ES2568228T3 - Uso de SS’-dimetil-gliotoxina como marcador diagnóstico de patologías causadas por hongos productores de gliotoxina o de sus derivados - Google Patents

Uso de SS’-dimetil-gliotoxina como marcador diagnóstico de patologías causadas por hongos productores de gliotoxina o de sus derivados Download PDF

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Universidad de Zaragoza
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Abstract

Un método in vitro para el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de patologías causadas por hongos productores de gliotoxina o de derivados de gliotoxina caracterizado por la detección de SS'-dimetil-gliotoxina en la muestra biológica de un sujeto, donde los hongos son hongos del género Aspergillus.

Description

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Barcelona, España) se utilizaron como disolventes. La separación y cuantificación de GT y bmGT se realizó con una mezcla de THF: C7: ACN (40:58:2) (v: v: v) durante 3 min.
Detección y cuantificación mediante espectroscopía UV se utilizó un escáner TLC3 (Camag) en el modo UV con el que se llevó a cabo densitometría de barrido UV para la determinación de GT y bmGT (longitud de onda (λ) = 280 y 367 nm). Un barrido lineal con un haz de 4 mm × 0,2 mm se utilizó en ambos casos. El área bajo los picos fue cuantificada y guardada utilizando el software de Camag.
Espectrometría de masas (MS):
Para la extracción de la GT y bmGT de las placas de HPTLC se utilizó un interfaz HPTLC-MS de Camag, utilizando MeOH como disolvente.
Para la identificación de GT y bmGT se utilizó un sistema de MS Sciex MDS, 3200 Q TRAMPA LC / MS / MS (Applied Biosystems) equipado con una fuente de ionización de electrospray (ESI).
Resultados
Aunque la GT fue aislada y caracterizada originalmente por cromatografía en capa fina (TLC) (Mullbacher A et al. 1985. J Gen Micorbiol 131(5):1251-1258; Mullbacher A et al. 1984 Proc Natl Acad Sci USA 81(12):3835-3837), los métodos de detección habituales se basan actualmente en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas (MS) (Sulyok et al. 2007 Anal Bioanal Chem 389(5):1505-1523; Vishwanath V et al. 2009 Anal Bioanl Chem 395(5):1355-1372). Aquí hemos empleado un método basado en HPTLC para separar, detectar y cuantificar GT y bmGT más sensible que los descritos en el estado del arte. Las ventajas principales del uso de HPTLC frente a HPLC son que las operaciones son más baratas, los resultados más rápidos y la posibilidad de analizar varias muestras al mismo tiempo para el análisis comparativo. Además, pueden ser ejecutados por personal del laboratorio no especializado. Por ejemplo, hemos sido capaces de analizar (detección, separación y cuantificación) 10 muestras en menos de 10 minutos, incluyendo la recuperación de la muestra.
En primer lugar se establecieron las condiciones óptimas para la extracción y separación de la GT y bmGT. Para ello hemos utilizado mezclas de compuestos puros o suero comercial humano al que se han añadido cantidades conocidas de estas mezclas. La separación óptima se obtuvo con la mezcla de disolventes C7: THF: ACN (58:40:2) (FIG. 2). Este protocolo de elución se utilizó en todos los estudios posteriores.
A continuación se determinó el límite de detección (LOD) y cuantificación (LOQ) de las diferentes técnicas. Con este objetivo se realizaron mezclas de GT y bmGT y suero comercial humano en el rango de 1 a 75 ng/punto aplicación para cada toxina. Las muestras se aplicaron a la placa HPTLC, se desarrollaron los cromatogramas y la señal obtenida de las muestras se comparó con las muestras del blanco (suero humano sin toxinas) aplicadas al mismo tiempo. La muestra que originaba una relación señal-ruido de 3 fue seleccionada como LOD y de 10 como LOQ.
Detección por UV:
En primer lugar, se analizaron los espectros de absorción de GT y bmGT después de su elución a partir de mezclas de compuestos puros. Los espectros presentaban dos máximos de absorción a 280 y 367 nm para la GT, mientras que sólo un máximo se observaba a 280 nm para la bmGT (FIG 1A). Es importante destacar que estas diferencias entre los espectros son útiles para diferenciar y cuantificar los compuestos. Con el fin de evaluar si los componentes del suero inducían cambios en el espectro UV de GT y bmGT, se analizó el efecto del suero humano. Se añadió GT
o bmGT a suero humano comercial, y posteriormente los compuestos se extrajeron, se aplicaron sobre las placas, se separaron y los espectros de UV se analizaron. Como se muestra en la FIG 2B los espectros de GT y bmGT eran idénticos a los de los compuestos puros (FIG 2A). Mediante el uso de la detección UV, hemos sido capaces de detectar 5 y 10 ng de GT y bmGT, respectivamente. Los límites de detección obtenidos son mejores que con otros métodos más complejos que los empleados en la presente invención. La cantidad más pequeña de GT utilizada en métodos como HPLC-MS fue de 15 ng en muestras de alimentos (Sulyok M et al. Anal Bioanal Chem 389(5):15051523) y 20 ng en cultivos de A. fumigatus (Kupfahl C et al. 2008 Int J Med Microbiol 298(3-4):319-327) o en muestras de suero humano (Lewis RE et al. 2005 Infect Immun 73(1):635-637. Un problema importante para este tipo de técnicas (HPCL-MS) podría ser un efecto matriz que produce una supresión de la señal, lo que reduce la sensibilidad de la detección. Otros métodos de HPLC necesitaban más 45ng de GT pura (Kupfahl C et al. 2008 Int J Med Microbiol 298(3-4):319-327; Kupfahl C et al. FEMS Yeast Res 7(6):986-992; Richard JL et al. Mycopathologia 107(2-3):145-151) añadida a muestras de alimentos o biológicas. La comparación con otros métodos que utilizan TLC indica que más de 100 ng / punto de aplicación eran requeridos para detectar la GT (Puri A et al. 2010 Biomed Chromatogr 24 (8):887-892; Wilhite S et al. 1994 Phytopathology 84(8):816-821). El método descrito en la presente invención permite detectar cantidades de GT y bmGT incluso más bajas que bioensayos específicos que necesitaban más de 18 ng de compuesto (Grovel O et al. 2006 J Microbiol Methods 66(2):286-293). Este método de detección (UV) fue elegido para la detección y cuantificación de GT y bmGT en muestras humanas. Recientemente,
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Trasplante cardiaco probable 1.22 - 3.52
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Oncología hematológica posible - - 14.26
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Pancitopenia. posible - - 19.99
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1 todas las muestras son suero excepto la 20 y la 21 que son lavados broncoalveolares. Para la obtención del suero la sangre se centrifugó a 2000 rpm durante 15 minutos y se recolectó la fracción soluble. Los lavados broncoalveolares se filtraron con un filtro de 0,2 µm. La extracción se realizó con diclorometano tal y como se
5 describe anteriormente.
2 enfermedad subyacente a la AI. ALL: Leucemia linfoblastica aguda; AML: Leucemia mieloide aguda; MG: Gammapatía Monoclonal; CLL: Leucemia linfática crónica; MS: síndrome mielodisplásico; MM: Mieloma múltiple
10 3 según las directrices EORTC/MSG para la clasificación de infecciones fúngicas
4 Indice superior a 0,5 es considerado como positivo
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