ES2573467T3

ES2573467T3 - Adsorbentes de afinidad para el fibrinógeno

Info

Publication number: ES2573467T3
Application number: ES06727057.9T
Authority: ES
Inventors: Jason Richard Betley; James Christopher Pearson; Ben Martin Beacom; Tadeusz Antoni Podgorski; Robert William Pannell
Original assignee: Prometic Biosciences Ltd
Current assignee: Prometic Bioseparations Ltd
Priority date: 2005-05-09
Filing date: 2006-05-09
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2026-05-09
Also published as: JP2008541083A; NO20075783L; CN101171077A; EP1885487B1; CN101171077B; US8551994B2; AU2006245482A1; CA2607863A1; JP4740321B2; CA2607863C; DK1885487T3; AU2006245482B2; PT1885487E; NZ563164A; WO2006120429A1; EP1885487A1; US20130317217A1; BRPI0611233A2; MX2007013948A; US20090326201A1

Abstract

El uso de un adsorbente de afinidad para la separación, extracción, aislamiento, purificación, caracterización, identificación o cuantificación de fibrinógeno o de una proteína que es un análogo del fibrinógeno, en el que el adsorbente de afinidad es un compuesto de seleccionado entre:**Fórmula**

Description

DESCRIPCION

Adsorbentes de afinidad para el fibrinogeno 5 Campo de la invencion

Esta invencion se refiere a compuestos y a su uso como ligandos de afinidad.

Antecedentes de la invencion

10

El fibrinogeno es una protema dimerica, cada una de cuyas mitades esta compuesta de cadenas polipeptidicas unidas por disulfuro designadas Aa, Bp y y. En el Imgado, los genes para las cadenas Aa y Bp codifican productos individuales de 610 y 461 restos de aminoacidos, respectivamente. En contraste, el procesamiento alternativo de los transcritos del gen de la cadena y da variantes de cadena y de longitudes ligeramente diferentes (411 y 427 restos), 15 el mas corto de ellos que constituye el ~90 % del producto final. La forma predominante del fibrinogeno se secreta a la circulacion con una masa molecular de ~340 kDa. Despues de su secrecion desde el Imgado, la protema se encuentra no solo en el plasma, sino tambien en la linfa y en el lfquido intersticial. En individuos sanos, la concentracion de fibrinogeno en plasma es de entre 4 y 10 pm. Es importante destacar que la concentracion puede aumentar hasta en un 400 % durante momentos de estres fisiologico.

20

El fibrinogeno se convierte en fibrina por la trombina, una proteinasa de serina de tipo tripsina. La trombina hidroliza al menos dos enlaces Arg-Gly espedficos dentro del fibrinogeno. Este proceso conduce inicialmente a la formacion de protofibrillas de fibrina que se pueden asociar lateralmente, formando fibras mas gruesas que, a su vez, se pueden asociar para formar haces de fibrina incluso mas gruesos y ramificados. Los haces de este tipo se 25 estabilizan adicionalmente por enlaces cruzados formados entre restos de Lys y Gln situados dentro de las cadenas alfa de moleculas de fibrina vecinas, para formar una malla tridimensional capaz de prevenir o limitar el flujo de sangre. Este proceso de reticulacion esta catalizado por la enzima Factor Xllla.

Existen dos tipos de anomalfas congenitas del fibrinogeno, la afibrinogenemia y la disfibrinogenemia. La 30 afibrinogenemia es una deficiencia cuantitativa que da lugar a diatesis hemorragica. El termino hipofibrinogenemia se refiere a una deficiencia menos severa del fibrinogeno. La disfibrinogemia se caracteriza por anomalfas funcionales del fibrinogeno que pueden resultar en hemorragia o trombosis. Los pacientes pueden ser tratados con concentrado o crioprecipitado de fibrinogeno. El fibrinogeno tambien se usa habitualmente durante cirugfa como complemento de la hemostasia en forma de selladores de fibrina. Normalmente estos son sistemas de dos 35 componentes que comprenden fibrinogeno (por ejemplo, en forma de concentrado de fibrinogeno) y trombina en composiciones farmaceuticas apropiadas.

Una preocupacion en la administracion de estas formas parcialmente purificadas de fibrinogeno es la presencia de protemas contaminantes. Por tanto sena util un metodo de purificacion basado en la afinidad para el aislamiento de 40 fibrinogeno. Dicho metodo de purificacion sena especialmente util si fuese capaz de aislar el fibrinogeno a partir de plasma no empobrecido, de un modo espedfico, dejando todos los demas componentes de la protema intactos para su posterior manipulacion.

El documento WO97/10887 desvela compuestos a base de triazina, utiles como adsorbentes de afinidad, de formula 45 l

imagen1

en la que R1 es H, alquilo, hidroxialquilo, ciclohexilo, NH2, fenilo, naftilo, 1-fenilpirazol, indazol, benzotiazol, benzoxazol o bencimidazol, cualquiera de dichos grupos aromaticos que pueden estar sustituidos con uno o mas de 50 alquilo, alcoxi, aciloxi, acilamino, amino, NH2, OH, CO2H, sulfonilo, carbamoilo, sulfamoilo, alquilsulfonilo y halogeno; un X es N y el otro es N, C-Cl o C-CN;

Y es O, S o NR2;

Z es O, S o NR3;

R2 y R3 son cada uno H, alquilo, hidroxialquilo, bencilo o p-feniletMo;

Q es benceno, naftaleno, benzotiazol, benzoxazol, 1 -fenilpirazol, indazol o bencimidazol;

5 R4, R5 y R6 son cada uno H, OH, alquilo, alcoxi, amino, NH2, aciloxi, acilamino, CO2H, acido sulfonico, carbamoilo, sulfamoilo, alquilsulfonilo o halogeno; n es de 0 a 6; p es de 0 a 20; y

A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.

10

Los compuestos de formula I se describen como que tienen afinidad por protemas tales como las inmunoglobulinas, la insulina, el factor VII o la hormona del crecimiento humano.

Se describen compuestos de estructura relacionada en los documentos WO00/67900 y WO03/097112. Tienen 15 afinidad por las endotoxinas.

Sumario de la invencion

Sorprendentemente, se ha descubierto que ciertos compuestos, muchos de los cuales son nuevos, son utiles para el 20 aislamiento del fibrinogeno basado en afinidad. Estos compuestos se definen en las reivindicaciones 1 y 3 a 7.

Descripcion de la invencion

Los documentos WO97/10887, WO00/67900 y WO03/097112 desvelan como se pueden construir bibliotecas 25 combinatorias de ligandos sobre un soporte solido. Durante el cribado de un grupo de estas bibliotecas combinatorias con plasma humano como materia prima, se identificaron una serie de ligandos que eran capaces de unirse y eluir selectivamente el fibrinogeno humano.

Los compuestos de formula III, IV, V, VI, y VII, para su uso en la invencion, se pueden preparar por procedimientos 30 conocidos por los expertos en la materia. Dichos procedimientos se describen en las 3 publicaciones PCT identificadas anteriormente; se pueden adaptar facilmente a la preparacion de nuevos compuestos.

El documento WO97/10887 da ejemplos de A, incluyendo espaciadores o enlazadores L a traves de los cuales el anillo de triazina puede estar ligado a un soporte solido M. Como se describe en el documento WO97/10887, dichos 35 soportes incluyen agarosa, silice, celulosa, dextrano, almidon, alginato, carragenano, polfmeros sinteticos, vidrio y oxidos metalicos. Los materiales de este tipo se pueden activar antes de la reaccion para formar un adsorbente de esta invencion.

L puede ser, por ejemplo, -T-(-V1-V2)m-, en la que T es O, S o -NR7-;

40 m es 0 o 1;

V1 es un radical hidrocarbonado opcionalmente sustituido de 2 a 20 atomos de C; y V2 es O, S, -COO-, -CONH-, -NHCO-, -PO3H-, -NH-arileno-SO2-CH2-CH2- o -NRs-; y R7 y R8 son cada uno independientemente H o alquilo C1-6.

45 El ligando o adsorbente de union a fibrinogeno tiene la formula III (que se protona a pH fisiologico)

imagen2

El ligando o adsorbente de union a fibrinogeno tambien tiene la formula IV

imagen3

imagen4

El ligando o adsorbente de union a fibrinogeno tambien esta representado por la estructura V 5

El ligando o adsorbente de union a fibrinOgeno tambien esta representado por la estructura VI

10

imagen5

El ligando o adsorbente de uniOn a fibrinOgeno tambien esta representado por la estructura VII

imagen6

15

Los ligandos y adsorbentes de uniOn a fibrinOgeno descritos en este documento son utiles para la purificaciOn de fibrinOgeno a partir de mezclas complejas, incluyendo, pero no limitado a, plasma humano y sobrenadantes de fermentaciOn recombinantes. Esta utilidad se demuestra a continuaciOn en el Ejemplo 7, por medio de experimentos de cromatograffa usando plasma humano reunido.

20

El termino "fibrinOgeno" se utiliza en este documento para describir el fibrinOgeno en sf y tambien analogos que tienen las caractensticas funcionales del fibrinOgeno, por ejemplo, en terminos de afinidad por un compuesto dado descrito en este documento. Por lo tanto, el analito puede ser una protema que sea un fragmento funcional de fibrinOgeno, o un analogo estructural que tiene uno o mas de todos los mismos sitios de uniOn, o una protema de 25 fusiOn.

Los siguientes ejemplos ilustran la invencion.

Ejemplo 1 - Sintesis de 4-(4-morfolino)anilinildiclorotriazina

5

Se disolvio cloruro cianurico (16,1 g) en tetrahidrofurano (130 ml) y se enfrio a 0°C en un bano de hielo/sal. Se anadio 4-(4-morfolino) anilina (29,61 g) en THF (400 ml) a la solucion de cloruro cianurico a una velocidad tal que la temperature no excediera de 0 °C. Despues de que la adicion se hubo completado, la mezcla se agito a 0 °C durante 30 minutos, antes de anadir la solucion a una mezcla de hielo (700 g) y agua (1,5 l). El solido resultante se separo 10 por filtracion, se lavo con agua (1 l), antes de secar en un horno de vado a 45 °C hasta peso constante (28,54 g).

Ejemplo 2 - Sintesis de adsorbente III

Se suspendio gel Purabead de agarosa reticulado al 6 % (1000 g sedimentados en agua de osmosis inversa (OI)) 15 con agua de OI (667 ml), hidroxido de sodio 10 M (NaOH) (90 ml) y epiclorhidrina (127 ml). La suspension se agito durante 2 horas. Despues se tomo una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis para los grupos epoxi mostraba que el gel se habfa derivado con 19,2 jmol de grupos epoxi por g de gel sedimentado.

20 El gel se drena antes de anadir el agua de OI (400 ml) y una solucion acuosa de amoniaco con un peso espedfico de 0,88 (100 ml). La mezcla se agito y se calento a 40 °C, y a continuacion se agito a esta temperatura durante 16 horas. Despues se tomo una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (12 x 500 ml). El analisis TNBS para grupos amina mostraba que el gel se habfa derivado con 28,0 jmol de grupos amina por g de gel sedimentado.

25

El gel aminado sedimentado (500 g) se suspendio en fosfato de potasio 1 M a pH 7,0 (500 ml), y a continuacion se dejo drenar. A este gel se le anadio a continuacion fosfato de potasio 1 M a pH 7,0 (125 ml) y agua de OI (125 ml). La suspension se agito vigorosamente mientras se anadfa acetona (250 ml). Despues de enfriar en un bano de hielo/sal durante 30 minutos, se anadio cloruro cianurico (12,5 g) en acetona fna (125 ml) en una porcion. La mezcla 30 se agito a 0 °C durante 1 hora, antes de lavar con acetona acuosa al 50 % (5 x 500 ml), agua de OI (5 x 500 ml), acetona acuosa al 50 % (5 x 500 ml), y agua de OI (10 x 500 ml). El gel se dejo sedimentar por gravedad, antes de tomar una muestra para su analisis. El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se habfa derivado con 26,1 |jmol de diclorotriazina sustituida por g de gel sedimentado.

35 El gel sedimentado de la etapa anterior (238 g) se suspendio con agua de OI (138 ml) con enfriamiento en hielo/sal, antes de anadir 2-(4-morfolino) etilamina (4,39 g) en agua de OI fna (8 °C) (95 ml), de manera que la temperatura de reaccion no excediese de 8 °C. A continuacion la mezcla se agito a 8 °C durante 1 hora. Despues se tomo una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (10 x 250 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se habfa derivado con 23,8 jmol de monoclorotriazina sustituida por 40 g de gel sedimentado.

A 238 g (sedimentados) del gel se le anadio sulfato de agmatina (15,42 g) disuelto en agua de OI (200 ml - pH ajustado a pH 10, y a continuacion, se completo hasta un volumen final de 238 ml con agua de OI). La mezcla se agito a 60 °C durante toda la noche, mientras el pH se mantiene a 10. Despues de tomar una muestra del 45 sobrenadante para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (15 x 250 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se habfa derivado con 17,0 jmol de agmatina por g de gel sedimentado.

El gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v durante toda la noche a 50 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (5 x 250 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (250 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M/etanol al 25 % (5 x 250 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 250 ml). A continuacion, el gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M durante toda la noche a 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 250 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por 55 gravedad, se anadio NaOH 0,5 M (250 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 250 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 250 ml). Despues de lavar con PBS 0,1 M a pH 7,0 (3 x 250 ml), el gel se lavo una vez mas con agua de OI (10 x 250 ml), antes de almacenar en una camara frigonfica a 4 °C en etanol acuoso al 20 % en v/v.

Ejemplo 3 - Sintesis de adsorbente IV

Se suspendio gel Purabead de agarosa reticulado al 6 % (650 g sedimentados en agua de OI) con agua de OI (438 ml), hidroxido de sodio 10 M (NaOH) (59 ml) y epiclorhidrina (83 ml). La suspension se agito durante 2 horas. 5 Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis de los grupos epoxi mostraba que el gel se habfa derivado con 16,5 pmol de grupos epoxi por g de gel sedimentado.

El gel se dreno, antes de anadir agua de OI (520 ml) y una solucion de amoniaco con un peso espedfico de 0,88 (130 ml). La mezcla se agito y se calento a 40 °C, y a continuacion se agito a esta temperatura durante 16 horas. 10 Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis TNBS para grupos amina mostraba que el gel se habfa derivado con 22,9 pmol de grupos amina por g de gel sedimentado.

Una porcion de 500 g del gel aminado sedimentado se suspendio con DMF (500 ml), y a continuacion se deja 15 drenar. A continuacion, este gel se suspendio con DMF (250 ml), y diisopropiletilamina (DIPEA) (11,0 ml) con agitacion. La mezcla se agito durante 10 minutos, y a continuacion se anadio 4-(4-morfolino)anilinildiclorotriazina (20,6 g) en DMF (250 ml) en una porcion. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con DMF acuoso al 70 % en v/v (4 x 150 ml), DMF al 50 % (2 x 150 ml), y agua de OI (10 x 150 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba 20 que el gel se habfa derivado con 20,2 pmol de monoclorotriazina sustituida por g de gel sedimentado. La amina residual era indetectable por el ensayo de TNBS despues de la derivacion.

Se suspendio una porcion de 150 g (sedimentado) del gel en tampon de borato sodico 1 M (150 ml) y el pH se ajusto a 10 con hidroxido de sodio 10 M. Se anadio arginina (5,50 g) en una porcion. La mezcla se agito a 60 °C durante 25 toda la noche, mientras el pH se mantiene a 10. Despues de tomar una muestra del sobrenadante para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 150 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se habfa derivado con 22,4 pmol de arginina por g de gel sedimentado.

El gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v durante toda la noche a 30 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M/etanol al 25 % (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). A continuacion, el gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M durante toda la noche a 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por 35 gravedad, se anadio NaOH 0,5 M (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). Despues de lavar con PBS 0,1 M a pH 7,0 (3 x 150 ml), el gel se lavo una vez mas con agua de OI (10 x 150 ml), antes de almacenar en una camara frigonfica en etanol acuoso al 20 % en v/v.

40 Ejemplo 4 - Sintesis de adsorbente V

Se suspendio gel Purabead de agarosa reticulado al 6 % (650 g sedimentados en agua de OI) con agua de OI (438 ml), hidroxido de sodio 10 M (NaOH) (59 ml) y epiclorhidrina (83 ml). La suspension se agito durante 2 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (12 45 x 1 l). El analisis de los grupos epoxi mostraba que el gel se habfa derivado con 16,5 pmol de grupos epoxi por g de gel sedimentado.

El gel se dreno antes de anadir el agua de OI (520 ml) y una solucion acuosa de amoniaco con un peso espedfico de 0,88 (130 ml). La mezcla se agito y se calento a 40 °C, y a continuacion se agito a esta temperatura durante 16 50 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis TNBS para grupos amina mostraba que el gel se habfa derivado con 22,9 pmol de grupos amina por g de gel sedimentado.

Una porcion de 500 g del gel aminado sedimentado se suspendio con DMF (500 ml), y a continuacion se dejo 55 drenar. A continuacion, este gel se suspendio con DMF (250 ml) y DIPEA (11,0 ml) con agitacion. La mezcla se agito durante 10 minutos, y a continuacion se anadio 4-(4-morfolino)anilinildiclorotriazina (20,6 g) en DMF (250 ml) en una porcion. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con DMF acuosa al 70 % en v/v (4 x 150 ml), DMF acuosa al 50 % en v/v (2 x 150 ml), y agua de OI (10 x 150 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se habfa derivado

con 20,2 pmol de monoclorotriazina sustituida por g de gel sedimentado. La amina residual era indetectable por el ensayo de TNBS despues de la derivacion.

Una porcion de 150 g (sedimentado) del gel se suspendio en tampon de borato sodico 1 M (150 ml) y el pH se ajusto 5 a 10 con hidroxido de sodio 10 M. Se anadio diclorhidrato de argininamida (7,75 g) en una porcion. La mezcla se agito a 60 °C durante toda la noche, mientras el pH se mantiene a 10. La suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (15 x 150 ml). El analisis del gel lavado y sedimentado para el cloruro residual indicaba que el gel se habfa derivado hasta la finalizacion de la argininamida.

10 El gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v durante toda la noche a 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25% en v/v (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). A continuacion, el gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 15 M durante toda la noche a 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). Despues de lavar con PBS 0,1 M a pH 7,0 (3 x 150 ml), el gel se lavo una vez mas con agua de OI (10 x 150 ml), antes de almacenar en una camara frigonfica en etanol acuoso al 20 % en v/v.

20

Ejemplo 5 - Sintesis de adsorbente VI

Se suspendio gel Purabead de agarosa reticulado al 6 % (650 g sedimentados en agua de OI) con agua de OI (438 ml), hidroxido de sodio 10 M (NaOH) (59 ml) y epiclorhidrina (83 ml). La suspension se agito durante 2 horas. 25 Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis de los grupos epoxi mostraba que el gel se habfa derivado con 16,5 pmol de grupos epoxi por g de gel sedimentado.

El gel se dreno antes de anadir agua de OI (520 ml) y una solucion de amoniaco con un peso espedfico de 0,88 (130 ml). La mezcla se agito y se calento a 40 °C, y a continuacion se agito a esta temperatura durante 16 horas. 30 Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con 12 x 1 l de agua de OI (12 x 1 l). El analisis TNBS para grupos amina mostraba que el gel se habfa derivado con 22,9 pmol de grupos amina por g de gel sedimentado.

Se suspendio gel aminado sedimentado (70 g) en fosfato de potasio 1 M (70 ml) y se dejo sedimentar. A 35 continuacion se anadio fosfato de potasio 1 M (20 ml), la mezcla se agito vigorosamente, y se anadio acetona (10 ml). La mezcla se enfrio a 0 °C en un bano de hielo con sal, antes de anadir cloruro cianurico (1,75 g) en acetona fna (17,5 ml) en una porcion. La suspension se agito durante 1 hora a 0-4 °C, antes de drenar, y a continuacion se lavo con acetona acuosa al 50 % en v/v (5 x 70 ml), agua de OI (5 x 70 ml), con acetona acuosa al 50 % en v/v (5 x 70 ml), y agua de OI (10 x 70 ml). El analisis revelo la union de 18,0 pmol de grupos diclorotriazina por g de gel 40 sedimentado.

La diclorotriazinilagarosa (55 g) se lavo con DMF acuosa al 50 % en v/v, y a continuacion se suspendio en DMF acuosa al 50 % en v/v (55 ml). Se disolvio 4-(4-morfolino) anilina (1,23 g) en DMF acuosa al 75 % en v/v (15 ml) y se enfrio en hielo, antes de la adicion a la diclorotriazinilagarosa. La mezcla se hizo reaccionar a 4 °C durante 60 45 minutos. Despues de este tiempo se tomo una muestra de sobrenadante, antes de lavar el gel con DMF al 50 % (5 x 100 ml) y agua de OI (10 x 100 ml). El analisis del ion cloruro liberado en la reaccion indicaba una carga de la amina de 20,6 pmol por g de gel sedimentado.

Una porcion de 37 g (sedimentado) del gel se suspendio en tampon de borato sodico 1 M (37 ml) y el pH se ajusto a 50 9 con hidroxido de sodio 10 M. Se anadio diclorhidrato de 4-aminobenzamidina (1,93 g) en una porcion. La mezcla se agito a 60 °C durante toda la noche, mientras el pH se mantiene a 10. La suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (15 x 150 ml). El gel se lavo con agua de OI (10 x 150 ml), antes de almacenar en una camara frigonfica a 4 °C en etanol acuoso al 20 % en v/v.

55 Ejemplo 6 - Sintesis de adsorbente VII

Se suspendio gel Purabead de agarosa reticulado al 6 % (650 g sedimentados en agua de OI) con agua de OI (438 ml), hidroxido de sodio 10 M (NaOH) (59 ml) y epiclorhidrina (83 ml). La suspension se agito durante 2 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis

de los grupos epoxi mostraba que el gel se hada derivado con 16,5 jmol de grupos epoxi por g de gel sedimentado.

El gel se dreno antes de anadir agua de OI (520 ml) y una solucion de amoniaco con un peso espedfico de 0,88 (130 ml). La mezcla se agito y se calento a 40 °C, y a continuacion se agito a esta temperatura durante 16 horas. 5 Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con agua de OI (12 x 1 l). El analisis TNBS para grupos amina mostraba que el gel se hada derivado con 22,9 jmol de grupos amina por g de gel sedimentado.

Una porcion de 150 g del gel aminado sedimentado se suspendio con DMF (150 ml), y a continuacion se deja 10 drenar. A continuacion, este gel se suspendio con DMF (75 ml) y DIPEA (1,38 ml) con agitacion. La mezcla se agito durante 10 minutos, y a continuacion se anadio 4-(4-morfolino) anilinildiclorotriazina (2,58 g) en DMF (75 ml) en una porcion. La mezcla se agito a temperatura ambiente durante 3 horas. Despues de tomar una muestra para su analisis, la suspension se filtro y se lavo con DMF acuosa al 70 % en v/v (4 x 150 ml), DMF acuosa al 50 % en v/v (2 x 150 ml), y agua de OI (12 x 150 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se hada derivado 15 con 21,4 |jmol de monoclorotriazina sustituida por g de gel sedimentado. El analisis de la amina residual indicaba que se manteman 0,8 jmol de grupos amina por g de gel sedimentado despues de la derivacion.

Una porcion de 132 g (sedimentado) del gel se suspendio en tampon de borato sodico 1 M (132 ml) y el pH se ajusto a 10 con hidroxido de sodio 10 M. Se anadio sulfato de agmatina (3,73 g) en una porcion. La mezcla se agito a 60 °C 20 durante toda la noche, mientras el pH se mantiene a 10. Despues de tomar una muestra del sobrenadante para su analisis, la suspension se filtro, y a continuacion se lavo con agua de OI (15 x 150 ml). El analisis para la liberacion de cloruro indicaba que el gel se hada derivado con 19,9 jmol de agmatina por g de gel sedimentado.

El gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v durante toda la noche a 25 40 °C, y a continuacion se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25 % en v/v (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M/etanol acuoso al 25% en v/v (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). A continuacion, el gel se incubo en una concentracion final de NaOH 0,5 M durante toda la noche a 40 °C, y se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml). Despues del lavado final se dejo drenar 30 por gravedad, se anadio NaOH 0,5 M (150 ml) y la mezcla se incubo a 40 °C durante toda la noche. El gel se lavo con NaOH 0,5 M (5 x 150 ml), y a continuacion con agua de OI (10 x 150 ml). Despues de lavar con PBS 0,1 M a pH 7,0 (3 x 150 ml), el gel se lavo una vez mas con agua de OI (10 x 150 ml), antes de almacenar en una camara frigonfica a 4 °C en etanol acuoso al 20 % en v/v.

35 Ejemplo 7 - Cromatografia en plasma humano

Se llevaron a cabo experimentos de cromatografia con cada uno de los adsorbentes III, IV, V, VI, y VII, utilizando una columna Omnifit con un volumen de columna de 10 ml y 1 cm de diametro con un sistema de cromatografia Biologic LP. La columna se equilibro con 5 volumenes de columna de citrato de sodio 13 mM, cloruro de sodio 140 40 mM a pH 7,0 y 100 cm/h. A continuacion se cargo plasma humano (0,45 jm filtrado, 100 ml) a 50 cm/h. El lavado posterior a la carga se realizo con citrato de sodio 13 mM, cloruro sodico 140 mM a pH 7,0, hasta un valor de absorbancia basal. A continuacion, la columna se eluyo con glicina 0,3 M, cloruro de sodio 0,5 M y colato de sodio al 1 % en p/v a pH 9,0, y se desinfecto con clorhidrato de guanidina 2 M a pH 7,0. La fraccion de elucion se neutralizo inmediatamente con HCl 0,4 M antes del analisis. Las fracciones de carga, no unida, y de elucion se analizaron por 45 nefelometna para determinar las capacidades de union y de elucion. Se llevo a cabo una SDS PAGE para determinar su pureza.

La pureza de fibrinogeno en cada eluato era superior al 85 %. Las capacidades de union y de elucion se presentan en la Tabla 1.

Tabla 1

Adsorbente: Capacidad de union (mg/ml) Capacidad de elucion (mg/ml)

III: 3,23 3,04

IV: 2,76 0,28

V: 6,43 3,77

VI: 8,36 3,99

VII: 17,97 15,04

Claims

REIVINDICACIONES

1. El uso de un adsorbente de afinidad para la separacion, extraccion, aislamiento, purificacion,

caracterizacion, identificacion o cuantificacion de fibrinogeno o de una protema que es un analogo del fibrinogeno, 5 en el que el adsorbente de afinidad es un compuesto de seleccionado entre:

imagen1

imagen2

en las que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.

5 2. Uso segun la reivindicacion 1, en el que el fibrinogeno se encuentra en una muestra de plasma.
3. Un compuesto de formula III

imagen3

10

en la que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.
4. Un compuesto de formula IV

15

imagen4

en la que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.
5. Un compuesto de formula V

20

imagen5

en la que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.
6. Un compuesto de formula VI

imagen6

5

en la que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.
7.

10

Un compuesto de formula VII

imagen7

en la que A es una matriz de soporte, opcionalmente unida al anillo de triazina por un espaciador.
8. Un compuesto que es un precursor de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las

15 reivindicaciones 3 a 7, en el que A se sustituye por un grupo funcional, unido directa o indirectamente al anillo de triazina, que permite la inmovilizacion del precursor sobre un soporte solido.