ES2584428T3

ES2584428T3 - Modelado de tejidos en un sistema de células madre embrionarias (ES)

Info

Publication number: ES2584428T3
Application number: ES04737076.2T
Authority: ES
Inventors: Eugen Kolossov; Jürgen Hescheler; Heribert Bohlen; Bernd Fleischmann; Wilhelm Röll; Andreas Ehlich; Jessica KÖNIGSMANN
Original assignee: Axiogenesis AG
Current assignee: Axiogenesis AG
Priority date: 2003-06-20
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2016-09-27
Anticipated expiration: 2024-06-21
Also published as: EP2578676A1; US9321997B2; JP4904153B2; EP3184629A1; WO2004113515A3; EP1641912B1; CA2525847A1; US20170160259A1; JP2008532474A; WO2004113515A2; US20070258948A1; CA2525847C; EP1641912A2

Abstract

Procedimiento de modelado y/u obtención de tejido cardíaco o estructuras similares a tejido cardíaco que comprenden cultivar un primer tipo celular derivado de células madre embrionarias (ES) en presencia de al menos un segundo tipo celular embrionario, y permitir la integración y alineamiento de dichos al menos dos tipos celulares en el tejido o estructuras similares a tejido; siempre que las células no deriven de un embrión humano.

Description

DESCRIPCION

Modelado de tejidos en un sistema de celulas madre embrionarias (ES)

5 Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere en general al uso de tipos de celulas embrionarias y derivados de celulas madre embrionarias para su uso en la regeneration de tejidos y aplicaciones no terapeuticas como la selection de farmacos.

10

[0002] La presente invencion no se refiere al uso de celulas derivadas de un embrion humano.

Antecedentes de la tecnica

15 [0003] Las celulas precursoras se han convertido en un interes central para la investigation medica. Muchos

tejidos del organismo tienen un reservorio de seguridad de precursores que pueden sustituir a celulas senescentes o danadas por "lesion o enfermedad". Recientemente se ha hecho un esfuerzo considerable para aislar precursores de varios tejidos diferentes para su uso en medicina regenerativa. Las fuentes y sistemas para la production de celulas diferenciadas a partir de una poblacion de celulas madre para su uso donde quiera que se desee una poblacion 20 celular relativamente homogenea se han resumido, por ejemplo, en la solicitud de patente de EE. UU. US2003/0040111. Puede inducirse a celulas madre embrionarias (ES) multi y pluripotentes as! como a celulas germinales embrionarias (EG) de mamlfero a diferenciarse en cultivo en diversos tipos de celulas, incluso celulas de musculo cardlaco. No obstante, los cardiomiocitos derivados de celulas ES constituyen solo del 1 al 5% de todas las celulas en los cuerpos embrioides (EB) diferenciados. La fraction principal de estos esta compuesta de celulas ES 25 indiferenciadas portadoras de un potencial tumorigenico significativo.

[0004] Recientemente se ha descrito la seleccion genetica de tipos de celulas especlficos a partir de cultivos en diferenciacion de celulas madre embrionarias (ES) basada en el uso de elementos reguladores genicos especlficos de tejido, promotores que dirigen casetes de resistencia a farmacos, vease, por ejemplo, la solicitud

30 internacional WO02/051987. Por tanto, los determinados tipos celulares diferenciados originados a partir de clones transgenicos de ES que poseen el vector correspondiente, podrlan seleccionarse mediante la aplicacion del correspondiente farmaco que elimina a todos los demas tipos celulares emergentes as! como a celulas ES indiferenciadas. Hasta la fecha esta tecnica ha resultado mas especlfica y eficaz para un alto grado de purification de celulas cardlacas, neuronales y secretoras de insulina a partir de cultivos de celulas ES en diferenciacion.

35

[0005] No obstante, un reto importante para el uso de celulas madre en terapia es controlar el crecimiento y la diferenciacion en el tipo de tejido en particular requerido para el tratamiento de cada paciente. Por tanto, existe la necesidad de nuevas tecnicas para generar poblaciones de celulas y tejidos diferenciados adecuados para su administration a humanos. La solution a dicho problema tecnico se logra proporcionando las realizaciones

40 caracterizadas en las reivindicaciones y descritas con mas detalle a continuation.

Resumen de la invencion

La presente invencion no se refiere al uso de celulas derivadas de un embrion humano.

45

[0006] Es sabido que cada tejido consta de un tipo principal de celulas especlfico que determina su papel funcional junto con tipos celulares auxiliares (p. ej., fibroblastos, celulas del estroma, endoteliales, gliales, etc.), que son importantes para mantener la estructura arquitectonica tridimensional de un tejido, su funcion trofica y las interconexiones con otros sistemas tisulares del organismo completo.

50

[0007] La presente invencion se basa en la teorla de que el diseno de la mayorla de los tejidos que constituyen un organismo adulto se establece en el desarrollo embrionario inicial cuando aparecen los tipos celulares correspondientes durante la diferenciacion formando interconexiones segun moleculas de serialization y receptores emergentes especlficos. Por tanto, puede esperarse que cuando diferentes tipos celulares que

55 contribuyen a un determinado tipo de tejido se seleccionan geneticamente a partir del mismo cultivo de celulas ES en diferenciacion, estos formaran interconexiones y estructuras arquitectonicas segun sus indicaciones naturales especlficas determinadas geneticamente. En ese caso, el alto nivel de purificacion de las celulas de interes en un cultivo en diferenciacion de celulas ES geneticamente modificadas es la premisa principal para el "autoensamblaje" de una estructura similar al tejido en el transcurso de la diferenciacion de celulas ES in vitro.

[0008] Segun la presente invencion se podrla mostrar sorprendentemente que el cocultivo y el cotrasplante de cardiomiocitos derivados de celulas ES con fibroblastos embrionarios lleva a la formacion de tejido similar al cardlaco in vitro y a una mejora significativa en los resultados del trasplante cuando se inyectan en corazones

5 crioinfartados de ratones.

[0009] Por tanto, en un aspecto la presente invencion se refiere a un procedimiento de modelado y/u obtencion de tejido cardlaco o estructuras similares a tejido que comprende cultivar un primer tipo de celulas derivadas de celulas madre (ES) embrionarias en presencia de al menos un segundo tipo de celulas embrionarias; y

10 a permitir la integracion y alineamiento de dichos al menos dos tipos de celulas en el tejido cardlaco o estructuras similares a tejido, donde preferiblemente la celula ES de dicho primer tipo de celulas derivadas de celulas ES comprende un marcador seleccionable unido de forma operativa a una primera secuencia reguladora especlfica de tipo de celulas especlficas para dicho primer tipo de celulas. De este modo la aplicacion de un sistema de alta eficiencia de seleccion de farmacos aumenta de forma eficaz (de 5 a 10 veces) el rendimiento final debido a la 15 proliferacion intensiva de cardiomiocitos y reduce la amenaza de desarrollo tumoral tras el trasplante a un nivel insignificante.

[0010] Con respecto a lo anterior, la presente invencion generalmente se refiere a un procedimiento para mejorar la reparacion del tejido cardlaco y/o la funcion del organo en un mamlfero que comprende las etapas de:

20

(a) introducir un inoculo celular que comprende un cocultivo de tipos celulares derivados de celulas ES en el que se ha iniciado la diferenciacion con celulas auxiliares embrionarias o introducir un tejido diferenciado al menos en una porcion del area previamente danada del tejido, y

25 (b) permitir que dicho inoculo celular introducido se implante in situ como celulas o tejido viables situados dentro del area previamente danada del tejido, donde el implante tiene como resultado una mejora del tejido y/o de la funcion del organo en dicho mamlfero, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

[0011] Las celulas auxiliares son preferiblemente fibroblastos y/o celulas endoteliales.

30

[0012] En particular, se proporciona un procedimiento para mejorar la funcion cardlaca en un mamlfero tras un infarto de miocardio, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

(a) cultivar celulas madre embrionarias (ES) de mamlferos indiferenciadas que comprenden un gen resistente y un 35 gen indicador bajo el control del mismo promotor especlfico cardlaco in vitro en un medio de cultivo que contiene el

agente selectivo para el gen de resistencia en condiciones que permiten la diferenciacion de dichas celulas ES en cardiomiocitos;

(b) aislar dichos cardiomiocitos diferenciados y/o eliminar las celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con 40 celulas que se diferencias en tipos celulas irrelevantes a partir de dichos cardiomiocitos en el transcurso de la

diferenciacion;

(c) cotrasplantar posteriormente dichos cardiomiocitos con fibroblastos embrionarios o derivados de celulas ES y/o celulas endoteliales a al menos una porcion de la zona previamente infartada del tejido cardlaco; y

45

(d) permitir que dicho inoculo celular introducido se implante in situ como celulas viables situadas dentro del area previamente infartada del tejido cardlaco, donde el implante tiene como resultado una mejora de la funcion cardlaca en dicho mamlfero siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

50 [0013] Para el trasplante real, se entendera que el cotrasplante de las celulas puede no realizarse de forma

concomitante sino tambien de forma posterior de cualquier manera.

[0014] Puede que no siempre haya celulas embrionarias disponibles como fuente auxiliar del tipo de celulas derivado de celulas ES para su desarrollo en un determinado tejido o que determinadas celulas embrionarias no

55 sean adecuadas para este objetivo. Adicionalmente, pueden existir otros motivos por los que el uso de esas celulas no sea apropiado, por ejemplo, debido al diferente estado de desarrollo de las celulas.

[0015] Para superar estos posibles obstaculos se ha contemplado segun la invencion proporcionar asimismo los tipos celulares adicionales a partir de celulas ES. Por tanto, se ha desarrollado un sistema de modelado de

tejidos derivados de celulas ES. El nucleo central de la tecnica propuesta es una seleccion por farmacos paralela de tipos de celulas que constituyen tejidos de interes en un cultivo de celulas ES en diferenciacion. Una de las ventajas de dicha tecnica es que las interacciones entre los tipos de celulas purificadas se procesan de forma "natural" inmediatamente despues de liberarse de celulas irrelevantes, usando senales naturales para la senalizacion de 5 "interferencias" y la formacion de estructuras similares a tejido viables como resultado. Segun la presente invencion, en principio, pueden usarse dos variantes de dicha tecnica:

a) se transfectan de forma estable clones multiples de ES transgenicas con un determinado numero de vectores con un casete de seleccion por farmaco dirigidos por promotores especlficos segun los tipos celulares que constituyen el

10 tipo de tejido deseado. En esta variante todos los tipos celulares emergentes se originan a partir de un clon antecesor comun de celulas ES y la proporcion resultante entre los diferentes componentes celulares depende de la velocidad de diferenciacion relativa de cada uno de ellos; veanse las figuras 2A y 3B.

b) se utilizan cuerpos embrioides (EB) quimericos generandose varios clones de ES transgenicos mediante esta 15 tecnica, donde cada clon individual posee solo un vector con un casete de resistencia a farmacos dirigido por uno de

los promotores especlficos de tipo de celulas. Para el modelado del tejido, los clones relevantes se mezclan en la fase inicial de diferenciacion ("gotas colgantes" o "cultivo en masa") para formar agregados de celulas ES (EB) donde, tras la seleccion por farmacos, surgen tipos celulares que tienen su origen en los correspondientes clones celulares de ES diferentes, y la proporcion final de los componentes celulares tambien depende y puede controlarse 20 mediante la proporcion inicial entre diferentes llneas celulas de ES; veanse las figuras 2B y 3C.

[0016] Por tanto, en un aspecto adicional la presente invencion se refiere a un procedimiento de modelado y/u obtencion de tejido cardiaco o estructuras similares a tejido que comprende las etapas de:

25 (a) transfectar una o mas celulas ES con moleculas de acido nucleico recombinantes que comprenden una primera y una segunda secuencia reguladoras especlficas de tipo celular unidas de forma operativa a al menos un marcador seleccionable, en el que dicho segundo tipo celular es diferente de dicho primer tipo celular;

(b) cultivar las celulas en condiciones que permitan la diferenciacion de las celulas; y 30

(c) aislar celulas de al menos dos tipos celulares diferenciados y/o eliminar las celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes a partir de los tipos de celulas de interes que activen el marcador seleccionable en el transcurso de la diferenciacion siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

35

[0017] De igual modo, la presente invencion se refiere a celulas que se obtienen por los procedimientos de la invencion, donde dichas celulas son capaces de diferenciarse en al menos dos tipos celulares. De igual modo, se abarcan un agregado celular de al menos dos tipos celulares diferentes que se obtienen por el procedimiento de la invencion y el tejido que comprende celulas o un agregado celular obtenidos por el procedimiento de la invencion,

40 as! como organos, implantes y trasplantes que comprenden esas celulas, agregados celulares o tejido.

[0018] La posibilidad de utilizar celulas ES humanas en la terapia de sustitucion de tejido hace que el problema de la purificacion a alto nivel de los tipos de celulas diferenciadas derivadas de celulas ES sea una de las piedras angulares del futuro de la trasplantologla basada en celulas ES. Aun no se han establecido los altos

45 patrones y criterios de pureza para los tipos celulares especlficos derivados de celulas ES seleccionados para fines terapeuticos. Hasta la fecha, en un modelo murino, se ha demostrado que la tecnica basada en la seleccion por farmacos de tipos celulares diferenciados derivados de celulas ES geneticamente modificadas es la mas eficaz en terminos de ausencia de celulas ES indiferenciadas en la produccion final as! como una baja tasa de incidencia de carcinomas embrionarios en los animales receptores. Ademas del problema de la pureza, la calidad del implante de 50 las celulas trasplantadas en el tejido receptor, especialmente en uno deteriorado, podrla depender en gran medida de celulas auxiliares (fibroblastos conectores, celulas del estroma, endoteliales, gliales, etc.). Todos estos elementos tisulares importantes sufren en el tejido danado del receptor, a igual que el tipo principal de celulas, y por esto se generan problemas adicionales para el proceso de implante de las celulas trasplantadas, especialmente en sus etapas mas tempranas. Por tanto, la formacion de tejido durante la diferenciacion de celulas ES humanas podrla 55 convertirse en un procedimiento importante para la obtencion de un prototipo de tejido viable con altas posibilidades para el trasplante.

[0019] En un aspecto en particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento para la preparacion de una composition farmaceutica que mejore la funcion cardlaca en un mamlfero tras un infarto de miocardio,

comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) transfectar celulas madre embrionarias (ES) de mamlfero con una molecula de acido nucleico recombinante que comprende un gen de resistencia bajo en control de secuencias reguladores especlficas cardlacas, de fibroblastos y,

5 opcionalmente, de endotelio y que, opcionalmente, comprenden uno o mas indicadores en las mismas secuencias reguladoras;

(b) cultivar dichas celulas ES in vitro en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo para el gen de resistencia en condiciones que permitan la diferenciacion de dichas celulas ES en cardiomiocitos, fibroblastos y,

10 opcionalmente, celulas endoteliales;

(c) eliminar a partir de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales diferenciadas celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes; opcionalmente

15 (d) permitir el alineamiento de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales en diferenciacion en el tejido similar a cardlaco;

(e) cotrasplantar posteriormente dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales o dicho tejido en al menos una porcion de la zona previamente infartada del tejido cardlaco; y

20

(f) permitir que dichas celulas o tejido introducido se implante in situ como celulas viables situadas dentro del area previamente infartada del tejido cardlaco, donde el implante tiene como resultado una mejora de la funcion cardlaca en dicho mamlfero siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

25 [0020] Los vectores y composiciones de vectores que comprenden las moleculas de acido nucleico

recombinantes segun se usan en los procedimientos de la presente invencion tambien son objeto de la presente invencion, como tambien lo son las celulas que comprenden dicho vector o composiciones de vector.

[0021] El modelado in vitro de diferentes tipos de tejido a partir de, por ejemplo, celulas ES murinas tiene 30 diferentes aplicaciones en (i) estudios in vitro en las etapas iniciales de formacion de tejidos durante el desarrollo

embrionario as! como en la influencia de diferentes tipos de factores y compuestos qulmicos sobre este proceso. Esto ultimo hace a la tecnica propuesta util para (ii) un ensayo in vitro de toxicologla embrionaria de alto rendimiento, donde pueden probarse diversas sustancias no solo por su capacidad para influir sobre la diferenciacion especlfica del tipo celular sino tambien sobre el Intimo proceso de "autoensamblaje" de las celulas diferenciadas en un tipo de 35 tejido especializado. La formacion de estas estructuras similares a tejido in vitro supone tambien una mejora de la funcionalidad y viabilidad en comparacion con homologos individualizados. Por tanto, los procedimientos de la presente invencion proporcionan una buena base para (iii) ensayos farmacologicos y farmacocineticos in vitro de alto rendimiento, donde podrlan probarse los efectos funcionales directos y los efectos secundarios a nivel tisular de diferentes compuestos con efectos dirigidos a tejido esperados. En todas las implicaciones mencionadas 40 anteriormente se asume una disminucion significativa del uso caro y eticamente controvertido de animales tanto para fines cientlficos como de seleccion. Todos los aspectos mencionados anteriormente para celulas ES murinas ((i), (ii) y (iii)) son completamente aplicables a la formacion de tejidos a partir de celulas ES humanas con un acento notable en que estos son practicamente la unica eleccion posible para proporcionan estudios embriologicos y de seleccion de alto rendimiento en un modelo humano.

45

[0022] Para dichas realizaciones es especialmente adecuado el uso de chips o matrices que contienen las celulas en diferenciacion de la presente invencion. Por tanto, la presente invencion tambien se refiere a matrices que comprenden un soporte solido y celulas unidas al mismo o suspendidas en el, tambien se refiere a un agregado celular o tejido preparado segun la presente invencion, en especial, a matrices de microelectrodos (MEA). En este

50 contexto, la presente invencion tambien abarca a dispositivos adaptados para el analisis de dichas matrices.

[0023] Por tanto, la presente invencion tambien se refiere a procedimientos para obtener y/o realizar el perfil de una sustancia de ensayo capaz de influir sobre el desarrollo de celulas cardlacas y/o sobre la formacion de la estructura tisular que comprende las etapas de:

55

(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende celulas, un agregado celular, tejido o un organo preparada segun la presente invencion con una sustancia de ensayo; y

(b) determinar una respuesta fenotlpica en dicha muestra de ensayo en comparacion con una muestra control, en la

que un cambio en la respuesta fenotlpica de dicha muestra de ensayo en comparacion con la muestra control es una indicacion de que dicha sustancia de ensayo tiene un efecto sobre el desarrollo celular y/o la formacion de la estructura tisular.

5 [0024] Esos procedimientos, que preferiblemente se realizan sobre un chip o una matriz, se implementan de

forma ventajosa en cualquiera de los procedimientos para obtencion/modelado de tejidos descrito en este documento, donde dicha muestra de ensayo se pone en contacto con dicha sustancia de ensayo antes, durante o despues de que dicha celula o agregado celular pase a traves de dicho procedimiento. Estos procedimientos de selection pueden combinarse con otros procedimientos de fabrication de farmacos o servir para refinarlos, en

10 particular de farmacos que ayudan a la curacion de herida y/o a la curacion de tejidos danados. Esos procedimientos pueden comprender por ejemplo, la mezcla de la sustancia aislada con un vehlculo farmaceuticamente aceptable y el acondicionamiento en un recipiente apropiado con las correspondientes indicaciones para el tratamiento terapeutico previsto.

15 [0025] Para todos los procedimientos de la presente invention se proporcionan kits utiles para realizar dichos

procedimientos que contienen los vectores o composiciones de vectores mencionados, matrices, celulas pluripotentes y, opcionalmente, un medio de cultivo, moleculas de acido nucleico recombinantes, compuestos patron, etc., siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

20 [0026] Otras realizaciones de la invencion seran aparentes a partir de la description que se recoge a

continuacion.

Breve descripcion de los dibujos

25 [0027]

Fig. 1: Esquema principal de los vectores para el modelado de tejidos en el sistema de celulas ES de la presente invencion

30 Fig. 2: Dos vectores: (A) Un clon de celulas ES transgenicas; (B) Dos clones de celulas ES transgenicas.

Fig. 3 : Tres vectores: (A) Construcciones de vector; (B) Un clon de celulas ES transgenicas; (C) Tres clones de celulas ES transgenicas.

35 Fig. 4: Los cardiomiocitos derivados de celulas ES, EGFP+ seleccionados con puromicina se cocultivaron en placas con fibroblastos embrionarios de raton. A, B - 1, 5d; C y D - 6d en cocultivo. Son evidentes los lineamientos de los cardiomiocitos EGFP+ con los fibroblastos los dlas 5° y 6°, respectivamente.

Fig. 5 : Los fibroblastos embrionarios de raton y los cardiomiocitos derivados de celulas ES, positivos para EGFP y

40 purificados con puromicina se disociaron mediante tratamiento con colagenasa y se cocultivaron en placas sobre la MEA. El dla 4 despues de la disposition en placas el grupo de celulas cardlacos con latido espontaneo EGFP positivas para aplastado estaba completamente integrado en la capa de fibroblastos (A) y se registraba un PA regular a partir de la mayorla de ellos (B).

45 Figura 6: Los cardiomiocitos derivados de celulas ES seleccionados con puromicina se implantaban con exito en las zonas crioinfartadas cuando se cotrasplantaban con fibroblastos sinergicos. A, un corazon 40 dlas despues del trasplante con luz de transmision-fluorescente combinada; B, C, los cardiomiocitos derivados de celulas EC (C) positivas para EGFP implantadas muestran estriado tras una inmunotincion con a-actinina (B).

50 Descripcion de la invencion

[0028] Celulas madre de diversos tipos se ha convertido en una modalidad extremadamente atractiva en la

medicina regenerativa. Estas pueden proliferar en cultivo y, a continuation, diferenciarse in vitro o in situ en los tipos celulares necesarios para el tratamiento. Sin pretender estar ligado a la teorla, es una hipotesis de esta invencion

55 que algunas de las poblaciones de celulas diferencias producidas usando procedimientos de cultivo adaptativo y seleccion positiva no seran optimas para su uso en terapia humana. En algunas circunstancias, las celulas indiferenciadas en la poblacion pueden alterar la implantation o funcion de las celulas in vivo. Las celulas indiferenciadas tambien pueden aumentar la posibilidad de formacion de una neoplasia maligna u otro tipo de tumor en el lugar del implante terapeutico, o mediante migration de las celulas trasplantadas. Ademas, o alternativamente,

la provision e implantacion de un tipo celular embrionario en particular puede a menudo no ser suficiente para conseguir la reconstitucion de, por ejemplo, el tejido danado.

[0029] Esta invencion esta dirigida a procedimientos para proporcionar protocolos y procedimientos para 5 proporcionar tejidos y organos de novo especialmente utiles para el trasplante y otros fines como se caracteriza en

las reivindicaciones.

[0030] En un primer grupo de experimentos segun la presente invencion podrla mostrarse que los cardiomiocitos purificados con puromicina muestran integracion y alineamiento con fibroblastos embrionarios en

10 cocultivo con estructuras de tipo tisular. No obstante, la cuestion sigue siendo si estas estructuras similares a tejido son comparables, o al menos estan suficientemente proximas, al tejido cardlaco nativo y, si es asl, si el efecto observado en cultivo in vitro tambien puede conseguirse in vivo.

[0031] Experimentos posteriores podrlan demostrar que los cardiomiocitos derivados de celulas ES 15 seleccionados mediante puromicina pueden implantarse en las zonas crioinfartadas del corazon de un raton cuando

se cotrasplantan con fibroblastos embrionarios singenicos. Esos cardiomiocitos derivados de celulas ES muestran la morfologla de subtipos cardlacos diferentes que ofrecen un aparato contractil bien desarrollado.

[0032] Por tanto, se ha establecido un sistema de alta eficacia de seleccion de farmaco y control de calidad 20 de tipos celulares derivados de celulas ES transgenicos como los cardiomiocitos. La seleccion de farmacos aumenta

de forma eficaz (de 5 a 10 veces) el rendimiento final debido a la proliferacion intensiva especlfica de tipo celular y reduce la amenaza de desarrollo tumoral tras el trasplante a un nivel insignificante. Ademas, el cocultivo y el cotrasplante de tipos celulares derivados de celulas ES con tipos celulares embrionarios pertenecientes al tejido conjuntivo como los fibroblastos permite la generacion de tejido nativo y estructuras similares a tejido in vitro e in 25 vivo.

[0033] Las tecnicas de esta invencion se han disenado en parte para proporcionar poblaciones celulares con caracterlsticas mejoradas para la terapia humana siempre que las celulas no deriven de un embrion humano. Tras la deplecion de las celulas indiferenciadas, se espera que la poblacion de tipos celulares embrionarios y derivadas de

30 celulas ES diferenciadas diferentes posea mejores caracterlsticas funcionales y de implante, y tenga un riesgo reducido de generar arquitectura tisular no deseada y neoplasias malignas en el sujeto tratado. Ademas, las poblaciones celulares de diferentes tipos celulares embrionarios y derivados de celulas ES que se desarrollan en tejido estan relacionadas mas de cerca con la situacion in vivo, lo que proporciona una ventaja notable para aplicaciones no terapeuticas como la seleccion de candidatos a farmacos.

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Definiciones

[0034] Para los fines de esta descripcion, el termino "celula madre" puede referirse a celulas madre o a celulas germinales, por ejemplo madre embrionarias (ES) siempre que las celulas no deriven de un embrion humano

40 y celulas germinales (EG), respectivamente. Brevemente, una celula madre tiene la capacidad de proliferar y formar celulas de mas de un fenotipo diferente, y tambien es capaz de autorrenovarse, como parte del mismo cultivo, o cuando se cultiva en condiciones diferentes. Las celulas madre embrionarias tambien son tlpicamente positivas para telomerasa y positivas para OCT-4. La actividad telomerasa puede determinarse usando el ensayo de actividad TRAP (Kim y col., Science 266 (1997), 2011), usando un kit disponible en el mercado (Kit de Deteccion de 45 Telomerasa TRAPeze(R) XK, N.° de cat. s7707; Intergen Co., Purchase N.Y. o TeloTAGGG(TlVI) Telomerase PCR ELISAplus, N.° de cat. 2 013 89; Roche Diagnostics, Indianapolis). La expresion de hTERT puede tambien evaluarse a nivel de ARNm mediante RT-PCR. El kit de cuantificacion de hTERT LightCycler TeloTAGGG(TM) (N.° de cat. 3 012 344; Roche Diagnostics) esta disponible en el mercado con fines de investigacion.

50 [0035] Las "celulas germinales embrionarias" o "celulas EG" son celulas derivadas de celulas germinales

primordiales. El termino "celula germinal embrionaria" se utiliza para describir las celulas de la presente invencion que muestran un fenotipo celular pluripotente embrionario. Los terminos "celula germinal embrionaria (EG) humana" o "celula germinal embrionaria" pueden usarse indistintamente en este documento para describir celulas de mamlfero, preferiblemente humanas, o sus llneas celulares, de la presente invencion que muestran un fenotipo de 55 celulas madre embrionarias pluripotentes como se define en este documento. Por tanto, las celulas EG son capaces de diferenciarse en celulas de las capas germinales ectodermica, endodermica y mesodermica. Las celulas EG tambien pueden caracterizarse por la presencia o ausencia de marcadores asociados con sitios de epltopos especlficos identificados mediante la union de anticuerpos en particular y la ausencia de determinados marcadores segun se identifica por la ausencia de union de determinados anticuerpos.

[0036] "Pluripotente" se refiere a celulas que retienen el desarrollo potencial para diferenciarse en una amplia variedad de estirpes celulares que incluyen la llnea germinal. Los terminos "fenotipo de celula madre embrionaria" y "celula similar a madre embrionaria" tambien se usan indistintamente en este documento para describir celulas que

5 estan indiferenciadas y, por tanto, son celulas pluripotentes y que son capaces de distinguirse visualmente de otras celulas adultas del mismo animal.

[0037] Estan incluidas en la definicion de celulas ES las celulas embrionarias de diversos tipos, ejemplarizadas por celulas madre embrionarias de primates, como celulas madre de macaco Rhesus (Thomson y

10 col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7844), celulas madres de tit! (Thomson y col., Biol. Reprod. 55 (1996), 254).

[0038] Las "celulas nodrizas" o "nodrizas" son terminos utilizados para describir celulas de un tipo que se cocultivan con celulas de otro tipo, para proporcionar un entorno en el que las celulas del segundo tipo pueden

15 crecer. Las celulas nodrizas son opcionalmente de una especie diferente a las celulas de las que son auxiliares. Por ejemplo, determinados tipos de celulas ES pueden estar ayudadas por fibroblastos embrionarios primarios de raton, fibroblastos embrionarios de raton inmortalizados (como celulas sTo murinas, por ejemplo, Martin y Evans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 (1975), 1441-1445), o celulas similares a fibroblastos humanos diferenciados a partir de celulas ES humanas, como se describe mas adelante en esta memoria descriptiva. El termino "celulas STO" hace 20 referencia a fibroblastos murinos embrionarios como los disponibles en el mercado e incluya a las depositadas como ATCC CRL 1503.

[0039] El termino "cuerpos embrioides" (EB) es un termino de la tecnica sinonimo de "cuerpos agregados". Los terminos se refieren a agregados de celulas diferenciadas e indiferenciadas que aparecen cuando las celulas ES

25 crecen en exceso en cultivos monocapa, o se mantienen en cultivos en suspension. Los cuerpos embrioides son una mezcla de diferentes tipos celulares, tlpicamente a partir de varias capas germinales, distinguibles por criterios morfologicos; vease tambien infra.

[0040] Los terminos "polinucleotido" y "molecula de acido nucleico" se refieren a un pollmero de nucleotidos 30 de cualquier longitud. Se incluyen genes y fragmentos genicos, ARNm, ARNt, ribozimas, ADNc, polinucleotidos

recombinantes, polinucleotidos ramificados, plasmidos, vectores, ADN y ARN aislados, sondas de acido nucleico y cebadores. Segun se usa en esta memoria descriptiva, el termino polinucleotidos hace referencia de forma indistinta a moleculas de cadena doble y sencilla. Siempre que no se especifique o requiera otra cosa, cualquier realizacion de la invention que es un polinucleotido abarca tanto una forma de cadena doble como cada una de las dos formas de 35 cadena sencilla complementarias conocidas o que se preve constituyen la forma de doble cadena. Se incluyen analogos de acido nucleico como fosforamidatos y tiofosforamidatos.

[0041] Se dice que una celula esta "geneticamente alterada", "transfectada" o "geneticamente trasformada" cuando un polinucleotido se ha transferido dentro de la celula mediante cualquier medio adecuado de manipulation

40 artificial o cuando la celula es una progenie de la celula originalmente alterada que ha heredado el polinucleotido. El polinucleotido comprendera a menudo una secuencia transcribible que codifique una protelna de interes, que permita a la celula expresa la protelna a un nivel elevado. Se dice que la alteration genetica es "hereditaria" si la progenie de la celula alterada tiene la misma alteracion.

45 [0042] Una "secuencia reguladora" o "secuencia control" es una secuencia de nucleotidos implicada en una

interaction de moleculas que contribuye a la regulation funcional de un polinucleotido, como replication, duplication, transcription, ayuste, traduction o degradation del polinucleotido. Entre los elementos de control transcripcional se incluyen promotores, potenciadores y represores.

50 [0043] Las secuencias genicas particulares referidas como promotores, como el promotor "aMHC" o

"colageno", son secuencias de polinucleotidos derivadas del gen de referencia en que promueven la transcripcion de un producto de expresion del gen al que se unen de forma operativa. Se reconoce que diversas porciones de la secuencia genica antes del extremo 5' y del intron no traducido pueden en determinadas circunstancias contribuir a promover la actividad y que todos o cualquier subgrupo de estas porciones pueden estar presentes en la 55 construction obtenida por ingenierla genetica a la que se refieren. El promotor puede basarse en la secuencia genica de cualquier especie que tenga el gen, siempre que no este expllcitamente restringido, y puede incorporar cualquier adicion, sustitucion o deletion que se desee, siempre que mantenga la capacidad para promover la transcripcion en el tejido diana. Las construcciones geneticas disenadas para el tratamiento de humanos tlpicamente comprenden un segmento que es al menos el 90% identico a una secuencia promotora de un gen humano. Puede

comprobarse la actividad y especificidad de una secuencia en particular, por ejemplo, mediante su union de forma operativa a un gen indicador; vease la figura 1.

[0044] Se dice que los elementos geneticos esta "unidos de forma operativa" si estan en una relacion

5 estructural que les permita funcionar de acuerdo con su funcion prevista. Por ejemplo, si un promotor ayuda a iniciar la transcripcion de la secuencia codificadora, la secuencia codificadora puede referirse como unida de forma operativa (o bajo su control) al promotor. Puede haber secuencias intermedias entre el promotor y la region codificadora siempre que se mantenga su relacion funcional.

10 [0045] En el contexto de las secuencias codificadoras, promotores y otros elementos geneticos, el termino

"heterologo" indica que el elemento deriva de una entidad geneticamente diferenciada del resto de la entidad con la que se esta comparando. Por ejemplo, un promotor o gen introducido por tecnicas de ingenierla genetica en un animal de una especie diferente se dice que es un polinucleotido heterologo. Un elemento genetico "endogeno" es un elemento que esta en el mismo lugar en el cromosoma en el que se encuentra en la naturaleza, aunque pueden 15 haberse introducido artificialmente otros elementos en una posicion vecina.

[0046] Los terminos "polipeptido", "peptido" y "protelna" se usan de forma indistinta en esta memoria descriptiva para referirse a pollmeros de aminoacidos de cualquier longitud. El pollmero puede comprender aminoacidos modificados, puede ser lineal o ramificado y puede estar interrumpido por no aminoacidos.

20

Descripcion detallada de las realizaciones de la presente invencion

[0047] La presente invencion se refiere a las realizaciones segun se caracteriza en las reivindicaciones y no se refiere al uso de celulas derivadas de un embrion humano.

25

[0048] En un aspecto, la presente invencion se refiere a un procedimiento de modelado y/u obtencion de tejido cardlaco o estructuras similares a tejido que comprende cultivar un primer tipo celular derivado de celulas madre embrionarias (ES) en presencia de al menos un segundo tipo celular embrionario, y permitir la integracion y alineamiento de dichas al menos dos tipos celulares en el tejido o estructuras similares a tejido.

30

[0049] La invencion puede ponerse en practica usando celulas madre de cualquier especie de vertebrados. Esto incluye celulas madre de humanos siempre que las celulas no deriven de un embrion humano as! como de primates no humanos, animales domesticos, ganado y otros mamlferos no humanos. Entre las celulas madre adecuadas para su uso en esta invencion se encuentran celulas madre pluripotentes de primate derivadas de tejidos

35 formados tras la gestacion, como blastocitos, o tejido fetal o embrionario obtenido en cualquier momento durante la gestacion. Son ejemplos no limitantes los cultivos primarios o llneas estabilizadas de celulas madre embrionarias. La invencion tambien es aplicable a celulas madre adultas. Esto hace referencia a la literatura de Anderson y col., Nat. Med. 7 (2001), 393-395 y Anderson y col., 2001, Gage, F.H., 200 y Prockop, Science 276 (1997), 71-74, donde se describe la extraccion y cultivo de estas celulas.

40

[0050] Los medios para el aislamiento y propagacion de celulas madre pueden tener varias formulas diferentes siempre que las celulas obtenidas tengan las caracterlsticas deseadas y pueden propagarse adicionalmente. Entre las fuentes adecuadas se incluyen medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), N.° de cat. de Gibco: 12440-053; medio de Eagles modificado por Dulbecco (DMEM), N.° de cat. de Gibco: 11965-092;

45 medio de Eagles modificado por Dulbecco para genes silenciados (KO DMEM), N.° de cat. de Gibco: 10829-018; L- glutamina 200 mM, N.° de cat. de Gibco: 15039-027; solucion de aminoacidos no esenciales, N.° de cat. de Gibco: 11140-050; [beta]-mercaptoetanol, N.° de cat. de Sigma: M7522; factor de crecimiento de fibroblastos basico recombinante (bFGF), N.° de cat. de Gibco: 13256-029. Se conocen ejemplos de medios y condiciones para ES que contienen suero para el cultivo de celulas madre y pueden optimizarse de forma apropiada segun el tipo celular. En 50 las referencias citadas en este documento se proporcionan medios y tecnicas de cultivo para los tipos celulares en particular referidos en la seccion previa.

[0051] Como se menciono anteriormente, los expertos en la materia disponen de varias fuentes de celulas ES. Pueden aislarse celulas madre embrionarias a partir de blastocitos de miembros de las especies de primates

55 (Thomson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7844).

[0052] Recientemente, se ha notificado que el diente caduco humano exfoliado, un tejido comparable muy accesible, contiene celulas madre multipotentes que se identificaron como una poblacion de celulas clonogenicas con alta capacidad proliferativa capaces de diferenciarse en diversos tipos celulares incluidos celulas neuronales,

adipocitos y odontoblastos, vease Miura y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 5807-5812. Tras el trasplante in vivo, se encontro que estas celulas eran capaces de inducir formacion osea, generar dentina y sobrevivir en el cerebro de raton junto con la expresion de marcadores neuronales. Adicionalmente, Lin y col. en Stem Cells 21 (2003), 152-161 han descrito el potencial multiestirpe de las celulas madre homocigotas de ovocitos en metafase II.

5 Se revisan varias fuentes de celulas precursoras en musculos postnatales y los factores que pueden potenciar la participacion de celulas madre en la formacion de nuevo esqueleto y musculo cardlaco in vivo en Grounds y col., J. Histochem. Cytochem. 50 (2002), 586-610. La purificacion de celulas madre hematopoyeticas (HSC) raras a homogeneidad que se alojan en la medula osea se describe en la solicitud de EE. UU. US2003/0032185. Se describe que estas celulas de medula osea adultas tienen una enorme capacidad de diferenciacion ya que tambien 10 pueden diferenciarse en celulas epiteliales del hlgado, pulmon, tracto digestivo y piel. Este hallazgo puede contribuir al tratamiento cllnico de la enfermedad genetica o a la reparacion tisular. Adicionalmente, pueden emplearse tecnicas como la transferencia nuclear para la reconstruccion de embriones en las que se trasplantan nucleos donantes diploides en ovocitos MII enucleados. Esta tecnologla junto con otros procedimientos que ayudan al establecimiento de llneas celulares madre embrionarias (ES) modificadas que son geneticamente identicas a las del 15 receptor se ha revisado en Colman y Kind, Trends. Biotechnol. 18 (2000), 192-196. Para evitar el rechazo del implante asociado con celulas alogenicas o xenogenicas en el trasplante, se usan preferiblemente celulas o receptores singenicos o autologos en las realizaciones correspondientes de la invencion. A la vista de las fuentes de celulas madre recientemente descubiertas como las de medula osea y dientes, seria posible cumplir esta demanda sin necesidad de recurrir a celulas y tejido embrionario. Alternativamente, las celulas pueden manipularse 20 geneticamente para suprimir antlgenos de trasplante relevantes, vease tambien infra, pueden usarse agentes inmunodepresores.

[0053] El campo de la tecnologla de celulas madre esta siendo revisado por Kiessling y Anderson, Harvard Medical School, en Human Embryonic Stem Cells: An Introduction to the Science and Therapeutic Potential; (2003)

25 Jones y Bartlett Publishers; ISBN: 076372341X.

[0054] Para evitar el uso de, por ejemplo, embriones humanos como donantes de celulas madre, puede ser posible incluso emplear animales transgenicos no humanos, en especial mamlferos, como fuente de celulas madre embrionarias. Por ejemplo, en la patente de EE. UU. 5 523 226 se describen composiciones y procedimientos para

30 obtener cerdos transgenicos para su uso como donantes xenografos. As! mismo, en la solicitud internacional WO97/12035 se describen procedimientos de produccion de animales transgenicos para xenotrasplante. Adicionalmente, en la solicitud internacional WO01/88096 se describe un tejido animal inmunologicamente compatible, adecuado para xenotrasplante en pacientes humanos. Los procedimientos para obtener celulas germinales embrionarias a partir de cerdo se describen, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 6 545 199.

35

[0055] Las celulas madre pueden propagarse de forma continua en cultivo, usando una combinacion de condiciones de cultivo que promueven la proliferation sin promover la diferenciacion. Tradicionalmente, las celulas madre se cultivan sobre una capa de celulas nodrizas, tlpicamente celulas de tipo fibroblasto, a menudo derivadas de tejido embrionario o fetal. Las llneas celulares se crecen en placas hasta practicamente la confluencia,

40 normalmente se irradian para evitar su proliferacion y, a continuation, se usan como apoyo para el cultivo en medio condicionado de determinadas celulas (p. ej., Koopman y Cotton, Exp. Cell 154 (1984), 233-242; Smith y Hooper, Devel. Biol. 121 (1987), 1-91) o mediante la adicion exogena de factor inhibidor de leucemia (LIF). Estas celulas pueden crecer de forma relativamente indefinida usando las condiciones de cultivo apropiadas.

45 [0056] En la solicitud internacional WO03/01303 y en Mummery y col., Circulation 107 (2003), 2733-2740, se

describen experimentos con celulas madre embrionarias humanas (hES) que se diferencian a cardiomiocitos, donde dichas celulas hES se cocultivan con celulas similares a endodermo visceral (VE) de raton. En esos experimentos las celulas de endodermo de raton sustituyen a las celulas nodrizas de tipo fibroblasto de raton utilizadas normalmente y se usan para la induction de diferenciacion de cardiomiocitos en celulas hES que no sufren 50 cardiogenesis espontanea.

Por consiguiente, Mummery y col. no muestran un procedimiento para proporcionar tejido o estructuras similares a tejido que permita la integration y alineamiento de dichas celulas de endodermo con las celulas hES. Por el contrario, el uso de celulas de endodermo de raton indica de hecho que estas desaparecen cuando se utilizan los 55 cardiomiocitos diferenciados para aplicaciones adicionales incluido el trasplante. Tambien en contraste con esto, los procedimientos de la presente invencion emplean tlpicamente celulas madre y celulas embrionarias procedentes de la misma especie, mas preferiblemente de humanos.

[0057] En ausencia de celulas nodrizas, factor inhibidor de leucemia (LIF) exogeno o medio condicionado, las

celulas ES o EG se diferencian de forma espontanea en una amplia variedad de tipos celulares, incluidas celulas que se encuentran en alguna de las capas germinales del endodermo, mesodermo y ectodermo. No obstante, con las combinaciones apropiadas de crecimiento y factores de diferenciacion, puede controlarse la diferenciacion celular. Por ejemplo, las celulas ES y EG de raton pueden generar celulas de la estirpe hematopoyetica in vitro 5 (Keller y col., Mol. Cell Biol. 13 (1993), 473-486; Palacios y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995), 7530-7534; Rich, Blood 86 (1995), 463-472). Adicionalmente, se han utilizado celulas ES de raton para generar in vitro cultivos de neuronas (Bain y col., Developmental Biology 168 (1995), 342-357; Fraichard y col., J. Cell Science 108 (1995), 3161-3188), cardiomiocitos (celulas de musculo cardlaco) (Klug y col., Am. J. Physiol. 269 (1995), H1913-H1921), celulas de musculo esqueletico (Rohwedel y col., Dev. Biol. 164 (1994), 87-101), celulas vasculares (Wang y col., 10 Development 114 (1992), 303-316). La patente de EE. UU. 5 773 255 se refiere a llneas celulares beta pancreaticas secretoras de insulina sensibles a la glucosa, la patente de EE. UU. 5 789 246 se refiere a celulas precursoras de hepatocitos. La diferenciacion hepatica de celulas madre embrionarias murinas tambien se describe en Jones y col., Exp. Cell Res. 272 (2002), 15-22.

15 Entre otros progenitores de interes se incluyen, pero sin limitaciones, condrocitos, osteoblastos, celulas del epitelio pigmentario retiniano, fibroblastos, celulas cutaneas como queratinocitos, celulas dendrlticas, celulas del follculo piloso, celulas epiteliales de los conductos renales, celulas de musculo liso y esqueletico, progenitores testiculares y celulas del endotelio vascular. Generalmente se han descrito modelos de diferenciacion de celulas madre embrionarias para cardiogenesis, miogenesis, neurogenesis, diferenciacion de musculo liso epitelial y vascular in 20 vitro en Guan y col., Cytotechnology 30 (1999), 211-226.

[0058] En determinadas realizaciones de la invencion, la diferenciacion esta promovida por la retirada de uno o mas componentes del medio que promueven el crecimiento de celulas indiferenciadas, o actuan como inhibidores de la diferenciacion. Entre los ejemplos de estos componentes se incluyen determinados factores de crecimiento,

25 mitogenos, factor inhibidor de leucocitos (LIF) y factor de crecimiento de fibroblastos basico (bFGF). La diferenciacion puede tambien promoverse mediante la adicion de un componente al medio que promueve la diferenciacion hacia el linaje celular deseado, o inhiba el crecimiento de celulas con caracterlsticas no deseadas.

[0059] Segun la invencion, las poblaciones de celulas diferenciadas carecen de celulas relativamente 30 indiferenciadas y/o de celulas de tipos celulares no deseados mediante el uso de un sistema de seleccion que es

letal para las celulas y tipos celulares no deseados, es decir, expresando un gen marcador seleccionable que hace a las celulas de tipo celular especlfico resistentes al efecto letal de un agente externo, bajo el control de una secuencia reguladora que hace que el gen se exprese de forma preferente en el tipo celular deseado y/ o en un determinado estadio de desarrollo. Para conseguir esto, las celulas se alteran geneticamente antes del proceso utilizado para 35 diferenciar las celulas en el linaje deseado para el tratamiento, de modo que las celulas comprend3n un marcador seleccionable unido de forma operativa a una primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfica para el primer tipo celular deseado. En la figura 1 se muestra un ejemplo de construction.

[0060] Puede utilizarse cualquier tipo de vector de expresion adecuado. Los sistemas de vectores virales 40 adecuados para la produccion de celulas madre alteradas segun esta invencion pueden prepararse usando

componentes vlricos disponibles en el mercado. La introduction de la construccion o construcciones de vectores en las celulas madre se produce de manera conocida, por ejemplo, mediante transfection, electroporation, lipofeccion o con ayuda de vectores virales. Los vectores virales que comprenden genes efectores generalmente se describen en las publicaciones referidas en la ultima section. Alternativamente, pueden introducirse plasmidos vectores en las 45 celulas mediante electroporacion, o usando complejos llpido/ADN. Un ejemplo es la formulation Lipofectamine 2000 (TM), disponible en Gibco/Life Technologies. Otro ejemplo de reactivo es el reactivo de transfeccion FuGENE (tm) 6, una mezcla de llpidos en forma no liposomal y otros compuestos en etanol al 80%, que se obtiene de Roche Diagnostics Corporation. Preferiblemente, se usan las construcciones de vector y los procedimientos de transfeccion descritos en la solicitud internacional WO021051987.

50

[0061] Los genes de resistencia se conocen per se. Son ejemplos de estos los genes de resistencia a antibioticos nucleosidos y aminoglucosidos para, por ejemplo, puromicina (puromicina-N-acetiltransferasa), estreptomicina, neomicina, gentamicina o higromicina. Son ejemplos adicionales de genes de resistencia la dehidrofolato reductasa que confiere resistencia frente a aminopterina y metotrexato, as! como genes de resistencia

55 a multiples farmacos, que confieren resistencia frente a varios antibioticos, por ejemplo, frente a vinblastina, doxorrubicina y actinomicina D.

En una realization especialmente preferida de la presente invencion, dicho marcador seleccionable confiere resistencia a puromicina. La puromicina es especialmente adecuada para la elimination rapida de celulas no

cardlacas en cultivos adherentes de EB transgenicas. Adicionalmente, la seleccion de farmacos de celulas cardlacas puede implementarse por completo en el cultivo en suspension de EB transgenicas. Por tanto, tambien se podrla mostrar que los cardiomiocitos derivados de celulas ES purificados sobreviven mucho mas en cultivo que sus homologos sin tratar. Ademas, se ha demostrado que la elimination de celulas ES indiferenciadas durante el 5 proceso de seleccion con farmacos en si tiene un efecto positivo claro sobre la viabilidad y longevidad de dichas celulas derivadas de celulas ES diferenciadas como cardiomiocitos. Ademas, podrla mostrarse de forma sorprendente que la liberation a partir de celulas no diferenciadas circundantes induce proliferation de cardiomiocitos. Por tanto, la seleccion por farmacos posee ambos efectos purificador y multiplicador.

10 [0062] En una realization preferida de la invention, dicha celula ES de dicho primer tipo celular derivado de

celulas ES comprende un gen indicador, donde dicho indicador esta unido de forma operativa a una secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfico para dicho primer tipo celular. Este tipo de vector tiene las ventajas de proporcionar visualization de diferenciacion, definition de punto temporal para el inicio de la seleccion por farmaco, visualizacion de la seleccion por farmaco y seguimiento del destino de las celulas purificadas implantadas 15 en el tejido receptor. Dichos vectores, que se emplean preferiblemente segun los procedimientos de la presente invencion, se describen en la solicitud internacional WO02/051987. Normalmente, dicha secuencia reguladora especlfica de tipo celular del gen indicador es sustancialmente la misma que dicha primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular del gen marcador. Esto puede conseguirse de forma ventajosa colocando dicho gen marcador y dicho gen indicador en la misma molecula de acido nucleico recombinante, es decir, el vector usado para 20 la transfection de la celula madre, preferiblemente de modo que dicho gen marcador y dicho gen indicador estan contenidos en el mismo cistron. En la figura 1 se muestra un ejemplo de un vector casete de resistencia a farmacos - indicador especlfico cardlaco dicistronico. El indicador puede ser de cualquier tipo siempre que no sea danino para la celula y confiera un fenotipo observable o cuantificable. Segun la presente invencion, pueden usarse la protelna verde fluorescente (GFP) de la medusa Aequorea victoria (descrita en las solicitudes internacionales WO95/07463, 25 WO96/27675 y WO95/121191) y sus derivados "Blue GFP" (Heim y col., Curr. Biol. 6 (1996), 178-182 y "Redshift GFP" (Muldoon y col., Biotechniques 22 (1997), 162-167). Es especialmente preferida la protelna verde fluorescente potenciada (EGFp). Son realizaciones adicionales las protelnas amarilla y ciano fluorescentes potenciadas (EYFP y ECFP, respectivamente) y las protelnas rojas fluorescentes (DsRed, HcRed). Los expertos en la materia conocen otras protelnas fluorescentes que pueden usarse segun la invencion siempre que no danen a las celulas. La 30 detection de protelnas de fluorescencia se produce mediante procedimientos de detection de fluorescencia conocidos per se; vease por ejemplo, Kolossov y col., J. Cell Biol. 143 (1998), 2045-2056. Alternativamente a las protelnas fluorescentes, especialmente en aplicaciones in vivo, tambien pueden usarse especialmente epitopes de esas proteinas. Tambien puede usarse el epitope de proteinas, aunque capaz de danar la celula per se, pero aquellos epitopes que no danan a las celulas; vease tambien la solicitud internacional WO02/051987.

35

[0063] Para la seleccion de celulas ES transfectadas de forma estable las construcciones de vector contienen un gen marcador seleccionable adicional que confiere, por ejemplo, resistencia frente a un antibiotico, por ejemplo, neomicina. Por supuesto, tambien pueden usarse otros genes de resistencia conocidos, por ejemplo, los genes de resistencia descritos anteriormente en asociacion con los genes que codifican proteinas fluorescentes. El gen de

40 seleccion para la seleccion de celulas ES transfectada de forma estable esta bajo en control de un promotor diferente del que regula el control de la expresion de la proteina detectable. A menudo se utilizan promotores constitutivamente activos, por ejemplo, el promotor PGK.

El uso de un segundo gen de seleccion es ventajoso por la capacidad de identificar los clones transfectados de 45 forma completamente exitosa (la eficiencia es relativamente baja). De lo contrario puede producirse una mayoria asfixiante de celulas ES no transfectadas y durante la diferenciacion, por ejemplo, podrian no detectarse celulas positivas para EGFP.

En una realizacion adicional de la invencion las celulas pueden manipularse adicionalmente, de modo que no se 50 formen los tejidos especificos. Esto se produce verbigracia, insertando elementos represores, por ejemplo, un elemento represor inducible por doxiciclina. De este modo, puede excluirse una posible contamination de las celulas diferenciadas deseadas con celulas pluripotentes potencialmente tumorigenicas.

[0064] El primer tipo de celulas deseado pretendido para que se diferencien las celulas madre puede ser de 55 cualquier tipo e incluye, sin limitaciones, celulas neuronales, celulas gliales, cardiomiocitos, celulas beta pancreaticas

secretoras de insulina sensibles a glucosa, hepatocitos, astrocitos, oligodendrocitos, condrocitos, osteoblastos, celulas epiteliales pigmentadas retinianas, fibroblastos, queratinocitos, celulas dendriticas, celulas del foliculo piloso, celulas epiteliales del conducto renal, celulas del endotelio vascular, progenitores del testiculo, celulas de musculo liso y esqueletico; vease tambien supra.

[0065] De acuerdo con la invencion, dicho primer tipo celular son cardiomiocitos. Para esta realizacion, dicha

primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular es preferiblemente especlfica de auricula y/o de ventrlculo. Se describen secuencias reguladoras correspondientes, es decir, promotores especlficos cardlacos, para Nkx-2.5 5 especlfico para cardiomiocitos muy precoces y celulas precursoras mesodermicas, respectivamente (Lints y col., Development 119 (1993), 419-431); a-actina cardlaca humana especlfica de tejido cardlaco (Sartorelli y col., Genes Dev. 4 (1990), 1811-1822) y MLC-2V especlfica para celulas de musculo cardiaco ventricular (O'Brien y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (1993), 5157-5161 y la solicitud internacional WO96/16163). Un promotor de la cadena pesada de la alfa-miosina especlfica cardiaca se describe en Palermo y col., Cell Mol. Biol. Res. 41 (1995), 501-519; 10 Gulick y col., J. Biol. Chem. 266 (1991), 9180-91855; el promotor de la cadena ligera 2v de miosina (MLC2v) tambien en Lee y col., Mol. Cell Biol. 14 (1994), 1220-1229; Franz y col., Circ. Res. 73 (1993), 629-638; vease tambien la expresion de la cadena pesada de la miosina especlfica de auricula AMHC1 y el establecimiento de polaridad anteroposterior en el corazon de pollo en desarrollo en Yutzey y col., Development 120 (1994), 871-883.

15 [0066] Muller y col. describen la seleccion de cardiomiocitos similares a los ventriculares a partir de celulas

ES in vitro usando la proteina verde fluorescente potenciada (EGFP) bajo el control de transcripcion del promotor de la cadena ligera de miosina 2v (MLC-2v) de 2,1 kb especlfica de ventriculo y el elemento potenciador de 0,5 kb del citomegalovirus (CMV(enh)); vease Muller y col., FASEB J. 14 (2000), 2540-2548. En esta publication tambien se describen estudios electrofisiologicos que pueden realizarse de forma similar con el tejido y las estructuras similares 20 a tejido generadas in vitro de la presente invencion.

[0067] Especialmente segun las realizaciones relacionadas con los cardiomiocitos diferenciados in vitro, se prefiere el uso de fibroblastos como dicho al menos un segundo tipo celular embrionario. Como se muestra en los ejemplos, el cocultivo y cotrasplante, respectivamente de cardiomiocitos derivados de celulas ES y fibroblastos

25 embrionarios da lugar a la formation de tejido cardiaco y a una terapia de sustitucion exitosa. Puede que no sea necesario que dichos fibroblastos deriven de embriones sino que tambien pueden generarse de novo a partir de celulas ES segun el procedimiento de la presente invencion. Por tanto, se transfectan celulas ES con una molecula de acido nucleico recombinante que comprende un marcador y, opcionalmente, un gen indicador unidos de forma operativa a una secuencia reguladora especlfica de tipo celular, es decir, un promotor especlfico de fibroblastos 30 como el promotor de colageno a2 (I) que tambien se activa en celulas oseas (Lindahl y col., J. Biol. Chem. 277 (2002), 6153-6161; Zheng y col., Am. J. Pathol. 160 (2002), 1609-1617; Antoniv y col., J. Biol. Chem. 276 (2001), 21754-21764; vease tambien Finer y col., J. Biol. Chem. 262 (1987), 13323-13333; Bou-Gharios y col., J. Cell Biol. 134 (1996), 1333-1344; Zheng y col., Am. J. Pathol. 160 (2002), 1609-1617; Metsaranta y col., J. Biol. Chem. 266 (1991) 16862-16869).

35

No obstante, para otras realizaciones pueden utilizarse fibroblastos asi como y/o alternativamente otras celulas auxiliares como celulas endoteliales, etc., y derivados de las mismas.

En una realizacion adicional preferida, el procedimientos de la presente invencion ademas comprende cultivar dichos 40 al menos dos tipos celulares en presencia de un tercer tipo celular embrionario o derivados de celulas madre (ES) embrionarias, siempre que estas celulas no deriven de un embrion humano. Dicho tercer tipo de celulas puede ser cualquier tipo celular mencionado anteriormente. Preferiblemente, dicho tercer tipo celular son celulas endoteliales. Por tanto, pueden usarse celulas endoteliales embrionarias o celulas endoteliales derivadas de celulas ES. En esta ultima realizacion, dichas celulas endoteliales derivan de celulas ES transfectadas con una construction de vector 45 como se ha descrito en general antes, donde dicha secuencia reguladora especlfica de tipo celular es un promotor especlfico endotelial; vease, por ejemplo, el promotor de cadherina del endotelio vascular descrito por Gory y col., Blood 93 (1999), 184-192; el promotor/potenciador de Tie-2 descrito por Schaeger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 3058-3063 y el promotor/potenciador de Flk-1 descrito por Kappel y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (2000), 1089-1099.

50

[0068] Se conocen otros promotores especificos de tipo celular y tejido; vease, por ejemplo, el fragmento promotor de la cadena de colageno (colageno 2) proalfa (II), especlfico de condrocitos descrito por Zhou y col., J. Cell. Sci. 108 (1995), 3677-3684; el promotor especlfico de alfa-1-tubulina neuronal descrito en Gloster y col., J. Neurosci. 14 (1994); 7319-7330 y el promotor de la proteina acida fibrilar glial (GFAP) descrito en Besnard y col., J.

55 Biol. Chem. 266 (1991), 18877-18883. Ejemplos adicionales de promotores especificos de tejido son aquellos que estan activos en celulas de la glia, celulas hematopoyeticas, celulas neuronales, preferiblemente celulas neuronales embrionarias, celulas endoteliales, celulas de cartllago o celulas epidermicas, as! como en celulas p secretoras de insulina. "Especlfico de tejido" se integra bajo el termino "especlfico de celula",

[0069] Son ejemplos adicionales de promotores no especlfico de corazon: PECAM1, FLK-1 (endotelio), nestina (celulas precursoras neuronales), promotor de tirosina-hidroxilasa-1 (neuronas dopaminergicas), a-actina de musculo liso, miosina de musculo liso (musculos lisos), a1-fetoprotelna (endodermo), promotor mlnimo de la cadena pesada de musculo liso (SMHC) (especifico de musculos lisos, Kallmeier y col., J. Biol. Chem. 270 (1995), 309495 30957).

[0070] El termino promotor especlfico de desarrollo se refiere a promotores que se activan en determinados puntos temporales durante el desarrollo. Ejemplos de dichos promotores son el promotor p-MHC que se expresa durante de desarrollo embrionario en el ventrlculo del raton y es sustituido por el promotor a-MHC en la fase

10 prenatal. NKx2.5, promotor durante el desarrollo temprano del mesodermo cardlaco, factor natriuretico auricular, marcador de corazon embrionario inicial con excepcion del marcapasos que tambien se regula por disminucion en los estadios tardlos del desarrollo, Flk-1, un promotor especlfico de endotelio activo durante la vasculogenesis inicial, el segmento del intron 2 del gen de la nestina que se expresa en celulas precursoras neuronales (neuronas embrionarias y celulas de glia) y celulas de glia adultas (que siguen siendo parcialmente capaces de dividirse) 15 (Lothian y Lendahl, Eur. J. Neurosci. 9 (1997), 452-462U).

[0071] En las realizaciones mencionadas se usan preferiblemente los vectores mencionados en las figuras 1 a 3.

20 [0072] La presente invencion tambien se refiere a cocultivos de celulas segun se define en los

procedimientos descritos a continuation en este documento as! como a tejido que puede obtenerse mediante el procedimiento de la invencion. Las celulas y tejido preparados segun esta invencion pueden usarse para diversos fines de investigation, diagnostico y terapeuticos importantes desde un punto de vista comercial. Debido a que las poblaciones celulares de esta invencion carecen de celulas indiferenciadas, pueden usarse para preparar 25 anticuerpos y bibliotecas de ADNc que son especlficos para el fenotipo diferenciado. Las tecnicas generales utilizadas en la obtencion, purification y modification de anticuerpos y su uso en inmunoensayos y procedimientos de inmunoaislamiento se describen en Handbook of Experimental Immunology (Weir y Blackwell eds.); Current Protocols in Immunology (Coligan y col., eds) y Methods of Immunological Analysis (Masseyeff y col., eds, Weinheim: VCH Verlags GmbH). Las tecnicas generales implicadas en la preparation de bibliotecas de ARNm y 30 ADNc se describen en RNA Methodologies A Laboratory Guide for Isolation and Characterization (R. E. Farrell, Academic Press, 1998); cDNA Library Protocols (Cowell & Austin, eds., Humana Press) y Functional Genomics (Hunt & Livesey, eds., 2000).

[0073] Un objeto principal de la presente invencion es, no obstante, la provision de celulas y tejido cardlaco

35 para su uso en trasplante. Por ejemplo, las 23 celulas diferenciadas de esta invencion pueden usarse para la reconstitution o regeneration tisular en un paciente humano: desarrollo ectodermico embrionario (eed) del mismo. Las celulas se administran de forma que se permite que se implanten en el sitio del tejido deseado y reconstituyan o regeneren la zona funcionalmente deficiente. Por tanto, la presente invencion se refiere en particular a un procedimiento para mejorar la reparation del tejido cardlaco y/o la funcion del organo en un mamlfero que 40 comprende las etapas de:

(a) introducir un inoculo celular que comprende un cocultivo de celulas madre preferiblemente transgenicas en el que se ha iniciado la diferenciacion o el tejido correspondiente al menos en una portion del area previamente danada del tejido, y

45

(b) permitir que dicho inoculo celular introducido se implante in situ como celulas o tejido viables situados dentro del area previamente danada del tejido, donde el implante tiene como resultado una mejora del tejido y/o la funcion del organo en dicho mamlfero, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

50 [0074] Se utilizan ejemplos seleccionados para ilustrar el potencial de las celulas madre, tanto en el sentido

de su capacidad para diferenciarse en tipos celulares especlficos como en el sentido de su poder para tratar diversas enfermedades y afecciones como la enfermedad de Parkinson, lesiones de la medula espinal, diabetes y enfermedad cardlaca que se han revisado en Pfendler y Kawase en Obstet. Gynecol. Surv. 58 (2003), 197-208. Todas esas afecciones pueden tratarse utilizando las celulas y tejido descritos anteriormente.

55

[0075] En un aspecto en particular, la presente invencion se refiere a un procedimiento para mejorar

notablemente la funcion cardlaca y reparar el tejido cardlaco en un sujeto mamlfero vivo tras un caso de infarto de miocardio o dano tisular. El procedimiento es una tecnica quirurgica con la que se introducen e implantan celulas madre embrionarias, es decir, cardiomiocitos derivados de celulas madre embrionarias de mamlfero junto con

celulas embrionarias auxiliares como fibroblastos embrionarios en la zona infartada o danada del miocardio. Tras la implantacion, las celulas forman implantes estables y sobreviven indefinidamente dentro de la zona infartada o danada del corazon de huesped vivo. Entre los efectos beneficios demostrados del procedimiento se incluyen una disminucion de la zona infartada y la mejora de la funcion cardlaca; vease la figura 6.

5

[0076] Por tanto, la presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para mejorar la funcion

cardlaca en un mamlfero tras un infarto de miocardio, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

(a) cultivar celulas madre embrionarias (ES) de mamlferos indiferenciadas que comprenden un gen de resistencia y 10 un gen indicador bajo el control del mismo promotor especlfico cardlaco in vitro en un medio de cultivo que contiene

el agente selectivo para el gen de resistencia en condiciones que permiten la diferenciacion de dichas celulas ES en cardiomiocitos;

(b) aislar dichos cardiomiocitos diferenciados y/o eliminar las celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con 15 celulas que se diferencian en tipos celulas irrelevantes a partir de dichos cardiomiocitos en el transcurso de la

diferenciacion;

(c) cotrasplantar posteriormente dichos cardiomiocitos con fibroblastos embrionarios o derivados de celulas ES y/o celulas endoteliales en al menos una porcion de la zona previamente infartada del tejido cardlaco; y

20

(d) permitir que dicho inoculo celular introducido se implante in situ como celulas viables situadas dentro del area previamente infartada del tejido cardlaco, donde el implante tiene como resultado una mejora de la funcion cardlaca en dicho mamlfero, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

25 [0077] De forma similar a las realizaciones descritas anteriormente en este documento, dicho gen de

resistencia y dicho gen indicador estan contenidos en un vector bicistronico y estan preferiblemente separados por un IRES. Es especialmente preferido el uso de una construccion, en la que dicho gen de resistencia confiere resistencia a puromicina, dicho marcador es EGFP y dicho promotor es el promotor aMHC cardlaco; vease la figura 3. La implantacion de celulas madre embrionarias en las que se ha iniciado la diferenciacion y la determinacion de la 30 funcion cardlaca puede realizarse como se describe en los ejemplos y referencias citadas o, por ejemplo, como se describe en la patente de EE. UU. 6 534 052.

[0078] En la patente de EE. UU. 5 733 727 se describen implantes miocardicos de mioblastos esqueleticos o cardiomiocitos, y composiciones y procedimientos celulares utiles para obtener los implantes. Esos implantes

35 miocardicos se describen como estables y utiles, por ejemplo, para la administration de protelnas recombinantes directamente al corazon. Aunque en esta patente de Ee. UU. solo se describe la estrategia comun de generar cardiomiocitos a partir de celulas ES y su uso en trasplante y como vehlculo para la administracion de protelnas recombinantes al corazon, sus conclusiones pueden aplicarse al tejido y a estructuras similares a tejido obtenidas segun la presente invencion. Por tanto, en especial la estructura similar a tejido cardlaco generado in vitro de la 40 presente invencion puede usarse para la administracion de protelnas terapeuticas, como factores angiogenicos (como por ejemplo, el factor de crecimiento de fibroblastos basico y acido, factor de crecimiento transformante p, factor de crecimiento endotelial vascular y factor de crecimiento de hepatocitos), para inducir la neovascularizacion. De forma similar los implantes que expresan agentes neurotroficos proximos a la region infartada pueden usarse para mejorar la arritmogenesis asociada con la zona fronteriza. Estas y otras muchas sustancias candidatas para la 45 administracion dirigida al corazon seran aparentes para los expertos en la materia.

[0079] Como se menciono anteriormente, segun la presente invencion cualquiera de los dichos al menos dos tipos celular es como el tipo celular principal y las celulas auxiliares correspondientes pueden derivar de celulas ES. Por tanto, en un aspecto adicional la presente invencion se refiere a un procedimiento de formation y/u obtencion de

50 tejido cardlaco o estructuras similares a tejido que comprende las siguientes etapas:

(a) transfectar una o mas celulas ES con moleculas de acido nucleico recombinantes que comprenden una primera y una segunda secuencia reguladoras especlficas de tipo celular unidas de forma operativa a al menos un marcador seleccionable, en el que dicho segundo tipo celular es diferente de dicho primer tipo celular;

55

(b) cultivar las celulas en condiciones que permitan la diferenciacion de las celulas; y

(c) aislar celulas de al menos dos tipos celulares diferenciados y/o eliminar las celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes a partir de los tipos celulares de

interes que activen el marcador seleccionable en el transcurso de la diferenciacion siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

[0080] De forma similar a los procedimientos previos, es deseable la generacion de mas de dos tipos 5 celulares. Por tanto, el procedimiento preferiblemente comprende transfectar dichas una o mas celulas con

moleculas de acido nucleico recombinantes que comprenden al menos una secuencia reguladora especlfica de tipo celular adicional unido de forma operativa a al menos un marcador seleccionable, donde dicho al menos un tipo celular adicional es diferente de dichos primer y segundo tipos celulares. Para su uso en el procedimiento, dichas moleculas de acido nucleico recombinantes estan incluidas en el mismo vector o en vectores diferentes. El principio 10 detras de estas opciones se muestra en las figuras 2 y 3 y se explica en los ejemplos.

[0081] El tipo celular puede seleccionarse a partir del grupo compuesto por celulas neuronales, celulas gliales, cardiomiocitos, celulas beta pancreaticas secretoras de insulina sensibles a glucosa, hepatocitos, astrocitos, oligodendrocitos, condrocitos, osteoblastos, celulas epiteliales pigmentadas retinianas, fibroblastos, queratinocitos,

15 celulas dendrlticas, celulas del follculo piloso, celulas epiteliales del conducto renal, celulas del endotelio vascular, progenitores de testlculo, celulas de musculo liso y esqueletico; vease tambien supra.

[0082] Los promotores que se utilizar preferiblemente si se desea la preparacion de tejido cardlaco mediante diferenciacion de las celulas madre transfectadas en cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas

20 endoteliales comprenden los descritos anteriormente en este documento. De forma similar, para producir tejido neuronal pueden usarse una o mas celulas madre, por ejemplo, celulas madre neuronales multipotentes que se modifican geneticamente segun la presente invencion para diferenciarse en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Se aplica la misma justificacion para la generacion de, por ejemplo, tejido hepatico o pancreatico. Las secuencias reguladoras de los promotores especlficos de tipo celular correspondientes pueden obtenerse a partir de la literatura; 25 vease, por ejemplo, "medline" y NCBI.

[0083] Se entendera que cuando se realiza el procedimiento de la invencion, dichas una o mas moleculas de acido nucleico recombinantes pueden transfectarse de forma concomitante o posterior en dichas una o mas celulas.

30 [0084] Como se explica en los ejemplos y se muestra en las figuras 2 y 3, el procedimiento de la invencion

puede realizarse de formas diferentes. En primer lugar, como se describe preferentemente en este documento, se transfecta de forma estable un clon multiple de celulas ES transgenicas con un determinado numero de vectores con un casete de seleccion por farmaco dirigidos por promotores especlficos segun los tipos celulares que constituyen el tipo tisular deseado. Por tanto, se transfecta y selecciona al menos una de dichas celulas ES o clon celular del 35 mismo, donde dicha celula o clon celular contiene moleculas de acido nucleico recombinantes con al menos dos secuencias reguladoras especlfica de tipo celular diferentes. En esta variante todos los tipos celulares emergentes se originan a partir de un clon antecesor comun de celulas ES y la proporcion resultante entre los diferentes componentes celulares depende de la velocidad de diferenciacion relativa de cada uno de ellos. Alternativamente, se transfectan y seleccionan al menos dos celulas ES o clones de las mismas diferentes, donde dichas al menos dos 40 celulas o clones celulares diferentes contienen moleculas de acido nucleico recombinantes con secuencias reguladoras especlficas de tipo celular diferentes. Mediante esta tecnica se generan varios clones de celulas ES transgenicos, donde cada clon individual posee solo un vector con un casete de resistencia a farmacos dirigido por uno de los promotores especlficos de tipo celular.

45 Para la modulation del tejido los clones relevantes se deben mezclar en la fase inicial de diferenciacion ("gotas colgantes" o "cultivo en masa") para forma agregados de celulas ES (EB) donde, tras la seleccion por farmacos, surgiendo tipos celulares que tienen su origen en los correspondientes diferentes clones celulares de ES y la relation inicial de los componentes celulares tambien depende y puede controlarse mediante la proporcion final entre diferentes llneas celulas de ES. Este procedimiento preferiblemente da lugar a agregados celulares que son 50 cuerpos embrioides (EB) quimericos.

[0085] Independientemente de la realization en particular del procedimiento de la invencion, se prefiere que los al menos dos de dichos marcadores seleccionables esten unidos de forma operativa a dichas secuencias reguladores especlficas de tipo celular diferentes sean identicas. Como se menciono anteriormente, estos

55 marcadores o genes marcadores son, preferiblemente, marcadores seleccionables que confieran resistencia a un agente citototoxico, preferiblemente puromicina, metotrexato o neomicina.

[0086] Como ya se ha descrito con respecto al procedimiento del primer aspecto de la presente invencion, dichas una o mas de dichas moleculas de acido nucleico recombinantes preferiblemente comprende ademas un

indicador unidos de forma operativa a dicha secuencia especlfica de tipo celular; vease supra. Tambien en este documento se prefieren las versiones de diferentes colores de la protelna verde fluorescente potenciada (EGFP), en especial EYFP (amarilla), ECFP (azul) y/o hcRFP (roja), unida de forma operativa a diferentes secuencias especlficas de tipo celular. Del mismo modo se prefiere que dicho marcador seleccionable y dicho indicador se 5 expresa a partir de un vector bicistronico, preferiblemente en el que dicho marcador seleccionable y dicho indicador estan separados por uno o mas sitios internos de entrada al ribosoma (IRES), que estan unidos de forma operativa a al menos uno de dichos genes.

[0087] Como se menciono anteriormente, el procedimiento de la presente invencion se realiza 10 preferiblemente de modo que se permite el autoensamblaje de los diferentes tipos celulares, por ejemplo dentro del

tejido o estructuras similares a tejido deseados. Las celulas madres estan en una realizacion preferida de la invencion disponibles en forma de agregados que se conocen como cuerpos embrioides. En la solicitud internacional WO02/051987 se describe un protocolo para obtener cuerpos embrioides. La produccion tiene lugar preferiblemente con un procedimiento de "gota colgante" o mediante cultivo en metilcelulosa (Wobus y col., Differentiation 48 (1991), 15 172-182).

Alternativamente a esto, pueden utilizarse matraces giratorios (cultivos en agitacion) como metodo de cultivo. Por tanto, las celulas ES indiferenciadas se introducen en cultivos en agitacion y se mezclan de forma permanente segun un procedimiento establecido. Por ejemplo, se introducen 10 millones de celulas ES en 150 ml de medio con 20 FCS al 20% y se agita de forma constante a una velocidad de 20 rpm, donde la direccion del movimiento de agitacion se cambia de forma regular. Veinticuatro horas despues de introducir las celulas ES se anaden 10 ml de medio mas con suero y, a continuacion, se cambian cada dla de 100 a 150 ml del medio (Wartenberg y col., FASEB J. 15 (2001), 995-1005). En estas condiciones de cultivo pueden obtenerse grandes cantidades de celulas derivadas de celulas ES, es decir, cardiomiocitos, celulas endoteliales, neuronas, etc., dependiendo de la composition del 25 medio. Las celulas se seleccionan por medio del gen de resistencia siguiendo con el cultivo en agitacion o tras la disposition en placas, respectivamente.

[0088] Alternativamente a esto, los EB diferenciados en la gota pendiente pueden no disponerse en placas, sino mantenerse simplemente en suspension. Incluso en estas condiciones podrla observarse experimentalmente

30 una progresion de la diferenciacion. La elimination mediante lavado de los tipos celulares no deseados puede realizar solo con mezcla mecanica y adicion de baja concentration de enzima (p. ej., colagenasa, tripsina); se consigue una suspension celulas sencilla con eliminacion mediante lavado facil de los tipos de celulas no deseados.

[0089] En una realizacion, el destino de los tipos celulares y la formation de agregados celulares y tejido as! 35 como el estado fisiologico y/o el desarrollo de las celulas o agregados celulares se analizan, por ejemplo, mediante

medidas de tension isometrica, ecocardiografla y similares. Preferiblemente, el estado de las celulas o agregados celulares se analiza mediante el seguimiento de la diferenciacion de la actividad electrica de las celulas en una matriz, por ejemplo, registrando los potenciales de campo extracelulares con una matriz de microelectrodos (MEA). Por ejemplo, las propiedades electrofisiologicas durante el proceso de diferenciacion en curso de celulas madre 40 embrionarias que se diferencian en miocitos cardlacos pueden seguirse mediante los registros de potenciales de campo extracelulares con matrices de microelectrodos (MEA) que constan de, por ejemplo, 60 electrodos integrados en el sustrato; vease Banach y col. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 284 (2003), H2114-H2123. Se usaron matrices multiples de microelectrodos de tungsteno para registrar las respuestas concurrentes de neuronas madre cerebrales que contribuyen a la generation de patrones motores respiratorios; vease Morris y col., Respir. Physiol. 45 121 (2000), 119-133.

[0090] La presente invencion tambien se refiere a celulas, agregados celulares y tejido que se obtienen mediante los procedimientos descritos anteriormente, en los que dichas celulas son capaces de diferenciares en al menos dos tipos celulares. Por tanto, dichas celulas son preferiblemente celulas especlficas de tejido y tipo celular

50 embrionarios, mas preferiblemente tejido cardlaco. As! mismo, los organos, agregados celulares y tejido constituidos a partir de dichas celulas son sujeto de la presente invencion as! los implantes o trasplantes que contiene dichas celulas, agregados celulares, tejido u organos. Todos ellos pueden usarse en un procedimiento de tratamiento de tejido u organos danados en un sujeto, lo que comprende su implantation o trasplante en el sujeto que lo necesite. Por tanto, las composiciones como composiciones farmaceuticas que comprenden cualquier de estas moleculas de 55 acido nucleico recombinante, celulas, agregados celular o tejido de la presente invencion como se describe en este documento estan incluidos en el alcance la presente invencion. Como se describio anteriormente, estas composiciones y procedimientos de la invencion pueden usarse para diversos objetivos, por ejemplo, para analizar las etapas iniciales de la formacion tisular durante el desarrollo embrionario o la influencia de factores y compuestos sobre este proceso.

[0091] Aun en una realizacion adicional, la presente invencion se refiere a animales transgenicos no humanos que pueden generarse a partir de las celulas ES mencionadas y de los tipos celulares y agregados celulares derivados de celulas ES; vease supra. La generation de animales transgenicos a partir de celulas ES es

5 conocida en la tecnica; vease por ejemplo, A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Press. En la materia se describe un procedimiento general para obtener animales transgenicos no humanos, vease por ejemplo, la solicitud internacional WO94/24274.

[0092] En un aspecto especialmente preferido, la presente invencion se refiere a un procedimiento para 10 mejorar la funcion cardlaca en un mamlfero tras un infarto de miocardio, comprendiendo dicho procedimiento las

etapas de:

(a) transfectar celulas madre embrionarias (ES) de mamlfero con una molecula de acido nucleico recombinante que comprende un gen de resistencia bajo el control de secuencias reguladores especlficos cardlacas, de fibroblastos y,

15 opcionalmente, de endotelio y que, opcionalmente, comprende uno o mas indicadores en las mismas secuencias reguladoras;

(b) cultivar dichas celulas ES in vitro en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo para el gen de resistencia en condiciones que permiten la diferenciacion de dichas celulas ES en cardiomiocitos, fibroblastos y,

20 opcionalmente, celulas endoteliales;

(c) eliminar a partir de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales diferenciadas celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas diferenciadas hacia tipos celulares irrelevantes; opcionalmente

25 (d) permitir la integration y el alineamiento de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales en diferenciacion en el tejido similar a cardlaco;

(e) cotrasplantar posteriormente dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales o dicho tejido en al menos una portion de la zona previamente infartada del tejido cardlaco; y

30

(f) permitir que dichas celulas o tejido introducidos se implanten in situ como celulas viables situadas dentro del area previamente infartada del tejido cardlaco, en el que el implante tiene como resultado una mejora de la funcion cardlaca en dicho mamlfero siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

35 Como se menciono anteriormente, dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales derivan preferiblemente de la misma celula ES. No obstante, tambien pueden usarse cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales derivadas de diferentes celulas ES. En esas realizaciones, dicha secuencia reguladora especlfica cardlaca se selecciona preferiblemente entre los promotores aMHC, MLC2v, MLC1a, MLC2a y pMHC, dicha secuencia reguladora especlfica de endotelio se selecciona preferiblemente entre los promotores de 40 Tie2, Tie1 y cadherina, y dicha secuencia reguladora especlfica de fibroblastos se selecciona preferiblemente entre los promotores del colageno I; vease supra. De forma similar, dicho indicador para dichos cardiomiocitos, fibroblastos y, opcionalmente, celulas endoteliales se seleccionan preferiblemente de forma independiente a partir de las protelnas verdes fluorescentes potenciadas ECFP (azul), EYFP (amarilla), y hcRFP (roja); vease tambien la figura 3 y los ejemplos. Dicho gen de resistencia y dicho indicador estan, preferiblemente, separados por un sitio 45 interno de entrada al ribosoma (IRES).

[0093] En otros ejemplos, se generan celulas neuroepiteliales que se usan para aumentar o sustituir celulas danadas por enfermedad, trastornos autoinmunes, dano accidental o trastorno genetico. Puede inducirse a celulas ES de raton a diferenciarse in vitro con acido retinoico para formar precursores neuronales y gliales, positivos para

50 marcadores de astrocitos (GFAP) u oligodendrocitos (04) y, despues, estos ultimos en neuronas funcionales (Fraichard y col., J. Cell Science 108 (1995), 3161-3188). Se observo que las celulas trasplantadas en cerebros adultos inervaban el nucleo estriado del huesped (Deacon y col., Exp. Neurology, 149 (1998), 28-41). Las llneas celulares EC humanas y de raton tambien pueden diferenciarse en neuronas. (Trojanowski y col., Exp. Neurology, 144 (1997), 92-97; Wojcik y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 (1993), 1305-1309). El trasplante de estas neuronas 55 en ratas sometidas a isquemia cerebral promovla un grado de recuperation funcional (Borlongan y col., Exp. Neurology 149 (1998), 310-321). Segun la presente invencion, para esta realizacion se usan los correspondientes promotores especlficos de neuronas y glia; vease, por ejemplo, Kawai y col., Biochim. Biophys. Acta 1625 (2003), 246-252 y Kugler y col., Gene Ther. 10 (2003), 337-347, para los promotores especlficos de glia y neuronales. La eficacia de la formation de cuerpos embrioides y el desarrollo hematopoyetico a partir de celulas madre

embrionarias en diferentes sistemas de cultivo se describen, por ejemplo, en Dang y col., Biotechnol. Bioeng. 78 (2002), 442-453. En otro uso de la invention, las celulas ES o sus derivados en diferenciacion o diferenciados pueden usarse para la generation de estructuras no celulares como sustituciones de hueso o cartllago. En otro uso de la invencion, las celulas ES o sus derivados en diferenciacion o diferenciados pueden usarse para la generacion 5 de tejido hepatico. Las secuencias reguladoras para la expresion especlfica de tipo celular pueden obtenerse a partir de la literatura y fuentes comunes como "medline" y NCBl. Si se desea, estas celulas pueden estar geneticamente modificadas a fines de terapia genica.

[0094] En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un vector o una composition de vectores 10 que comprenden las moleculas de acido nucleico recombinantes segun se define en el contexto de los

procedimientos de la presente invencion anteriormente en este documento. En particular, la presente invencion se refiere a vectores y composiciones de vectores que comprenden en suma al menos dos unidades de un gen de resistencia bajo el control de una secuencia reguladora especlfica cardlaca, de fibroblastos y, opcionalmente, endotelio, y que, opcionalmente comprenden uno o mas indicadores bajo las mismas secuencias reguladoras 15 especlficas como se describe anteriormente; vease tambien la figura 3A. Estos vectores o composiciones de vector pueden estar sustancialmente aislados o pueden estar presentes en una muestra o, por ejemplo, en una o mas celulas huesped utiles para, por ejemplo, la propagation de los vectores.

[0095] En una realization especialmente preferida, la presente invencion se refiere a matrices que 20 comprenden un soporte solido y unido a este o suspendido en el celulas, agregados celulares o tejido obtenidos por

el procedimiento de la presente invencion o en el proceso de diferenciacion. Es de especial interes el uso de matrices planas de microelectrodos para el cultivo de celulas y agregados celulares como biosensores. Estas matrices generalmente constan de un sustrato de vidrio, plastico o silicona sobre el que se deposita un conductor, por ejemplo, oro, platino, oxido de indio y estano, iridio, etc. Se deposita una capa aislante, por ejemplo, poliimida, 25 dioxido de silicio, nitruro de silicio, etc., fotorresistente, sobre los electrodos conductores y se conectan entre si, y, a continuation, se eliminan las regiones entre los electrodos para definir los puntos de registro. Las celulas se cultivan directamente sobre esta superficie y se pone en contacto el conducto expuesto en los puntos de registro no aislados. Dependiendo del tamano de los electrodos y de las celulas, los registros de la actividad electrica pueden proceder de una unica celula o de poblaciones de celulas que incluyan agregados celulares. Cada punto de electrodo 30 generalmente esta conectado a la entrada de una alta impedancia de entrada, un amplificador de bajo ruido, con o sin condensadores de acoplamiento de CA, que permiten la amplification de las senales extracelulares relativamente pequenas. Ejemplos de dichos biosensores se describen en Novak y col., IEEE Transactions on Biomedical Engineering BME-33(2) (1986), 196-202; Drodge y col., J. Neuroscience Methods 6 (1986), 1583-1592; Eggers y col., Vac. Sci. Technol. b8(6) (1990), 1392-1398; Martinoia y col., J. Neuroscience Methods 48 (1993), 11535 121; Maeda y col., J. Neuroscience 15 (1995), 6834-6845 y Mohr y col., Sensors and Actuators B-Chemical 34 (1996), 265-269. Tambien es materia de la presente invencion un aparato preparado y adaptado para el analisis de las matrices descritas anteriormente.

[0096] Las celulas, agregados celulares, tejido, organo y procedimientos de la presente invencion son 40 especialmente adecuados para su uso en la selection de farmacos y en aplicaciones terapeuticas. Por ejemplo, las

celulas madre diferenciadas de este invencion pueden usarse para la seleccion de factores (como solventes, moleculas pequenas, farmacos, peptidos, polinucleotidos y similares) o condiciones ambientales (como condiciones de cultivo o manipulation) que afectan a las caracterlsticas de las celulas en diferenciacion. Las aplicaciones de seleccion en particular de esta invencion se refieren a la prueba de compuestos farmaceuticos en la investigation de 45 farmacos. Estas se refieren generalmente al libro de texto convencional "In vitro Methods in Pharmaceutical Research", Academic Press, 1997 y la patente de EE. UU. 5 030 015. La evaluation de la actividad de los compuestos farmaceuticos candidatos generalmente implica la combination de celulas diferenciadas de esta invencion con el compuesto candidato, determinando cualquier cambio en la morfologla, fenotipo marcador o actividad metabolica de las celulas que es atribuible al compuesto (en comparacion con celulas no tratadas o celulas 50 tratadas con un compuesto inerte) y, a continuacion, correlaccionar el efecto del compuesto con el cambio observado. La seleccion puede realizarse, por ejemplo, porque el compuesto se disena para tener un efecto farmacologico sobre determinados tipos celulares o porque un compuesto disenado para tener efectos en otra parte puede tener efectos adversos no deseados. Pueden probarse dos o mas farmacos en combinacion (mediante su combinacion con las celulas de forma simultanea o secuencial) para detectar posibles efectos de interaction 55 farmacologica. En algunas aplicaciones, los compuestos se seleccionan inicialmente segun su posible toxicidad (Castell y col., pag. 375-410 en "In vitro Methods in Pharmaceutical Research," Academic Press, 1997). La citotoxicidad puede determinarse en el primer caso mediante el efecto sobre la viabilidad celular, supervivencia, morfologla y expresion o liberation de determinados marcadores, receptores o enzimas. Los efectos de un farmaco sobre el aDn cromosomico pueden determinarse midiendo la slntesis o reparation del ADN. La incorporation de

[Hjtimidina o BrdU, especialmente en momentos no programados en el ciclo celular, o por encima del nivel requerido para la replicacion celular, coincide con un efecto del farmaco. Los efectos no deseados tambien pueden incluir tasas inusuales de intercambio de cromatidas hermanas, determinado mediante una extension en metafase. Consulte A. Vickers (pag. 374-410 en "In vitro Methods in Pharmaceutical Research, "Academic Press, 1997) para 5 su elaboration adicional.

[0097] Por tanto, en una realization adicional la presente invention se refiere a procedimientos para obtener y/o realizar el perfil de una sustancia de ensayo capaz de influir sobre el desarrollo celular y/o sobre la formation de la estructura tisular cardlaca que comprende las etapas de:

10

(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende una celula, un agregado celular, un tejido o un organo preparado o diferenciado segun la presente invencion con una sustancia de ensayo; y

(b) determinar una respuesta fenotlpica en dicha muestra de ensayo en comparacion con una muestra control, en la 15 que un cambio en la respuesta fenotlpica de dicha muestra de ensayo en comparacion con la muestra control es una

indication de que dicha sustancia de ensayo tiene un efecto sobre el desarrollo celular y/o la formacion de la estructura tisular.

[0098] Estos procedimientos pueden sustituir a diversos modelos animales y formar nuevas pruebas basadas 20 en humanos y biosensores ambientales extremos. En especial, los procedimientos de la invencion pueden usarse

para pruebas toxicologicas, mutagenicas y/o teratogenicas in vitro. Puesto que las celulas y tejido obtenidos segun la presente invencion recuerda mas de cerca a la situation in vivo, se preve que los resultados obtenidos mediante los ensayos toxicologicos de la presente invencion se correlacionen tambien con la teratogenicidad in vivo de los compuestos probados.

25

[0099] Por ejemplo, los compuestos, en particular compuestos activos cardlacos pueden probarse segun los procedimientos descritos en el documento DE 195 25 285 A1; Seiler y col., ALTEX 19 Supl. 1 (2002), 5563; Takahashi y col., Circulation 107 (2003), 1912-1916 y Schmidt y col., Int. J. Dev. Biol. 45 (2001), 421-429; en este ultimo se describe una prueba para celulas ES (EST) utilizada en un estudio de valoracion de la Union Europea

30 para la selection de agentes embriotoxicos determinando la diferenciacion dependiente de concentration de celulas ES en celulas cardlacas y miogenicas.

[0100] Las celulas y tejido del sistema nervioso central (SNC) generados por los procedimientos de la presente invencion o durante la diferenciacion en dichos procedimientos pueden probarse, por ejemplo, en cultivos

35 celulares como se describe en la patente de EE. UU. 6 498 018. De forma similar, pueden probarse celulas y tejido relacionados con el hlgado; vease, por ejemplo, la solicitud de EE. UU. US2003/0003573. Un procedimiento de ensayo in vitro adicional para la detection de efectos inducidos qulmicamente sobre el desarrollo embrionario y la diferenciacion para el objetivo de seleccion de embriotoxicidad/teratogenicidad basado en celulas madre embrionarias (ES) pluripotentes diferenciadas de ratones y ratas usando celulas germinales embrionarias (EG) 40 obtenidas a partir de celulas germinales primordiales se describe en la solicitud internacional WO97/01644 y puede adaptarse segun las indicaciones de la presente invencion.

[0101] Las formulaciones para la comprobacion de compuestos preferidos no incluyen componentes adicionales como conservantes, que tengan un efecto significativo sobre la formulation global. Por tanto, las

45 formulaciones preferidas constan esencialmente de un compuesto activo biologico y un vehlculo fisiologicamente aceptable, por ejemplo, agua, etanol, DMSO, etc. No obstante, si un compuesto es llquido sin un excipiente, la formulacion puede constar esencialmente del compuesto en si. Adicionalmente, pueden realizarse una diversidad de ensayos en paralelo con diferentes concentraciones del compuesto para obtener una respuesta diferencial a las diversas concentraciones. Como se conoce en la tecnica, la determination de la concentracion eficaz de un 50 compuesto tlpicamente usa un intervalo de concentraciones resultantes de diluciones 1:10, o a otra escala logarltmica. Las concentraciones pueden, si es necesario, refinarse ademas con una segunda serie de diluciones. Tlpicamente, una de estas concentraciones sirve como control negativo, es decir, a concentracion cero o por debajo del nivel de deteccion.

55 [0102] Los compuestos de interes abarcan numerosas clases qulmicas, aunque tlpicamente son moleculas

organicas. Los agentes candidatos comprenden grupos funcionales necesarios para la interaction estructural con protelna, especialmente enlaces de hidrogeno, y tlpicamente incluyen al menos un grupo amina, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferiblemente al menos dos de los grupos qulmicos funcionales. Los agentes candidatos a menudo comprenden estructuras de carbono clclicas o heteroclclicas y/o estructuras aromaticas o poliaromaticas sustituidas

con uno o mas de los grupos funcionales anteriores. Entre los agentes candidatos tambien se encuentran biomoleculas incluidos peptidos, acidos nucleicos, sacaridos, acidos grasos, esteroides, purinas, pirimidinas, derivados, analogos estructurales o combinaciones de los mismos.

5 [0103] Se obtienen compuestos y agentes candidatos a partir de una amplia variedad de fuentes incluidas

bibliotecas de compuestos sinteticos o naturales. Por ejemplo, hay disponibles numerosos medios para la slntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos organicos y biomoleculas, incluida la expresion de oligonucleotidos y oligopeptidos aleatorizados. Alternativamente, hay disponibles o se obtienen bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos de bacterias, fungicos, vegetales y animales. Por ejemplo, la inhibi cion 10 de la angiogenesis inducida por tumor y la expresion de la metaloprotelnasa de matriz en cultivos de confrontation de cuerpos embrioides y esferoides tumorales mediante principios vegetales utilizados en medicina china tradicional se ha descrito en Wartenberg y col., Lab. Invest. 83 (2003), 87-98.

[0104] Adicionalmente, las bibliotecas y los compuestos naturales u obtenidos mediante slntesis se modifican 15 facilmente por medios qulmicos, flsicos o bioqulmicos convencionales y pueden usarse para producir bibliotecas

combinatorias. Los agentes farmacologicos conocidos pueden someterse a modificaciones qulmicas directas o aleatorias, como acilacion, alquilacion, esterification, amidacion, etc., para producir analogos estructurales.

[0105] Los compuestos tambien pueden estar incluidos en una muestra que incluya llquidos a los que se han 20 anadido componentes adicionales, por ejemplo, componentes que afectan a la fuerza ionica, pH, concentration de

protelna total, etc. Ademas, las muestras pueden tratarse para conseguir al menos un fraccionamiento o concentracion parcial. Las muestras biologicas pueden almacenarse si se hace con precaution para reducir la degradation del compuesto, por ejemplo, en atmosfera de nitrogeno, congeladas o con una combination de ambos. El volumen de la muestra utilizado es suficiente para permitir una detection mensurable, normalmente es suficiente 25 de aproximadamente 0,1 pl a 1 ml de una muestra biologica.

[0106] Entre los compuestos de ensayo se incluyen todas las clases de moleculas descritas anteriormente, y pueden comprender ademas muestras de contenido desconocido. Aunque muchas muestras contendran compuestos en solution, tambien pueden ensayarse muestras solidas que pueden disolverse en un solvente

30 adecuado. Entre las muestras de interes se incluyen muestras ambientales, por ejemplo, aguas subterraneas, aguas marinas, residuos de minerla, etc.; muestras biologicas, por ejemplo, lisados preparados a partir de cultivos, muestras de tejidos, etc.; muestras de production, por ejemplo, curso temporal durante la preparation de compuestos farmaceuticos; as! como bibliotecas de compuestos preparados para analisis y similares. Se ha evaluado el posible valor terapeutico de muestras de compuestos de interes, es decir, de candidatos a farmacos.

35

[0107] El compuesto de ensayo puede opcionalmente ser una biblioteca combinatoria para la selection de muchos compuestos. Dicha coleccion de sustancias de ensayo puede tener una diversidad de aproximadamente 103 a aproximadamente 105 y se reduce normalmente con exito aplicando el procedimiento, opcionalmente combinado con otros dos o mas veces. Los compuestos identificados en el procedimiento de la invencion pueden

40 ser adicionalmente evaluados, detectados, clonados, secuenciados y similares, en solucion o tras su union a un soporte solido, mediante cualquier procedimiento normalmente aplicado a la deteccion de una secuencia de ADN especlfica como PCR, restriction de oligomero (Saiki y col., Bio/Technology 3 (1985), 1008-1012), analisis de sondas oligonucleotldicas especlficas de alelo (ASO) (Conner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 278), ensayos de ligamiento de oligonucleotidos (OLA) (Landegren y col., Science 241 (1988), 1077) y similares. Se han 45 revisado las tecnicas moleculares para el analisis de ADN (Landegren y col., Science 242 (1988), 229-237). Por tanto, el procedimiento de la presente invention puede tambien utilizarse para obtener el perfil transcripcional de celulas madre embrionarias y adultas; vease, por ejemplo, Ramalho-Santos y col., Science 298 (2002), 597-600; Tanaka y col., Genome Res. 12 (2002), 1921-1928.

50 [0108] La incubation incluye condiciones que permiten el contacto entre el compuesto de ensayo y las

celulas ES o celulas derivadas de ES. El contacto puede realizarse tanto en condiciones in vitro como in vivo. Por ejemplo, puede ser deseable probar una matriz de compuestos o pequenas moleculas sobre una unica o algunas celulas ES en un "chip" u otro soporte solido; vease supra. Por ejemplo, los cardiomiocitos o las neuronas de los chips podrlan proporcionan una lectura de la velocidad de contraction o del numero de descargas (disparos), 55 respectivamente, en respuesta a un compuesto y servir para la deteccion de agentes ambientales daninos o, al menos, biologicamente activos.

Las matrices de electrodos neuronales biologicamente compatibles permiten que las celulas madre se sometan a diferenciacion adicional en la propia matriz. Estas matrices permiten la medida en tiempo real de los cambios en la

actividad electrica en las neuronas derivadas de celulas ES en respuesta a la presencia de agentes conocidos o no identificados. La actividad electrica de los cardiomiocitos puede controlarse mediante la disposition sobre placas de las celulas en una matriz de microelectrodos extracelulares (Connolly y col., Biosens. Biores. 5 (1990), 223-234). Las celulas muestran contracciones regulares y las senales extracelulares registradas muestran una relation con los 5 registros de voltaje intracelular (Connolly y col., supra). Este procedimiento no invasivo permite el seguimiento a largo plazo y es mas simple y solido que las tecnicas de pinzamiento zonal en celula completa.

[0109] Por tanto, en un procedimiento preferido de la presente invention, la respuesta fenotlpica que se va a determinar comprende propiedades electrofisiologicas, preferiblemente determinado durante el proceso de

10 diferenciacion en curso. Esta realization es especialmente adecuada para proporcionar patrones de referencia de modulation y bases de datos para los patrones de referencia de modulation para una amplia gama de compuestos biologicamente activos. A continuation, los patrones de referencia se utilizan para la identification y clasificacion de los compuestos de ensayo. La evaluation de los compuestos de ensayo puede usarse para conseguir resultados diferentes.

15

Los expertos en la materia conocen los procedimientos para la clasificacion de agentes biologicos segun la firma de densidad espectral de cambios evocados en el potencial electrico celular; vease, por ejemplo, la patente de EE. UU. 6 377 057. Por tanto, los compuestos biologicamente activos se clasifican segun su efecto sobre los canales ionicos, cambios en el potencial de membrana y en las corrientes ionicas, y el contenido de frecuencia de potenciales de 20 action que los compuestos evocan en las celulas excitables. Los cambios de densidad espectral de dicho potencial de membrana evocado o potencial de accion son una caracterlstica de cada tipo de canal que es modulada por los compuestos de ensayo. Un patron de cambios espectrales en el potencial de membrana se determina poniendo en contacto una celula sensible con un compuesto y haciendo un seguimiento del potencial de membrana o las corrientes ionicas durante el tiempo. Estos cambios se correlacionan con el efecto de ese compuesto, o clase de 25 compuestos, sobre los canales ionicos de la celula respondedora. Este patron de cambios espectrales proporciona una firma unica para el compuesto y proporciona un procedimiento util para la caracterizacion de los agentes que modulan el canal. El efecto de un compuesto sobre los canales ionicos y sobre el potencial de accion de una celula viva, puede proporcionar information util sobre la clasificacion e identidad del compuesto. Los procedimientos y medios para extraer dicha informacion son de especial interes para el analisis de compuestos biologicamente 30 activos, con aplicaciones especlficas en la selection farmacologica, descubrimiento de farmacos, monitorizacion ambiental, detection y clasificacion de guerra biologica y similares. Se describen ejemplos de biosensores basados en celulas completas en Gross y col., Biosensors and Bioelectronics 10 (1995), 553-567; Hickman y col. Abstracts of Papers American Chemical Society 207 (1994), BTEC 76 e Israel y col., American Journal of Physiology: Heart and Circulatory Physiology 27 (1990), H1906-H1917.

35

Connolly y col., Biosens. Biores. 5 (1990), 223-234, describen una matriz plana de microelectrodos desarrollada para hacer un seguimiento la actividad electrica de celulas en cultivo. El dispositivo permite la incorporacion de caracterlsticas de topografla superficial en una capa aislante sobre los electrodos. Se emplea la tecnologla de semiconductores para la fabrication de electrodos de oro y para el deposito y modelado de una capa aislante de 40 nitruro de silicio33. Los electrodos se probaron usando un cultivo de celulas cardlacas de miocitos de embrion de pollo, y los latidos flsicos de las celulas cultivadas se correlacionabas con las medidas del voltaje extracelular obtenidas. El control molecular de los canales ionicos cardlacos se revisa en Clapham, Heart Vessels Supl. 12 (1997), 168-169. Oberg y Samuelsson, J. Electrocardiol. 14 (1981), 13942, realizaron analisis de Fourier sobre las fases de repolarizacion de potenciales de accion cardlacos. Rasmussen y col., American Journal of Physiology 259 45 (1990), H370-H389, describen un modelo matematico de actividad electrofisiologica en auriculas de sapo toro.

[0110] Existe una gran cantidad de literatura sobre el area general de canales ionicos. Puede encontrarse una revision de la literatura en las series de libros, "The Ion Channel Factsbook", volumenes 1-4, de Edward C. Conley y William J. Brammar, Academic Press. Se proporciona una vision general de: canales ionicos dependientes

50 de ligando extracelulares (ISBN: 0121844501), canales dependientes de ligando intracelulares (ISBN: 012184451X), canales rectificadores internos e intercelulares (ISBN: 0121844528) y canales dependientes de voltaje (ISBN: 0121844536). Hille, B. (1992) "Ionic Channels of Excitable Membranes", 2a Ed. Sunderland MA: Sinauer Associates.

[0111] En otro aspecto, las celulas cultivadas o modificadas usando los materiales y procedimientos 55 proporcionados por la presente invencion se colocan sobre las superficies de soporte para realizar la seleccion de

sustancias bioactivas. En un ejemplo, las celulas se conjugaron con un sustrato de modo que pueden medirse los cambios electrofisiologicos en las celulas en respuesta a estlmulos externos, por ejemplo, para su uso como una seleccion de alto rendimiento para sustancias bioactivas. Las celulas tambien pueden transfectarse con ADN que se dirige, expresa o silencia genes especlficos o productos genicos en la celula. Proporcionando dichas celulas sobre

un chip conjugadas con dispositivos de medida, como un ordenador, puede analizarse de forma rapida y precisa muchos compuestos. Las celulas o chips podrlan tambien estar conjugados a los dispositivos de medicion en matrices para una selection paralela a mayor escala.

5 [0112] Los procedimientos de ensayo de la presente invention pueden estar en formato analltico

convencional o adaptado para un alto rendimiento. El termino "alto rendimiento" (HTS) se refiere a un ensayo disenado que permite un analisis facil de multiples muestras de forma simultanea y permite la manipulation robotica. Otra caracterlstica deseada de los ensayos de alto rendimiento es un diseno del ensayo que se optimiza para reducir el uso de reactivos o minimizar el numero de manipulaciones para conseguir el analisis deseado. Entre los 10 ejemplos de formatos de ensayo se incluyen placas de 96 pocillos, 384 pocillos o mas pocillos, gotas colgantes y chips de microcanales en "laboratorios en un chip" utilizados para experimentos de manipulacion de llquidos. Es bien conocido por los expertos en la materia que con el avance de la miniaturization de los moldes de plastico y de los dispositivos de manejo de llquidos, o con la mejora del diseno de los dispositivos de ensayo, pueden analizarse un numero mucho mayor de muestras usando el diseno de la presente invencion.

15

[0113] En el procedimiento de la invencion, dichas celulas estan contenidas preferiblemente en un recipiente,

por ejemplo, en un pocillo de una placa de microvaloracion, que puede ser una placa de 24, 96, 384 y 1586 pocillos. Alternativamente, las celulas pueden introducirse en dispositivos microfluldicos, como los proporcionados por Caliper (Newton, MA, EE. UU.). En otra realization preferida, el procedimiento de la presente invencion comprende obtener 20 2, 3, 4, 5, 7, 10 o mas medidas, opcionalmente en diferentes posiciones dentro del recipiente. En una realizacion de los procedimientos de seleccion de la presente invencion se anade a la muestra o medio de cultivo un compuesto conocido por activar o inhibir el proceso de diferenciacion y/o formation de la estructura tisular, por ejemplo, acido retinoico; veanse tambien supra los compuestos apropiados.

25 [0114] Adicionalmente, los procedimientos descritos anteriormente pueden, por supuesto, combinarse con

una o mas etapas de cualquiera de los procedimientos de seleccion descritos anteriormente u otros procedimientos de seleccion bien conocidos en la tecnica. Los procedimientos para el descubrimiento de compuestos cllnicos comprenden por ejemplo, la seleccion de ultra alto rendimiento (Sundberg, Curr. Opin. Biotechnol. 11 (2000), 47-53) para la identification de prototipos, y el diseno de farmacos basado en la estructura (Verlinde y Hol, Structure 2 30 (1994), 577-587) y la qulmica combinatoria (Salemme y col., Structure 15 (1997) 319-324) para la optimization de prototipos. Una vez seleccionado un farmaco, el procedimiento puede tener una etapa adicional de repetition del procedimiento utilizado para realizar un diseno racional del farmaco usando el farmaco modificado y evaluar si dicho farmaco modificado muestra una mejor afinidad segun, por ejemplo, el analisis de interaccion/energla. El procedimiento de la presente invencion puede repetirse una o mas veces de modo que se reduzca sucesivamente la 35 diversidad de dicho compendio de compuestos.

[0115] Las sustancias se metabolizan tras su administration in vivo para su elimination mediante excretion o

metabolizacion en uno o mas metabolitos activos o inactivos (Meyer, J. Pharmacokinet. Biopharm. 24 (1996), 449459). Por tanto, en lugar de usar el compuesto o farmaco real identificado y obtenido segun los procedimientos de la 40 presente invencion, puede usarse una formulation correspondiente como profarmaco que se convierte en su forma activa en el paciente mediante su metabolismo. Las medidas de precaution que pueden tomarse para la aplicacion de profarmaco y farmacos se describen en la literatura; vease, para revision, Ozama, J. Toxicol. Sci. 21 (1996), 323329.

45 [0116] Adicionalmente, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto identificado, aislado y/o

producido por cualquiera de estos procedimientos para la preparation de una composition para el tratamiento de trastornos relacionados con, por ejemplo, el dano tisular o la formacion de tejidos u organos aberrantes, insuficiencia cardlaca, etc.; vease tambien supra. Preferiblemente, el compuesto aislado o el farmaco correspondiente ayuda en la curacion de la herida y/o en la curacion del tejido danado. Como procedimiento para el tratamiento puede 50 administrarse al sujeto que sufre de dicho trastorno la sustancia identificada o la composicion que la contiene. Tambien pueden utilizarse compuestos identificados, aislados y/o producidos mediante el procedimiento descrito anteriormente como compuestos prototipo en el descubrimiento de farmacos y la preparacion de farmacos o profarmacos. Esto normalmente implica la modification del compuesto prototipo, un derivado del mismo o un compuesto aislado como se describe anteriormente en este documento modificando de este modo dicha sustancia 55 para alterar, eliminar y/o derivar una portion de la misma que se sospecha causa toxicidad o aumento de la biodisponibilidad, solubilidad y/o semivida. El procedimiento puede ademas comprender la mezcla de la sustancia aislada o modificada con un vehlculo farmaceuticamente aceptable. Las distintas etapas mencionadas anteriormente generalmente son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, hay disponibles programas de ordenador para la implementation de estas tecnicas; por ejemplo, Rein, Computer-Assisted Modeling of Receptor-Ligand Interactions

(Alan Liss, Nueva York, 1989). Los procedimientos para la preparacion de derivados y analogos qulmicos son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Beilstein, Handbook of Organic Chemistry, Springer Edition New York Inc., 175 Fifth Avenue, Nueva York, N.Y. 10010 U.S.A., y Organic Synthesis, Wiley, Nueva York, EE. UU. Adicionalmente, pueden usarse peptidomimeticos y/o disenos asistidos por ordenados de 5 derivados y analogos apropiados, por ejemplo, segun los procedimientos descritos anteriormente. Los procedimientos para la generacion de prototipos en el descubrimiento de farmacos tambien incluyen el uso de protelnas y procedimientos de deteccion como la espectrometrla de masas (Cheng y col., J. Am. Chem. Soc. 117 (1995), 8859-8860) y algunos procedimientos de resonancia magnetica nuclear (RMN) (Fejzo y col., Chem. Biol. 6 (1999), 755-769; Lin y col., J. Org. Chem. 62 (1997), 8930-8931). Tambien pueden incluir o depender de analisis de 10 relacion cuantitativa estructura-actividad (QsAr) (Kubinyi, J. Med. Chem. 41 (1993), 2553-2564, Kubinyi, Pharm. Unserer Zeit 23 (1994), 281-290), bioqulmica combinatoria, qulmica clasica y otros (vease, por ejemplo, Holzgrabe y Bechtold, Pharm. Acta Helv. 74 (2000), 149-155). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de vehlculos y procedimientos de formulacion en Remington's Pharmaceutical Sciences.

15 [0117] Una vez seleccionado el farmaco segun uno cualquiera de los procedimientos de la presente

invention descritos anteriormente, el farmaco o un profarmaco del mismo puede sintetizarse en una cantidad terapeuticamente eficaz. Segun se usa en este documento, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" significa la cantidad total del farmaco o profarmaco que es suficiente para que el paciente muestre un beneficio significativo, es decir, tratamiento, curacion, prevention o mejora del tejido danado, o un aumento de la tasa de tratamiento, 20 curacion, prevencion o mejora de dichas afecciones. Ademas o alternativamente, en especial con respecto a la prueba precllnica del farmaco, el termino "cantidad terapeuticamente eficaz" incluye la cantidad total del farmaco o profarmaco que es suficiente para obtener una respuesta fisiologica en una prueba en animales no humanos.

[0118] La presente invencion tambien se refiere a composiciones de kit que contienen reactivos especlficos 25 como los descritos anteriormente en este documento utiles para realizar cualquiera de los procedimientos de la

presente invencion descritos anteriormente, que contienen el vector o la composition de vectores descritos anteriormente en este documento, celulas pluripotentes, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano y, opcionalmente, un medio de cultivo, moleculas de acido nucleico recombinantes, compuestos patron, etc.. Dicho kit podrla tlpicamente comprender un vehlculo compartimetalizado adecuado para mantenerse el confinamiento al 30 menos en un recipiente. El vehlculo podrla ademas comprender reactivos utiles para llevar a cabo dichos procedimientos. El vehlculo tambien puede contener un medio para la deteccion, tal como sustratos enzimaticos marcados o similares.

[0119] Por tanto, los medios y procedimientos de la presente invencion descritos anteriormente en este 35 documento pueden usarse en diversas aplicaciones incluidas, pero sin limitaciones, los ensayos de "perdida de

funcion", con celulas ES que contienen mutaciones homocigotas de genes especlficos, ensayos de "ganancia de funcion" con celulas ES que sobreexpresan genes exogenos, analisis de desarrollo de compuestos teratogenos/embriotoxicos in vitro, ensayos farmacologicos y el establecimiento de sistemas modelo para funciones de celulas patologicas, y la aplicacion de factores de diferenciacion y crecimiento para la induction de celulas 40 diferencias de forma selectiva que pueden usarse como fuente para implantes de tejido; vease para revision, por ejemplo, Guan y col., Altex 16 (1999), 135-141.

[0120] Estas y otras realizaciones estan descritas y las abarcan la description y los ejemplos de la presente invencion. Bibliografla adicional correspondiente a cualquiera de los materiales, procedimientos, usos y compuestos

45 que han de emplearse segun la presente invencion pueden obtenerse de bibliotecas y bases de datos publicas, usando por ejemplo, dispositivos electronicos. Por ejemplo, puede utilizarse la base de datos publica «medline» que esta hospedada por el National Center for Biotechnology Information y/o la National Library of Medicine de los National Institutes of Health. Otras bases de datos y direcciones web, como las del European Bioinformatics Institute (EBI), que es parte del European Molecular Biology Laboratory (EMBL) son conocidas por los expertos en la materia 50 y tambien pueden obtenerse usando motores de busqueda en Internet. En Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364, se proporciona una vision general de la information de patentes en biotecnologla y un estudio de las fuentes relevantes de informacion de patentes util para la busqueda retrospectiva y el conocimiento presente.

[0121] La descripcion anterior describe en general la presente invencion. Puede obtenerse un entendimiento 55 mas completo en referencia a los siguientes ejemplos y figuras especlficas que se proporcionan en este documento

solo con fines ilustrativos.

[0122] En la practica de la presente invencion se emplearan, a menos que se indique lo contrario, las tecnicas convencionales de biologla celular, cultivo celular, biologla molecular, microbiologla, ADN recombinante,

qulmica de protelnas e inmunologla, que estan dentro de los conocimientos de la tecnica.

[0123] Por una elaboracion adicional de las tecnicas generales relacionadas con la tecnologla de celulas madre, el profesional puede referirse a libros de texto y revisiones convencionales, por ejemplo Teratocarcinomas

5 and embryonic stem cells: A practical approach (E. J. Robertson, ed., IRL Press Ltd. 1987); Guide to Techniques in Mouse Development (P. M. Wasserman y col., eds., Academic Press 1993); Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro (Wiles, Meth. Enzymol. 225 (1993), 900,); Properties and uses of Embryonic Stem Cells: Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy (Rathjen y col., Reprod. Fertil. Dev. 10 (1998), 31,). La diferenciacion de celulas madre se revisa en Robertson, Meth. Cell Biol. 75 (1997), 173 y Pedersen, Reprod. Fertil. 10 Dev. 10 (1998), 31. Ademas de las fuentes de celulas madre ya descritas anteriormente se proporcionan referencias adicionales; veanse Evans y Kaufman, Nature 292 (1981), 154-156; Handyside y col., Roux's Arch. Dev. Biol., 196

(1987) , 185-190; Flechon y col., J. Reprod. Fertil. Abstract Series 6 (1990), 25; Doetschman y col., Dev. Biol. 127

(1988) , 224-227; Evans y col., Theriogenology 33 (1990), 125-128; Notarianni y col., J. Reprod. Fertil. Supl., 43 (1991), 255-260; Giles y col., Biol. Reprod. 44 (Supl. 1) (1991), 57; Strelchenko y col., Theriogenology 35 (1991),

15 274; Sukoyan y col., Mol. Reprod. Dev. 93 (1992), 418-431; lannaccone y col., Dev. Biol. 163 (1994), 288-292.

[0124] Los procedimientos de genetica molecular e ingenierla genetica se describen generalmente en las ediciones actuales de Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Sambrook y col., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); DNA Cloning, volumenes I y II (D. N. Glover ed.,

20 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. B. Hames & Higgins eds. (1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan, R. Liss, Inc., 1987); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller & Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols in Molecular Biology, 3a Edicion (F. M. Ausubel y col., eds.) y Recombinant DNA Methodology (R. Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. 25 Miller y M.P. Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vol. 154 y 155 (Wu y col., eds.); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer y Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumenes I-IV (D. M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986). Los reactivos, vectores de clonacion y kits para manipulacion genetica 30 referidos en esta description estan disponibles a partir de proveedores comerciales como BioRad, Stratagene, Invitrogen y ClonTech. Las tecnicas generales de cultivo celular y recogida de medios se describen en Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu y col., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375) y Suspension Culture of Mammalian Cells (Birch y col., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251).

35

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Generacion de los clones de celulas ES transgenicas para la seleccion de farmacos de los cardiomiocitos derivados de celulas ES

40

Diseno del vector

[0125] El fragmento BamHI-SaII de 5,5 kb de la region promotora para la cadena pesada de a-miosina especlfica de tejido cardlaco (aMHC) (N.° de acceso a GenBank: U71441; Subramaniam y col., J. Biol. Chem. 266

45 (1991), 24613-24620; Sanbe y col., Circ. Res. 92 (2003), 609-616) y se codifica la region codificadora para el casete de resistencia a puromicina (Pac), se inserto posteriormente en el sitio de multiclonacion (MCS) del vector pIRES2- EGFP (Clontech®) despues de que se escindiera el promotor temprano del citomegalovirus humano (CMV) (Pcmv IE) mediante AseI-Eco47 III. En el vector bicistronico resultante (paPIG) el promotor aMHC especlfico de tejido cardlaco dirige la expresion tanto de Pac como del marcador selectivo para farmacos y la protelna verde fluorescente

50 potenciada (EGFP) como un gen indicador en vivo. La secuencia IRES (sitio interno de entrada al ribosoma) proporciona la traduction independiente de ambas protelnas en celulas transfectadas estables. El vector contiene tambien los casetes de resistencia a kanamicina y neomicina para la seleccion de transfectantes en los cultivos de celulas bacterianas y ES, respectivamente.

55 Transfection y seleccion de los clones de celulas ES

[0126] Se electroporaron 5x106 celulas ES (llnea D3, Doetschman y col., J. Embryol. Exp. Morph. 87 (1985), 27-45) con 30 pig de aDn del vector paPIG linearizado mediante SacI. Las celulas se sembraron en la placa de cultivo tisular de 10 cm que contenla una monocapa de celulas nodrizas resistentes a neomicina inactivadas con

mitomicina. Cuarenta y ocho horas despues de la siembra, se anadio al medio de cultivo neomicina (G418) a 300 pg/ml para la seleccion de los clones de celulas ES transfectadas de forma estable. Ocho a diez dlas despues del inicio de la seleccion se picaron las colonias de celulas ES supervivientes, se tripsinizaron y se propagaron finalmente en placas de 48 pocillos, 24 pocillos y 6 cm. Los clones resultantes se utilizaron en el protocolo de 5 diferenciacion cardlaca para la seleccion.

[0127] La diferenciacion se realizo segun el protocolo convencional de "gota pendiente" como se describe en, por ejemplo, Maltsev y col., Circ. Res. 75 (1994), 233-244. Los dlas 8 a 10 de desarrollo los cuerpos embrioides (EB) con latido espontaneo que expresaban fluorescencia EGFP se trataron con puromicina a 10 pg/ml. La muerte celular

10 con puromicina era evidente aproximadamente a las 12 horas de tratamiento cuando en el numero de clones los grupos de cardiomiocitos con latido espontaneo de celulas positivas para EGFP no solo sobrevivlan al tratamiento sino que tambien mostraban una intensification de la frecuencia de latido. Ya despues de 3 a 5 dlas de tratamiento los grupos de celulas con latido espontaneo intenso positivas para EGFP representaban la principal fraction celular en EB de las placas as! como en los cultivos de EB en suspension.

15

[0128] Se seleccionaron dos clones (aPIG10 y aPIG44) que mostraban la expresion especlfica cardlaca de ambos casetes de EGFP y resistencia a puromicina y se usaron en los experimentos adicionales.

Ejemplo 2: Cocultivo de las celulas cardfacas derivadas de celulas ES purificadas y fibroblastos 20 embrionarios de raton

[0129] Despues de 7 a 10 dlas de tratamiento con puromicina, los grupos de celulas cardlacas con latido espontaneo positivas para EGFP se recogieron mediante centrifugation, se lavaron dos veces con PBS y se trataron con 0,1% de colagenasa B (Boehringer, Mannheim), durante 20 min a 37 °C. Tras 10 min y al final de la incubation

25 la suspension celular se pipeteo suavemente a traves de una punta azul de una pipeta de 1 ml. Posteriormente, se anadieron uno, dos y de nuevo dos volumenes de medio que contenlan el 20% de suero fetal de ternera (FCS) y las celulas se centrifugaron y lavaron con este medio dos veces, se resuspendieron y se contaron con un microscopio de fluorescencia.

30 [0130] Se obtuvieron fibroblastos embrionarios de raton a partir de embriones de 14 a 16 dlas segun el

procedimiento convencional, vease, por ejemplo, Joyner A.L. Gene targeting. A Practical Approach. Oxford University Press, 1993. Las celulas se crecieron hasta confluencia y se tripsinizaron con tripsina al 0,05%, se lavaron dos veces con medio que contenla FCS al 20% y se contaron. Para el cocultivo se mezclaron aproximadamente de 50x103 a 100x103 fibroblastos con una cantidad igual de los cardiomiocitos derivados de celulas ES y positivos para 35 EGFP y se dispusieron en un pocillo de las placas de 24 pocillos o, en algunos experimentos, en matrices de electrodos multiples (MEA). Como se muestra en la fig. 4, un dla despues de la disposition en placa de forma conjunta, los fibroblastos formaron una monocapa mientras que los cardiomiocitos positivos para EGFP mostraban solo celulas individuales o grupos de celulas ligeramente pegados a los fibroblastos. Durante los siguientes dlas los cardiomiocitos positivos para EGFP derivados de celulas Es mostraban una completa integration y alineamiento con 40 los fibroblastos adquiriendo la morfologla y orientation longitudinales segun los fibroblastos circundantes (fig. 4). Las celulas cardlacas integradas con los fibroblastos embrionarios mostraban viabilidad y contractibilidad durante al menos algunas semanas como se mostro en el experimento de MEA (fig. 5). Para los registros extracelulares asistidos de la matriz de electrodos multiples (MEA) se cultivaron los cardiomiocitos derivados de celulas ES y los fibroblastos sobre la matriz de electrodos multiples (MEA; Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemania) compuesta 45 de un sustrato de vidrio (5 cm x 5 cm) con 60 electrodos de nitruro de titanio (diametro de 30 pm, espaciados 200 pm) en el centro de la MEA y un electrodo de referencia interno. Los registros electrofisiologicos extracelulares de los cardiomiocitos se realizaron con el sistema MEA60 (Multi Channel Systems, Reutlingen, Alemania). El sistema comprende el amplificador MEA-1060 (anchura de banda: de 10 Hz a 3 kHz; amplification: 1200), el controlador de temperatura HC-X para mantener el medio de cultivo a 37°C y un sistema de ordenador para registrar los datos 50 medidos con el software MC-Rack. La velocidad de muestra de los registros era de 4 kHz.

Ejemplo 3: Cotrasplante de las celulas cardlacas derivadas de celulas ES purificadas y fibroblastos embrionarios de raton

55 [0131] La llnea de raton SV129 se utilizo para la preparation de fibroblastos embrionarios mediante

procedimientos convencionales (vease, por ejemplo, Joyner A.L. Gene targeting. A Practical Approach. Oxford University Press, 1993) para que coincidiera con el origen de los clones de celulas ES utilizados para la generation de cardiomiocitos. Se mezclaron de 50 x 103 a 100 x 103 de cardiomiocitos y fibroblastos purificados, y se inyectaron en los corazones crioinfartados de ratones SV129 como se describe en Roell y col., Circulation 105 (2002), 2435-

2441. Se detectaron cardiomiocitos que mostraban fluorescencia EGFP y estriado cruzado en corazones trasplantados durante el margen de tiempo de 10 a 70 dias tras la operacion (fig. 6) confirmando de este modo la viabilidad de las celulas cardiacas derivadas de celulas ES implantadas.

5 Ejemplo 4: Diseno principal de clones de celulas ES transgenicas para modelado de tejidos

Diseno del vector:

[0132] Los elementos basicos para los vectores son elementos reguladores genomicos especificos de tipo 10 celular (denominados adicionalmente "promotores"), que incluyen promotores comunes y elementos potenciadores

especificos. Tipicamente, abarcan la region del extremo 5' de la region codificador del gen y, en ocasiones, incluyen tambien los fragmentos intron-exon no traducidos. Los promotores determinan la activacion especifica de celulas del casete de resistencia a farmacos que es el segundo elemento basico del vector y normalmente va detras del promotor justo en el extremo 5' de este. Dicha combinacion permite la eliminacion de celulas ES no diferenciados 15 junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes a partir del tipo celular de interes que activa el casete de resistencia a farmacos en el transcurso de la diferenciacion.

[0133] Adicionalmente, se recomienda incluir en el vector un casete denominado proteina de color fluorescente en vivo unido a un casete de resistencia a farmacos a traves de un sitio interno de entrada al ribosoma

20 (IRES). Dichos vectores bicistronicos permiten la transcription de ambos casetes genicos de resistencia a farmacos e indicador en vivo a partir del mismo vector bajo un promotor especifico del tipo celular. Posteriormente, el IRES permite la traduction ribosomica independiente de ambos casetes visualizando las celulas diferenciadas seleccionadas para su seguimiento. Hasta la fecha hay disponibles al menos tres versiones de color de proteina verde de fluorescencia potenciada (EGFP): EYFP (amarilla), ECFP (azul) y hcRFP (roja), para la visualization 25 simultanea de al menos tres tipos celulares diferentes en el mismo cultivo. El diseno principal de dicho vector se muestra en la fig. 1.

Clones de ES transgenicos:

30 [0134]

El nucleo del procedimiento de la presente invention es una selection por farmacos paralela de tipos celulares que constituyen tejidos en interes en un cultivo de celulas ES en diferenciacion. La ventaja de dicha tecnica es que las interacciones entre los tipos de celulas purificadas se procesan de forma "natural" inmediatamente despues de 35 liberarse de celulas irrelevantes, usando senales naturales para la serialization de "interferencias" y formado de estructuras similares a tejido viables como resultado. Se presentan dos variantes de dicha tecnica:

a) clones multiples de celulas ES transgenicas transfectados de forma estable con un determinado numero de vectores con casetes de seleccion por farmaco dirigidos por promotores especificos segun los tipos celulares que

40 constituyen el tipo tisular deseado. En esta variante todos los tipos celulares emergentes se originan a partir de un clon antecesor comun de celulas ES y la proportion resultante entre los diferentes componentes celulares depende de la velocidad de diferenciacion relativa de cada uno de ellos (fig. 2A y 3B);

b) cuerpos embrioides (EB) quimericos: mediante esta tecnica se generan varios clones de celulas ES transgenicos, 45 donde cada clon individual posee solo un vector con un casete de resistencia a farmacos dirigido por uno de los

promotores especificos de tipo celular. Para la formation del tejido los clones relevantes se mezclan en la fase inicial de diferenciacion ("gotas colgantes" o "cultivo en masa") para formar agregados de celulas ES (EB) donde, tras la seleccion por farmacos, surgen tipos celulares que tienen su origen en los correspondientes clones celulares de ES diferentes y la proporcion final de los componentes celulares tambien depende y puede controlarse mediante la 50 proporcion final entre diferentes lineas celulas de ES (fig. 2B y 3C).

Ejemplo 5: Modelado del tejido cardfaco en un sistema de celulas ES

[0135] Se establecio un sistema para la seleccion por farmaco de los cardiomiocitos derivados de celulas ES

55 en base al esquema principal descrito anteriormente de los vectores bicistronicos. Para este fin, el promotor especifico de tejido cardiaco para la cadena pesada de a-miosina (promotor aMHC) y el casete de resistencia a puromicina se han insertado como un "promotor especifico de tipo celular" y "casete de resistencia a farmacos para la seleccion de tipo celular" (fig. 1 y 3A), respectivamente, en el vector pIRES2-EGRP (Clontech®) que posee un IRES, y proteina verde fluorescente potenciada (EGFP) como "IRES" y "casete indicador de fluorescencia en vivo"

(fig. 1), respectivamente; veanse tambien los ejemplos 1 y 2 de la solicitud internacional WO02/051987. Este sistema permite una purificacion rapida y eficaz de los cardiomiocitos viables adecuados para el trasplante. Se comprueban las ventajas obvias de este sistema mediante la posibilidad de controlar la diferenciacion, seleccion especlfica cardlaca y el destino de las celulas trasplantadas. Tambien se ha mostrado que los cardiomiocitos purificados con 5 puromicina se integran y alinean por completo con los fibroblastos embrionarios durante algunos dlas en cocultivo (fig. 4). En dicho cocultivo los cardiomiocitos purificados derivados de celulas ES mantenlan un buen estado funcional al menos durante dos semanas cuando se registraban la contraccion espontanea y la senal de potencial de campo (PC) mediante las medidas de matrices de electrodos multiples (MEA) (fig. 5).

10 [0136] Los fibroblastos se conocen como un elemento celular clave para el tejido conjuntivo en especies de

mamlferos y no mamlferos. Especialmente en el corazon de raton constituyen hasta el 50% del corazon embrionario y hasta el 80% del corazon adulto. Otro elemento no cardlaco importante del tejido cardlaco esta representado por las celulas endoteliales como elemento celular principal para capilares y vasos que poseen una funcion trofica importante. Por tanto, se preve que las celulas cardlacas derivadas de celulas ES, endoteliales y fibroblastos puedan

15 constituir un conjunto suficiente para forma un tejido similar al cardlaco.

Diseno de vectores y clones de celulas ES:

[0137]

20

1) Para el vector especlfico de tejido cardlaco, puede usarse el promotor aMHC mencionado anteriormente u otros promotores especlficos de tejido cardlaco (MLC2v, MLC1a, MLC2a, 13-MHC, etc.) como "promotor especlfico de tipo celular" y la protelna ciano fluorescente potenciada (ECFP, Clontech®) como gen indicador en vivo junto con casetes de IRES y puromicina (o algun otro marcador selectivo) segun la fig. 3A.

25

2) Para el vector especlfico endotelial, puede usarse Tie2 (u otros promotores especlficos de endotelio como Tie1, cadherina, etc.) como "promotor especlfico de tipo celular" y la protelna amarilla fluorescente potenciada (EYFP, Clontech®) como gen indicador en vivo junto con casetes de IRES y puromicina (o algun otro marcador selectivo) segun la fig. 3A.

30

3) Para el vector especlfico de fibroblastos, puede usarse colageno I (u otros promotores especlficos de fibroblastos) como "promotor especlfico de tipo celular" y la protelna hcRed fluorescente (hcRFP, Clontehch®) como gen indicador en vivo junto con casetes de IRES y puromicina (o algun otro marcador selectivo) segun la fig. 1.

35 [0138] El diseno, diferenciacion y esquemas de seleccion de clones de celulas ES pueden realizarse segun

los dos principios principales descritos anteriormente. "Tres vectores - Un clon" (fig. 3B) o "Tres vectores - Tres clones" (fig. 3C). La transfeccion y seleccion de tipos celulares derivados de celulas ES y el trasplante se realizan como se describe en la solicitud internacional WO02/051987; vease en especial los ejemplos 1 y 2 del documento WO02/051987 y las referencias citadas en el mismo.

40

[0139] El uso de tres vectores indicadores de fluorescencia en vivo permite hacer un seguimiento de la

diferenciacion, la seleccion y las conexiones intercelulares durante la formation del tejido en un cultivo en modo "en vivo". La formacion in vitro de la estructura similar a tejido cardlaco en el cultivo de celulas ES puede usarse como un sistema fisiologico significativo para comprobar diferentes sustancias cardiotroficas y cardiotoxicas en

45 experimentos bioqulmicos y electrofisiologicos (MEA). Adicionalmente, podrla convertirse en una fuente relevante de material trasplantado en la terapia de sustitucion de enfermedades cardlacas.

Ejemplo 6: Sistema transgenico doble para la seleccion cardiovascular en el sistema de celulas ES

50 [0140] El objetivo principal de este experimento era una seleccion paralela de los dos tipos celulares

derivados de celulas ES estrechamente relacionados entre si tanto funcionalmente como por su origen mesodermico comun. Para este fin, se generaron clones dobles de celulas ES transgenicas estables, donde un vector posea un casete de resistencia a farmacos bajo el control del promotor especlfico de tejido cardlaco mientras que el segundo posee ambos casetes de resistencia a farmacos e indicador de fluorescencia en vivo bajo el control del promotor

55 especlfico endotelial. Las celulas cardlacas y endoteliales aparecen muy pronto en el desarrollo embrionario real y constituyen elementos funcional y anatomicamente muy estrechamente relacionados de la formacion del corazon. Por tanto, se previo que siendo seleccionados de forma eficaz a partir de un cultivo de celulas ES en diferenciacion, estos tipos celulares mostrarlan patrones de autoensamblaje dirigidos por pistas similares a las que se produclan durante una cardiogenesis embrionaria real. En la primera version experimental, las celulas similares a endoteliales

tenlan que identificarse mediante la fluorescencia de la protelna verde fluorescente potenciada (EGFP) mientras que las celulas similares a cardiomiocitos incoloras se identificaban mediante la deteccion de los grupos contractiles. En experimentos adicionales se generaron cuerpos embrioides que constaban del clon mencionado anteriormente y de otro clon transgenico que posela la protelna roja fluorescente (HcRFP) y un casete de resistencia a farmacos ambos 5 dirigidos por un promotor especlfico de tejido cardlaco. Por tanto, este ultimo experimento permitla visualizar la diferenciacion y seleccion de ambos tipos celulares cardlacas y endoteliales.

Vectores:

10 [0141]

1) Para el vector paMHC-Pac se escindio el casete de resistencia a puromicina (Pac) del vector pCre-Pac (Taniguchi y col., Nucleic Acid Research 26 (1998, 679-680) mediante las enzimas de restriction HindllI-SalI y se ligo mediante extremos romos en el vector aMHC-EGFP tras la deletion del casete EGFP mediante las enzimas BamHI-Aflll.

15

Para la electroporation de las celulas ES se utilizo el vector resultado de la linealizacion con Hindlll.

2) Para el vector pTie2 -Pac-lRES-EGFP (pTie2-PlG) se escindio el casete Pac-lRES-EGFP del vector pPlG mediante Sall-Aflll y se inserto mediante ligamiento con extremos romos en el sitio Notl del vector pSPTg.T2FXK

20 (Schlaeger y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 (1997), 3058-3063) entre el promotor de Tie2 y el potenciador de Tie2.

Para la electroporacion de celulas ES, el fragmento promotor de Tie2-PlG-potenciador de Tie2 se escindio a parti r del vector resultante mediante Sall y se purifico mediante electroforesis en el gel de agarosa al 1%.

25

3) Para el vector paMHC-hcRFP se escindio el fragmento de 5,5 kb del promotor de tejido cardlaco aMHC mediante BamHl-Sall a partir de paMHC-BS2SK+ (Robbins, Trends Cardiovasc. Med. 7 (1997), 185-191) y se ligo mediante extremos romos en el sitio Smal del pHcRed1-1 (Clontech®, USA).

30 Protocolos de cultivo, transformation y diferenciacion de celulas ES:

[0142] Se cultivaron celulas ES y se realizo la electroporacion segun se ha descrito (Kolossov y col., J. Cell Biol. 143 (1998), 2045-2056). Se cotransfectaron 5 x 106 celulas ES (llnea D3) con 30 pg de ADN de cada paMHC- Pac y fragmentos promotor Tie2-PlG-potenciador Tie2. Los clones resistentes a G418 se seleccionaron, propagaron 35 y sometieron a diferenciacion como se ha descrito (Kolossov y col., J. Cell Biol. 143 (1998), 2045-2056). Para la generation de los EB quimericos, se mezclaron suspensiones de las celulas de los clones transgenicos Tie2- PlG/aMHC-Pac y aMHC-hcRFP/aMHC-Pac hasta una densidad celular de 0,01 x 106 celulas de cada clon por ml (200 celulas de cada clon por gota).

40 [0143] Se realizo un control de los EB a traves de un microscopio de fluorescencia Axiovert 200M (Zeiss, Alemania).

Clon Tie2-PlG/aMHC-Pac:

45 [0144] Las contracciones espontaneas se iniciaron los dlas 8 a 10 de desarrollo. Los dlas 11 a 14 se detectaron las primeras celulas positivas para EGFP exclusivamente en los EB con latido espontaneo en las zonas que solapaban o muy proximas a los grupos celulares contractiles cardlacos. En este momento, se anadio puromicina (5 pg/ml) y, a continuation, se cambio el medio cada 2 a 3 dlas. Durante los dlas siguientes se detecto un aumento de contractibilidad de los grupos celulares cardlacos junto con un aumento de la expresion de EGFP. Al 50 mismo tiempo se registro la muerte intensiva de las celulas no resistentes a puromicina. Tlpicamente, ya aproximadamente 4 dlas despues del tratamiento con puromicina las celulas positivas para EGFP formaron una red incluida en grupos celulares con latido espontaneo vigoroso de celulas cardlacas. Despues de 10 o mas dlas de tratamiento con puromicina, la intensidad de fluorescencia aumentaba drasticamente.

55 EB quimericos: clon Tie2-PlG/aMHC-Pac + clon aMHG-hcRPP/aMHC-Pac:

[0145] Al igual que los EB del clon descrito anteriormente los EB quimericos mostraban el mismo tiempo de expresion de EGFP en las zonas con latido espontaneo. De forma simultanea, se detecto una intensa fluorescencia RFP en las mismas zonas con latido espontaneo marcandose de este modo los cardiomiocitos diferenciados.

Notablemente, los grupos celulares con fluorescencia EGFP y RFP se solapaban en el espacio aunque no estaban completamente superpuestos ya que como grupos celulares con latido espontaneo presentaban una clara estructura en mosaico verde y roja. Tanto la fluorescencia verde como la roja aumentaban significativamente durante el tratamiento con puromicina.

5

[0146] Por tanto, los experimentos mencionados anteriormente muestran inequlvocamente una conexion clara y fuerte entre la diferenciacion cardlaca y endotelial en el sistema de celulas ES: los EB sin actividad contractil no expresaban tampoco ninguna fluorescencia EGFP. Ambos tipos de celulas mostraron tambien una alta coincidencia espacial en la mayorla de las zonas con celulas que expresaban EGFP que se localizaban muy proximas a grupos

10 de celulas con latido espontaneo o se solapaban completamente con ellos. Tras el tratamiento con puromicina las conexiones entre estos dos tipos de celulas resultaban obvias: tras la muerte de la mayorla de las celulas indiferenciadas las redes de celulas fluorescentes EGFP estaban incluidas en los grupos de celulas cardlacas con latido espontaneo mostrando con frecuencia signos de orientacion estructural. De forma notable, la intensidad de fluorescencia de EGFP aumentaba drasticamente durante el tratamiento con puromicina lo que sugerla la 15 proliferacion de celulas endoteliales tras la liberacion de las celulas ES indiferenciadas como se ha comprobado para las celulas cardlacas segun la presente invencion.

Las estrechas conexiones entre elementos cardlacos y endoteliales especialmente evidentes en las imagenes de fluorescencia multicolor de grupos celulares con latido espontaneo permiten considerar a estas estructuras como un 20 posible prototipo de estructura similar a tejido cardiovascular creado mediante la seleccion por farmaco a partir de diferentes cultivos de celulas ES multitransgenicas.

[0147] Finalmente, los datos presentados apuntan hacia la viabilidad principal del "modelado de tejidos" mediante la seleccion multilinaje en un sistema de celulas ES multitransgenico.

25

Claims

REIVINDICACIONES

I. Procedimiento de modelado y/u obtencion de tejido cardlaco o estructuras similares a tejido cardlaco que comprenden cultivar un primer tipo celular derivado de celulas madre embrionarias (ES) en presencia de al

5 menos un segundo tipo celular embrionario, y permitir la integracion y alineamiento de dichos al menos dos tipos celulares en el tejido o estructuras similares a tejido;

siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

10 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la celula de dicho primer tipo celular derivado de

celula comprende un marcador seleccionable unido de forma operativa a una primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfica para dicho primer tipo celular.
3. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que dicho marcador seleccionable confiere resistencia a 15 puromicina.
4. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha celula de dicho primer tipo celular derivado de celula comprende un gen indicador unido de forma operativa a una secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfica para dicho primer tipo celular.

20
5. El procedimiento de la reivindicacion 4, en el que dicha secuencia reguladora especlfica de tipo celular del gen indicador es sustancialmente la misma que dicha primera secuencia reguladora especlfica de celula del gen marcador.

25 6. El procedimiento de la reivindicacion 5, en el que dicho indicador se selecciona a partir de las

diferentes versiones de color de la protelna verde fluorescente potenciada (EGFP).
7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho primer tipo celular son cardiomiocitos.

30
8. El procedimiento de la reivindicacion 7, en el que dicha primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular es preferiblemente especlfica de auricula y/o ventriculo.
9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que ademas comprende cultivar 35 dichos al menos dos tipos celulares en presencia de un tercer tipo celular embrionario o derivado de celulas ES,

siempre que la celula no derive de un embrion humano.
10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que dicho tercer tipo celular son celulas endoteliales o fibroblastos.

40

II. Un cocultivo de celulas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende al menos celulas de dicho primero y segundo tipo celular en condiciones, en el que dichas celulas son capaces de integrarse y alinearse en el tejido cardlaco o estructuras similares a tejido, en el que la celula de dicho primer tipo celular derivado de celulas comprende un marcador seleccionable y/o un gen indicador unidos de forma

45 operativa a una primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfica para dicho primer tipo celular, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.
12. Un tejido cardlaco que se obtiene mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que la celula de dicho primer tipo celular derivado de celula comprende un marcador seleccionable y/o

50 un gen indicador unidos de forma operativa a una primera secuencia reguladora especlfica de tipo celular especlfica para dicho primer tipo celular.
13. Procedimiento de modelado y/u obtencion de tejido cardlaco o estructuras similares a tejido que comprende las etapas siguientes:

(a) transfectar una o mas celulas ES con moleculas de acido nucleico recombinantes que comprenden una primera y una segunda secuencia reguladoras especificas de tipo celular unidas de forma operativa a al menos un marcador seleccionable, en el que dicho segundo tipo celular es diferente de dicho primer tipo celular;

(b) cultivar las celulas en condiciones que permitan la diferenciacion de las celulas; y

(c) aislar celulas de al menos dos tipos celulares diferenciados y/o eliminar las celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes a partir de los tipos celulares de

5 interes que activen el marcador seleccionable en el transcurso de la diferenciacion siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.
14. El procedimiento de la reivindicacion 13, que ademas comprende transfectar dicha una o mas celulas con moleculas de acido nucleico recombinantes que comprenden al menos una secuencia reguladora especlfica de

10 tipo celular adicional unida de forma operativa a al menos un marcador seleccionable, en el que dicho al menos un tipo celular adicional es diferente de dichos primer y segundo tipos celulares.
15. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 13 o 14, en el que la secuencia reguladora es un promotor seleccionado a partir del grupo compuesto por los promotores de aMHC, MLC2V,

15 cadherina, Tie-2 y colageno.
16. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que se transfectan y seleccionan al menos dos celulas o clones de las mismas diferentes, en el que dichas al menos dos celulas o clones celulares diferentes contienen moleculas de acido nucleico recombinantes con secuencias reguladoras especlficas

20 de tipo celular diferentes.
17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que dichas al menos dos celulas o clones celulares diferentes se mezclan en el estadio inicial de diferenciacion para permitir la formation de agregados celulares.

25 18. El procedimiento de la reivindicacion 17, en el que dichos agregados celulares son cuerpos embrioides

(EB) quimericos.
19. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18, en el que se transfecta y selecciona una de dichas celulas o clones celulares de las mismas, en el que dicha celula o clon celular contiene

30 moleculas de acido nucleico recombinantes con al menos dos secuencias reguladoras especlficas de tipo celular diferentes.
20. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que al menos dos de dichos marcadores seleccionables unidos de forma operativa a dichas secuencias reguladores diferentes especlficas de

35 tipo celular son identicos.
21. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 20, en el que al menos uno de dicho marcador seleccionable unido de forma operativa a dichas secuencias reguladoras especlficas de tipo celular diferentes confiere resistencia a puromicina, bleomicina, higromicina, metotrexato o neomicina.

40
22. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en el que una o mas de dichas moleculas de acido nucleico recombinantes ademas comprenden un indicador unido de forma operativa a dicha secuencia especlfica de tipo celular.

45 23. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que dicho indicador se selecciona a partir de las

diferentes versiones de color de la protelna verde fluorescente potenciada (EGFP).
24. El procedimiento de la reivindicacion 23, en el que EYFP (amarilla), ECFP (azul) y/o hcRFP (roja) se unen de forma operativa a secuencias especlficas de tipo celular diferentes.

50
25. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en el que dicho marcador seleccionable y dicho indicador se expresan a partir de un vector bicistronico.

55 26. El procedimiento de la reivindicacion 25, que ademas comprende uno o mas sitios internos de entrada

al ribosoma (IRES), en el que dicho IRES separa dicho marcador seleccionable y dicho indicador.
27. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 26, que ademas comprende permitir el

autoensamblaje de los diferentes tipos celulares.
28. Una celula o celulas que se obtienen mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27, en el que dicha celula o celulas son capaces de diferenciarse en al menos dos tipos celulares y en el que dichas celulas son capaces de integrarse y alinearse en el tejido cardlaco o estructuras

5 similares a tejido.
29. Un agregado celular de al menos dos tipos celulares diferentes que se obtienen mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27 y en el que dichas celulas son capaces de integrarse y alinearse en el tejido cardlaco o en estructuras similares a tejido.

10
30. Un tejido cardlaco que se obtiene mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 27, o comprende celulas de la reivindicacion 28 o un agregado celular de la reivindicacion 29, o un organo que comprende celulas de la reivindicacion 28, un agregado celular de la reivindicacion 29 o tejido de la reivindicacion 12.

15
31. Un tejido cardlaco, implante o trasplante similar a tejido que comprende celulas de la reivindicacion 28, un agregado celular de la reivindicacion 29, un tejido de la reivindicacion 12 o 30 o un organo de la reivindicacion 30.
32. Una composicion en cuestion que comprende celulas de la reivindicacion 28, un agregado celular de 20 la reivindicacion 29 o un tejido de la reivindicacion 12 o 30.
33. Un procedimiento para la preparacion de una composicion farmaceutica para mejorar la funcion cardlaca en un mamlfero tras un infarto de miocardio, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

25 (a) transfectar celulas ES de mamlfero con una molecula de acido nucleico recombinante que comprende un gen de resistencia bajo en control de secuencias reguladores especlficos cardlacas, de fibroblastos y/o de endotelio y que, opcionalmente, comprende uno o mas indicadores bajo las mismas secuencias reguladoras especlficas;

(b) cultivar dichas celulas in vitro en un medio de cultivo que contiene el agente selectivo para el gen de resistencia 30 en condiciones que permitan la diferenciacion de dichas celulas en cardiomiocitos, fibroblastos y/o celulas

endoteliales;

(c) eliminar a partir de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y/o celulas endoteliales diferenciadas celulas no diferenciadas, opcionalmente junto con celulas en diferenciacion hacia tipos celulares irrelevantes; opcionalmente

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(d) permitir el alineamiento y la integracion de dichos cardiomiocitos, fibroblastos y/o celulas endoteliales en diferenciacion en un tejido similar a cardlaco,

en el que dicha composicion farmaceutica se disena para cotrasplantar posteriormente dichos cardiomiocitos y 40 dichos fibroblastos y/o celulas endoteliales o dicho tejido a al menos una porcion de la zona previamente infartada del tejido cardlaco, y/o permitir que dichas celulas o tejido se implantan in situ como celulas viables situadas dentro de la zona previamente infartado del tejido cardlaco, en el que el implante tiene como resultado una mejora de la funcion cardlaca en dicho mamlfero; siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

45 34. El procedimiento de la reivindicacion 33, en el que dicha secuencia reguladora especlfica cardlaca se

selecciona entre los promotores de aMHC, MLC22v, MLC1a, MLC2a y pMHC, dicha secuencia reguladora especlfica de fibroblastos se selecciona entre los promotores de Tie2, Tie1 y cadherina, y dicha secuencia reguladora especlfica de endotelio se selecciona entre los promotores del colageno I.

50 35. El procedimiento de la reivindicacion 33 o 34, en el que dicho indicador para dichos cardiomiocitos,

fibroblastos y/o celulas endoteliales se selecciona independientemente a partir de las protelnas verdes de

fluorescencia potenciadas ECFP (azul), EYFP (amarilla) y hcRFP (roja).
36. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, en el que dicho gen de resistencia y 55 dicho indicador estan separados por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
37. Uso de un vector o una composicion de vectores en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, comprendiendo dicho vector o composicion de vectores las moleculas de acido nucleico recombinante como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36.
38. Uso de una celula o diversidad de celulas en un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 33 a 36, comprendiendo dicha celula o diversidad de celulas el vector o la composicion de vectores de la reivindicacion 37, siempre que las celulas no deriven de un embrion humano.

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39. Una matriz que comprende un soporte solido y celulas unidas al mismo o suspendidas en el de la reivindicacion 28, un agregado de la reivindicacion 29 o un tejido de la reivindicacion 12 o 30.
40. La matriz de la reivindicacion 39, que es una matriz de microelectrodos (MEA).

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41. Un procedimiento para la seleccion y/u obtencion del perfil de una sustancia de ensayo capaz de influir sobre el desarrollo de las celulas cardlacas y/o la formacion de la estructura del tejido cardlaco que comprende las etapas del procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o 13 a 27 y ademas comprende las etapas de:

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(a) poner en contacto una muestra de ensayo que comprende celulas de la reivindicacion 28 o 38, un agregado celular de la reivindicacion 29, un tejido de la reivindicacion 12 o 30, un organo de la reivindicacion 30 o una matriz de la reivindicacion 39 o 40 con una sustancia de ensayo y

20 (b) determinar una respuesta fenotlpica en dicha muestra de ensayo en comparacion con una muestra control, en la que un cambio en la respuesta fenotlpica de dicha muestra de ensayo en comparacion con la muestra control es una indicacion de que dicha sustancia de ensayo tiene un efecto sobre el desarrollo celular y/o la formacion de la estructura tisular.

25 42. El procedimiento de la reivindicacion 41, que se realiza en una matriz como se define en la

reivindicacion 39 o 40.
43. El procedimiento de la reivindicacion 41 o 42, en el que la respuesta fenotlpica comprende propiedades electrofisiologicas durante el proceso de diferenciacion en curso.

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44. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 13 a 27 o 41 a 43, en el que dicha una o mas celulas se manipulan mediante ingenierla genetica para (sobre)expresar o inhibir la expresion de un gen diana.

35 45. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, 13 a 27 o 41 a 44, en el que se

anade al medio de cultivo un compuesto conocido por activar o inhibir el proceso de diferenciacion y/o la formacion de estructura tisular.
46. Uso de un kit o composicion para realizar un procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones

40 1 a 10, 13 a 27, 33 a 36 o 41 a 45, conteniendo dicho kit o composicion el vector o la composicion de vectores de la reivindicacion 37, una celula pluripotente y, opcionalmente, medio de cultivo, moleculas de acido nucleico recombinante o compuestos convencionales;

siempre que la celula no derive de un embrion humano.

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