ES2570432B1 - Dispositivo para generar hipertermia en células mediante nanopartículas magnéticas (mnps), método de determinación de temperatura en células que hace uso del mismo y uso del dispositivo para determinar temperatura en células - Google Patents

Abstract

Dispositivo para generar hipertermia en células mediante nanopartículas magnéticas (MNPs). Método de determinación de temperatura en células que hace uso del mismo y uso del dispositivo para determinar temperatura en células.#El dispositivo permite generar hipertermia en nanopartículas magnéticas (conocidas como MNPs por sus siglas en inglés) mediante la inducción controlada de un campo magnético de manera que la temperatura de las MNPs afectadas por dicho campo magnético se controla de manera directa y se puede monitorizar para variar dicha temperatura mediante modificaciones en tiempo real del campo magnético inducido y aplicado a dichas MNPs. Todo el proceso se encuentra controlado mediante una unidad central de proceso que a su vez permite automatizar todo el proceso. Asimismo se describen en este documento tanto un método para determinar temperatura celular mediante la implementación del dispositivo de la invención como el uso del mismo para determinar temperatura en células.

Description

DISPOSITIVO PARA GENERAR HIPERTERMIA EN CELULAS MEDIANTE NANOPARTICULAS MAGNETICAS (MNPS), METODO DE DETERMINACION DE TEMPERATURA EN CELULAS QUE HACE USO DEL MISMO Y USO DEL DISPOSITIVO PARA DETERMINAR TEMPERATURA EN CELULAS

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D E S C R I P C I O N

OBJETO DE LA INVENCION

10 El objeto de la invention se enmarca en el campo de la nanotecnologla.

Mas concretamente el objeto de la invention que se describe en este documento esta orientado a un sistema para generar hipertermia en celulas previamente tratadas con nanopartlculas magneticas (MNPs) mediante la induction de Campos Magneticos Alternos 15 (AMFs) con control de las temperaturas alcanzadas en el interior de la celula. Para lograr dicho control el dispositivo consta con la capacidad de aplicar simultaneamente AMFs al cultivo celular tratado con MNPs y a una muestra de referencia de la cual se obtienen las lecturas de temperatura en la cual se encuentra las MNPs en la misma concentration que las presentes en el interior de la celula.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCION

En la actualidad los sistemas existentes empleados para generar hipertermia en nanopartlculas magneticas (MNPs) funcionan mediante el efecto de la induction generada sobre estas por 25 Campos Magneticos Alternos AMFs.

Actualmente existen generadores de AMF que trabajan en una frecuencia fija que es seleccionada previamente sin capacidad de poderse variar esta durante el proceso de aplicacion sobre las MNPs; sin embargo la complejidad del proceso de aplicacion de 30 hipertermia intracelular en cultivos in-vitro, que permiten el correcto estudio de los procesos de muerte celular ampliamente conocidos en la actualidad pero aun por determinar, requiere de un control muy preciso de la temperatura alcanzada por las MNPs absorbidas en el interior de la celula. En la actualidad diferentes estudios y publicaciones intentan dilucidar los procesos generados (apoptosis, autofagia, necrosis, termoablacion etc) que conllevan a la destruction de

estas celulas portadoras de MNPs y expuestas a un AMF. Tambien son conocidas las soluciones que recurren al control de la intensidad del AMF (al tratarse de circuitos resonante LC variando la frecuencia de aplicacion), dicha variacion se hace para lograr mantener una temperatura que como hemos visto en el comentario anterior no toman del interior de las 5 celulas, sino del medio celular (placa de cultivo) empleando sondas de temperatura de fibra optica que no se ven afectadas por el AMF. Dichas soluciones presentan el problema de que al no captarse del interior de la celula el valor de la temperatura tomada no es nada precisa.

Uno de los mayores problemas para la aplicacion de tratamientos de hipertermia en celulas 10 vivas es que la temperatura alcanzada en el interior de las celulas no debe sobrepasar los 45°C ni ser menor de 43°C y en todo caso debe ser controlada. Se presentan por lo tanto dos inconvenientes:

• Al tratarse de un tratamiento que requiere de la aplicacion de AMF no se pueden emplear elementos con partes metalicas para la lectura de la temperatura.

15 • Dado el tamano de las celulas y su naturaleza es imposible medir la temperatura de

su interior sin alterarlas y alterar la medida.

Los actuales equipos para la aplicacion de AMF in-vitro constan de sistemas de medicion de la temperatura alcanzada, pero solo en el medio de cultivo en el cual se encuentran las celulas. El 20 inconveniente de estos es obvio, ya que unicamente pueden reflejar la temperatura del medio, no la alcanzada por las concentraciones de MNPs presentes en los organulos (lisosomas) de las celulas que las contienen tras su absorcion.

Como ya se ha mencionado existen equipos donde las mediciones de temperatura no cuentan 25 con la posibilidad de mostrar la temperatura alcanzada en el interior de la celula, por lo que es imposible con esos dispositivos la obtencion de una temperatura precisa y constante en las MNPs y la determination de la temperatura de las celulas, lo que convierte en tarea practicamente imposible la experimentation precisa de los procesos de hipertermia intracelular.

30 A la vista de lo anterior se hace necesaria una solution a la carencia de una referencia de la temperatura alcanzada en el interior de la celula y a la imposibilidad de una supervision y ajuste continuo automatizado de la temperatura de las MNPs presentes en el interior de la celula durante el proceso de aplicacion del AMF.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

En un primer aspecto de la invention se tiene un dispositivo para generation de hipertermia en MNPs que aporta una solution al problema anteriormente planteado, al permitir generar una 5 variation automatizada de la frecuencia y amplitud del AMF generado, posibilitando la

regulation de la temperatura alcanzada por las MNPs bajo su influencia, asl como la posibilidad de efectuar una medicion de alta precision por comparacion de la temperatura alcanzada por estas MNPs en el interior de la celula.

10 Para ello se emplea al menos una MNP de referencia que es exactamente igual a aquella MNPs que se encuentra en el interior de la celula; si bien preferiblemente se emplea una multitud de MNPs presentadas como una concentration de MNPs calibrada o muestra de referencia de concentration conocida, que sera similar a la conocida en el interior de la celula.

15 Dado que el proceso de captation de las MNPs por las celulas es ampliamente conocido en biologla, las vlas de distribution y asimilacion celular son asimismo conocidas, pudiendose conocer por varios medios la concentration de MNPs en el interior de las celulas una vez estas son depositadas en el medio de cultivo.

20 El dispositivo aqul descrito se basa en el conocimiento de esta concentration para realizar una medicion precisa de la temperatura de una concentration de MNPs o muestra de referencia de concentration conocida ubicada dentro un contenedor como puede ser un tubo Eppendorf que se encuentra alojado en el interior del dispositivo y expuesto al mismo AMF aplicado al cultivo in vitro a procesar.

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Esto permite la lectura continua del contenido de este contenedor (un tubo Eppendorf por ejemplo) mediante una sonda de temperatura sin contacto que puede estar basada en una pila receptora de infrarrojos que esta alojada en el exterior de la zona afectada por el AMF generado cuya incidencia provocarla un aumento de temperatura en sus partes metalicas lo

30 cual irla en detrimento de la medida a realizar; dicha sonda de temperatura sin contacto permite conocer la temperatura de las MNPs de referencia con una precision de 0,01 °C, que sera similar a la temperatura alcanzada por las MNPs absorbidas por las celulas presentes en el cultivo in vitro.

En un segundo aspecto de la invention se tiene un metodo para determinar temperatura en celulas utilizando del dispositivo para generation de hipertermia en MNPs del primer aspecto de la invention. Dicho metodo del segundo aspecto de la invention requiere de la insertion previa de nanopartlculas magneticas MNPs en la celula, dicha insertion se puede hacer de 5 distintas maneras, siendo la funcionalizacion (por ejemplo con una protelna) de las MNPs de manera que la celula ingiera las mismas hacia su lisosoma un ejemplo, pero puede llevarse a cabo de otras maneras. Una vez tenemos las celulas con las MNPs en su interior se depositan en el portamuestras del dispositivo de la invention el cual ya tiene las nanopartlculas magneticas de referencia en el contenedor y se procede a generar al menos un campo 10 magnetico, preferiblemente alterno (conocido por sus siglas en ingles AMF) y controlado de forma continua en el interior de la bobina, preferiblemente en una zona donde el campo magnetico inducido sea homogeneo como puede ser la central del interior de la bobina, provocando hipertermia en las MNPs (las que se encuentran en el interior de la celula y las de referencia); dado que ambas MNPs son exactamente iguales y reaccionan igual al campo 15 magnetico se puede determinar la temperatura de unas midiendo las de las otras, es decir se puede determinar la temperatura de las MNPs de referencia mediante la toma de temperatura haciendo uso de la sonda y esa temperatura registrada se tiene por igual a aquella temperatura de las MNPs presentes en el interior de la celula pues son identicas y las condiciones a las que estan sometidas son iguales.

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Al generar el campo magnetico la temperatura de ambos tipos de MNPs, las de referencia y las ubicadas en el interior de la celula sufren una elevation de temperatura (hipertermia) a causa de la incidencia del campo magnetico AMF, a continuation se procede a captar mediante la sonda de temperatura sin contacto la temperatura de las nanopartlculas magneticas de 25 referencia, alojadas preferentemente en el fondo del tubo Eppendorf, para posteriormente poder, de manera indirecta, determinar la temperatura de las nanopartlculas magneticas que estan en el interior de la celula a partir de la temperatura de estas nanopartlculas magneticas de referencia. Cabe destacar que el contenedor, en este caso el tubo Eppendorf, se encuentra ubicado en el interior de la bobina de tal manera que la sonda de temperatura se encuentra 30 ubicada en una zona externa al campo magnetico generado por la bobina, mientras que las MNPs de referencia se encuentran ubicadas en el contenedor en una zona interior de la bobina donde el campo magnetico es homogeneo, es decir en una zona esencialmente central del interior de la bobina.

En un tercer aspecto de la invention se tiene un uso del dispositivo para generation de hipertermia en MNPs del primer aspecto de la invencion para determinar temperatura en celulas.

5 DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

Para complementar la description que se esta realizando y con objeto de ayudar a una mejor comprension de las caracterlsticas de la invencion, de acuerdo con un ejemplo preferente de realization practica de la misma, se acompana como parte integrante de dicha descripcion, un 10 juego de dibujos en donde con caracter ilustrativo y no limitativo, se ha representado lo siguiente:

Figura 1.- Muestra una section de un detalle del modulo generador de campos magneticos alternos AMFs.

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Figura 2.- Muestra un esquema del dispositivo de la invencion donde se aprecian los distintos componentes que lo conforman.

Figuras 3a, 3b - 3a) Muestra la capacidad de calentamiento de un primer tipo de MNPs 20 (MNP1) durante la aplicacion de un campo magnetico alterno para dos concentraciones diferentes. 3b) Muestra la capacidad de calentamiento de otros dos tipos de MNP (MNP2 y MNP3) que se encuentran a una misma concentration.

Figura 4.- Muestra los resultados obtenidos tras realizar un analisis in vitro de celulas con 25 MNPs y tratadas con hipertermia (HPTM).

Figura 5.- Muestra imagenes de microscopio optico donde se aprecian celulas tratadas solo con MNP y, en un segundo recuadro, celulas tratadas con MNPs durante 60 minutos de campo magnetico alterno.

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REALIZACION PREFERENTE DE LA INVENCION

En una realizacion preferida de un aspecto de la invencion referido a un dispositivo (1) para generar hipertermia en nanopartlculas magneticas (76) como el que se muestra en la figura

2, este presenta un modulo generador (7) de Campos Magneticos Alternos (AMFs), como el mostrado en la figura 1, el cual se encuentra gobernado por una unidad central de proceso (2) y englobado en una camara isotermica que aloja al menos el modulo generador (7) de campos magneticos alternos AMFs.

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Dicho modulo generador (7) de AMFs se encuentra adaptado para poder modificar al menos una de: frecuencia y amplitud de una onda a aplicar donde dicha modification puede ser una variation en base al valor de una temperatura previamente medida en unas MNPs de referencia; contemplandose la posibilidad de que dicha variacion de pueda producir de 10 manera automatica. En una posible realization alternativa se puede hacer uso de algoritmos que son seleccionados previamente, de manera que la regulation de la temperatura pueda efectuarse de varias formas: modulation de pulsos, de frecuencia, de amplitud o mixtas.

El modulo generador (7) de AMFs esta basado en un sintetizador de frecuencias (3) 15 destinado a controlar la modulacion en frecuencia y que es controlado digitalmente y que posteriormente es amplificado por un una formation de transistores tipo de IGBTs (sus siglas en ingles correspondientes a: Insulated-gate bipolar transistor) que eleva una tension hasta una limites necesarios para generar una onda senoidal con unas caracterlsticas necesarias para ser aplicada a un circuito de acoplamiento inductivo y a una bobina 20 aplicadora. Un modulo de tension regulable varla el voltaje entregado a los IGBTs y de esta forma controla la modulacion en Amplitud que sera la encargada de aplicar el AMF al cultivo in vitro y a las muestras de referencia de concentration conocida en el interior del tubo Eppendorf de manera simultanea.

25 El dispositivo (1) posee un sistema de criostato que permite controlar por microprocesador la temperatura de la bobina aplicadora del AMF en un valor prefijado mediante el control de la temperatura de un fluido que circula por su interior, y que permitira en todo momento mantener las condiciones de temperatura ambientales dentro de los parametros seleccionados (normalmente 37°C), lo que permite la realizacion de experimentos con 30 cultivos in vitro dentro de parametros estables y biologicamente aceptables.

El conjunto cuenta con un modulo de visualization de datos que facilita la visualization de parametros correspondientes a la aplicacion de AMFs a las MNPs y que tiene la capacidad de obtener y mostrar lecturas en tiempo real de todos los parametros del proceso

(temperatura de las MNPs, corriente por la bobina aplicadora, frecuencia, amplitud, temperatura ambiente, etc.), datos que pueden representados graficamente y almacenados por un sistema SCADA (Supervisory Control And Data Acquisition) que permite emplear, tambien en tiempo real, estos datos para posteriores trabajos de representation y analisis.

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Adicionalmente, se han realizado las siguientes pruebas de concepto para determinar las condiciones de funcionamiento de la presente invention en diferentes escenarios:

Escenario 1. Monitoreo de nanopartlculas para su capacidad de calentar

10

Las figuras 3A y 3B ilustran la capacidad de calentamiento de MNPs durante la aplicacion de un campo magnetico alterno para diferentes materiales de muestra mostrando, por una parte, la temperatura de la muestra y, adicionalmente, la temperatura de la bobina (coil normalmente, por su nomenclatura en ingles).

15

Una dispersion de MNPs en agua se coloco en un tubo Eppendorf y se coloco en el equipo. Un campo magnetico alterno se aplico con una intensidad de 250 kHz durante 40 minutos. La temperatura de la bobina se fijo a 37 oC, y la temperatura de la muestra se midio por la camara sin contacto (conocidas en la tecnica como camaras "non-contact”). Ambas 20 temperaturas se registraron utilizando el software SCADA y se representaron graficamente para ver la capacidad de calentamiento de cada muestra.

Haciendo referencia a la figura 3A, se ilustra, en primer grafico (31) la temperatura alcanzada para un intervalo de tiempo de una muestra de un primer material MNP1. Como 25 conclusion principal, para una muestra de MNP1 se observa que alcanza una temperatura maxima de 49 oC y una variation de temperatura desde el tiempo 0 hasta el tiempo 2500 de 12 oC.

En un segundo grafico (32), se ilustra que una muestra de MNP1 concentrada 10 veces, 30 alcanza una temperatura maxima de 58 oC y una variacion de temperatura desde el tiempo 0

hasta el tiempo 2500 de 20,5 oC.

Haciendo referencia a la figura 3B, se ilustra, en tercer grafico (33) en el que la temperatura maxima alcanzada para una muestra de MNP2 es de 44 oC y una variacion de temperatura

durante el intervalo de tiempo analizado de 6,5 oC.

En un cuarto grafico (34), se ilustra que una muestra de MNP3, alcanza una temperatura maxima de 38,5 oC y una variacion de temperatura durante el intervalo de tiempo analizado 5 de 1,5 oC.

10

A partir de la pendiente de la curva de la temperatura de la muestra en los primeros 60 segundos de la aplicacion de la AMF, se midio el Indice de absorcion especlfica de la MNPs (curva SAR, de ingles specific absorrption rate), utilizando la ecuacion:

SAR

Cs ( AT) ,

— * (mFF ) ;

mFe At

En la que Cs es la capacidad de calentamiento del dispersante, mFe y mFF la masa de hierro y del ferrofluido respectivamente, y AT/At es la pendiente de la curva.

15

En particular, para el caso de la muestra de MNP1 (es decir, la muestra del primer grafico (31) de la figura 3A):

SAR = C • (mFF —) = 16W / g

mFe At

20 Siendo:

Cs = 4,181J/g oC mFe = 2,505mg mFF = 0,15g

25 AT/At = 0,0618 oC/s

Escenario 2. Analisis in vitro de celulas con MNPs y tratadas con hipertermia

En un ejemplo de realizacion, la llnea celular de cancer de pancreas Panc02 se utilizo para 30 probar la eficacia del equipo logrando la muerte de celulas tratadas con MNP tras la aplicacion de un campo magnetico alterno.

Las celulas fueron tratadas aplicando MNPs al medio de cultivo y se incubaron durante una noche para que entrara en las celulas, tras lo cual se lavan con PBS. A continuation, se insertaron las celulas tratadas con MNPs y celulas sin ningun tratamiento en el equipo y se aplico un campo magnetico alterno (250 kHz) durante una hora. La temperatura se fijo para 5 alcanzar hasta 45 oC.

Haciendo referencia a la figura 4, en un octavo grafico (8) se puede observar el aumento de temperatura asl como la intensidad del campo. Como controles, se utilizaron celulas con o sin MNPs, en el que no se aplico AMF alguno.

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Despues del tratamiento aplicado mediante AMFs durante una hora, la viabilidad celular se midio usando el kit de la actividad metabolica PrestoBlue. Los resultados se muestran en un noveno grafico (9). Las celulas que fueron tratadas con MNPs y AMF durante una hora demostraron una disminucion del 40% de la viabilidad, lo que demuestra que tuvo lugar un 15 proceso de hipertermia (HPTM) causando muerte de las celulas tumorales.

Despues de 24 horas, se observo una muerte celular incluso mayor, no observada para celulas sin tratamiento AMF tal y como se desprende de la figura 5, en la que, en un primer recuadro (10) se observan imagenes de microscopio optico de las celulas tratadas solo con 20 MNP y, en un segundo recuadro (11), las imagenes de microscopio optico obtenidas para celulas tratadas con nanopartlculas y 60 minutos de campo magnetico alterno, obtenidas a las 24 horas de la aplicacion de este.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   R E I V I N D I C A C I O N E S

   1. Dispositivo (1) para generar hipertermia mediante nanoparticulas magneticas (76), dispositivo caracterizado por que comprende asociados a una unidad central de proceso (2):

   • un sintetizador de frecuencias (3) digital,

   • un modulo de control de amplitud (4) ,

   • un amplificador de potencia (5) asociado al sintetizador de frecuencias (3) y al modulo de control de amplitud (4), amplificador de potencia (5) que comprende una formacion de transistores tipo IGBTs para ampliar las mismas y elevar una tension hasta una limites necesarios para generar una onda senoidal,

   • un circuito de acoplamiento (6) asociado al amplificador de potencia (5) y adaptado para recibir la onda senoidal, y

   • un modulo generador (7) de campos magneticos alternos AMFs asociado al circuito de acoplamiento (6) y que a su vez comprende:

   o una bobina (71) asociada al circuito de acoplamiento (6) y adaptada para generar campos magneticos alternos AMFs, continuos y/o pulsados, o un contenedor (72) ubicado al menos parcialmente en el interior de la bobina (71) de tal manera que al menos parte de su contenido sea susceptible de recibir los campos magneticos alternos AMFs que genera la bobina (71), o al menos una nanopartlcula magnetica de referencia (73) ubicada en el interior del contenedor (72),

   o una sonda de temperatura (74) sin contacto asociada al contenedor (72) y ubicada de tal manera que no sea susceptible de recibir los campos magneticos alternos AMFs que genera la bobina (71), y o un portamuestras (75) ubicada en el interior de la bobina (71) en contacto con una parte inferior de la contenedor (72) y de tal manera que al menos parte de su contenido sea susceptible de recibir campos magneticos alternos AMFs que genera la bobina (71), portamuestras (75) que comprende en su interior las nanoparticulas magneticas (76).
2. 2. Dispositivo segun reivindicacion 1 caracterizado por que adicionalmente comprende un sistema de criostato asociado a la una unidad central de proceso (2) y operativo para

   controlar mediante dicha unidad central de proceso (2) una temperatura de la bobina

   11

   5

   10

   15

   20

   25

   30

   aplicadora en un valor prefijado mediante un control de la temperatura de un fluido que circula por su interior.
3. 3. Dispositivo segun reivindicacion 1 caracterizado por que adicionalmente comprende un modulo de visualizacion de datos adaptado para facilitar la captacion y visualizacion de datos correspondientes a la aplicacion de AMFs a las MNPs.
4. 4. Dispositivo (1) segun reivindicacion 1 caracterizado por que la sonda de temperatura comprende una pila receptora de infrarrojos.
5. 5. Dispositivo (1) segun reivindicacion 1 caracterizado por que adicionalmente comprende una camara isotermica que aloja al menos el modulo generador (7) de campos magneticos alternos AMFs.
6. 6. Dispositivo (1) segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el contenedor (72) se encuentra ubicado en el interior de la bobina (71) de tal manera que la nanopartlcula magnetica de referencia (73) se encuentre en una zona central de la bobina (71) donde los campos magneticos alternos AMFs son homogeneos.
7. 7. Metodo para determinar temperatura en celulas, metodo caracterizado por que hace uso del dispositivo (1) descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 y por que comprende:

   i. insertar una pluralidad de nanopartlculas magneticas (76) en el interior de al menos una celula,

   ii. colocar en el portamuestras (75) una muestra que comprende la celula con las nanopartlculas magneticas (76) en su interior,

   iii. generar al menos un campo magnetico alternos AMF en el interior de la bobina (71) provocando hipertermia en las nanopartlculas (73 ,76)

   iv. captar mediante la sonda de temperatura (74) una temperatura de las nanopartlculas magneticas de referencia (73),

   v. determinar una temperatura de las nanopartlculas magneticas en el interior de las celulas (76) a partir de la temperatura de las nanopartlculas magneticas de referencia

   (73), y

   vi. asignar como valor de temperatura de las nanopartlculas alojadas en el interior de la

   celula (76) el valor de la temperatura de las nanopartlculas magneticas de referenda (73).
8. 8. Metodo segun reivindicacion 7 caracterizado porque el paso i comprende

   5 funcionalizar la MNP e insertarla en un medio en el cual se encuentran las celulas de

   manera que las MNPs entran en el interior de la celula.
9. 9. Metodo segun reivindicacion 7 caracterizado por que la nanopartlcula magnetica de referencia (73) se encuentra en una suspension de concentracion conocida.

   10
10. 10. Metodo segun reivindicacion 7 caracterizado por que las nanopartlculas magneticas de referencia (73) se encuentran en concentracion similar a aquella presente en el interior de la celula (75); donde dicha concentracion depende de al menos uno de estos valores: volumen de lisosoma de la celula, el tipo de nanopartlculas (73,76), el tiempo

    15 de exposicion del cultivo celular a las nanopartlculas (76), y la funcionalizacion de las

    nanopartlculas (76).
11. 11. Metodo segun reivindicacion 7 caracterizado por que la temperatura maxima provocada en el paso iii es de 45°C.

    20
12. 12. Uso del dispositivo (1) descrito en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 para determination de temperatura en celulas.