normal inflamacion local 19 sem normal inflamacion local 11 sem

Rinon

normal normal normal normal normal

Rodilla

normal normal normal normal normal

Tobillo

normal normal normal normal normal

Los resultados en las tablas 9 y 10 indican que el tratamiento con PA de ratones BXSB pudo reducir el dano autoinmunitario de una manera dependiente de la dosis. El tratamiento retraso la aparicion de atrofia tfmica, y redujo la intensidad de la inflamacion en el hfgado y las articulaciones. Los rinones permanecieron dentro del intervalo 20 normal. Los tejidos de animales tratados con PA mostraron una reversion del dano presente en tejidos de control de ratones BXSB, aunque no fueron completamente normales en comparacion con animales C57BL/6J. La dosis de PA optima fue de 0,0001 mg, lo cual concuerda con otros sistemas de ensayo (por ejemplo, produccion de Ig-PFC, actividad de NK, patron de respuesta frente a mitogeno, produccion de citocinas, produccion de autoanticuerpos, tamano de bazo, mejoras histologicas).

25

En resumen, los estudios indican que PA previene la aparicion temprana de demacracion, y mejora o revierte el dano provocado por procesos patologicos autoinmunitarios en tejidos incluyendo timo, hfgado, rinon, rodilla y tobillo.

Ejemplo 4

Este ejemplo describe datos que indican que PA tiene actividad moduladora inmunitaria (por ejemplo, proliferacion, apoptosis o diferenciacion) en el bazo reflejado por la inhibicion de la expansion en el bazo y el numero de esplenocitos.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se extirparon los bazos de animales durante los estudios. El bazo de ratones C57BL/6J normales fue un punto de referencia. Los bazos de animales BXSB no tratados estaban significativamente agrandados. En cambio, los bazos de animales BXSB tratados con PA se parecfan al tamano del bazo de animales C57BL/6J normales.

Los bazos agrandados en animales BXSB no tratados se conoce como esplenomegalia, y es el resultado o bien de un proceso infeccioso sistemico masivo o bien de apoptosis o proliferacion celular aberrante. Dado que estos animales se mantienen en un entorno esteril, es probable que el bazo agrandado sea el resultado de un control defectuoso del crecimiento/muerte celular. Otra explicacion para el bazo agrandado serfa que las celulas habfan aumentado su tamano individual, un proceso conocido como blastosis. La exploracion de los datos de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) para medir el tamano celular descarto esta posibilidad. El analisis mediante FACS revelo que aunque se observo una tendencia a celulas ligeramente mas grandes en los controles de ratones BXSB, no se observo ningun aumento estadfsticamente significativo del tamano celular. De manera que concuerda con estos hallazgos, los numeros de esplenocitos de ratones BXSB son mas de cinco veces los de animales normales (tabla 11, parte superior).

Tabla 11: Efecto de PA sobre la esplenomegalia

Control de ratones BXSB Ratones C57BL/6J Ratones DBA/2J

Media

5E+08 9E+07 1E+08

EEM

4E+07 7E+06 6E+06

N

20 20 20

Rx 1,0 PA Valor de p Rx 0,1 PA Valor de p Rx 0,01 PA Valor de p Rx 0,001 PA Valor de p

Media

1E+08 8,68E-03 1E+08 7,32E-04 7E+07 1,02E-06 1E+08 8,92E-06

EEM

7E+07 5E+07 4E+07 4E+07

N

3 3 5 4

RxE-04 PA Valor de p RxE-05 PA Valor de p RxE-06 PA Valor de p RxE-07 PA Valor de p

Media

3E+08 1,73E-02 1E+08 6,70E-05 3E+08 9,54E-02 2E+08 7,26E-05

EEM

6E+07 3E+07 1E+08 4E+08

N

4 3 4 5

La tabla 11 (parte superior) muestra el contenido de los bazos de ambas razas de raton de control, C57BL/6J y DBA/2J, y de ratones macho BXSB. Los numeros de esplenocitos de ratones BXSB son mas de 5 veces los encontrados para cualquiera de las razas normal. El tratamiento con PA redujo significativamente los numeros de esplenocitos de ratones BXSB (tabla 11, parte inferior).

En resumen, los estudios indican que PA regula la expansion del compartimento esplenico (proliferacion/apoptosis) provocada por la enfermedad autoinmunitaria y los numeros de esplenocitos. El tratamiento con PA redujo tanto el tamano del bazo como los numeros de esplenocitos significativamente de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 5

Este ejemplo describe datos que indican que los animales BXSB muestran una diferenciacion o proliferacion o apoptosis de esplenocitos aberrante. Por tanto, estos datos indican que la actividad de PA en el bazo de ratones BXSB incluye volver a regular la diferenciacion de esplenocitos o proliferacion/apoptosis de esplenocitos aberrante/deficiente (es decir restaurar la proliferacion o apoptosis celular normal).

Los mitogenos son lectinas que tienen la capacidad no especffica de estimular la division celular en poblaciones de celulas generales (por ejemplo, linfocitos T y/o B). Las lectinas se encuentran en plantas y animales y se caracterizan mejor como precursores de las moleculas de anticuerpo modernas. Las lectinas se utilizan para la comunicacion intracelular y otras formas de comunicacion.

Para determinar si el compartimento de linfocitos T en ratones BXSB es aberrante, se utilizaron dos mitogenos especfficos de celulas T y dos especfficos de celulas B para estudiar la respuesta de esplenocitos aislados a partir de ratones BXSB. Se utilizaron 7 concentraciones de mitogeno diferentes y 4 puntos de tiempo cineticos para someter a prueba la respuesta de esplenocitos de animales BXSB en cuanto a la amplitud de respuesta (una indicacion del numero de celulas presentes), y en segundo lugar, la concentracion de estimulacion optima (una indicacion del estado de diferenciacion de las celulas).

En resumen, se sacrificaron ratones BXSB y de control periodicamente durante el regimen de tratamiento y se extirparon sus bazos. Se dispensaron suspensiones de esplenocitos a de 1 a 2x106/ml en placas de 96 pocillos. Se anadieron mitogenos (de 10 p.G/10 ul a 0,01 mg/10 ul) por triplicado en los pocillos y se recogieron los cultivos a

intervalos de 24 horas desde 24 hasta 96 horas de cultivo. Se trataron todos los cultivos con timidina tritiada durante 16 horas antes de la recogida. Se extrajo el ADN, incluyendo el ADN radiomarcado recien sintetizado, sobre filtros de fibra de vidrio y se determino la radiactividad mediante por centelleo de lfquido.

5 Tabla 12: Respuestas a mitogenos de ratones normales (C57BL/6) (fndice de estimulacion, S.I.)

PHA: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

MEDIA

24,56 29,54 33,39 19,95 3,07 1,79 1,03

D.E.

11,39 13,47 14,00 11,47 3,40 1,69 0,57

EEM

2,15 2,55 2,65 2,17 0,64 0,32 0,11

Recuento

27 27 27 27 27 27 27

Con-A: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

MEDIA

0,57 1,69 48,07 11,79 1,83 2,00 2,39

D.E.

0,27 1,50 32,63 15,80 1,94 1,08 2,99

EEM

0,05 0,28 6,17 2,99 0,37 0,20 0,56

Recuento

27 27 27 27 27 27 27

SEB: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

MEDIA

18,70 15,79 10,61 7,87 5,23 3,41 1,47

D.E.

11,49 8,69 6,14 5,57 4,57 2,47 0,55

EEM

2,17 1,64 1,16 1,05 0,86 0,47 0,10

Recuento

27 27 27 27 27 27 27

LPS: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

MEDIA

105,66 103,65 94,60 85,92 69,95 59,05 39,44

D.E.

46,55 46,89 46,30 52,67 41,29 36,17 29,92

EEM

8,80 8,86 8,75 9,95 7,80 6,84 5,66

Recuento

27,00 27,00 27,00 27,00 27,00 27,00 27,00

10

La tabla 12 muestra las respuestas a mitogenos de ratones C57BL/6J frente a fitohemaglutinina (PHA), concanavalina A (Con-A), enterotoxina de estafilococos B (SEB) y lipopolisacarido (LPS). PHA y Con-A estimulan que proliferen poblaciones de linfocitos T basicos de una manera dependiente de la dosis, mientras que SEB y LPS estimulan la proliferacion dependiente de la dosis de poblaciones de linfocitos B.

15

Tabla 13: Respuestas a mitogenos de ratones BXSB

PHA: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

Media

4,63 2,17 3,64 4,29 3,77 2,55 1,95

D.E.

6,29 1,40 1,56 2,11 1,76 0,81 0,88

EEM

0,87 0,19 0,22 0,29 0,24 0,11 0,12

N

39 39 39 39 39 39 39

Con-A: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

Media

0,99 2,42 6,34 7,08 3,93 1,88 1,67

D.E.

1,02 2,07 4,32 3,69 3,46 0,97 0,93

EEM

0,14 0,29 0,60 0,51 0,48 0,14 0,13

N

39 39 39 39 39 39 39

SEB: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

Media

6,05 6,10 5,21 4,70 3,00 2,53 1,91

D.E.

3,77 3,18 2,69 3,48 1,66 1,85 1,04

EEM

0,52 0,44 0,37 0,48 0,23 0,26 0,14

N

39 39 39 39 39 39 39

LPS: SI

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

Media

26,40 27,76 29,58 24,83 10,85 7,08 3,97

D.E.

18,99 20,58 20,78 14,66 5,50 3,76 1,64

EEM

2,63 2,85 2,88 2,03 0,76 0,52 0,23

N

39 39 39 39 39 39 39

La tabla 13 muestra los resultados del estudio con mitogenos de ratones de control BXSB. Los analisis estadfsticos indican que todas las respuestas a mitogenos son significativamente inferiores a las de ratones de control C57BL/6J.

Ademas, la forma de las curvas de respuesta a PHA y Con-A para ratones de control BXSB son diferentes de los ratones de control C57BL/6J normales. En ambos casos hubo un desplazamiento hacia concentraciones de mitogeno inferiores para lograr una respuesta pico. Estos cambios en la forma de la curva de respuesta se han asociado con cambios en el estado de diferenciacion.

5

Tabla 14: Comparacion estadfstica de respuesta a mitogenos de ratones BXSB con el control

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

PHA

1E-10 2E-11 2E-11 5E-07 5E-02 N.S. N.S.

Con-A

N.S. N.S. 6E-07 6E-02 N.S. N.S. N.S.

SEB

2E-05 4E-06 4E-05 2E-04 6E-04 1E-03 N.S.

LPS

5E-09 2E-08 5E-07 5E-06 8E-08 8E-08 N.S.

La tabla 14 muestra una comparacion estadfstica de las respuestas a mitogenos de ratones BXSB de control con 10 respecto a ratones C57BL/6 de control. En casi todos los casos, la amplitud de la respuesta a mitogenos en ratones BXSB se suprime, lo que indica una disminucion de la poblacion de celulas maduras y un desplazamiento en la concentracion de respuesta optima hacia un valor inferior. Por tanto, estos datos indican una diferenciacion aberrante en esplenocitos de ratones BXSB de control que conduce a una sobreproliferacion o apoptosis reducida de esplenocitos.

15

Tabla 15: Respuesta a PHA en funcion del tratamiento con PA

PHA: S.I.

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

1 PA

2,23 3,27 8,64 11,52 10,91 4,63 1,86

0,1 PA

1,08 1,82 4,13 5,25 4,76 2,95 2,62

0,001 PA

1,52 1,21 2,70 4,41 3,90 2,57 1,94

0,0001 PA

5,53 4,03 9,65 15,41 10,91 3,91 1,95

1E-04 PA

5,71 2,98 5,14 6,82 6,22 2,73 1,66

1E-05 PA

7,73 7,00 8,34 9,80 7,26 3,47 1,89

1E-06 PA

2,70 3,13 4,47 4,82 3,84 3,29 2,20

1E-07 PA

5,08 5,84 3,41 4,22 3,90 2,37 2,00

Tabla 16: Respuesta a Con-A en funcion del tratamiento con PA

20

Con-A: S.I.

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

1 PA

1,42 4,88 23,61 36,83 6,57 2,70 2,07

0,1 PA

1,29 5,43 8,51 8,06 2,00 2,20 1,64

0,001 PA

1,34 3,31 8,26 17,4 9,14 3,33 1,92

0,0001 PA

1,92 2,05 27,27 51,59 10,40 2,10 2,02

1 E-04 PA

0,56 1,31 7,29 15,26 6,87 4,56 1,79

1 E-05 PA

0,76 3,10 5,31 14,29 7,69 2,25 1,34

1 E-06 PA

1,01 2,34 5,04 15,98 8,03 2,85 2,52

1 E-07 PA

1,65 2,90 9,05 22,83 8,10 2,17 2,05

Tabla 17: Respuesta a SEB en funcion del tratamiento con PA

SEB: S.I.

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

1 PA

13,39 11,88 12,41 8,39 6,42 4,73 3,76

0,1 PA

6,25 6,57 4,29 4,15 2,37 1,68 1,32

0,001 PA

7,51 7,54 10,06 7,37 5,76 5,28 3,82

0,0001 PA

14,60 12,60 9,55 5,72 4,66 4,21 2,05

1 E-04 PA

8,01 5,15 6,48 4,55 5,12 2,97 1,34

1 E-05 PA

6,92 8,02 7,94 5,28 4,13 3,54 3,40

1 E-06 PA

9,34 8,01 9,74 5,82 4,33 5,73 4,20

1 E-07 PA

5,92 5,67 5,88 6,90 2,33 2,35 2,33

25 Tabla 18: Respuesta a LPS en funcion del tratamiento con PA

LPS: S.I.

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

1 PA

52,36 52,74 56,61 49,82 22,00 18,14 8,47

0,1 PA

20,73 20,47 20,23 16,29 7,47 6,42 3,45

0,001 PA

13,85 15,86 16,57 12,71 8,52 6,46 4,76

0,0001 PA

37,85 42,85 41,46 37,76 19,10 15,78 6,41

1 E-04 PA

23,10 37,92 32,05 27,29 13,38 20,52 7,49

5

10

15

20

25

30

35

40

LPS: S.I.

10,00 5,00 1,00 0,50 0,10 0,05 0,01

1E-05 PA

27,43 27,18 27,90 28,69 17,44 16,69 8,88

1E-06 PA

22,67 21,88 17,14 17,60 12,40 9,27 6,30

1E-07 PA

14,49 16,56 17,95 18,56 10,99 7,20 3,40

Las tablas 15 a 18 muestran los efectos de PA sobre las respuestas a mitogenos de esplenocitos de ratones BXSB. Aunque la cinetica es compleja, pueden extraerse varias conclusiones. El hecho de que PA (0,5 mg) aumenta las respuestas a PHA y Con-A indica normalizacion de la dinamica de poblaciones de celula T y B. El hecho de que PA tambien restaura gran parte de la amplitud de las respuestas a mitogenos y la forma de las curvas de respuesta indica una restauracion parcial o completa de la respuesta de celulas T y celulas B frente a mitogenos.

En resumen, los estudios indican que los numeros de linfocitos esplenicos de ratones BXSB aberrantes asf como las respuestas a mitogenos de celulas T y B tfpicas pueden corregirse, por lo menos en parte, con tratamiento con PA.

Ejemplo 6

Este ejemplo describe datos que indican que PA reduce la cantidad de autoanticuerpos que es probable que sean responsables de la destruccion tisular en animales BXSB.

La inmunidad humoral es responsable de la produccion de anticuerpos y es significativa ya que se encuentran anticuerpos reumatoides en un porcentaje significativo en pacientes con RA. Se han encontrado anticuerpos anomalos en la capsula sinovial de algunos pacientes. En el modelo de ratones BXSB, se producen anticuerpos anomalos.

Se estudiaron celulas del bazo obtenidas a partir de animales BXSB de control y tratados con PA en un ensayo de celulas formadoras de placas (PFC). En este ensayo, se marcan los globulos rojos diana con protefna A que se unira a cualquier inmunoglobulina secretada independientemente de la especificidad antigenica, proporcionando por tanto una vista amplia de la inmunidad humoral.

Tabla 19: Celulas productoras de anticuerpos no especfficos de ratones BXSB

Ratones BXSB Ratones C57BL/6J

Media

60333 611,80

D.E.

33915 658,67

N

45 75,00

EEM

5056 120,26

La tabla 19 muestra las respuestas de Ig-PFC de esplenocitos de ratones BXSB de control, que es 100 veces mayor que los esplenocitos de ratones C57BL/6 de control, lo que indica una produccion de anticuerpos aberrante en los animales BXSB.

Tabla 20: Tratamiento con PA y produccion de Ig-PFC en animales BXSB

Ratones de control BXSB Rx 1 PA RX 0,1 PA Rx 0,01 PA Rx 0,001 PA

Media

60333 20741 35808 27909 30533

N

45 11 12 11 15

EEM

5056 6603 12010 2959 9581

Valores de P

4,22E-05 0,04 5,16E-07 0,01

Rx 0,0001 PA Rx 0,00001 PA Rx 0,000001 PA Rx 0,0000001 PA

Media

3850 12310 16278 11042

N

5 10 9 12

EEM

696 2040 4068 1751

Valores de P

7,33E-15 2,92E-12 3,11E-08 8,16E-13

La tabla 20 muestra el efecto de PA relacionado con la dosis sobre la produccion de Ig-PFC. Todas las cantidades de PA redujeron significativamente la sobreproduccion de Ig-PFC, mostrando 0,0001 mg de PA la mayor reduccion.

Los esplenocitos de ratones de control BXSB producen y secretan anticuerpos a niveles enormes (61400 +6435 PFC/1E06). Esto es aproximadamente 100 veces los valores observados en ratones de control normales C57BL/6J. El tratamiento con PA reduce significativamente los niveles de autoanticuerpos de una manera dependiente de la dosis y del tiempo.

5

10

15

20

25

30

35

Tabla 21: PA y el efecto sobre los autoanticuerpos circulantes en animales BXSB

Control Rx 0,01 PA

2 semanas

0,262 0,016

0,318 0,000

5 semanas

0,272 0,029

0,360 -0,032

11 semanas

1,317 0,103

1,449 0,125

14 semanas

0,402 0,283

0,357 0,206

La tabla 21 muestra el desarrollo de autoanticuerpos en animales BXSB (los numeros mas altos indican mayores cantidades de autoanticuerpos circulantes). El tratamiento con PA reduce los niveles de autoanticuerpos en todos los puntos de tiempo medidos.

Tabla 22: El efecto de la concentracion de PA sobre la produccion de autoanticuerpos (ANA)

Control Rx 1 PA Rx 0,1 PA Rx 0,01 PA Rx 0,001 PA

Media

0,475 0,306 0,176 0,091 0,341

N

11 7 7 9 11

EEM

0,14 0,03 0,09 0,03 0,10

Valor de P

0,16 0,07 0,02 0,25

Rx 0,0001 PA Rx 0,00001 PA Rx 0,000001 PA Rx 0,0000001 PA

Media

0,229 0,090 0,176 0,098

N

9 12 12 15

EEM

0,04 0,06 0,03 0,03

Valor de P

0,02 0,02 0,08 0,02

La tabla 22 muestra que la reduccion mediada por PA de autoanticuerpos es dependiente de la dosis. La mayor reduccion se produce a 0,00001 mg.

En resumen, PA regula el numero de anticuerpos no especfficos, reduciendo la cantidad de autoanticuerpos daninos. El hecho de que PA tambien reduce las celulas productoras de anticuerpos en bazos de ratones BXSB se correlaciona con estos datos. Por tanto, el tratamiento con PA restaura, por lo menos en parte, la inmunidad humoral.

Ejemplo 7

Este ejemplo describe datos que indican que PA reduce la respuesta de citotoxicidad de ratones BXSB, volviendo a regular esta respuesta a o cerca de niveles iniciales.

El componente celular del sistema inmunitario es el principal factor de integracion de la funcion para todo el sistema inmunitario, suministrando las celulas T y celulas B en sus diversas formas diferenciadas para la funcion tanto de reconocimiento como efectora. En el modelo de animal BXSB ha habido informes de que el sistema inmunitario mediado por celulas (CMI) esta intacto. Sin embargo, en contra de estos informes, los datos descritos a continuacion indican que el CMI esta afectado en el raton BXSB.

Se estudiaron ratones BXSB, tanto de control como tratados con PA, para determinar su capacidad para reconocer y someter a lisis dianas no especfficas marcadas con cromo radiomarcado. En resumen, se sembraron en placas aproximadamente 200 ml de celulas del bazo (1x107/ml) a partir de ratones BXSB de control y tratados en una placa de microtitulacion en medio RPMI y se realizaron cinco diluciones en serie dobles en medios RPMI. Se

J 51

radiomarcaron celulas P815 con cromo (Cr ) y se anadieron a cada pocillo de una placa de 96 pocillos, se centrifugaron durante 12 minutos y despues se incubaron durante 3-4 horas a 37°C. Volvieron a centrifugarse las celulas y se conto una muestra de 110 ml para determinar Cr51. Se presenta un protocolo mas detallado en Current Protocols in Immunology, 3.11, Assays for T cell Function.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 23: Respuesta de citotoxicidad de ratones BXSB y normales

Ratones de control BXSBC Ratones C57BL/6J Ratones BXSB Rx 3 semanas (agudo)

Razon E/F

% de lisis espedfica D.E. % de lisis espedfica D.E. % de lisis espedfica D.E.

100:1

122,0 5,0 2,0 0,1 5,43 4,1

50:1

95,1 9,4 -1,2 0,5 4,94 4,4

25:1

93,8 10,3 -1,5 0,6 3,94 3,3

12,5:1

85,4 8,3 -1,3 0,5 3,04 3,1

6,25:1

50,5 35,1 -1,2 0,2 2,84 3,0

3,13:1

5,3 5,3 -2,5 0,3

La tabla 23 muestra que los ratones normales (columna central) tienen un nivel inicial tfpico de actividad de linfocitos citoltticos naturales frente a la diana P-815 marcada con Cr51; el nivel es de entre el 0 y el 3% de citotoxicidad a una razon de efector/diana de 100:1. La columna de la izquierda muestra la respuesta de citotoxicidad de ratones BXSB frente a la misma diana; el nivel de citotoxicidad es extremadamente alto, a mas del 50% a una razon de efector/diana de 6:1. El tratamiento con PA de ratones BXSB a lo largo de un periodo de 3 a 15 semanas (columna de la derecha) redujo la citotoxicidad hasta niveles iniciales, es decir el 0-3% a una razon de E/T de 100:1 sin ningun analisis de regresion posible.

En resumen, los estudios indican que el tratamiento con PA reduce las respuestas de citotoxicidad de ratones BXSB no reguladas en un factor de 20, hasta o cerca de niveles iniciales de control. Por tanto, el tratamiento con PA restaura, por lo menos en parte, la inmunidad celular.

Ejemplo 8

Este ejemplo describe datos que indican que PA regula la expresion de marcadores CD que reflejan la regulacion de la diferenciacion, proliferacion o apoptosis celular de celulas de linaje linfoide.

La expresion de cumulos de determinantes (marcadores CD) indica el estado de diferenciacion de celulas linfoides. PA regula espedficamente estos marcadores. Esta regulacion tiene correlaciones directas con los datos descritos anteriormente.

Tabla 24A: Perfiles de marcadores CD

69+4- 69+4+ 69-4+ 4+8- 4+8+ 4-8+ 69+8- 69+8+ 69-8+

Ratones de control BL6

7,6+-1,4 7,6+-1,6 85+-2,9 74+-4,4 7,6+-1,7 18+-3,2 30+-2,3 5,0+-0,9 66+-2,7

N

23 23 23 23 23 23 23 23 23

Ratones BXSB 2-10

20+-4,1 13+-1,5 68+-5,1 42+-7,7 8,5+-1,3 49+-6,9 22+-5,7 7,8+-1,5 71+-6,9

p unilateral

0,009 0,017 0,006 0,002 0,34 0,0008 0,11 0,07 0,25

Ratones BXSB 11-15

44+-1,0 20+-1,3 36+-2,1 16+-1,3 14+-0,8 70+-1,1 23+-2,3 14+-0,7 64+-2,2

P unilateral

2,5E-12 4,8E-5 1,8E-9 1,7E-12 0,002 3,3E-14 0,03 1,7E-6 0,3

La tabla 24A muestra datos de varios marcadores CD de celulas T. Aproximadamente el 80% de los esplenocitos normales (ratones de control BL6) son celulas T no activadas (CD69-) celulas T (CD69-, CD4+). Esta poblacion disminuye en animales BXSB tanto jovenes (2-10 semanas de experimentacion, y de 10 a 18 semanas de edad cronologica) como ancianos (11-15 semanas de experimentacion, y de 19 a 23 semanas de edad cronologica). Tambien hay un efecto cinetico: los animales BXSB de 11-15 semanas estan comprometidos de manera mucho mas intensa en cuanto a sus marcadores de celulas T que animales BXSB mas jovenes. Esto se correlaciona con una funcion celular reducida y una tasa de muerte global aumentada.

Tabla 24B: Perfiles de marcadores CD, continuacion

19+45- 19+45+ 19-45+ 80+25- 80+25+ 80-25+

Ratones C57BL/6J

3+-0,6 80+-2 18+-3 70+-3 13+-1 18+-1

Ratones BXSB de 2-10 sem

8+-4 60+-12 35+-11 65+-7 17+-2 18+-5

P [unilateral]

N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.

Ratones BXSB de 11-15 sem

14+-7 64+-22 22+-15 61+-6 18+-2 21+-8

P [unilateral]

N.S. N.S. N.S. N.S. N.S. N.S.

La tabla 24B muestra datos de varios marcadores CD de celulas B. El primer conjunto de tres marcadores son indicativos de celulas B en reposo (es decir no activadas) y los ultimos tres representan celulas B activadas. Estos datos muestran que la poblacion de celulas B es independiente tanto de la raza como del estadio del proceso

5

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30

patologico en los ratones BXSB. Por tanto, parece que el componente inmunitario celular primario del proceso patologico de inmunodeficiencia combinada de ratones BXSB implica celulas T.

El grafico 1 muestra datos del efecto del tratamiento cronico (desde 3 hasta 15 semanas) de ratones BXSB con concentraciones variables de PA (de 1E-03 a 1E-07 mg de PA/inyeccion). La primera caracterfstica significativa de estos datos es que el tratamiento de ratones BXSB con PA regula la poblacion de celulas T CD69-/CD4+. La regulacion esta interrelacionada con la regulacion de los otros marcadores de celulas T, lo cual es de esperar dado que una poblacion celular actua sobre las otras en la serie (y otras series de celulas) en mecanismos tanto de retroalimentacion como de prealimentacion. Tambien hay un efecto de respuesta a la dosis de PA sobre poblaciones celulares, compatible con la respuesta descrita anteriormente en los ensayos funcionales; tambien hay una respuesta cinetica al tiempo de dosis. Estos datos indican que el tratamiento con PA si regula de hecho la diferenciacion de celulas T.

El grafico 1 tambien muestra datos que indican que la dosis de E-03 de PA rectifica la reduccion de CD69-CD4+ observada en ratones de control BXSB en puntos de tiempo tempranos, aunque mas tarde se pierde este efecto en puntos de tiempo mas largos de tratamiento cronico. En cambio, la dosis de E-07 parece ser eficaz en puntos de tiempo tanto cortos como largos. Estos datos son compatibles con caracterfsticas del regimen biorregulador: 1) Las curvas de dosis-respuesta son gaussianas; y 2) las pequenas cantidades de PA que producen los efectos sugieren una diana orientada al proceso en lugar de una diana efectora individual mas tradicional.

imagen1

La tabla 25 muestra el efecto de PA cronica (1E-05 mg/dosis) administrada tres veces por semana a lo largo de un periodo de 6 y 9 semanas en comparacion con el tratamiento agudo a la misma cantidad tres veces por semana durante un periodo de 3 semanas individual seguido por 6 y 9 semanas adicionales sin tratamiento. El tratamiento agudo es eficaz en la modulacion de la presentacion de marcadores CD. Aunque son complejos, los datos demuestran la interrelacion entre los diversos marcadores; de nuevo la serie de CD 8 parece ser menos sensible a PA que la serie CD4 o de celulas B.

Tabla 25

Porcentaje

Tratamiento agudo frente a cronico CD69+ CD69+ CD4+ CD4+ 0,00001 ug de PA CD4+ CD8+ CD69+ CD69+ CD8+

CD4- CD4+ CD69- CD8- CD8+ CD4- CD8- CD8+ CD69-

Ratones de control

19,73 12,45 67,50 41,85 8,48 49,24 21,53 7,80 70,67

BXSB 6 sem, agudo

56,25 22,42 21,34 17,64 7,68 73,59 24,91 5,56 69,54

5

10

15

Tratamiento agudo frente a cronico, 0,00001 ug de PA

Porcentaje

CD69+ CD69+ CD4+ CD4+ CD4+ CD8+ CD69+ CD69+ CD8+

CD4- CD4+ CD69- CD8- CD8+ CD4- CD8- CD8+ CD69-

9 sem, agudo

63,37 18,82 17,81 24,38 12,81 61,90 42,74 7,16 50,10

Ratones de control

7,58 7,63 84,69 73,81 7,60 18,41 29,61 5,01 65,56

BL6 Rx cronico, 6 sem

10,90 83,69 5,39 4,62 10,35 85,03 6,70 10,13 83,17

Rx cronico, 9 sem

46,20 23,09 30,45 16,64 10,40 72,96 23,02 12,74 64,23

La tabla 26 muestra un perfil en el tiempo de una unica dosis de PA (1E-05 mg) sobre la serie de nueve marcadores de celulas T utilizada en estos estudios. De nuevo, las celulas doble positivas (destinadas a apoptosis) asf como la serie de activacion con CD8 son relativamente resistentes al tratamiento. El tratamiento con PA si que modula la activacion de la serie CD4 y las celulas T citotoxicas maduras (CD8+CD4-).

Tabla 26

Porcentaje

CD69+ Tratamiento con 0,00001 ug de PA CD69+ CD4+ CD4+ CD4+ CD8+ CD69+ CD69+ CD8+

CD4- CD4+ CD69- CD8- CD8+ CD4- CD8- CD8+ CD69-

3 sem

29,79 12,41 57,8 42,57 7,22 50,21 24,98 4,78 70,24

6 sem

10,9 83,69 5,36 4,62 10,35 85,03 6,7 10,13 83,17

9 sem

46,2 23,09 30,45 16,64 10,4 72,96 23,02 12,74 64,23

12 sem

55,87 19,68 24,27 12,05 14,68 73,27 25,44 17,5 57,06

Ratones BL6 sin tratar

7,58 7,63 84,68 73,8 7,6 18,41 29,61 5,01 65,55

Ratones BXSB sin tratar

44,34 19,69 35,78 15,92 13,91 70,16 22,54 13,69 63,76

En resumen, los estudios indican que el tratamiento agudo o cronico con PA regulo los marcadores CD de celulas T en ratones BXSB de una manera dependiente de la dosis y la cinetica, lo cual se correlaciona con los cambios funcionales descritos anteriormente que incluyen la restauracion parcial de respuestas mitogenicas normales (ejemplo 5), la reduccion de la produccion de autoanticuerpos (ejemplo 6) y la reduccion de respuesta de citotoxicidad (ejemplo 7). Por tanto, PA regula la secuencia de diferenciacion de celulas de linaje linfoide.

Claims (5)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion que comprende una cantidad eficaz de protefna A monomerica (PA) suficiente para tratar un trastorno autoinmunitario para su utilizacion en el tratamiento del trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario.
2. 2. Composicion para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario segun la reivindicacion 1, en la que el trastorno autoinmunitario comprende artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, osteoartritis, artritis psoriasica, diabetes mellitus, esclerosis multiple, encefalomielitis, miastenia grave, lupus eritematoso sistemico (SLE), tiroiditis autoinmunitaria, dermatitis atopica, dermatitis eccematosa, psoriasis, sfndrome de Sjogren, enfermedad de Crohn, ulcera aftosa, iritis, conjuntivitis, queratoconjuntivitis, colitis ulcerosa, lupus eritematoso cutaneo, esclerodermia, vaginitis, proctitis, eritema nudoso leproso, uveitis autoinmunitaria, encefalomielitis alergica, encefalopatia hemorragica necrotizante aguda, perdida de audicion neurosensorial progresiva bilateral idiopatica, anemia aplasica, anemia de globulos rojos puros, trombocitopenia idiopatica, policondritis, granulomatosis de Wegener, hepatitis activa cronica, sfndrome de Stevens- Johnson, esprue idiopatico, liquen plano, enfermedad de Graves, sarcoidosis, cirrosis biliar primaria, uveitis posterior, fibrosis pulmonar intersticial, tiroiditis de Hashimoto, sfndrome poliglandular autoinmunitario, diabetes mellitus insulinodependiente, diabetes mellitus resistente a insulina, esterilidad mediada por el sistema inmunitario, enfermedad de Addison autoinmunitaria, penfigo vulgar, penfigo foliaceo, dermatitis herpetiforme, alopecia autoinmunitaria, vitiligo, anemia hemolftica autoinmunitaria, purpura trombocitopenica autoinmunitaria, anemia perniciosa, Sfndrome de Guillain-Barre, sfndrome del hombre rfgido, fiebre reumatica aguda, oftalmia simpatica, sfndrome de Goodpasture, vasculitis necrotizante sistemica, sfndrome antifosfolipfdico o una alergia.
3. 3. Composicion para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en la que el sujeto es un ser humano.
4. 4. Composicion para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la composicion debe ser administrada por via intravenosa, oral, intramuscular, intraperitoneal, intradermica, subcutanea, intracavitaria, intracraneal, transdermica o parenteral.
5. 5. Composicion para su utilizacion en el tratamiento de un trastorno autoinmunitario en un sujeto con o con riesgo del trastorno autoinmunitario segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la composicion es una formulacion farmaceutica.