ES2584107A1

ES2584107A1 - Biodegradable scaffold comprising messenger rna (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Info

Publication number: ES2584107A1
Application number: ES201630565A
Authority: ES
Inventors: Marcos Garcia Fuentes; Adriana MARTINEZ LEDO; Anxo Vidal Figueroa
Original assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Current assignee: Universidade de Santiago de Compostela
Priority date: 2016-05-02
Filing date: 2016-05-02
Publication date: 2016-09-23
Anticipated expiration: 2036-05-02
Also published as: WO2017191345A1; ES2584107B2

Abstract

Biodegradable scaffold comprising messenger rna. This invention relates to a biodegradable scaffold comprising messenger rna. More particularly, it refers to the scaffolding, the method of preparation and the use thereof. A biodegradable scaffold comprises a biodegradable polymer, an isolated mrna that encodes a transcription factor and transfection agents. (Machine-translation by Google Translate, not legally binding)

Description

DESCRIPCIÓN DESCRIPTION

Andamio biodegradable que comprende ARN mensajero Biodegradable scaffolding comprising messenger RNA

Field of the Invention

Esta invención se refiere a un andamio biodegradable que comprende ARN mensajero. Más particularmente, se refiere al andamio, el método de preparación y uso de los mismos. 5 This invention relates to a biodegradable scaffold comprising messenger RNA. More particularly, it refers to scaffolding, the method of preparation and use thereof. 5

Background of the invention

Los factores de transcripción (TFs) son proteínas capaces de inducir grandes cambios en la expresión génica (Graf, 2009, Nature 462, 587-594). Dado que el transporte intracelular de proteínas es un gran desafío, una de las principales preocupaciones es cómo ceder estos 10 TFs a su lugar de acción en el interior del núcleo y la forma de integrar estas tecnologías de cesión en sistemas de ingeniería de tejidos o dispositivos implantables. Para estas aplicaciones, por lo general la cesión se realiza a través de la terapia génica, usando andamios activados con vectores virales. Sin embargo, usar un vector viral puede causar problemas de seguridad, incluyendo reacciones inmunes peligrosas y la supresión inmune 15 de los vectores virales. La activación de andamios con ADN plasmídico (pDNA) también es posible (Fang, 1996, PNAS 93, 5753-5758), pero la eficacia de transfección es baja. Los andamios también han sido activados con otros oligonucleótidos tales como microRNA y siRNA, pero estas moléculas sólo pueden producir la inhibición de la expresión génica, y no la expresión forzada de la proteína (Andersen et al., 2010, Mol Ther 18, 2018-2027). 20 Además, estas estrategias tienen todavía dificultades, especialmente en el caso de la transfección in vivo realizada en andamios de tejido. Transcription factors (TFs) are proteins capable of inducing large changes in gene expression (Graf, 2009, Nature 462, 587-594). Since intracellular protein transport is a major challenge, one of the main concerns is how to transfer these 10 TFs to their place of action inside the nucleus and how to integrate these transfer technologies into tissue or device engineering systems. implantable For these applications, the assignment is usually made through gene therapy, using scaffolds activated with viral vectors. However, using a viral vector can cause safety problems, including dangerous immune reactions and immune suppression of viral vectors. The activation of scaffolds with plasmid DNA (pDNA) is also possible (Fang, 1996, PNAS 93, 5753-5758), but the transfection efficiency is low. Scaffolds have also been activated with other oligonucleotides such as microRNA and siRNA, but these molecules can only produce gene expression inhibition, not forced protein expression (Andersen et al., 2010, Mol Ther 18, 2018- 2027). 20 Furthermore, these strategies still have difficulties, especially in the case of in vivo transfection performed on tissue scaffolds.

Publicaciones recientes han demostrado que el ARN mensajero (mRNA) puede inducir la expresión forzada de la proteína, y se han aplicado para la codificación de los factores de crecimiento. Así, Lui et al. usaron mRNA para la codificación del factor de crecimiento 25 VEGF para la vascularización de tejido, e implantaron esta terapia junto con las células en un andamio de proteína tumoral comercial (Matrigel®) (Lui, 2013, Cell Research 23, 1172-1186). Sin embargo, esta tecnología no se puede aplicar en terapia ya que Matrigel se basa en las proteínas tumorales. Recent publications have shown that messenger RNA (mRNA) can induce forced protein expression, and have been applied for the coding of growth factors. Thus, Lui et al. they used mRNA for 25 VEGF growth factor coding for tissue vascularization, and implanted this therapy together with the cells in a commercial tumor protein scaffold (Matrigel®) (Lui, 2013, Cell Research 23, 1172-1186). However, this technology cannot be applied in therapy since Matrigel is based on tumor proteins.

Por otro lado, Balmayor et al. han cedido un mRNA que codifica para factores de crecimiento a un defecto de fémur en un modelo de rata con buenos resultados (Balmayor, 2016, Biomaterials 87, 131–146). On the other hand, Balmayor et al. they have yielded an mRNA that codes for growth factors to a femur defect in a rat model with good results (Balmayor, 2016, Biomaterials 87, 131-146).

Sin embargo, todavía hay una necesidad de proporcionar tecnologías para la cesión de mRNAs, y más específicamente mRNAs que codifican para factores de transcripción que 5 son proteínas intracelulares estrictamente reguladas, con una vida media muy corta. Los mRNAs deben de seguir siendo eficaces tras su cesión, y conseguir una transfección en el entorno tridimensional, que por lo general muestra una eficiencia más baja que en 2D. Estos dispositivos deben ser capaces de producir un efecto biológico claro inducido por la sobreexpresión del factor de transcripción. Este efecto podría ser medido por una 10 sobreexpresión del propio factor de transcripción, pero incluso más importante, de otros genes objetivo regulados por dicho factor de crecimiento. Además, la estructura 3D del andamio debe ser capaz de albergar células adheridas y, si es necesario, permitir su proliferación. However, there is still a need to provide technologies for the transfer of mRNAs, and more specifically mRNAs encoding transcription factors that are strictly regulated intracellular proteins, with a very short half-life. The mRNAs must continue to be effective after cession, and achieve transfection in the three-dimensional environment, which generally shows lower efficiency than in 2D. These devices must be able to produce a clear biological effect induced by overexpression of the transcription factor. This effect could be measured by an overexpression of the transcription factor itself, but even more importantly, of other target genes regulated by said growth factor. In addition, the 3D structure of the scaffold must be able to house adhered cells and, if necessary, allow proliferation.

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Brief Description of the Invention

Los autores de la presente invención han desarrollado un andamio biodegradable que está activado con secuencias de mRNA que codifican para factores de transcripción. Este andamio biodegradable puede conducir a la expresión forzada pronunciada del factor de transcripción, mayor que la conseguida con ADN plasmídico. También hemos confirmado 20 que esta expresión forzada de un factor de transcripción induce cambios en los niveles de expresión de otros genes, indicando un claro efecto biológico. Además, este andamio tiene la ventaja de evitar problemas de seguridad, en particular evita vectores virales. The authors of the present invention have developed a biodegradable scaffold that is activated with mRNA sequences encoding transcription factors. This biodegradable scaffolding can lead to the pronounced forced expression of the transcription factor, greater than that achieved with plasmid DNA. We have also confirmed that this forced expression of a transcription factor induces changes in the expression levels of other genes, indicating a clear biological effect. In addition, this scaffolding has the advantage of avoiding security problems, in particular it avoids viral vectors.

Así, un aspecto de la invención se refiere a un andamio biodegradable que comprende un polímero biodegradable, un mRNA aislado que codifica para un factor de transcripción y 25 un agente de transfección. Thus, one aspect of the invention relates to a biodegradable scaffold comprising a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent.

Otro aspecto de la invención se refiere a un andamio biodegradable de la invención para uso como medicamento. En una realización particular, el andamio biodegradable de la invención es para uso en tejidos u órganos de terapia regenerativa, preferiblemente el tejido es cartílago, músculo o tejido nervioso. En otra realización particular, el andamio 30 biodegradable de la invención es para uso en el tratamiento de un defecto de cartílago, daño muscular o daño en el tejido nervioso. Another aspect of the invention relates to a biodegradable scaffold of the invention for use as a medicament. In a particular embodiment, the biodegradable scaffold of the invention is for use in tissues or organs of regenerative therapy, preferably the tissue is cartilage, muscle or nerve tissue. In another particular embodiment, the biodegradable scaffold of the invention is for use in the treatment of a cartilage defect, muscle damage or nerve tissue damage.

En otra realización particular, la invención se refiere al uso del andamio biodegradable de la invención para preparar un medicamento. En otra realización particular, la invención se refiere al uso del andamio biodegradable de la invención para preparar un medicamento para uso en tejidos u órganos en terapia regenerativa, preferiblemente el tejido es cartílago, músculo o tejido nervioso. En otra realización particular, la invención se refiere al uso de 5 del andamio biodegradable de la invención para preparar un medicamento para el uso en el tratamiento de un defecto de cartílago, daño muscular o daño del tejido nervioso. In another particular embodiment, the invention relates to the use of the biodegradable scaffold of the invention to prepare a medicament. In another particular embodiment, the invention relates to the use of the biodegradable scaffold of the invention to prepare a medicament for use in tissues or organs in regenerative therapy, preferably the tissue is cartilage, muscle or nerve tissue. In another particular embodiment, the invention relates to the use of the biodegradable scaffold of the invention to prepare a medicament for use in the treatment of a cartilage defect, muscle damage or nerve tissue damage.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el andamio biodegradable de la invención descrito previamente. Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the biodegradable scaffold of the invention described previously.

Un aspecto adicional de la invención se refiere a una composición cosmética que 10 comprende el andamio biodegradable de la invención descrito previamente. A further aspect of the invention relates to a cosmetic composition comprising the biodegradable scaffold of the invention described previously.

Un aspecto más de la invención se refiere a un método para preparar el andamio biodegradable descrito antes, que comprende A further aspect of the invention relates to a method for preparing the biodegradable scaffold described above, which comprises

(i) mezclar un polímero biodegradable, un mRNA aislado que codifica un factor de transcripción y un agente de transfección, opcionalmente adicionar células 15 seleccionadas del grupo que consiste en células primarias y líneas de células inmortalizadas, (i) mixing a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent, optionally adding cells selected from the group consisting of primary cells and immortalized cell lines,

(ii) incubar la mezcla preparada en (i), (ii) incubate the prepared mixture in (i),

(iii) inducir la coagulación de la mezcla preparada en (ii). (iii) induce coagulation of the mixture prepared in (ii).

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Descripción detallada de las figuras Detailed description of the figures

Figura 1: (A) Estructura del vector plásmidico usado para la transcripción in vitro del mRNA que codifica para la proteína fluorescente YFP. (B) Imagen de fluorescencia de las células U87MG, 24 h después de la transfección con mRNA codificante de YFP usando 25 lipofectamina 2000 (imagen de la derecha). El experimento se realizó en una placa de 24 pocillos. Como referencia se muestra una imagen de luz transmitida de las mismas células (imagen izquierda). Figure 1: (A) Structure of the plasmid vector used for in vitro transcription of the mRNA encoding the YFP fluorescent protein. (B) Fluorescence image of U87MG cells, 24 h after transfection with YFP-encoding mRNA using 25 lipofectamine 2000 (right image). The experiment was performed in a 24-well plate. A transmitted light image of the same cells is shown as a reference (left image).

Figura 2: (A) Un diagrama ilustrando los andamiajes, las células y el mRNA con un agente 30 de transfección se muestra en la Figura 2A. (B) Las imágenes de microscopía óptica de las células madre mesenquimales humanas cultivadas en andamiajes activados con complejos de 3DFectIN/mRNA. Los andamiajes se prepararon a dos concentraciones de fibrina (2 y 4 Figure 2: (A) A diagram illustrating scaffolds, cells and mRNA with a transfection agent 30 is shown in Figure 2A. (B) Optical microscopy images of human mesenchymal stem cells cultured in scaffolds activated with 3DFectIN / mRNA complexes. Scaffolds were prepared at two fibrin concentrations (2 and 4

mg/mL). (C) Imagen de fluorescencia de andamiajes activados con plásmido, en complejos 3DFectIN/pDNA. Tres proporciones 3DFectIN/pDNA fueron probadas: 2: 1, 3: 1 y 4: 1. El pDNA se marcó con SYBERGold para su observación por microscopía de fluorescencia. mg / mL) (C) Fluorescence image of plasmid activated scaffolds, in 3DFectIN / pDNA complexes. Three 3DFectIN / pDNA ratios were tested: 2: 1, 3: 1 and 4: 1. The pDNA was labeled with SYBERGold for observation by fluorescence microscopy.

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Figura 3: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de andamiajes de fibrina (2 mg/mL), tanto sin células (Control) o con células (Sembrado) y a diferentes aumentos. Las barras de escala se integran en cada imagen y se referencian en el lateral. Figure 3: Scanning electron microscopy images of fibrin scaffolds (2 mg / mL), both without cells (Control) or with cells (Sown) and at different magnifications. The scale bars are integrated into each image and referenced on the side.

Figura 4: Imágenes de microscopía electrónica de barrido de andamiajes de fibrina (4 10 mg/mL), tanto sin células (Control) o con células (Sembrado) y a diferentes aumentos. Las barras de escala se integran en cada imagen y se referencian en el lateral. Figure 4: Scanning electron microscopy images of fibrin scaffolds (4 10 mg / mL), both without cells (Control) or with cells (Sown) and at different magnifications. The scale bars are integrated into each image and referenced on the side.

Figura 5: Andamiajes biodegradables preparados a partir de alginato y poliarginina. A la izquierda, la imagen macroscópica de los geles formados en la parte inferior cónica de 15 tubos Eppendorf, manteniéndose en su posición tras la inversión del tubo. A la derecha, las imágenes de microscopía óptica de dos ejemplo representativos de estos andamiajes sembrados con células U87MG. Figure 5: Biodegradable scaffolds prepared from alginate and polyarginine. On the left, the macroscopic image of the gels formed in the conical lower part of 15 Eppendorf tubes, keeping in position after the inversion of the tube. On the right, the optical microscopy images of two representative examples of these scaffolds seeded with U87MG cells.

Figura 6: Transfección de células U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA 20 (2 μg mRNA, relación 3DFectIN/mRNA 4:1). Se utilizó un mRNA codificante de YFP. La transfección de las células se evaluó a las 24 h, 48 h, 72 h y a los 5 días. Cada panel muestra como referencia imágenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma área. Figure 6: Transfection of U87MG cells in fibrin scaffolds activated with mRNA 20 (2 μg mRNA, 3DFectIN / mRNA 4: 1 ratio). A YFP coding mRNA was used. The transfection of the cells was evaluated at 24 h, 48 h, 72 h and at 5 days. Each panel shows as reference images of transmitted light (left) and fluorescence (right) of the same area.

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Figura 7: Transfección de células U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA (1 μg de mRNA, relación 3DFectIN/mRNA 3:1). Se utilizó un mRNA codificante de YFP. La transfección de las células se evaluó a las 24 h, 48 h, 72 h y a los 5 días. Cada panel muestra como referencia imágenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma área. 30 Figure 7: Transfection of U87MG cells in fibrin scaffolds activated with mRNA (1 μg of mRNA, 3DFectIN / mRNA 3: 1 ratio). A YFP coding mRNA was used. The transfection of the cells was evaluated at 24 h, 48 h, 72 h and at 5 days. Each panel shows as reference images of transmitted light (left) and fluorescence (right) of the same area. 30

Figura 8: Transfección de células U87MG en andamiajes de fibrina activados con mRNA (1 μg de ARNm, relación 3DFectIN/mRNA 2:1). Se utilizó un mRNA codificante de YFP. Figure 8: Transfection of U87MG cells in fibrin scaffolds activated with mRNA (1 µg of mRNA, 3DFectIN / mRNA 2: 1 ratio). A YFP coding mRNA was used.

La transfección de las células se evaluó a las 24 h, 48 h y a los 5 días. Cada panel muestra como referencia imágenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma área. The transfection of the cells was evaluated at 24 h, 48 h and at 5 days. Each panel shows as reference images of transmitted light (left) and fluorescence (right) of the same area.

Figura 9: Transfección de células U87MG en andamiajes de fibrina activados con pDNA 5 (1 μg pDNA, relación 3DFectIN/pDNA 3:1). Se utilizó un pDNA codificante de YFP. La transfección de las células se evaluó a las 48 h y a los 5 días. Cada panel muestra como referencia imágenes de luz transmitida (izquierda) y de fluorescencia (derecha) de la misma área. Figure 9: Transfection of U87MG cells in fibrin scaffolds activated with pDNA 5 (1 μg pDNA, 3DFectIN / pDNA 3: 1 ratio). A YFP coding pDNA was used. The transfection of the cells was evaluated at 48 h and at 5 days. Each panel shows as reference images of transmitted light (left) and fluorescence (right) of the same area.

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Figura 10: Estudio de citotoxicidad con células U87MG cultivadas en andamiajes de fibrina (4 mg/mL de fibrina) activados con complejos 3DFectIN/mRNA en relaciones 2: 1 y 3: 1. Andamiajes no activados fueron utilizados como control (etiquetado "C" en la figura). La citotoxicidad de los andamiajes se midió mediante un ensayo de MTT a las 24 h (A) y 48 h (B). (C) La capacidad de los andamiajes de fibrina activados con 15 3DFectin/mRNA para soportar la proliferación celular se confirmó mediante la cuantificación de la cantidad de DNA en el cultivo a las 0, 3 y 7, medido mediante un ensayo de PicoGreen. Figure 10: Cytotoxicity study with U87MG cells cultured in fibrin scaffolds (4 mg / mL fibrin) activated with 3DFectIN / mRNA complexes in 2: 1 and 3: 1 ratios. Non-activated scaffolds were used as control (labeled "C" in the figure). The cytotoxicity of the scaffolds was measured by an MTT test at 24 h (A) and 48 h (B). (C) The ability of fibrin scaffolds activated with 3DFectin / mRNA to support cell proliferation was confirmed by quantifying the amount of DNA in the culture at 0, 3 and 7, measured by a PicoGreen assay.

Figura 11: (A) Transfección de células madre mesenquimales humanas (hMSCs) en los 20 andamiajes de fibrina activados con complejos de mRNA a las 24 h (1 μg de mRNA, relación de 3DFectIN/mRNA 3: 1). Se utilizó mRNA codificante de YFP. La transfección de las células se evaluó en andamiajes preparados a partir de soluciones de fibrina de 2 y 4 mg/mL. Cada panel muestra la imagen de fluorescencia a la izquierda, y como referencia, la imagen de luz trasmitida de la misma zona a la derecha. (B) Estudio de la citotoxicidad 25 de hMSC cultivadas en andamiajes de fibrina (2 o 4 mg / ml de fibrina) activados con mRNA (relación 3DFectIN/mRNA 3:1). Andamiajes no activados se utilizaron como control (etiquetado "C" en la figura). La citotoxicidad de los andamiajes se midió mediante un ensayo de MTT a las 24 h y 48 h. (C) La capacidad de los andamiajes activados con mRNA (2 y 4 mg / ml de fibrina) para soportar la proliferación celular se confirmó 30 mediante la cuantificación de la masa de ADN en el cultivo a 0, 3, 7 y 10 semanas, medido mediante un ensayo PicoGreen. En cada gráfico, la proliferación en el andamiaje activado Figure 11: (A) Transfection of human mesenchymal stem cells (hMSCs) in the 20 fibrin scaffolds activated with mRNA complexes at 24 h (1 μg of mRNA, 3DFectIN / mRNA 3: 1 ratio). YFP coding mRNA was used. Cell transfection was evaluated in scaffolds prepared from fibrin solutions of 2 and 4 mg / mL. Each panel shows the fluorescence image on the left, and as a reference, the transmitted light image of the same area on the right. (B) Study of the cytotoxicity 25 of hMSC cultured in fibrin scaffolds (2 or 4 mg / ml fibrin) activated with mRNA (3DFectIN / mRNA 3: 1 ratio). Scaffolds not activated were used as control (labeled "C" in the figure). The cytotoxicity of the scaffolds was measured by an MTT test at 24 h and 48 h. (C) The ability of mRNA activated scaffolds (2 and 4 mg / ml fibrin) to support cell proliferation was confirmed by quantifying the mass of DNA in the culture at 0, 3, 7 and 10 weeks, measured by a PicoGreen test. In each graph, proliferation in activated scaffolding

con mRNA ("Tratamiento") se compara con los mismos andamiajes sin complejos 3DFectIN/mRNA ("Control"). With mRNA ("Treatment") it is compared with the same scaffolds without 3DFectIN / mRNA ("Control") complexes.

Figura 12: (A) Estructura del vector plasmídico usado para la transcripción in vitro de mRNA codificante del factor de transcripción SOX9. (B) Después de la transfección de 5 células HEK293 con este mRNA y con lipofectamina, la expresión de SOX9 fue evaluada por mediante extracción de las proteínas a las 12 y 24 h y la realización de un western blot. Células no transfectadas se utilizaron como control negativo (C-). Las células transfectadas con pDNA codificante de SOX9 se utilizaron como control positivo (C+). La proteína α-tubulina se utilizó como referencia en el western blot. 10 Figure 12: (A) Structure of the plasmid vector used for in vitro transcription of mRNA encoding the transcription factor SOX9. (B) After transfection of 5 HEK293 cells with this mRNA and with lipofectamine, the expression of SOX9 was evaluated by extracting the proteins at 12 and 24 h and performing a western blot. Untransfected cells were used as a negative control (C-). Cells transfected with pDNA encoding SOX9 were used as a positive control (C +). The α-tubulin protein was used as a reference in the western blot. 10

Figura 13: (A) Expresión relativa de Sox9 24 h después de la transfección de la línea celular U87MG en un andamiaje de fibrina (4 mg/mL) activado con mRNA o pDNA (1 μg, relación de 3DFectIN/mRNA y 3DFectIN/pDNA de 2:1 y 3:1). Se utilizó un mRNA codificante de Sox9. La expresión relativa de Sox9 se cuantificó por análisis de RT-PCR 15 cuantitativo (qRT-PCR) de células transfectadas con respecto a los genes de referencia GAPDH yβ-actina. (B) Una réplica del experimento anterior de expresión de Sox9 a las 24 h post-transfección en U87MG, pero focalizado en los andamiajes de fibrina activados con mRNA o pDNA (1 μg) con proporción 3:1. (C) El mismo estudio comparativo del panel (B), pero realizado en células madre mesenquimales humanas. 20 Figure 13: (A) Relative expression of Sox9 24 h after transfection of the U87MG cell line in a fibrin scaffold (4 mg / mL) activated with mRNA or pDNA (1 μg, 3DFectIN / mRNA and 3DFectIN / pDNA ratio 2: 1 and 3: 1). An mRNA encoding Sox9 was used. The relative expression of Sox9 was quantified by quantitative RT-PCR (qRT-PCR) analysis of transfected cells with respect to the GAPDH and β-actin reference genes. (B) A replica of the previous experiment of Sox9 expression at 24 h post-transfection in U87MG, but focused on fibrin scaffolds activated with mRNA or pDNA (1 μg) with a 3: 1 ratio. (C) The same comparative study of panel (B), but performed on human mesenchymal stem cells. twenty

Figura 14: Cinética de expresión de mRNA de Sox9 tras la transfección de hMSCs en andamiajes de fibrina de (A) 2 mg/mL y (B) 4 mg/mL. Los andamiajes fueron activados con 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/pDNA (1 μg, proporción 3:1). Se utilizó un mRNA codificante de Sox9. La expresión génica se midió después de 12, 24 y 48 h. 25 Figure 14: Expression kinetics of Sox9 mRNA after transfection of hMSCs in fibrin scaffolds of (A) 2 mg / mL and (B) 4 mg / mL. The scaffolds were activated with 3DFectIN / mRNA or 3DFectIN / pDNA (1 μg, 3: 1 ratio). An mRNA encoding Sox9 was used. Gene expression was measured after 12, 24 and 48 h. 25

Figura 15: Expresión génica relativa de marcadores de diferenciación condrogénica en hMSC transfectadas en andamiajes de fibirina (4 mg/mL) activados con mRNA o pDNA, o no activados (“C”). Los andamiajes se cultivaron durante 21 días en medio condrogénico incompleto (ICM) o medio condrogénico completo (CCM). La expresión 30 génica relativa de los marcadores (A) Sox9 (A) y (B) agrecano (ACAN) fue medida en estas condiciones tras los 21 días de cultivo. Figure 15: Relative gene expression of chondrogenic differentiation markers in hMSC transfected into fibrine scaffolds (4 mg / mL) activated with mRNA or pDNA, or not activated ("C"). The scaffolds were grown for 21 days in incomplete chondrogenic medium (ICM) or complete chondrogenic medium (CCM). The relative gene expression of the markers (A) Sox9 (A) and (B) aggrecan (ACAN) was measured under these conditions after 21 days of culture.

Figura 16: Expresión génica relativa de los marcadores de diferenciación condrogénica en hMSC transfectadas en andamiajes de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/ mL) activados con mRNA, pDNA o no activados (“C”). Los andamiajes fueron cultivados por 28 días en medio condrogénico incompleto (ICM) o medio condrogénico completo (CCM). La expresión génica relativa de los marcadores (A) Sox9 (A) y (B) agrecano (ACAN) fue 5 medida en estas condiciones tras los 28 días de cultivo. Figure 16: Relative gene expression of chondrogenic differentiation markers in hMSC transfected into fibrin scaffolds (2 mg / mL and 4 mg / mL) activated with mRNA, pDNA or not activated ("C"). The scaffolds were grown for 28 days in incomplete chondrogenic medium (ICM) or complete chondrogenic medium (CCM). The relative gene expression of the markers (A) Sox9 (A) and (B) aggrecan (ACAN) was measured under these conditions after 28 days of culture.

Detailed description of the invention

En un aspecto, la invención se refiere a un andamio biodegradable que comprende un polímero biodegradable, un mRNA aislado que codifica un factor de transcripción y un 10 agente de transfección. In one aspect, the invention relates to a biodegradable scaffold comprising a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent.

Los andamios de la invención tienen la ventaja de que son biocompatibles y no ejercen importante toxicidad a células residentes (ejemplo 4 y figura 10). Además, los andamios de la invención pueden soportar proliferación celular (ejemplo 4) y pueden conducir a elevados niveles de expresión forzada de los factores de transcripción por las células 15 (ejemplo 7, figura 13); incluso la transfección fue efectiva en células mesenquimales humanas (ejemplo 5 y figura 11). The scaffolds of the invention have the advantage that they are biocompatible and do not exert significant toxicity to resident cells (example 4 and figure 10). In addition, the scaffolds of the invention can support cell proliferation (example 4) and can lead to high levels of forced expression of transcription factors by cells 15 (example 7, figure 13); even transfection was effective in human mesenchymal cells (example 5 and figure 11).

Los andamios de la invención activados con mRNA codificando SOX9 son capaces de conseguir la transfección en un entorno tridimensional, y lograr una expresión significativa de SOX9 en U87MG y también en células humanas mesenquimales (hMSCs). Esta 20 expresión es mucho más elevada que la obtenida cuando se empleó un ADN plasmídico (pDNA) (ejemplo 6, figuras 13A y 13C). The scaffolds of the invention activated with mRNA encoding SOX9 are capable of achieving transfection in a three-dimensional environment, and achieving significant expression of SOX9 in U87MG and also in human mesenchymal cells (hMSCs). This expression is much higher than that obtained when a plasmid DNA (pDNA) was used (example 6, Figures 13A and 13C).

Además, hemos confirmado que los andamios de la invención activados con mRNA pueden modificar el perfil de expresión génico de las células residentes, conduciendo per se a la diferenciación de hMSCs hacia un linaje condrogénico (ejemplos 8 y 9). 25 In addition, we have confirmed that mRNA-activated scaffolds of the invention can modify the gene expression profile of resident cells, leading per se to the differentiation of hMSCs into a chondrogenic lineage (examples 8 and 9). 25

“Andamio” significa una estructura temporal usada para sostener células en tres dimensiones, mientras reconstruyen un tejido u órgano o realizan otras funciones biológicas. Andamios de tejidos están ampliamente descritos en la bibliografía, y pueden tener dos posibles estructuras, o estructuras intermedias entre extremos: (i) una estructura sólida en forma de matriz que tiene poros interconectados suficientemente grandes (>50 30 μm) para permitir penetración celular y hospedaje o (ii) una estructura de hidrogel donde las células pueden ser encapsuladas. Los andamios de la invención son biodegradables y así adecuados para ser reemplazados por tejido natural. "Scaffolding" means a temporary structure used to support cells in three dimensions, while reconstructing a tissue or organ or performing other biological functions. Tissue scaffolds are widely described in the literature, and can have two possible structures, or intermediate structures between ends: (i) a solid matrix-shaped structure that has interconnected pores large enough (> 50 30 μm) to allow cell penetration and lodging or (ii) a hydrogel structure where cells can be encapsulated. The scaffolds of the invention are biodegradable and thus suitable to be replaced by natural tissue.

El término “biocompatibilidad” se entiende que se refiere a la capacidad de un material para llevar a cabo con una apropiada respuesta en su hospedador en una situación específica. Para que se considere biocompatible, un dispositivo debería de cumplir con ISO 10993 o un standard similar, y ser testado en animales y en ensayos clínicos. The term "biocompatibility" is understood to refer to the ability of a material to perform with an appropriate response in its host in a specific situation. To be considered biocompatible, a device should comply with ISO 10993 or a similar standard, and be tested in animals and in clinical trials.

Los materiales que son susceptibles para la preparación de los andamios de la invención, 5 que son biocompatibles y biodegradables y están bien descritos en la bibliografía, se pueden clasificar en materiales inorgánicos, polímeros degradables enzimáticamente y polímeros degradables hidrolíticamente. Ejemplos de materiales inorgánicos biodegradables son, pero no se limitan a, materiales cerámicos tales como apatitas, por ejemplo de hidroxiapatita, y el silicio poroso. Preferiblemente, el material utilizado debe 10 estar libre de residuos de patógenos de origen animal o humano. Materials that are susceptible to the preparation of the scaffolds of the invention, which are biocompatible and biodegradable and are well described in the literature, can be classified into inorganic materials, enzymatically degradable polymers and hydrolytically degradable polymers. Examples of biodegradable inorganic materials are, but are not limited to, ceramic materials such as apatites, for example hydroxyapatite, and porous silicon. Preferably, the material used should be free of residues of pathogens of animal or human origin.

“Biodegradable” en relación a la presente invención significa que el material es completamente reabsorbido cuando está en el entorno de un organismo después de 24 horas. "Biodegradable" in relation to the present invention means that the material is completely reabsorbed when it is in the environment of an organism after 24 hours.

“Polímero biodegradable” significa un polímero que se reabsorbe completamente tras la 15 implantación después de 24 horas, y que es adecuado para acomodar o para el crecimiento de células. Preferiblemente, el polímero biodegradable está libre de materiales patogénicos y/o no deriva de muestras patogénicas. Los polímeros biodegradables en esta invención pueden ser polímeros degradables enzimáticamente y polímeros degradables hidrolíticamente. Polímeros degradables enzimáticamente como se entiende en la presente 20 invención son, por ejemplo, colágeno, elastina, péptidos tipo-elastina, albúmina, fibrina, fibroína de seda, quitosano, alginato, ácido hialurónico y sulfato de condroitina. Polímeros degradables hidrolíticamente como se entiende en la presente invención son, por ejemplo poliésteres, poliuretanos, poli(éster amida), poli(orto ésteres), polianhídridos, poli(anhidro-co-imida), polianhídridos entrecruzados, poli(propilenfumarato), poli(pseudoaminoácidos), 25 poli(alquil cianocrilatos), polifosfacenos, polifosfoésteres. Ejemplos de poliésteres útiles comprenden, pero no están limitados a, poliglicólico, poliláctico, poli(láctico-co-glicólico), polidioxanona, policaprolactona y poli(trimetilen carbonato). "Biodegradable polymer" means a polymer that is completely reabsorbed after implantation after 24 hours, and which is suitable for accommodating or for cell growth. Preferably, the biodegradable polymer is free of pathogenic materials and / or not derived from pathogenic samples. The biodegradable polymers in this invention can be enzymatically degradable polymers and hydrolytically degradable polymers. Enzymatically degradable polymers as understood in the present invention are, for example, collagen, elastin, elastin-like peptides, albumin, fibrin, silk fibroin, chitosan, alginate, hyaluronic acid and chondroitin sulfate. Hydrolytically degradable polymers as understood in the present invention are, for example, polyesters, polyurethanes, poly (ester amides), poly (ortho esters), polyanhydrides, poly (anhydro-co-imide), crosslinked polyanhydrides, poly (propylene fumarate), poly (pseudoamino acids), poly (alkyl cyanoacrylates), polyphosphazenes, polyphosphoesters. Examples of useful polyesters include, but are not limited to, polyglycolic, polylactic, poly (lactic-co-glycolic), polydioxanone, polycaprolactone and poly (trimethylene carbonate).

En una realización preferida de la invención el polímero biodegradable se selecciona de fibrina, alginato y mezclas de los mismos. 30 In a preferred embodiment of the invention the biodegradable polymer is selected from fibrin, alginate and mixtures thereof. 30

“mRNA aislado” se entiende como una molécula polimérica hecha de ácidos nucleicos capaces de ser traducido en los ribosomas a una secuencia específica de aminoácidos, y por lo tanto, para expresar una o más proteínas, que ha sido aislado por procedimientos "Isolated mRNA" is understood as a polymeric molecule made of nucleic acids capable of being translated in ribosomes to a specific amino acid sequence, and therefore, to express one or more proteins, which has been isolated by procedures.

técnicos de un medio biológico o se ha sintetizado anteriormente para ser utilizado en el andamio de la presente invención. Este término también incluye mRNA que puede estar modificado químicamente. Algunos ejemplos de modificaciones químicas de ácidos nucleicos de ARNm, pero no limitado, son: 5-metil-citidina, 2-tio-uridina, 5-methoxyuridine, N-1-metilpseudo-uridina y pseudo-uridina. 5 Technicians of a biological medium or have been previously synthesized to be used in the scaffolding of the present invention. This term also includes mRNA that can be chemically modified. Some examples of chemical modifications of mRNA nucleic acids, but not limited, are: 5-methyl-cytidine, 2-thio-uridine, 5-methoxyuridine, N-1-methylpseudo-uridine and pseudo-uridine. 5

El término “ARN mensajero” (“mRNA) se entiende como una molécula polimérica hecha de ácidos nucleicos capaces de ser traducido en los ribosomas a una secuencia específica de aminoácidos, y por lo tanto, para expresar una o más proteínas. En el contexto de esta invención, el mRNA está codificando al menos para un factor de transcripción (TF). Preferiblemente, el mRNA empleado en esta invención está optimizado para la traducción 10 en células eucariotas. Preferiblemente, el mRNA empleado en esta invención se sintetiza para un propósito específico y con secuencias específicas. Por lo tanto, conjuntos de mRNA extraídos de organismos vivos naturales, no manipulados o partes de ellos no son preferidos para la presente invención. The term "messenger RNA" ("mRNA) is understood as a polymeric molecule made of nucleic acids capable of being translated in ribosomes into a specific amino acid sequence, and therefore, to express one or more proteins. In the context of this invention, the mRNA is encoding at least one transcription factor (TF). Preferably, the mRNA employed in this invention is optimized for translation in eukaryotic cells. Preferably, the mRNA employed in this invention is synthesized for a specific purpose and with specific sequences. Therefore, sets of mRNA extracted from natural, non-manipulated living organisms or parts thereof are not preferred for the present invention.

Aunque no se limita a estos procedimientos, el mRNA de la invención preferentemente se 15 sintetiza mediante reacciones de transcripción in vitro, a partir de un molde de plásmido, o alternativamente, mediante síntesis química en fase sólida. Although not limited to these procedures, the mRNA of the invention is preferably synthesized by in vitro transcription reactions, from a plasmid template, or alternatively, by solid phase chemical synthesis.

Aunque no se limita a las estructuras descritas a continuación, la eficacia de la invención se beneficia de la utilización de mRNA con alta traducibilidad. Las características estructurales del mRNA como un 5’ Cap, una cola 3’ poliadenina son algunas de las más 20 importantes para asegurar la elevada capacidad de traducción. Además, un tramo corto 3' de oligouridina también es potencialmente útil. Otras estructuras que podrían mejorar la traducción del mRNA son regiones no traducidas, que podrían estar situadas en el 5' y / o en el extremo 3' en relación con la región de codificación. Although not limited to the structures described below, the effectiveness of the invention benefits from the use of mRNA with high translatability. The structural characteristics of mRNA such as a 5 ’Cap, a 3’ polyadenin tail are some of the 20 most important to ensure high translation capacity. In addition, a short 3 'section of oligouridine is also potentially useful. Other structures that could improve mRNA translation are untranslated regions, which could be located at 5 'and / or at the 3' end in relation to the coding region.

Por lo tanto, una realización particular de la invención está dirigida a un mRNA que tiene 25 un 5'-Cap. Otra realización particular se refiere a un mRNA que tiene una cola poliadenina. Otra realización particular de la invención está dirigida a un mRNA que tiene una región no traducida 5'. Y otra realización particular se refiere a un mRNA que tiene una región no traducida 3'. Therefore, a particular embodiment of the invention is directed to an mRNA having a 5'-Cap. Another particular embodiment relates to an mRNA having a polyadenine tail. Another particular embodiment of the invention is directed to an mRNA having a 5 'untranslated region. And another particular embodiment refers to an mRNA having a 3 'untranslated region.

Las secuencias de mRNA pueden generar inmunidad celular, así, para la presente 30 invención es preferido que algunos de los ácidos nucleicos estén modificados químicamente para reducir su reconocimiento inmune. Una realización particular de la invención se dirige a un mRNA que tiene ácidos nucleicos químicamente modificados The mRNA sequences can generate cellular immunity, thus, for the present invention it is preferred that some of the nucleic acids be chemically modified to reduce their immune recognition. A particular embodiment of the invention is directed to an mRNA having chemically modified nucleic acids.

seleccionados de la lista que consiste en 5-metil-citidina, 2-tio-uridina, 5-metoxiuridina, N1-metilpseudo-uridina y pseudo-uridina. selected from the list consisting of 5-methyl-citidine, 2-thio-uridine, 5-methoxyuridine, N1-methylpseudo-uridine and pseudo-uridine.

El término "factor de transcripción" ("TF") significa una proteína que se une a secuencias específicas de DNA, controlando de este modo la tasa de transcripción de la información genética del DNA al mRNA. A veces los TFs también se llaman "trans-activadores" en 5 bibliografía, siendo ambos términos sinónimos. Los TFs para la presente invención preferiblemente tienen uno o más dominios de unión al DNA. Los TFs han sido clasificados por su superclase en: (1) dominios básicos, (2) dominios de unión al DNA zinc-coordinados, (3) hélice-giro-hélice, (4) factores con estructura beta y contactos en la hendidura menor, (5) otros factores de transcripción. Varias revisiones de la función y la 10 estructura de TF están disponibles en la literatura (Latchman, 1997, Int J Biochem Cell Biol 29, 1305–1312). The term "transcription factor" ("TF") means a protein that binds to specific DNA sequences, thereby controlling the rate of transcription of genetic information from DNA to mRNA. Sometimes TFs are also called "trans-activators" in 5 bibliography, both terms being synonyms. The TFs for the present invention preferably have one or more DNA binding domains. TFs have been classified by their superclass into: (1) basic domains, (2) zinc-coordinated DNA binding domains, (3) helix-spin-helix, (4) beta structure factors and minor cleft contacts , (5) other transcription factors. Several reviews of the function and structure of TF are available in the literature (Latchman, 1997, Int J Biochem Cell Biol 29, 1305-1312).

La base de datos de descriptores Medical Subject Headings (MeSH) identifica TFs mediante los tres números D12.776.930. Hay varias bases de datos de TF disponibles para buscar secuencias y funciones de TFs, por ejemplo, JASPAR (
http://jaspar.genereg.net). 15 The Medical Subject Headings (MeSH) descriptor database identifies TFs through the three numbers D12.776.930. There are several TF databases available to search for TF sequences and functions, for example, JASPAR (
http://jaspar.genereg.net). fifteen

En una realización preferida de la invención, el mRNA codifica para un factor de transcripción condrogénico. In a preferred embodiment of the invention, the mRNA encodes a chondrogenic transcription factor.

En una realización preferida de la invención, los TFs codificados activan programas genéticos responsables de la diferenciación celular o desdiferenciación. En una realización preferida de la invención, el mRNA codifica para un factor de transcripción seleccionado 20 del grupo que consiste en SOX9, MyoD, NeuroD1, c-Myc, Klf4, Nanog, Oct4, SOX2, C/EBP-β, PPAR-γ, Brn2, Lmx1a, Nurr1, Mash1, Myt1l y NeuroG2. En una realización más preferida de la invención, el mRNA codifica para los factores de transcripción seleccionado de SOX9, MyoD, NeuroD1, SOX2, Oct4, Klf4 y c-Myc. En una realización más preferida de la invención, el TF es SOX9. 25 In a preferred embodiment of the invention, the encoded TFs activate genetic programs responsible for cell differentiation or dedifferentiation. In a preferred embodiment of the invention, the mRNA encodes a transcription factor selected from the group consisting of SOX9, MyoD, NeuroD1, c-Myc, Klf4, Nanog, Oct4, SOX2, C / EBP-β, PPAR-γ , Brn2, Lmx1a, Nurr1, Mash1, Myt1l and NeuroG2. In a more preferred embodiment of the invention, the mRNA encodes for the transcription factors selected from SOX9, MyoD, NeuroD1, SOX2, Oct4, Klf4 and c-Myc. In a more preferred embodiment of the invention, the TF is SOX9. 25

El término “agente de transfección” se entiende como un compuesto capaz de mejorar la cesión de la secuencia de ARN mensajero (mRNA) al citoplasma. Así, la presencia de un agente de transfección se evidencia por un incremento marcado de la expresión de proteína. El agente de transfección, también llamado sistema de cesión de genes, vehículo de cesión de genes, o matrices activadas de genes, han sido descritos en muchas 30 publicaciones (Borrajo, 2015, In: Polymers in Regenerative Medicine, 285-336). The term "transfection agent" is understood as a compound capable of improving the cession of the messenger RNA sequence (mRNA) to the cytoplasm. Thus, the presence of a transfection agent is evidenced by a marked increase in protein expression. The transfection agent, also called the gene transfer system, gene transfer vehicle, or activated gene matrices, has been described in many 30 publications (Borrajo, 2015, In: Polymers in Regenerative Medicine, 285-336).

Los agentes de transfección pueden estar hechos de materiales inorgánicos, materiales lipídicos y materiales poliméricos. Aunque no está limitado a estos, una posible lista de Transfection agents can be made of inorganic materials, lipid materials and polymeric materials. Although not limited to these, a possible list of

agentes de transfección inorgánicos son sales de fosfato cálcico y nanopartículas de silicio catiónicas. Inorganic transfection agents are calcium phosphate salts and cationic silicon nanoparticles.

Agentes de transfección lipídicos se pueden clasificar en lípidos condensantes y no condensantes, siendo los condensantes frecuentemente denominados lipoplejos. Los lípidos no condensantes son emulsiones, nanoemulsiones y liposomas que pueden 5 encapsular el material genético. Los lipoplejos se forman mediante lípidos con una cadena alifática y uno o varios grupos catiónicos. Aunque no está necesariamente limitado a estos, a menudo estos grupos catiónicos son aminas primarias, secundarias o terciarias, o estructuras con una mezcla de estas. La carga neta de los lípidos en los lipoplexos deberían de ser positivos a pH fisiológico, como medida de du potencial zeta, y deberían de ser 10 capaces de unirse a material genético mediante fuerzas electrostáticas. Lipid transfection agents can be classified into condensing and non-condensing lipids, the condensers being often referred to as lipoplexes. Non-condensing lipids are emulsions, nanoemulsions and liposomes that can encapsulate the genetic material. Lipoplejos are formed by lipids with an aliphatic chain and one or more cationic groups. Although not necessarily limited to these, these cationic groups are often primary, secondary or tertiary amines, or structures with a mixture of these. The net lipid charge in lipoplexes should be positive at physiological pH, as a measure of du zeta potential, and should be able to bind to genetic material by electrostatic forces.

Agentes de transfección poliméricos también se pueden clasificar como condensantes y no condensantes. Los no condensantes generalmente se unen a material genético mediante alguna técnica de encapsulación o a través de fuerzas débiles. Polymeric transfection agents can also be classified as condensing and non-condensing. Non-condensing generally binds to genetic material through some encapsulation technique or through weak forces.

Los vehículos poliméricos condensantes están formados por polímeros que muestran una 15 carga neta positiva a pH fisiológico, como medida del potencial zeta, y que se pueden unir al material genético, mediante fuerzas electrostáticas. The condensing polymeric vehicles are formed by polymers that show a positive net charge at physiological pH, as a measure of zeta potential, and that can be attached to the genetic material, by electrostatic forces.

En una realización preferida de la invención, el agente de transfección se selecciona de entre lípidos catiónicos, polímeros catiónicos, y una sal de fosfato cálcico. In a preferred embodiment of the invention, the transfection agent is selected from cationic lipids, cationic polymers, and a calcium phosphate salt.

En una realización preferida de la invención, el agente de transfección. En una realización 20 preferida de la invención, el agente de transfección es un agente condensante lipídico. En una realización más preferida de la invención, el agente condensante lipídico es Lipofectamina o 3DFectin. In a preferred embodiment of the invention, the transfection agent. In a preferred embodiment of the invention, the transfection agent is a lipid condensing agent. In a more preferred embodiment of the invention, the lipid condensing agent is Lipofectamine or 3DFectin.

En una realización preferida de la invención, el agente de transfección es un agente condensante polimérico. En una realización más preferida de esta invención, el agente 25 polimérico condensante es poliarginina. En otra realización más preferida de la invención, el agente polimérico condenstante es poloxamina. En otra realización más preferida de la invención, agente polimérico condensante es un polifosfaceno catiónico. In a preferred embodiment of the invention, the transfection agent is a polymeric condensing agent. In a more preferred embodiment of this invention, the condensing polymeric agent is polyarginine. In another more preferred embodiment of the invention, the condensing polymeric agent is poloxamine. In another more preferred embodiment of the invention, condensing polymeric agent is a cationic polyphosphazene.

En una realización particular de la invención, el anadamio biodegradable comprende además células. Aunque una variedad de células se podría beneficiar de la capacidad de 30 esta invención para ejercer control sobre sus funciones, las células primarias son de primer interés. Entre ellas, células progenitoras con alta plasticidad tales como células madre adultas y células madre pluripotentes inducidas podrían ser los mejores candidatos para ser In a particular embodiment of the invention, the biodegradable anadamium further comprises cells. Although a variety of cells could benefit from the ability of this invention to exert control over their functions, primary cells are of first interest. Among them, progenitor cells with high plasticity such as adult stem cells and induced pluripotent stem cells could be the best candidates to be

incluidos a esta invención. Estas células tienen la capacidad de proliferar y pueden recapitular diferentes vías de diferenciación. Las células incorporadas al andamiaje de la invención, pueden proliferar y formar estructuras biológicas en forma 3D incluyendo tejidos en estos andamios. included to this invention. These cells have the ability to proliferate and can recapitulate different differentiation pathways. The cells incorporated into the scaffolding of the invention can proliferate and form biological structures in 3D form including tissues in these scaffolds.

En una realización particular, las células se seleccionan del grupo que consiste en células 5 primarias y líneas celulares inmortalizadas. En una realización particular, las células no son células madre embrionarias. En una realización preferida, el andamio de la invención es clínicamente útil ya que es biodegradable y biocompatible. In a particular embodiment, the cells are selected from the group consisting of primary cells and immortalized cell lines. In a particular embodiment, the cells are not embryonic stem cells. In a preferred embodiment, the scaffold of the invention is clinically useful since it is biodegradable and biocompatible.

En una realización más preferida de la invención, las células primarias son células progenitoras. En una realización más preferida de la invención, las células primarias son 10 células madre adultas o células madre pluripotentes inducidas. En una realización preferida de la invención, las células madre adultas son células madre mesenquimales. In a more preferred embodiment of the invention, the primary cells are progenitor cells. In a more preferred embodiment of the invention, the primary cells are adult stem cells or induced pluripotent stem cells. In a preferred embodiment of the invention, adult stem cells are mesenchymal stem cells.

En otra realización preferida de la invención, las células primarias son fibroblastos o condrocitos. In another preferred embodiment of the invention, the primary cells are fibroblasts or chondrocytes.

En otra realización, la invención se dirige a una composición farmacéutica que comprende 15 un andamio como se describe arriba. In another embodiment, the invention is directed to a pharmaceutical composition comprising a scaffold as described above.

En una realización particular, la composición farmacéutica comprende además vehículos farmacéuticamente aceptables. In a particular embodiment, the pharmaceutical composition further comprises pharmaceutically acceptable carriers.

En otra realización particular, la composición farmacéutica comprende además al menos un ingrediente farmacéutico activo adicional. Así, otros fármacos o compuestos se pueden 20 incorporar a las composiciones para mejorar su actuación o mejorar su presentación para el uso final. En una realización preferida, el ingrediente activo adicional se selecciona de fármacos, como por ejemplo antibióticos, inmunosupresores, anti-inflamatorios, de biológicos como por ejemplo factores de crecimiento, citoquinas, morfógenos, proteínas, polisacáridos de la matriz extracelular; de compuestos para modificar las propiedades 25 mecánicas y de gelificación de los andamios como por ejemplo agentes de entrecruzamiento adicionales. In another particular embodiment, the pharmaceutical composition further comprises at least one additional active pharmaceutical ingredient. Thus, other drugs or compounds can be incorporated into the compositions to improve their performance or improve their presentation for final use. In a preferred embodiment, the additional active ingredient is selected from drugs, such as antibiotics, immunosuppressants, anti-inflammatories, biologics such as growth factors, cytokines, morphogens, proteins, extracellular matrix polysaccharides; of compounds for modifying the mechanical and gelling properties of scaffolds such as additional crosslinking agents.

En otra realización particular, la composición farmacéutica es una solución inyectable, suspensión, hidrogel o una matriz porosa sólida. In another particular embodiment, the pharmaceutical composition is an injectable solution, suspension, hydrogel or a solid porous matrix.

En otra realización particular, la composición farmacéutica es para uso como vacuna. 30 In another particular embodiment, the pharmaceutical composition is for use as a vaccine. 30

En otra realización particular, la invención se refiere a un método para preparar el andamio de la invención como se describe arriba, que comprende: In another particular embodiment, the invention relates to a method for preparing the scaffolding of the invention as described above, comprising:

(i) Mezclar un polímero biodegradable, un mRNA aislado que codifica para un factor de transcripción y un agente de transfección, y opcionalmente células seleccionadas de entre el grupo que consiste en células primarias y líneas celulares inmortalizadas, (i) Mixing a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent, and optionally selected cells from the group consisting of primary cells and immortalized cell lines,

(ii) Incubar la mezcla preparada en (i), 5 (ii) Incubate the prepared mixture in (i), 5

En otra realización particular, la invención se refiere a un método alternativo para preparar el andamio de la invención como se describe arriba, que comprende: In another particular embodiment, the invention relates to an alternative method for preparing the scaffold of the invention as described above, comprising:

(i) Preparar un andamio, (i) Prepare a scaffold,

(ii) Mezclar un mRNA aislado que codifica para un agente de transcripción y 10 un agente de transfección, (ii) Mix an isolated mRNA encoding a transcription agent and a transfection agent,

(iii) Incubar la mezcla preparada en (ii) sobre el andamio preparado en (i), y opcionalmente añadir células. (iii) Incubate the mixture prepared in (ii) on the scaffold prepared in (i), and optionally add cells.

En una realización particular, el polímero biodegradable se selecciona de fibrina, alginato y mezclas de los mismos. En una realización preferida, la concentración de fibrina es de 15 entre 1 mg/mL y 5 mg/mL. En una realización más preferida, la concentración de fibrina es de entre 2 mg/mL y 4 mg/mL. In a particular embodiment, the biodegradable polymer is selected from fibrin, alginate and mixtures thereof. In a preferred embodiment, the fibrin concentration is between 1 mg / mL and 5 mg / mL. In a more preferred embodiment, the fibrin concentration is between 2 mg / mL and 4 mg / mL.

En una realización particular, la coagulación de la etapa (iii), se lleva a cabo mediante la adición de un agente de coagulación. En una realización preferida, el agente de coagulación se selecciona de trombina, sal cálcica y sal de polifosfato. 20 In a particular embodiment, the coagulation of step (iii) is carried out by the addition of a coagulation agent. In a preferred embodiment, the coagulation agent is selected from thrombin, calcium salt and polyphosphate salt. twenty

En una realización particular de la invención, cuando la trombina se usa como agente de coagulación, el rango de trombina que se usa está entre 0.2 U y 1.2 U por mg del fibrinógeno usado. In a particular embodiment of the invention, when thrombin is used as a coagulation agent, the thrombin range used is between 0.2 U and 1.2 U per mg of the fibrinogen used.

En el método alternativo, la interacción del andamio y el mRNA/agente de transfección en la etapa (iii) puede ser reforzada mediante secado o liofilización del sistema. 25 In the alternative method, the interaction of the scaffold and the mRNA / transfection agent in step (iii) can be reinforced by drying or lyophilization of the system. 25

En otra realización, la invención se refiere a un andamio biodegradable obtenido por el método descrito arriba. In another embodiment, the invention relates to a biodegradable scaffold obtained by the method described above.

En otra realización, la invención se refiere al uso de un andamio de la invención, como un reactivo de diferenciación in vitro o como implante cosmético. In another embodiment, the invention relates to the use of a scaffold of the invention, as an in vitro differentiation reagent or as a cosmetic implant.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un andamio biodegradable como se 30 describe arriba como dispositivo para la regeneración de tejido y órganos. En una realización preferida de la invención, el andamio biodegradable se usa como dispositivo para regeneración de cartílago. Another aspect of the invention relates to the use of a biodegradable scaffold as described above as a device for tissue and organ regeneration. In a preferred embodiment of the invention, the biodegradable scaffold is used as a device for cartilage regeneration.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de un andamio biodegradable definido arriba para propósitos cosméticos. Another aspect of the invention relates to the use of a biodegradable scaffold defined above for cosmetic purposes.

Un último aspecto de la invención se refiere al uso de un andamio biodegradable como se define arriba como un fármaco para prevenir, paliar o curar enfermedades. A final aspect of the invention relates to the use of a biodegradable scaffold as defined above as a drug for preventing, alleviating or curing diseases.

5 5

A continuación se describen algunos ejemplos ilustrativos de la invención; sin embargo, no deben de ser consideradas como limitaciones impuestas a la misma. Some illustrative examples of the invention are described below; however, they should not be considered as limitations imposed on it.

EJEMPLOS 10 EXAMPLES 10

Ejemplo 1 Example 1

Síntesis de mRNA codificante de la proteína fluorescente YFP: Un plásmido para la transcripción in vitro de mRNA fue diseñado basado en el plásmido pBluescript KS (pBSK KS, Stratagene, EE.UU.), con un promotor de la transcripción de T7. En este plásmido, la 15 secuencia de YFP y una señal de poliadenilación fue clonada a partir de un plásmido pIRES YFP (Clontech, Alemania), utilizando los sitios de restricción SmaI y XhoI. El diseño correcto se verificó a través de su escisión en sitios de restricción, y análisis por ensayos de migración en gel y secuenciación. La estructura del plásmido utilizado se representa en la Figura 1A. El mRNA se sintetizó con un Cap análogo anti-reverso 20 (ARCA) a través del kit ultra mMACHINE T7 (Ambio), siguiendo las instrucciones del fabricante. El mRNA se puede aislar por un método de extracción estándar de fenol-cloroformo. Sin embargo, se consigue una mejor reproducibilidad entre lotes de mRNA si la extracción se realiza con un tubo Pharme Lock Gel Light (5Prime, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante. 25 Synthesis of YR fluorescent protein encoding mRNA: A plasmid for in vitro transcription of mRNA was designed based on plasmid pBluescript KS (pBSK KS, Stratagene, USA), with a T7 transcription promoter. In this plasmid, the YFP sequence and a polyadenylation signal was cloned from a YFP pIRES plasmid (Clontech, Germany), using the SmaI and XhoI restriction sites. The correct design was verified through its cleavage at restriction sites, and analysis by gel migration and sequencing assays. The structure of the plasmid used is depicted in Figure 1A. The mRNA was synthesized with an anti-reverse analogue Cap 20 (ARCA) through the ultra mMACHINE T7 kit (Ambio), following the manufacturer's instructions. The mRNA can be isolated by a standard phenol-chloroform extraction method. However, better reproducibility between batches of mRNA is achieved if the extraction is performed with a Pharme Lock Gel Light tube (5Prime, Germany), following the manufacturer's instructions. 25

Para verificar la actividad del mRNA, las células U87MG fueron transfectadas con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las recomendaciones del fabricante. las células U87MG se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 26300 células/cm2 el día antes de la transfección. Los lipoplexos se prepararon a continuación en 100 μl de OptiMEM (Gibco), con 0,5 μg de mRNA y con una proporción de mRNA: lípido de 2:1; 30 los complejos preparados se añadieron a las células. Después de 6 h de incubación, el medio con lipoplexos se eliminó y se reemplazó con medio de cultivo fresco. La presencia de células fluorescentes se verificó mediante un microscopio de fluorescencia (Olympus) To verify mRNA activity, U87MG cells were transfected with Lipofectamine 2000 (Invitrogen) according to the manufacturer's recommendations. U87MG cells were seeded in 96-well plates at a density of 26300 cells / cm2 the day before transfection. The lipoplexes were then prepared in 100 µl of OptiMEM (Gibco), with 0.5 µg of mRNA and with a mRNA: lipid ratio of 2: 1; The prepared complexes were added to the cells. After 6 h of incubation, the medium with lipoplexes was removed and replaced with fresh culture medium. The presence of fluorescent cells was verified by a fluorescence microscope (Olympus)

24 h después de la transfección. Los resultados confirmaron que una alta fracción de las células que pueden ser observadas con luz trasmitida fueron transfectadas con éxito (fig. 1B). 24 h after transfection. The results confirmed that a high fraction of the cells that can be observed with transmitted light were successfully transfected (Fig. 1B).

las células U87MG fueron cultivadas rutinariamente en medio completo, que consiste en Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium con alta glucosa (D5671 Sigma) suplementado con 5 10% de suero bovino fetal, 2 mM de glutamina y 100 mg/L de penicilina-estreptomicina (Sigma-Aldrich). El cultivo se mantuvo a 37 ° C y bajo una atmósfera de 5% de CO2. Un esquema del andamiaje, las células, los mRNA y el agente de transfección se representa en la Figura 2A; la ilustración representa un andamiaje biodegradable activado con mRNA que codifica para los factores de transfección y complejado este a un agente de 10 transfección. La inclusión de las células en el andamiaje podría ser una opción interesante para algunas aplicaciones, pero se considera como opcional en la presente invención. U87MG cells were routinely cultured in complete medium, consisting of Dulbecco's Modified Eagle's Medium with high glucose (D5671 Sigma) supplemented with 5 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine and 100 mg / L penicillin-streptomycin (Sigma- Aldrich). The culture was maintained at 37 ° C and under an atmosphere of 5% CO2. A scheme of scaffolding, cells, mRNAs and the transfection agent is depicted in Figure 2A; The illustration depicts a biodegradable scaffold activated with mRNA that codes for transfection factors and complexed this to a transfection agent. The inclusion of the cells in the scaffolding could be an interesting option for some applications, but it is considered as optional in the present invention.

Preparación de los andamiajes de fibrina activados con 1 o 2 μg de mRNA y 3DFectIN como agente de transfección: En primer lugar, 1 μg o 2 μg de mRNA fueron diluidos hasta 25 μl en OptiMEM (para andamiajes activados con 1 o 2 μg de mRNA, respectivamente). 15 A continuación, esta disolución de mRNA se mezcló con otra fase de 25 μl de 3DFectin (OZ Biosciences, Francia) en OptiMEM. Para andamiajes con 1 μg de mRNA, esta segunda fase tenía 2, 3 o 4 μl de 3DFectIN (correspondiente a las relaciones 2:1, 3:1 o 4:1, respectivamente) diluido hasta 25 μL en OptiMEM. Para los andamiajes con 2 μg de mRNA, esta segunda fase tenía 4, 6 o 8 μl de 3DFectIN (correspondiente a las relaciones 20 2:1, 3:1 o 4:1, respectivamente) y diluido hasta 25 μL en OptiMEM. El mRNA y las fases 3DFectIN se mezclaron y se dejaron interactuar durante 20 minutos. Esta reacción da lugar a 50 μL de fase 3DFectIN/mRNA. Preparation of fibrin scaffolds activated with 1 or 2 μg of mRNA and 3DFectIN as a transfection agent: First, 1 μg or 2 μg of mRNA were diluted up to 25 μl in OptiMEM (for scaffolds activated with 1 or 2 μg of mRNA , respectively). 15 Next, this mRNA solution was mixed with another 25 μl phase of 3DFectin (OZ Biosciences, France) in OptiMEM. For scaffolds with 1 μg of mRNA, this second phase had 2, 3 or 4 μl of 3DFectIN (corresponding to the 2: 1, 3: 1 or 4: 1 ratios, respectively) diluted to 25 μL in OptiMEM. For scaffolds with 2 μg of mRNA, this second phase had 4, 6 or 8 μl of 3DFectIN (corresponding to 20 2: 1, 3: 1 or 4: 1 ratios, respectively) and diluted up to 25 μL in OptiMEM. The mRNA and 3DFectIN phases were mixed and allowed to interact for 20 minutes. This reaction results in 50 μL of 3DFectIN / mRNA phase.

Además de esta fase 3DFectIN/mRNA, se prepararon otras dos disoluciones. Una disolución de fibrinógeno de 20 μL a 10 o 20 mg/mL se preparó para generar andamiajes 25 de 2 o 4 mg/mL de concentración final. Una solución de trombina de 20 μL a 12,5 U/mL fue preparada también como reticulante del fibrinógeno. La disolución de fibrinógeno se pipetea después en un pocillo de cultivo o en el lugar donde se pretende generan los andamiajes. Los complejos 3DFectIN/mRNA se mezclan después con 10 μL de OptiMEM y la suspensión resultante se mezcla con el fibrinógeno mediante pipeteo. A continuación, 30 esta fase se mezcla con una disolución de trombina para la gelificación. Después de 1 h de incubación a 37 ° C con la trombina, todas estas posibles combinaciones de sistemas han formado un hidrogel. In addition to this 3DFectIN / mRNA phase, two other solutions were prepared. A fibrinogen solution of 20 μL at 10 or 20 mg / mL was prepared to generate scaffolds of 2 or 4 mg / mL of final concentration. A thrombin solution of 20 μL at 12.5 U / mL was also prepared as a fibrinogen crosslinker. The fibrinogen solution is then pipetted into a culture well or in the place where it is intended to generate the scaffolds. The 3DFectIN / mRNA complexes are then mixed with 10 μL of OptiMEM and the resulting suspension is mixed with the fibrinogen by pipetting. Then, this phase is mixed with a thrombin solution for gelation. After 1 h of incubation at 37 ° C with thrombin, all these possible combinations of systems have formed a hydrogel.

Las células se pueden integrar en esta composición, cambiando los 10 μL de OptiMEM añadidos a los complejos de 3DFectIN/mRNA por el mismo volumen de suspensión de células en OptiMEM. Un número de 1,5x105 células pueden ser fácilmente incorporados en este volumen. Cuando las células van a ser cultivadas en los andamiajes, se puede añadir medio celular completo a los andamiajes después de su formación, es decir, después 5 de 1 h de incubación del fibrinógeno y la trombina a 37ºC. Cells can be integrated into this composition, changing the 10 μL of OptiMEM added to the 3DFectIN / mRNA complexes for the same volume of cell suspension in OptiMEM. A number of 1.5x105 cells can easily be incorporated into this volume. When the cells are to be cultured in the scaffolds, complete cell media can be added to the scaffolds after their formation, that is, after 5 hours of incubation of fibrinogen and thrombin at 37 ° C.

las células madre mesenquimales humanas (hMSC) se incorporaron a los andamiajes de fibrina activados con mRNA codificante de YFP. La observación mediante microscopia óptica muestra que hMSCs están perfectamente integradas en estas matrices en 3D, y pueden ser cultivadas tanto en andamiajes de fibrina de 4 mg/mL como en andamiajes de 2 10 mg/mL (Figura 2B). Human mesenchymal stem cells (hMSC) were incorporated into fibrin scaffolds activated with YFP-encoding mRNA. Observation by optical microscopy shows that hMSCs are perfectly integrated into these 3D matrices, and can be grown both in 4 mg / mL fibrin scaffolds and in 2 10 mg / mL scaffolds (Figure 2B).

Andamiajes activados con ADN plasmídico (pDNA): como referencia, se prepararon también andamiajes de fibrina activados con pDNA codificante de YFP. El plásmido usado para estos experimentos era el mismo que utilizamos para la transcripción in vitro de mRNA (Figura 1), ya que el plásmido pBSK KS tiene también un promotor de la 15 transcripción eucariótica. Estos andamiajes se pueden preparar exactamente de la misma manera que los activados con mRNA, pero cambiando mRNA por la misma cantidad de pDNA. Los andamiajes activados con pDNA mostraron exactamente las mismas propiedades morfológicas y mecánicas. Esperamos que los complejos de 3Dfectin/pADN tendrán una distribución similar en los andamiajes a los complejos de 3Dfectin/mRNA. 20 Debido a esto, marcamos los andamiajes activados con pDNA mediante SYBRGold (Thermo Fisher Scientific, Inc.), y observamos la distribución de la fluorescencia en los andamiajes sin células (Figura 2C). La fluorescencia estuvo presente en todas las áreas del andamiaje. Sin embargo, se observó que las relaciones 2:1 3DFectin/pDNA daban lugar a aglomeraciones de la fluorescencia. Esta aglomeración era menos prominente en la 25 proporción de 3:1 y no detectable en la relación 4: 1. Plasmid DNA activated scaffolds (pDNA): as a reference, fibrin scaffolds activated with YFP-encoding pDNA were also prepared. The plasmid used for these experiments was the same as we used for in vitro transcription of mRNA (Figure 1), since plasmid pBSK KS also has a promoter of eukaryotic transcription. These scaffolds can be prepared in exactly the same way as those activated with mRNA, but by changing mRNA for the same amount of pDNA. The scaffolds activated with pDNA showed exactly the same morphological and mechanical properties. We expect that 3Dfectin / pDNA complexes will have a similar distribution in scaffolds to 3Dfectin / mRNA complexes. 20 Because of this, we mark the scaffolds activated with pDNA by SYBRGold (Thermo Fisher Scientific, Inc.), and observe the distribution of fluorescence in scaffolds without cells (Figure 2C). Fluorescence was present in all areas of the scaffolding. However, it was observed that the 2: 1 3DFectin / pDNA ratios resulted in fluorescence agglomerations. This agglomeration was less prominent in the 3: 1 ratio and not detectable in the 4: 1 ratio.

Se prepararon andamiajes de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/mL) tal como se describió anteriormente, y se cargaron con 1,5x105 células U87MG. Fibrin scaffolds (2 mg / mL and 4 mg / mL) were prepared as described above, and loaded with 1.5x105 U87MG cells.

Los andamiajes de fibrina activados con mRNA se sembraron con células hMSC, y se cultivaron durante una semana a 37 ° C con medio completo (90% de humedad, 5% de 30 CO2). Después de una semana, los andamiajes se liofilizaron, se metalizaron con oro-paladio al vacío, y se estudiaron por microscopía electrónica de barrido (SEM, LEO 435VP-SEM, Soluciones SEMTECH, Reino Unido). Las imágenes de SEM confirmaron Fibrin scaffolds activated with mRNA were seeded with hMSC cells, and cultured for a week at 37 ° C with complete medium (90% humidity, 5% 30 CO2). After one week, the scaffolds were lyophilized, metallized with gold-palladium in vacuo, and studied by scanning electron microscopy (SEM, LEO 435VP-SEM, SEMTECH Solutions, United Kingdom). SEM images confirmed

que los hidrogeles de fibrina forman una estructura altamente porosa (Figura 3 y 4). Contrariamente a nuestras expectativas, el tamaño de poro fue mayor en los hidrogeles de fibrina de 4 mg/mL que en los de 2 mg/mL. Las micrografías sugieren una estructura diferente para los andamiajes sembrados con células en comparación con andamiajes control. Esto podría estar relacionado con la contracción mecánica del andamiaje inducida 5 por la adhesión celular y por la deposición de matriz extracelular por parte de dichas células. that fibrin hydrogels form a highly porous structure (Figure 3 and 4). Contrary to our expectations, the pore size was larger in fibrin hydrogels of 4 mg / mL than in those of 2 mg / mL. Micrographs suggest a different structure for scaffolds seeded with cells compared to control scaffolds. This could be related to the mechanical contraction of the scaffolding induced by cell adhesion and by the deposition of extracellular matrix by said cells.

Ejemplo 2 Example 2

Este ejemplo describe la síntesis de andamiajes de alginato activados con mRNA y dos 10 polímeros catiónicos, poliarginina y protamina. Para los ejemplos actuales, se utilizó mRNA que codifica YFP, preparado tal como se describe en el ejemplo 1. En un primer paso, 1 o 2 μg de mRNA se mezclaron con una solución de 10 μl de poliarginina o protamina (1 o 2 mg) . La solución se dejó a interactuar durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después, se añadieron 50 μl de alginato (8 o 16 mg) a esta suspensión y se 15 mezcló. Después, se añadió a la disolución una suspensión de 10 μl con tiene 1.5x105 células U87MG. El sistema formó una estructura de tipo hidrogel después de la adición de 70 μl de la primera mezcla sobre 30 μl de una solución de CaCl2 (243 o 486 mM). Los hidrogeles se estabilizan por incubación a 37 ° C, 5% de CO2 y con un 95% de humedad durante 5 minutos. Después de este punto, se puede añadir medio completo de cultivo 20 celular sobre los andamiajes. This example describes the synthesis of alginate scaffolds activated with mRNA and two cationic polymers, polyarginine and protamine. For the current examples, mRNA encoding YFP was used, prepared as described in example 1. In a first step, 1 or 2 μg of mRNA was mixed with a solution of 10 μl of polyarginine or protamine (1 or 2 mg ). The solution was allowed to interact for 5 minutes at room temperature. Then, 50 μl of alginate (8 or 16 mg) was added to this suspension and mixed. Then, a 10 µl suspension with 1.5x105 U87MG cells was added to the solution. The system formed a hydrogel-like structure after the addition of 70 µl of the first mixture over 30 µl of a solution of CaCl2 (243 or 486 mM). The hydrogels are stabilized by incubation at 37 ° C, 5% CO2 and with 95% humidity for 5 minutes. After this point, complete cell culture medium 20 can be added on the scaffolds.

Todos hidrogeles formaron estructuras estables y mecánicamente competentes, como se evidencia por pruebas de inversión de tubo (Figura 5, izquierda). Las células se integraron con éxito en los andamiajes, y pudieron ser cultivadas durante al menos cuatro días en estas estructuras (Figura 5, a la derecha). 25 All hydrogels formed stable and mechanically competent structures, as evidenced by tube inversion tests (Figure 5, left). The cells were successfully integrated into the scaffolds, and could be cultured for at least four days in these structures (Figure 5, right). 25

Se comprobó que el prototipo con un 0,2% de protamina y 1,6% de alginato dio lugar a la expresión forzada de YFP. It was found that the prototype with 0.2% protamine and 1.6% alginate resulted in the forced expression of YFP.

Ejemplo 3 Example 3

Se prepararon andamiajes de fibrina (4 mg /mL) activados con 3DFectIN/mRNA (1 o 2 μg 30 de mRNA, proporciones 2:1, 3:1 y 4:1), usando un mRNA codificante de YFP según el método descrito en el ejemplo 1, pero antes de la adición de la trombina, en lugar de 10 μl de OptiMEM, se añadió el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 células Fibrin scaffolds (4 mg / mL) activated with 3DFectIN / mRNA (1 or 2 μg 30 mRNA, ratios 2: 1, 3: 1 and 4: 1) were prepared using a YFP coding mRNA according to the method described in Example 1, but before the addition of thrombin, instead of 10 μl of OptiMEM, the same volume of this medium containing 1.5x105 cells was added

U87MG. Como referencia, se preparó un andamiaje de fibrina (4 mg/ mL) activado con 3DFectin/pDNA (1 μg de pDNA, relación 3:1) y con la misma concentración de células U87MG. Después de la formación de hidrogel, se añadió medio de cultivo completo y las células se cultivaron durante 5 días (37ºC, 5% de CO2), con cambios en el medio cada dos días. 5 U87MG As a reference, a fibrin scaffold (4 mg / mL) activated with 3DFectin / pDNA (1 μg of pDNA, 3: 1 ratio) and with the same concentration of U87MG cells was prepared. After hydrogel formation, complete culture medium was added and the cells were cultured for 5 days (37 ° C, 5% CO2), with changes in the medium every two days. 5

La transfección celular se evaluó a través de un microscopio de fluorescencia a 24 h, 48 h, 72 h y 5 días (5 d) después de la preparación del andamiaje. Se tomaron imágenes ópticas de la misma área como referencia. Los resultados mostraron una alta transfección celular en todos los andamiajes activados con mRNA independientemente de la relación 3DFectin/mRNA y del la punto de tiempo de observación (Figuras 6-8). La transfección de 10 los andamiajes activados con mRNA fue claramente mayor que la observada para los andamiajes activados con pDNA (Figura 9). Este resultado fue una primera indicación de que los andamiajes activados con mRNA podían lograr niveles de expresión génica forzada superiores a los obtenidos con los andamiajes activados con pADN. Cellular transfection was evaluated through a fluorescence microscope at 24 h, 48 h, 72 h and 5 days (5 d) after scaffolding preparation. Optical images of the same area were taken as a reference. The results showed high cellular transfection in all mRNA activated scaffolds regardless of the 3DFectin / mRNA ratio and the observation time point (Figures 6-8). The transfection of 10 mRNA activated scaffolds was clearly greater than that observed for pDNA activated scaffolds (Figure 9). This result was a first indication that mRNA activated scaffolds could achieve forced gene expression levels higher than those obtained with pDNA activated scaffolds.

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Ejemplo 4 Example 4

Se prepararon andamiajes de fibrina (4 mg/mL) activados con 3DFectIN/mRNA (1 μg de mRNA, relaciones 2:1 y 3:1) codificando YFP tal como se describe en el ejemplo 1, pero antes de añadir la trombina, en lugar de 10 μl de OptiMEM, se añadió el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 células U87MG. Como control negativo (C), se preparó 20 un andamiaje no activado utilizando el mismo procedimiento, pero añadiendo sólo OptiMEM en lugar de la suspensión de 50 μl 3DFectIN/mRNA en OptiMEM. Después de la formación de hidrogel, se añadió medio de cultivo completo y las células fueron cultivadas durante 24, 48 h, 3 semanas y 7 semanas (37ºC, 5% CO2). Fibrin scaffolds (4 mg / mL) activated with 3DFectIN / mRNA (1 µg of mRNA, ratios 2: 1 and 3: 1) were prepared encoding YFP as described in example 1, but before adding thrombin, in Instead of 10 μl of OptiMEM, the same volume of this medium containing 1.5x105 U87MG cells was added. As a negative control (C), a non-activated scaffold was prepared using the same procedure, but adding only OptiMEM instead of the 50 μl 3DFectIN / mRNA suspension in OptiMEM. After hydrogel formation, complete culture medium was added and the cells were cultured for 24, 48 h, 3 weeks and 7 weeks (37 ° C, 5% CO2).

La viabilidad celular a las 24 y 48 h se midió mediante un ensayo MTT siguiendo las 25 instrucciones del fabricante. La capacidad de los andamiajes para sostener la proliferación celular se evaluó midiendo el contenido de DNA en los cultivos al inicio (semana 0), tras 3 semanas y después de 7 semanas. Los andamiajes con relación 3:1 fueron los prototipos seleccionados para este ensayo de proliferación. El contenido de DNA en los andamiajes se midió, después de la extracción de ADN, mediante un ensayo PicoGreen (Thermo 30 Fisher Scientific, Inc.), siguiendo las instrucciones del fabricante. La extracción del DNA para su cuantificación se realizó mediante la incubación de los andamiajes con una solución de 100 μL tripsina (5%) durante 30 minutos, y a continuación, mediante la Cell viability at 24 and 48 h was measured by an MTT assay following the manufacturer's instructions. The ability of scaffolds to sustain cell proliferation was evaluated by measuring the DNA content in the cultures at the beginning (week 0), after 3 weeks and after 7 weeks. Scaffolds with a 3: 1 ratio were the prototypes selected for this proliferation test. The DNA content in the scaffolds was measured, after DNA extraction, by a PicoGreen assay (Thermo 30 Fisher Scientific, Inc.), following the manufacturer's instructions. DNA extraction for quantification was performed by incubating the scaffolds with a solution of 100 μL trypsin (5%) for 30 minutes, and then, using the

incubación de la suspensión resultante durante 20 minutos en SDS 0,1% bajo intensa agitación. incubation of the resulting suspension for 20 minutes in 0.1% SDS under intense agitation.

Los resultados del ensayo MTT demostraron que los andamiajes activados con el complejo 2:1 no eran tóxicos bajo cualquiera de las condiciones (Figura 10). Los andamiajes activados con la relación 3:1 no mostraron toxicidad a las 24 h y mostraron signos de 5 toxicidad menores a las 48 h. El ensayo de contenido de DNA confirmó que el andamiaje 3:1 puede soportar la proliferación y el cultivo de células durante un período de 7 semanas, aunque no se observó proliferación adicional pasada la semana 3. The MTT test results showed that scaffolds activated with the 2: 1 complex were not toxic under any of the conditions (Figure 10). The scaffolds activated with the 3: 1 ratio showed no toxicity at 24 h and showed signs of less toxicity at 48 h. The DNA content test confirmed that 3: 1 scaffolding can support proliferation and cell culture over a period of 7 weeks, although no additional proliferation was observed after week 3.

Ejemplo 5 10 Example 5 10

Se prepararon andamiajes de fibrina (2 y 4 mg/mL) activados con mRNA (1 μg de mRNA, relación 3:1) codificante de YFP tal como se describe en el ejemplo 1, pero antes de añadir la trombina, en lugar de 10 μl de OptiMEM, se añadió el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 hMSCs. Como control negativo (C), se preparó un andamiaje no activado po5 el mismo procedimiento, pero utilizando sólo OptiMEM en lugar de los 50 μl 15 de la suspensión de 3DFectIN/mRNA. Después de la formación de hidrogel, se añadió medio de cultivo completo y las células fueron cultivadas durante 24 y 48 h (37ºC, 5% CO2). Se evaluó la transfección de hMSCs a las 24 h tal como se describe en el ejemplo 3. Se evaluó la toxicidad del andamiaje a las 24 y 48 h mediante un ensayo de MTT tal como se describe en el ejemplo 4. La capacidad del andamiaje para apoyar la proliferación de 20 células a los 0, 3, 7 y 10 días fue evaluada mediante un ensayo de cuantificación de DNA tal como se describe en el ejemplo 4. Fibrin scaffolds (2 and 4 mg / mL) activated with mRNA (1 µg of mRNA, 3: 1 ratio) encoding YFP were prepared as described in example 1, but before adding thrombin, instead of 10 μl of OptiMEM, the same volume of this medium containing 1.5x105 hMSCs was added. As a negative control (C), a non-activated scaffolding was prepared for the same procedure, but using only OptiMEM instead of the 50 μl of the 3DFectIN / mRNA suspension. After hydrogel formation, complete culture medium was added and the cells were cultured for 24 and 48 h (37 ° C, 5% CO2). Transfection of hMSCs was evaluated at 24 h as described in example 3. Scaffolding toxicity was evaluated at 24 and 48 h by an MTT assay as described in example 4. Scaffolding capacity for supporting the proliferation of 20 cells at 0, 3, 7 and 10 days was evaluated by a DNA quantification assay as described in example 4.

El experimento mostró que los andamiajes activados con mRNA pueden generar una transfección eficaz en hMSCs, tanto para prototipos con 2 mg/mL de fibirina como los de 4 mg/mL de fibrina. Las pruebas de MTT indicaron que todos los andamiajes de fibrina 25 mostraron una toxicidad menor a las 24 h, y ausencia de toxicidad a 48 h. La cuantificación de DNA apoya la capacidad de estos andamiajes para soportar la proliferación celular. Esto fue particularmente visible para los andamiajes de 2 mg/mL de fibrina (Figura 11). The experiment showed that mRNA activated scaffolds can generate an effective transfection in hMSCs, both for prototypes with 2 mg / mL of fibirin and those of 4 mg / mL of fibrin. MTT tests indicated that all fibrin 25 scaffolds showed less toxicity at 24 h, and no toxicity at 48 h. DNA quantification supports the ability of these scaffolds to support cell proliferation. This was particularly visible for the 2 mg / mL scaffolds of fibrin (Figure 11).

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Ejemplo 6 Example 6

Síntesis de mRNA codificante de SOX9: se diseñó un plásmido para la transcripción in vitro de mRNA basado en un plásmido pCMVTnT®, en el cual se introdujo el gen SOX9 Synthesis of mRNA encoding SOX9: a plasmid was designed for in vitro transcription of mRNA based on a plasmid pCMVTnT®, into which the SOX9 gene was introduced

junto con una secuencia de consenso Kozak para iniciar la traducción, una región UTR 5' de β-globina y una región UTR 3' de α-globina. Se agrego bien una cola de politimina o una señal de poliadenilación tardía de SV40 en 3' para la síntesis de mRNA con una cola de poliadenina. El plásmido diseñado tenía también un sitio de la transcripción eucariótica, ya que se usó el mismo como control en los andamiajes activados pDNA codificante de 5 SOX9. La estructura del plásmido utilizado se muestra en la Figura 12. La síntesis y aislamiento del mRNA a partir del plásmido se realizó mediante el método descrito en el ejemplo 1. Para validar la bioactividad de la secuencia de SOX9, se cultivaron células U87MG en una placa de cultivo de 24 pocillos y se transfectaron con 1 μg de este mRNA. La expresión de SOX9 en las células cultivadas 12 y 24 h después de la transfección fue 10 validada mediante western-blot tras la extracción de proteínas (anticuerpos anti-SOX9, Santa Cruz Biotech, USA). Las células no transfectadas se utilizaron como control negativo (C-) y las células transfectadas con el plásmido se utilizaron como control positivo (C+). Los resultados del western blot confirmaron la bioactividad del mRNA sintetizado. 15 together with a Kozak consensus sequence to initiate translation, a 5 'UTR region of β-globin and a 3' UTR region of α-globin. A polyimine tail or a late polyadenylation signal of SV40 in 3 'was well added for mRNA synthesis with a polyadenine tail. The designed plasmid also had a eukaryotic transcription site, since it was used as a control in the activated scaffolds pDNA encoding 5 SOX9. The structure of the plasmid used is shown in Figure 12. The synthesis and isolation of mRNA from the plasmid was performed by the method described in example 1. To validate the bioactivity of the SOX9 sequence, U87MG cells were cultured in a plate 24-well culture and transfected with 1 μg of this mRNA. The expression of SOX9 in cultured cells 12 and 24 h after transfection was validated by western blotting after protein extraction (anti-SOX9 antibodies, Santa Cruz Biotech, USA). Untransfected cells were used as a negative control (C-) and cells transfected with the plasmid were used as a positive control (C +). The western blot results confirmed the bioactivity of the synthesized mRNA. fifteen

Los andamiajes de fibrina (4 mg/mL) activados con 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/ pDNA (1 μg de mRNA/pDNA, relaciones 2:1 y 3:1) codificando SOX9 se prepararon como se describe en el ejemplo 1, pero antes de añadir la trombina, en lugar de 10 μl de OptiMEM, se añadió el mismo volumen de este medio conteniendo 1.5x105 células U87MG. Como control negativo (C-), se preparó un andamiaje sin mRNA/pDNA ni 3DFectIN por el 20 mismo procedimiento, pero utilizando sólo OptiMEM en lugar de la 50 μl de suspensión 3DFectIN/mRNA. Después de la formación del hidrogel, se añadió medio de cultivo completo, y las células se cultivaron durante 24 h (37ºC, 5% CO2). Fibrin scaffolds (4 mg / mL) activated with 3DFectIN / mRNA or 3DFectIN / pDNA (1 μg of mRNA / pDNA, ratios 2: 1 and 3: 1) encoding SOX9 were prepared as described in example 1, but before if thrombin was added, instead of 10 μl of OptiMEM, the same volume of this medium containing 1.5x105 U87MG cells was added. As a negative control (C-), a scaffold without mRNA / pDNA or 3DFectIN was prepared by the same procedure, but using only OptiMEM instead of the 50 μl of 3DFectIN / mRNA suspension. After hydrogel formation, complete culture medium was added, and the cells were cultured for 24 h (37 ° C, 5% CO2).

La capacidad de los andamiajes activados con mRNA o pDNA para inducir expresión forzada de SOX9 se midió mediante una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo 25 real cuantitativa (qRT-PCR, C1000 termociclador, Bio-Rad Laboratories, Inc., EE.UU.), utilizando sondas para los genes SOX9, GAPDH y β-actina (Taqman, Thermo Fisher Scientific, Inc.). La expresión relativa se evaluó utilizando el método 2ΔΔCt se utilizó para evaluar la expresión relativa, usando GAPDH y β-actina (ACTB) como los genes de referencia. La expresión relativa del control (C) es 1 en todos los gráficos, pero no es 30 visible en los gráficos debido a la escala requerida para representar el resto de los datos. The ability of mRNA or pDNA activated scaffolds to induce forced expression of SOX9 was measured by a quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR, C1000 thermal cycler, Bio-Rad Laboratories, Inc., USA). .), using probes for the SOX9, GAPDH and β-actin genes (Taqman, Thermo Fisher Scientific, Inc.). Relative expression was evaluated using the 2ΔΔCt method was used to evaluate relative expression, using GAPDH and β-actin (ACTB) as the reference genes. The relative expression of the control (C) is 1 in all the graphs, but it is not visible in the graphs due to the scale required to represent the rest of the data.

El experimento demostró la capacidad de generar una regulación positiva extrema de la expresión de SOX9 con los andamiajes activados con mRNA. La expresión con el The experiment demonstrated the ability to generate extreme positive regulation of SOX9 expression with scaffolds activated with mRNA. The expression with the

andamiaje activado mRNA con una relación 2:1 fue de alrededor de 5000 veces la del control, mientras que la proporción de 3:1 llegó a 20000 veces el control. La regulación positiva generada con andamiajes activados con pDNA fue órdenes de magnitud menor que la obtenida con mRNA, aunque significativamente superior al control negativo (Figura 13A). 5 mRNA activated scaffolding with a 2: 1 ratio was about 5000 times that of the control, while the 3: 1 ratio reached 20,000 times the control. The positive regulation generated with scaffolds activated with pDNA were orders of magnitude smaller than that obtained with mRNA, although significantly higher than the negative control (Figure 13A). 5

El mismo experimento se repitió, con un mayor número de replicados, pero sólo para los andamiajes activados con mRNA o pDNA en la relación 3:1 (Figura 13B). Finalmente, el mismo experimento se repitió para los andamiajes activados con mRNA y pDNA en la relación 3:1, pero utilizando hMSCs en lugar de las células U87MG (misma densidad de sembrado). Los resultados mostraron una sobreexpresión de SOX9 en los andamiajes 10 activados con mRNA 40000 veces superior al control, notablemente mejor que el conseguido con pDNA (Figura 13C). The same experiment was repeated, with a greater number of replicates, but only for scaffolds activated with mRNA or pDNA in the 3: 1 ratio (Figure 13B). Finally, the same experiment was repeated for scaffolds activated with mRNA and pDNA in the 3: 1 ratio, but using hMSCs instead of U87MG cells (same seeding density). The results showed an overexpression of SOX9 in scaffolds 10 activated with mRNA 40,000 times higher than the control, notably better than that achieved with pDNA (Figure 13C).

Ejemplo 7 Example 7

En este experimento se intentó establecer la cinética de expresión de SOX9 a tiempos 15 cortos tras la transfección de hMSC en andamiajes activados con mRNA o pDNA. Para ello, andamiajes con 2 y 4 mg/mL de fibrina y activados con 1 μg de mRNA o pDNA (relación 3:1 de 3DFectIN/mRNA o 3DFectIN/pDNA) se prepararon con hMSCs siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 1, pero utilizando mRNA codificante de Sox9 (ver síntesis en ejemplo 7). Los andamiajes se cultivaron durante 48 h en medio 20 completo, a 37°C, con 90% de humedad relativa y 5% de CO2. La expresión génica de SOX9 en las células se valoró por qRT-PCR tal como se describe en el ejemplo 6. Los resultados mostraron un comportamiento diferente para andamiajes de 2 y 4 mg/mL de fibrina. La activación con pDNA fue tan eficiente o incluso más eficiente en algún caso que la activación con mRNA en los andamiajes con 2 mg/mL de fibrina. Por otra parte, la 25 activación con mRNA fue claramente más eficiente en los andamiajes con 4 mg/mL de fibrina (Figura 15). In this experiment, we tried to establish the expression kinetics of SOX9 at short times after transfection of hMSC in scaffolds activated with mRNA or pDNA. For this, scaffolds with 2 and 4 mg / mL of fibrin and activated with 1 µg of mRNA or pDNA (3: 1 ratio of 3DFectIN / mRNA or 3DFectIN / pDNA) were prepared with hMSCs following the procedure described in example 1, but using mRNA encoding Sox9 (see synthesis in example 7). The scaffolds were grown for 48 hours in complete medium, at 37 ° C, with 90% relative humidity and 5% CO2. Gene expression of SOX9 in the cells was assessed by qRT-PCR as described in example 6. The results showed a different behavior for scaffolds of 2 and 4 mg / mL fibrin. PDNA activation was as efficient or even more efficient in some cases than mRNA activation in scaffolds with 2 mg / mL fibrin. On the other hand, mRNA activation was clearly more efficient in scaffolds with 4 mg / mL fibrin (Figure 15).

La cinética de la expresión del gen parece estar afectada tanto por el polinucleótido utilizado para la activación, mRNA o pDNA, como por la concentración de fibrina en los andamiajes. Para el mRNA, se alcanzaron valores máximos a las 12 y 24 h después de la 30 siembra de las células, independientemente de las condiciones. Para el pDNA, la expresión fue más constante, pero se pudo observar un pico a las 24 h para los andamiajes de 2 mg/mL y a las 48 h para los de 4 mg/mL (Figura 14). The kinetics of gene expression seem to be affected both by the polynucleotide used for activation, mRNA or pDNA, and by the concentration of fibrin in scaffolds. For mRNA, maximum values were reached at 12 and 24 h after 30 cell seeding, regardless of conditions. For pDNA, the expression was more constant, but a peak could be observed at 24 h for the 2 mg / mL scaffolds and at 48 h for the 4 mg / mL scaffolds (Figure 14).

Ejemplo 8 Example 8

En este experimento, se probó la capacidad de los andamiajes activados con mRNA de inducir la diferenciación celular directa hacia un linaje condrogénico. Andamiajes de fibrina (4 mg/mL) se activaron con mRNA codificante para SOX9 (relación 3:1) y se 5 sembraron con hMSCs, siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo 6. Como referencia, se utilizó un andamiaje sembrado con hMSCs y activado con pDNA (también relación 3:1). In this experiment, the ability of mRNA activated scaffolds to induce direct cell differentiation towards a chondrogenic lineage was tested. Fibrin scaffolds (4 mg / mL) were activated with mRNA encoding SOX9 (3: 1 ratio) and seeded with hMSCs, following the procedure described in example 6. As a reference, scaffolding seeded with hMSCs was used and activated with pDNA (also 3: 1 ratio).

Después de la formación del andamiaje por reticulación (1 h a 37ºC después de la adición de la trombina), se añadió medio de cultivo celular a las placas de cultivo donde fueron 10 colocados los andamiajes. El experimento se realizó cultivando las células en los andamiajes en dos medios diferentes: (i) medio condrogénico incompleto (ICM) y (ii) medio condrogénico completo (CCM). El ICM contenía DMEM con alta glucosa (Sigma), 100 nM de dexametasona, 50 μg/mL de ácido ascórbico 2-fosfato, 40 μg /mL de L-prolina, 1% de suplemento Premix ITS (Becton Dickinson), 1 mM piruvato sódico (Sigma) y 1% 15 de penicilina/estreptomicina (Sigma). El CCM contenía ICM y 10 ng/mL de TGF-β3 (Peprotech, UK). Los andamiajes se cultivaron durante 21 días, con 3 cambios de medio a la semana, a 37ºC, con un 90% de humedad y 5% de CO2. Después de 21 días, se evaluó la expresión de genes marcadores de diferenciación condrogénica Sox9, agrecano (ACAN) y colágeno de tipo II (Col2a1). 20 After the formation of the cross-linking scaffolding (1 h at 37 ° C after the addition of the thrombin), cell culture medium was added to the culture plates where the scaffolds were placed. The experiment was carried out by culturing the cells in the scaffolds in two different media: (i) incomplete chondrogenic medium (ICM) and (ii) complete chondrogenic medium (MCC). The ICM contained DMEM with high glucose (Sigma), 100 nM dexamethasone, 50 μg / mL ascorbic acid 2-phosphate, 40 μg / mL L-proline, 1% Premix ITS supplement (Becton Dickinson), 1 mM pyruvate sodium (Sigma) and 1% 15 penicillin / streptomycin (Sigma). The CCM contained ICM and 10 ng / mL of TGF-β3 (Peprotech, UK). The scaffolds were grown for 21 days, with 3 changes of medium per week, at 37 ° C, with 90% humidity and 5% CO2. After 21 days, the expression of chondrogenic differentiation marker genes Sox9, aggrecan (ACAN) and type II collagen (Col2a1) was evaluated. twenty

Los resultados mostraron que los andamiajes, tanto activados con mRNA como con pDNA, producen cantidades mucho más grandes que los controles del regulador condrogénico maestro SOX9 después de 21 días, independientemente del medio de cultivo (ICM o CCM). Los andamiajes activados con mRNA fueron también capaces de inducir la expresión de ACAN en comparación con los controles en ICM, aunque su efecto parecía 25 ser negativo para este gen en los andamiajes cultivados en CCM (Figura 15). The results showed that scaffolds, both activated with mRNA and pDNA, produce much larger quantities than the controls of the master chondrogenic regulator SOX9 after 21 days, regardless of the culture medium (ICM or CCM). The mRNA activated scaffolds were also able to induce ACAN expression compared to the controls in ICM, although their effect appeared to be negative for this gene in the scaffolds grown in CCM (Figure 15).

También se midió la expresión de Col2a1. Sin embargo, debido a que el gen no se detectó en los andamiajes control, no fuimos capaces de utilizar el procedimiento de cálculo 2ΔΔCt. En su lugar, la Tabla 2 presenta el Ct de Col2a1 y los genes de referencia (GAPDH, ActB) para cada muestra. Es reseñable que los andamiajes activados con mRNA fueron el único 30 tipo de muestra donde el Col2a1 se expresó consistentemente, y que este resultado fue independiente del medio de cultivo empleado (ICM o MCP). The expression of Col2a1 was also measured. However, because the gene was not detected in the control scaffolds, we were not able to use the 2ΔΔCt calculation procedure. Instead, Table 2 presents the Ct of Col2a1 and the reference genes (GAPDH, ActB) for each sample. It is noteworthy that the scaffolds activated with mRNA were the only 30 type of sample where Col2a1 was consistently expressed, and that this result was independent of the culture medium used (ICM or MCP).

En general, este dato confirma que los andamiajes activados con mRNA pueden inducir por si mismos la diferenciación de hMSC hacia un linaje condrogénico. In general, this data confirms that mRNA activated scaffolds can induce hMSC differentiation towards a chondrogenic lineage.

Tabla 2: Valores de Ct de Col2a1 y de los genes de referencia (GAPDH, ActB) expresados por hMSCs cultivadas en ICM o MCP durante 21 días en andamiajes de fibrina (4 mg/mL) 5 no activados (C-), activados con 3DFectIN/mRNA (relación 3:1) o activados con 3DFectIN/pDNA (relación 3:1). N/D = No detectado. Table 2: Ct values of Col2a1 and reference genes (GAPDH, ActB) expressed by hMSCs cultured in ICM or MCP for 21 days in fibrin scaffolds (4 mg / mL) 5 not activated (C-), activated with 3DFectIN / mRNA (3: 1 ratio) or activated with 3DFectIN / pDNA (3: 1 ratio). N / A = Not detected.

: C- mRNA 3:1 pDNA 3:1 C- mRNA 3: 1 pDNA 3: 1

ICM ICM: Col2a1 ActB GAPDH Col2a1 ActB GAPDH Col2a1 ActB GAPDH Col2a1 ActB GAPDH Col2a1 ActB GAPDH Col2a1 ActB GAPDH

N/D N / A: 15,9893 17,57854 37,82298 16,05839 17,91439 N/D 16,05839 17,91439 15,9893 17,57854 37,82298 16,05839 17,91439 N / A 16,05839 17,91439

N/D N / A: 15,95448 17,54497 39,31226 16,09343 17,98782 N/D 16,09343 17,98782 15,95448 17,54497 39,31226 16.09343 17.98782 N / A 16.09343 17.98782

N/D N / A: 16,06559 17,65261 32,98505 16,0598 17,81497 35,54242 16,0598 17,81497 16,06559 17.65261 32.98505 16.0598 17.81497 35.54242 16.0598 17.81497

CCM CCM: N/D 15,00767 17,28146 31,41614 15,41693 17,09681 N/D 14,95397 16,98424 N / A 15,00767 17.28146 31,41614 15,41693 17,09681 N / A 14.95397 16,98424

N/D N / A: 14,99462 17,26188 29,41751 15,44408 17,28308 N/D 15,04821 17,0261 14.99462 17.26188 29.41751 15.44408 17.28308 N / A 15,04821 17,0261

N/D N / A: 15,06974 17,27417 30,63256 15,42 17,09684 28,43756 15,07596 17,07207 15,06974 17,27417 30.63256 15.42 17.09684 28.43756 15,07596 17.07207

10 10

Ejemplo 9 Example 9

En esta prueba, se repitió el mismo experimento que en el ejemplo 8, pero utilizando andamiajes con dos concentraciones de fibrina (2 mg/mL y 4 mg/mL), preparadas como en el ejemplo 6. Además, en este experimento los marcadores de diferenciación se analizaron después de 28 días de cultivo. 15 In this test, the same experiment as in example 8 was repeated, but using scaffolds with two fibrin concentrations (2 mg / mL and 4 mg / mL), prepared as in example 6. In addition, in this experiment the markers of Differentiation were analyzed after 28 days of culture. fifteen

A los 28 días, Sox9 estaba claramente sobreexpresado en los andamiajes activados con mRNA en comparación con los controles, y este resultado fue independiente de la concentración de fibrina en el andamiaje (2 mg/mL o 4 mg/mL) y del medio de cultivo (ICM o CCM). A los 28 días, ACAN también estaba sobreexperesado en comparación con el control en los andamiajes activados con mRNA de 2 mg/mL, y este resultado también 20 era independiente del medio de cultivo utilizado. Para los andamiajes de 4 mg/mL, los prototipos activados con mRNA mostraron niveles similares a los controles con ambos medios (Figura 16). At 28 days, Sox9 was clearly overexpressed in mRNA activated scaffolds compared to controls, and this result was independent of the fibrin concentration in the scaffolding (2 mg / mL or 4 mg / mL) and the culture medium (ICM or CCM). At 28 days, ACAN was also overexpressed compared to the control in scaffolds activated with 2 mg / mL mRNA, and this result was also independent of the culture medium used. For the 4 mg / mL scaffolds, mRNA activated prototypes showed similar levels to the controls with both media (Figure 16).

El análisis de la expresión génica Col2a1 solamente se realizó con andamiajes cultivados en CCM. Los resultados confirmaron que los andamiajes activados con mRNA fueron los 25 The analysis of the Col2a1 gene expression was only performed with scaffolds grown in CCM. The results confirmed that the scaffolds activated with mRNA were 25

únicos capaces de producir la expresión consistente de este gen. En este experimento, todos los andamiajes con 4 mg/mL de fibrina fueron capaces de expresar Col2a1. Sin embargo, sólo los andamiajes activados con mRNA mostraron expresión de mRNA en los prototipos con 2 mg/mL de fibrina (Tabla 3). Este dato confirma que los andamiajes activados con mRNA pueden inducir la diferenciación de hMSC hacia un linaje 5 condrogénico, ya sea por sí mismo, o en combinación con medios clásicos de diferenciación con factores de crecimiento. unique capable of producing consistent expression of this gene. In this experiment, all scaffolds with 4 mg / mL of fibrin were able to express Col2a1. However, only mRNA activated scaffolds showed mRNA expression in prototypes with 2 mg / mL fibrin (Table 3). This data confirms that mRNA activated scaffolds can induce the differentiation of hMSC towards a chondrogenic lineage, either by itself, or in combination with classical means of differentiation with growth factors.

Tabla 3: Los valores de Ct de Col2a1 y del gen de referencia(GAPDH) expresados por hMSCs cultivadas en CCM durante 28 días en andamiajes de 2 o 4 mg/mL de fibrina, no 10 activados (C-), activados con 3DFectIN/mRNA (relación 3:1), o activados con 3DFectIN/pDNA (relación 3:1). N/D = No detectado. Table 3: The Ct values of Col2a1 and the reference gene (GAPDH) expressed by hMSCs cultured in CCM for 28 days in scaffolds of 2 or 4 mg / mL of fibrin, not activated (C-), activated with 3DFectIN / mRNA (3: 1 ratio), or activated with 3DFectIN / pDNA (3: 1 ratio). N / A = Not detected.

: C- RNA 3:1 DNA 3:1 C- RNA 3: 1 DNA 3: 1

2 mg/mL 2 mg / mL: Col2a1 GAPDH Col2a1 GAPDH Col2a1 GAPDH Col2a1 GAPDH Col2a1 GAPDH Col2a1 GAPDH

N/D N / A: 19,80034 N/D 19,96768 N/D 20,62754 19,80034 N / A 19,96768 N / A 20,62754

N/D N / A: 19,78157 38,71413 20,16157 N/D 20,70585 19.78157 38.71413 20.16157 N / A 20.70585

N/D N / A: 19,78686 38,71413 19,96851 N/D 20,68075 19.78686 38.71413 19.96851 N / A 20.68075

4 mg/mL 4 mg / mL: 26,98096 18,42884 38,62078 17,79144 39,60755 17,98131 26,98096 18,42884 38,62078 17.79144 39.60755 17.98131

26,98096 26,98096: 18,33812 35,16769 17,75767 39,60755 18,12178 18,33812 35,16769 17,75767 39,60755 18,12178

38,62078 38,62078: 18,22016 35,16769 17,81862 N/D 18,13876 18,22016 35,16769 17,81862 N / A 18,13876

15 fifteen

Claims

1. Biodegradable scaffold comprising a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent.

2. Scaffolding according to claim 1, further comprising cells selected from the group consisting of primary cells and immortalized cell lines, with the proviso that said cells are not embryonic stem cells.

3. Scaffolding according to any of the preceding claims, wherein the mRNA encodes for a chondrogenic transcription factor.

4. Scaffolding according to claims 1-2, wherein the mRNA encodes a transcription factor selected from the group consisting of SOX9, MyoD, NeuroD1, c-10 Myc, Klf4, Nanog, Oct4, SOX2, C / EBP-β , PPAR-γ, Brn2, Lmx1a, Nurr1, Mash1, Myt1l and NeuroG2.

5. Scaffolding according to claims 1-2, wherein the mRNA encodes for dedifferentiation transcription factor.

6. Scaffolding according to any of the preceding claims, wherein the mRNA 15 codes for a transcription factor selected from SOX9, MyoD, NeuroD1, SOX2, Oct4, Klf4 and c-Myc.

7. Scaffolding according to claims 2-6, wherein the primary cells are induced pluripotent stem cells or adult stem cells.

8. Scaffolding according to claims 2-6, wherein the primary cells are fibroblasts or chondrocytes.

9. Scaffolding according to any of the preceding claims, wherein the biodegradable polymer is selected from fibrin, alginate and mixtures thereof.

10. Scaffolding according to any of the preceding claims, wherein the transfection agent is selected from a cationic lipid, a cationic polymer, and a calcium phosphate salt.

11. Scaffolding according to claim 10, wherein the cationic polymer is polyarginine or a cationic polyphosphazene.

12. Scaffolding, according to any of claims 1-11, for use as a medicament. 30

13. Scaffolding according to any of claims 1-11, for use in regenerative therapy of tissues or organs.

14. Scaffolding according to any of claims 1-11, for use according to claim 13 wherein the tissue is cartilage, muscle or nerve tissue.

15. Scaffolding according to any one of claims 1-11, for use in the treatment of a cartilage defect, muscle damage or nerve tissue damage.

16. Pharmaceutical composition comprising the scaffold described in any of the claims 1 to 11.

17. Pharmaceutical composition according to claim 16, wherein it further comprises acceptable pharmaceutical vehicles.

18. Pharmaceutical composition according to any of claims 16-17, further comprising at least one additional active pharmaceutical ingredient. 10

19. Pharmaceutical composition according to claims 16-18, which is an injectable solution, suspension, hydrogel or a solid porous matrix.

20. Pharmaceutical composition according to any of claims 16-19, for use as a vaccine.

21. Cosmetic composition comprising the scaffold as described in any one of claims 1-11.

22. A method of preparing the scaffold as described in any of claims 1-11, comprising:

(i) Mixing a biodegradable polymer, an isolated mRNA encoding a transcription factor and a transfection agent, and optionally 20 cells selected from the group consisting of primary cells and immortalized cell lines,

(ii) Incubate the prepared mixture in (i),

(iii) Induce coagulation of the mixture prepared in (ii).

23. Method according to claim 22, wherein the coagulation step (iii) is carried out by the addition of a coagulation agent.

24. Method for preparing the scaffold as described in any of claims 1-11, comprising:

(i) Prepare a scaffold,

(ii) Mix an isolated mRNA encoding a transcription agent and a transfection agent,

(iii) Incubate the mixture prepared in (ii) on the scaffold prepared in (i), and optionally add cells.

25. Biodegradable scaffolding obtained by the method according to claims 22-23 or by the method according to claim 24.

26. Use of a scaffold as described in any of claims 1-11, as an in vitro differentiation reagent or as a cosmetic implant.

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