ES2561112T3

ES2561112T3 - Uso de ulvanos como activadores de las reacciones de defensa de las plantas y de resistencia contra las limitaciones bióticas o abióticas

Info

Publication number: ES2561112T3
Application number: ES05746653.4T
Authority: ES
Inventors: Xavier Briand; Stéphanie CLUZET; Marie-Thérèse ESQUERRE-TUGAYE; Sylvie Salamagne; Bernard Dumas
Original assignee: CENTRE MONDIAL D'INNOVATION
Current assignee: CENTRE MONDIAL D'INNOVATION
Priority date: 2004-03-30
Filing date: 2005-03-30
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2025-03-30
Also published as: CA2838231C; PT1729582E; BRPI0509523A; EP1729582B1; FR2868253B1; PL1729582T3; CA2838231A1; FR2868253A1; US20070232494A1; CA2561378C; WO2005094588A1; EP1729582A1; CA2561378A1; US7820176B2

Abstract

Uso de ulvanos, o de oligosacáridos derivados de ulvanos obtenidos mediante hidrólisis ácida o enzimática de dicho ulvano, como activadores de las reacciones de defensa de las plantas y de resistencia contra las limitaciones bióticas o abióticas.

Description

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siguiente.

TABLA 1: Composición de los extractos de algas verdes

Alga: % de ulvanos (% del peso seco del alga) % de azúcares totales % de sulfato % de proteínas

UIva armoricana: 7-15 50-50 10-20 3-7

Ulva rigida: 5-15 50-50 13-17 1-10

Ulva rotundata: 6-15 50-70 10-20 1-10

Ulva lactuca: 5-17 50-70 10-20 1-8

Enteromorpha intestinalis: 5-15 45-75 15-20 1-10

Enteromorpha compressa: 5-16 50-75 10-20 1-12

Alga: Ram Gal Glc Xil GlcA IdoA

Ulva armoricana: 45-50 1-4 5-20 6-15 15-25 5-15

Ulva rigida: 50-60 0,5-2 5-8 5-15 18-35 2-5

Ulva rotundata: 45-55 1-3 5-15 5-25 16-30 0,5-5

Ulva lactuca: 45-60 0,5-5 2-6 1-10 15-25 2-5

Enteromorpha compressa: 25-50 1-5 2-10 5-15 10-20 5-10

Enteromorpha intestinalis: 30-50 1-4 1-5 6-15 15-20 5-10

5 EJEMPLO 2 A -Puesta de manifiesto de los efectos de los ulvanos sobre la expresión de genes de una planta modelo

10 Se realizó un análisis global de la expresión de numerosos genes involucrados en la defensa de una planta modelo usando técnicas de genómica funcional. La leguminosa Medicago truncatula (número elevado de secuencias de ADN disponibles) se utilizó como planta modelo.

De esta forma se estudió el efecto de los ulvanos sobre aproximadamente 200 genes implicados en la defensa de 15 esta planta modelo mediante análisis de macromatrices. a) Material biológico Las plantas de Medicago truncatula línea F83 005.5 se cultivaron en un ambiente controlado (16 h / 8 h, 20°C / 15°C,

20 60 % de humedad). Los productos estudiados (extractos obtenidos de acuerdo con el procedimiento del ejemplo 1) se aportaron bien por vía foliar, o por vía radicular.

25 En el caso de aportación foliar, las diferentes soluciones de activadores se pulverizaron sobre las hojas de plantas que tenían 1 mes de edad a la concentración de 1 mg/ml. En el caso de aportación radicular, los productos se introdujeron en el medio nutriente. 30 El estudio de la expresión global de los genes potencialmente implicados en la defensa y la señalización se vigiló mediante macromatrices. b) Preparación de las macromatrices

35 La selección de etiquetas de genes expresados (EST) de Medicago truncatula basada fundamentalmente en su implicación en la defensa de los vegetales y en el metabolismo primario se realizó utilizando las bases de datos TGIR y MENS.

De las bibliotecas MtBA, MtBB y MtBC se recuperaron 165 EST procedentes de 144 secuencias de Medicago truncatula (secuencias de consenso posibles (TC)).

8 fragmentos de genomas (TC76726, TC77277, TC77910, TC77988, TC78214, TC85619, TC86687, TC85808) se 5 amplificaron mediante PCR utilizando ADN genómico de Medicago truncatula como cebador. Estos 8 EST se clonaron a continuación en el vector pGEM-Teasy (Promega) y se verificaron mediante secuenciación.

Los 173 fragmentos de ADN se amplificaron mediante PCR utilizando cebadores universales complementarios de las secuencias vectores que rodeaban el sitio de clonación de ADN. Los productos de amplificación se analizaron 10 mediante electroforesis y se ajustaron 0,2-0,5 µg/ µl con DMSO (50 %) y se depositaron sobre una membrana con un robot (Eurogridder spotting robot).

c) Resultados

15 La actividad activadora de los ulvanos extraídos de algas se estudió siguiendo la expresión simultánea de varios cientos de genes. Las distintas categorías de los EST seleccionados se clasificaron según familia: ruta de los fenilpropanoides, biosíntesis de fitoalexinas, proteínas de las paredes, defensa celular, estrés oxidante, RH de senescencia, ruta del etileno, síntesis de lípidos, estreses abióticos, transducción de señales, nodulinas, genes constitutivos.

20 Los extractos de algas verdes ricos en ulvanos conducen a la inducción de 16 a 31 genes potencialmente implicados en la defensa sin alterar el metabolismo primario. Se obtuvieron respuestas similares para los 2 tipos de aportación, es decir, foliar y radicular. Se observa así, para el conjunto de los tratamientos, esencialmente la inducción de genes relacionados con las familias de proteínas de las paredes, biosíntesis de fitoalexinas y defensa celular.

25 La inducción de genes es más importante para los ulvanos ricos en derivados del ácido xiloiduroramnano, como por ejemplo los ulvanos de Ulva armoricana y Enteromorpha intestinalis. Estos últimos también tienen la particularidad de producir un gen implicado en la vía de las oxilipinas. Los oligoulvanos obtenidos tras la hidrólisis presentan resultados idénticos.

30 Tabla 2. Efectos de los ulvanos de diferentes algas verdes sobre la expresión de determinados genes en macromatrices

Familia de genes: Nb de TC1 Ulva Enteromorpha

U. armoricana: U. rigida U. rotundata U. lactuca E. compressa E. intestinalis

Ulvanos: Oligoulvanos

Ruta de los fenilpropanoides: 8 4 4 3 3 2 3 4

Ruta de las fitoalexinas: 10 5 5 3 2 2 4 5

Proteínas de las paredes: 17 6 5 4 5 3 3 6

Defensa celular: 8 2 2 2 2 1 2 1

Estrés oxidante: 20 5 5 5 4 3 3 5

RH de senescencia: 3 1 1 1 1 1 1

Producción de etileno: 2 0 0 0 0 0 0 0

Vía de las oxilipinas: 23 2 2 2 0 0 0 1

Estreses abióticos: 3 1 1 1 1 1 1 1

Transducción de señales: 8 4 3 4 4 3 3 4

Nodulinas: 6 0 0 0 0 0 0

Otros: 8 1 1 0 1 0 0 1

Total: 116 31 29 23 23 16 20 29

1 Los valores corresponden al número de TC (TIGR Tentative Consensus Sequence) para cada familia de genes.2 Los valores son el promedio de 3 tratamientos independientes que corresponden al número de genes inducidos. 35 Solamente se han incluido los genes inducidos dos veces seguidas (cocientes 1,5).

d) Influencia del número de tratamientos en la sensibilización de la planta

Se llevó a cabo una segunda serie de experimentos para evaluar el efecto de la sensibilización de la planta tratada

40 con el extracto de Ulva armoricana durante el ataque fúngico. Se evaluó de esta forma el efecto de un segundo tratamiento con extracto de Ulva armoricana, 3 días después de la primera pulverización. Los efectos sobre la expresión de los genes se estudiaron mediante macromatrices.

Los tratamientos efectuados en una o dos aportaciones inducen la expresión de un elevado número de genes implicados en los mecanismos de defensa y de señalización en un grado similar.

Los tratamientos inducen la expresión de genes en todas las categorías funcionales: 5 -la de los fenilpropanoides: fenilalanina amoniaco liasa, ácido cafeico O-metiltransferasa, alcohol cinamílico

deshidrogenasa, -la de las fitoalexinas: chalcona reductasa, isoflavone reductasa, vestitona reductasa, -la de las proteínas parentales: extensina, glicoproteína rica en hidroxiprolina, proteína rica en arabinogalactana,

10 proteína rica en prolina, prolil hidroxilasa endo, endo-1,3-1,4-β-D-glucanasa, -la de los genes de defensa: PR10-1, endoquitinasa, SRG1, inhibidor de poligalacturonasa, PR1.

En el caso del estrés oxidativo, se observa la inducción de la expresión de diferentes genes que codifican diferentes enzimas: ascorbato peroxidasa, peroxidasa, superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa o glutatión S-transferasa.

15 En el metabolismo de los lípidos se inducen diferentes genes implicados en la vía de las oxilipinas, en particular las fosfolipasas D y C, tres lipoxigenasas, una desaturasa y una oxofitodienoato reductasa. Dos tratamientos consecutivos inducen la expresión de un número mayor de genes (6 genes respecto a 2).

20 TABLA 3: Efectos de los ulvanos de Ulva armoricana (AV) en la expresión de algunos genes en macromatrices

Tratamiento

TC TIGRb: Función N.º registro en GBc AVd AV+AVe

1: 2 3 1 2 3

Ruta de los fenilpropanoides

TC85501: fenilalanina amoniaco liasa AL372483 NS 2,33 1,83 1,18 4,44 1,00

TC85550: ácido cafeico Ometiltransferasa AL367074 1,52 1,93 2,54 NS 4,33 1,90

TC85894: cafeoil-CoA O-metiltransferasa AL368189 2,03 0,67 1,57 NS 1,22 NS

TC77145: alcohol cinamílico deshidrogenasa AL372163 1,00 5,47 4,33 1,03 3,40 2,01

Ruta de las fitoalexinas

TC76884: chalcona sintasa AL369218 1,20 NS 1,45 4,92 0,96 4,01

TC85146: chalcona sintasa AL368203 1,00 2,09 2,34 2,00 NS 1,13

TC85169: chalcona sintasa AL370220, AL385833 1,51 2,93 1,54 2,17 0,97 2,42

TC85521: chalcona reductasa AL381630 1,00 1,00 NS 1,85 1,00 2,95

TC85633: chalcona isomerasa AL381790 2,01 3,31 1,25 4,88 6,04 5,17

TC85477: isoflavona reductasa AL384237 1,68 3,61 2,55 3,41 2,25 5,99

TC85478: isoflavona reductasa AL383870 1,00 1,00 NS 1,99 2,09 1,00

TC77308: vestitona reductasa AL383703, AL384920 3,96 1,92 3,09 NS 1,00 1,00

Proteínas de pared

TC76311: extensina AL381854 1,00 2,76 1,79 2,00 2,34 1,47

TC76716: extensina AL373614 1,15 3,08 2,59 1,64 3,51 2,12

TC77527: glicoproteína rica en hidroxiprolina AL370995 0,77 1,19 NS NS 2,50 1,56

TC79404: proteína rica en arabinngalactano AL368602 1,00 2,08 5,16 3,33 3,37 2,97

Tratamiento

TC TIGRb: Función N.º registro en GBc AVd AV+AVe

1: 2 3 1 2 3

Proteínas de pared

TC86688: proteína rica en arabinoqalactano AL381434 1,00 1,94 4,04 0,75 NS 0,74

TC85413: proteína rica en prolina AL386974 3,97 1,29 2,99 NS 1,60 2,59

TC86651: prolil hidrolada AL367499 1,00 1,00 3,30 1,69 2,50 1,00

TC86689: endo-1,3-1,4-β-D-glucanasa AL387547 1,62 1,89 2,09 1,19 2,51 2,00

Defensa

TC76511: PR10-1 AL382676 1,72 5,69 4,40 3,43 1,54 2,15

TC76513: PR10-1 AL373773 2,14 12,14 2,69 3,29 3,04 1,18

-: PR10-1 Y08641 5,12 19,05 0,99 11,22 2,07 2,70

TC76833: endoquitinasa AL380364 1,16 2,19 2,61 1,52 2,22 1,43

TC85427: quitinasa AL388544 1,34 0,75 NS 0,50 NS 0,45

TC85652: SRG1 AL379718 1,41 1,40 NS 1,71 3,50 1,48

TC85805: Inhibidor de poligalacturonasa AL381114 1,80 1,00 1,89 0,97 NS 1,00

TC86002: PR1 AL386306 1,00 1,00 5,22 1,63 2,81 1,00

TC86646: β-1,3-glucanasa AL378026 1,09 1,00 NS 1,00 5,44 1,36

Estrés oxidante

TC76384: ascorbato peroxidasa AL367369 1,60 2,40 1,00 0,90 0,74 NS

TC85974: peroxidasa AL371851 1,05 1,46 NS 2,77 5,38 2,69

TC76946: superóxido dismutasa AL375556 2,49 3,12 1,00 1,40 NS 1,00

TC86106: glutatión peroxidasa AL374155 0,88 1,43 1,40 NS 2,08 1,90

TC85451: glutatión S-transferasa AL368847 1,00 1,16 1,00 1,15 1,55 3,01

TC87485: análogo de germina AL373691 NS 1,32 1,10 1,16 NS NS

Senescencia RH

TC78195: HSR203 AL366024 1,34 2,58 4,38 1,98 2,78 1,31

Señalización de lípidos

TC76357: fosfolipasa D AL383583, AL387293 1,60 1,39 1,44 2,75 5,49 2,40

TC77257: hidroperóxido liasa AL372355 1,35 0,74 1,21 0,84 7,20 1,73

TC82008: fosfolipasa C AL380498 1,00 1,04 NS 1,37 4,17 3,45

TC84245: lipoxigenasa AL371045, AL389771 1,00 1,14 1,46 1,57 1,86 0,83

TC85148: lipoxigenasa AL370268, AL381315 1,75 NS 1,11 2,04 2,03 1,03

TC85171: lipoxigenasa AL378899, AL380164 1,00 NS 1,53 2,27 2,75 NS

TC85192: lipoxigenasa AL387727 2,14 1,02 2,04 1,16 NS 1,00

TC85264: lipoxigenasa AL371045, AL389771 1,00 1,14 1,46 1,20 1,57 1,86

Tratamiento

TC TIGRb: Función N.º registro en GBc AVd AV+AVe

1: 2 3 1 2 3

Señalización de lípidos

TC85619: lipoxigenasa 1,00 1,93 2,05 1,44 NS 0,78

TC85808: oxofitodienoato reductasa 1,00 NS 1,00 1,49 1,92 4,42

TC85814: desaturasa AL367066, AL377575 1,54 0,91 0,95 2,28 1,63 1,41

Estreses abióticos

TC77019: ribonucleasa AL371802 1,52 2,72 1,67 0,47 0,80 NS

Transducción de señales

TC77346: proteína quinasa análoga a un receptor AL383027, AL384392 1,66 1,44 4,89 1,28 NS 1,06

TC76783: calmodulina AL378480 2,40 1,71 1,52 0,82 1,46 NS

TC76643: proteína de respuesta a ABA AL373345 3,27 2,60 1,42 2,04 1,48 NS

TC86374: proteína de transporte ABC AL365693 1,44 1,98 2,71 NS 1,16 NS

Nodulina

TC76916: MtN4 AL376203 0,89 1,11 1,14 NS 1,63 1,58

Otras

TC86776: β-glucosidasa cianogénica AL370555 1,03 NS 1,00 1,38 1,65 1,00

TC78462: proteína unida al ácido nucleico AL367624 1,00 NS NS NS 3,41 3,30

TC85305: acuaporina AL370135 1,04 NS NS 2,02 1,93 2,61

TC87062: ubiquinol-citocromo-c reductasa AL386789 NS 4,41 4,54 3,81 8,96 NS

a: Valores correspondientes a los cocientes de las "intensidades de las señales de las plantas tratadas con el extracto de Ulva (AV)" con respecto a las "intensidades de las señales de las plantas control". Solamente se incluyen los genes inducidos (cociente >1,5) en al menos dos ensayos independientes. En la comparación de los inventores realizada en réplicas de tres experimentos, se considera que el cociente de un solo gen no debe inducirse en una réplica y estar reprimido como mínimo en una de las otras, de lo contrario se considera como no significativo (NS). b: TC TIGR, número de intento de consenso de acuerdo con The Institute of Genome Research. c: GB, número de registro en Genebank. d: AV, un único tratamiento AV. e: AV+AV, dos tratamientos AV consecutivos.

Ejemplo 3 -Puesta de manifiesto de los efectos de los ulvanos sobre la defensa de las plantas frente a los estreses abióticos 5 La experimentación se llevó a cabo con maíz cultivado en macetas a 25 ºC. El extracto de ulvanos se aportó por vía radicular o foliar 17 días después de la siembra. Cuatro días después del tratamiento, las plantas se sometieron a estrés hídrico o térmico (15 ºC). 10 Las plantas se cosecharon 21 días después de la aplicación de los estreses en la fase de 8 hojas. Los resultados del experimento se presentan en la Tabla 4. 15 La aplicación de ulvanos permite luchar parcialmente contra las limitaciones hídricas y térmicas en respuesta a la expresión de los genes de los estreses oxidativos o abióticos.

Tabla 4: Efectos de los ulvanos en plantas de maíz en estado de estrés hídrico y térmico

Peso seco de la planta (en índice)

Control sin estresar: 100

Estrés hídrico

Control sin ulvanos: 60

Peso seco de la planta (en índice)

Aportación foliar: Ulvanos 0,1 g/l 82

Ulvanos 10 g/l: 94

Aportación radicular: Ulvanos 10 g/ha 78

Ulvanos 1000 g/ha: 89

Estrés térmico

Control sin ulvanos: 67

Aportación foliar: Ulvanos 1 g/l 85

Ulvanos 10 g/l: 99

Aportación radicular: Ulvanos 10 g/ha 84

Ulvanos 1000 g/ha: 97

Ejemplo 4 -Puesta de manifiesto de los efectos de los ulvanos sobre la defensa de las plantas frente a los oomicetos

5 El extracto de ulvanos se pulverizó (1 g por litro, es decir, 200 g/ha) sobre plantas de colza cultivadas en macetas en la fase 2 hojas.

El número de plántulas por tratamiento es de 28. La inoculación con Pythium (marchitamiento fúngico) se realizó 3 10 días después del tratamiento.

Las plántulas se clasificaron por observación según la escala de calificación siguiente:

0: Sin ataque

1: Necrosis superficial de longitud inferior a 1 cm

2: Necrosis superficial de longitud superior a 1 cm

3: Necrosis profunda de longitud inferior a 0,5 cm

4: Necrosis profunda de longitud inferior a 1 cm

5: Necrosis profunda de longitud superior a 1 cm

15 Los resultados obtenidos y presentados en la tabla 5 siguiente muestran que el extracto de ulvanos de acuerdo con la invención permite reducir significativamente la incidencia del ataque por Pythium, reduciendo la longitud y la profundidad de las necrosis.

Tabla 5 -Efectos del tratamiento con ulvanos sobre la colza infectada por Pythium

Control: Ulvanos

Necrosis (índice): 2,92 1,61

Peso fresco de las plántulas (g): 0,49 0,69

20 La medida del peso fresco de las plántulas confirma también la mayor resistencia de la colza al ataque fúngico.

Ejemplo 5 -Puesta de manifiesto de los efectos de los ulvanos sobre la defensa de las plantas frente a otros ataques fúngicos

25 a) Interacciones en alfalfa (Medicago truncatula) -Colletotrichum tritolii

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pulverulentos o granulados. Preferentemente, esta cantidad será de 50 a 500 g/ha, y más preferentemente de 150 a 250 g/ha.

Se proporcionan a continuación, a modo de ejemplo, diferentes formulaciones que se pueden utilizar de acuerdo con 5 la invención con indicaciones sobre las condiciones de aplicación de dichas formulaciones.

A -ENMIENDAS

ENMIENDA CALIZA

Lithothamnium 1000 kg Derivados de ulvanos suficiente hasta 200 g/ha Dosis de aportación: 1 T/ha

15 Carbonato de calcio 1000 kg Derivados de ulvanos suficiente hasta 1000 g/ha Dosis de aportación: 1 T/ha

ENMIENDA ORGÁNICA Y SOPORTES DE CULTIVO

Sustrato 500 kg Turba 500 kg Derivados de ulvanos suficiente hasta 500 g/ha Dosis de aportación: 1 T/ha

25 B – ABONOS RADICULARES

ABONOS NP

Lithothamnium 310 kg Cloruro de potasio 167 kg Urea 161 kg Sulfato de amonio 362 kg Derivados de ulvanos suficiente hasta 200 g/ha

35

CULTIVOS: Dosis de la aportación (kg/ha)

Pastos Cereales Maíz: 200 -400

ABONOS PK

Lithothamnium: 297 kg

Fosfato natural: 536 kg

Cloruro de potasio: 167 kg

Derivados de ulvanos: suficiente hasta 500 g/ha

CULTIVOS: Dosis de la aportación (kg/ha)

Todos los cultivos: 300 -500

45: ABONOS NPK + MgO

Lithothamnium Fosfato de amonio Sulfato de amonio Urea Óxido de magnesio Cloruro de potasio Derivados de ulvanos: 158 kg 116 kg 186 kg 156 kg 50 kg 334 kg suficiente hasta 1000 g/ha

CULTIVOS: Dosis de la aportación (kg/ha)

Maíz Cereales Praderas Todos los cultivos: 400 -800

C – ABONOS FOLIARES

SOLUCIÓN Mg

5: Nitrato de magnesio Agua Derivados de ulvanos 50 kg 50 kg cantidad suficiente hasta 1 g/l (solución final aplicada a la planta)

CULTIVOS: Número de aportes en diferentes etapas de la campaña Dosis por aportación

Frutales: 3 -6 8 l/ha

Cultivos hortícolas: 2 -6 5 -8 l/ha

10: Solución de N Fe Mn

15: Nitrato de manganeso Cloruro férrico Agua Derivados de ulvanos 15 kg 25 kg 60 kg cantidad suficiente hasta 0,1 g/l (solución final aplicada a la planta)

CULTIVOS: Número de tratamientos Dosis por tratamiento

Frutales: 4 -6 3 -6 l/ha

Cultivos hortícolas: 4 -6 3 -6 l/ha

Solución de N Mn Zn

20

Nitrato de manganeso: 31 kg

Nitrato de zinc: 22 kg

Agua: 47 kg

Derivados de ulvanos: cantidad suficiente hasta 10 g/l (solución final aplicada a la planta)

25

CULTIVOS: Número de aportes Dosis por aportación

Maíz: 1 -2 4 -8 l/ha

Lino: 1 -2 4 -8 l/ha

Remolacha: 1 -3 4 -8 l/ha

Soja: 1 -2 4 -8 l/ha

Patata: 1 -3 4 -8 l/ha

Judías verdes: 2 -3 4 -8 l/ha

Solución NPK Oligoelementos

30: Urea Ácido fosfórico 17 kg 9 kg

Potasa: 9 kg

Nitrato de manganeso: 0,7 kg

Nitrato de zinc: 0,3 kg

Nitrato de cobre: 0,10 kg

35: Cloruro férrico Ácido bórico 0,20 kg 0,4 kg

Agua: 63,3 kg

Derivados de ulvanos: cantidad suficiente hasta 1 g/l (solución final aplicada a la planta)

CULTIVOS: Número de aportes Dosis por aportación

Cultivos hortícolas: 5 -10 4 -6 l/ha

Frutales: 4 -6 4 -6 l/ha

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Claims

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