ES2560538T3

ES2560538T3 - Composición farmacéutica que contiene SAA para su uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones inflamatorias desreguladas agudas y crónicas

Info

Publication number: ES2560538T3
Application number: ES10002990.9T
Authority: ES
Inventors: Leif Erik Sander; Christian Trautwein; Reinhold Paul Linke
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-22
Filing date: 2010-03-22
Publication date: 2016-02-19
Anticipated expiration: 2030-03-22
Also published as: EP2990052A1; EP2368564A1; EP2368564B1; HUE028190T2; DK2368564T3

Abstract

Composición farmacéutica que contiene un principio activo, en donde el principio activo es una cantidad eficaz de amiloide A de suero (SAA) solo o un fragmento activo del mismo, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para su uso en el tratamiento de enfermedades o afecciones inflamatorias desreguladas aumentando la actividad de células supresoras de origen mieloide (MDSC), en donde las enfermedades o afecciones inflamatorias desreguladas son enfermedades autoinflamatorias o enfermedades autoinflamatorias con componentes autoinmunitarios o enfermedades autoinmunitarias incluyendo EII, artritis reumatoide, psoriasis, esclerosis múltiple, rechazo a trasplante, enfermedad del injerto contra el huésped o del huésped contra el injerto, enfermedades inflamatorias locales y sistémicas, un síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, septicemia, septicemia grave, choque séptico, síndrome de disfunción multiorgánica, síndrome de insuficiencia de múltiples órganos y rechazo a trasplante agudo.

Description

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enfermedad asociada con enfermedades o afecciones inflamaciones desreguladas aumentando la actividad de MDSC.

Se prefiere además que el principio activo sea un péptido invariable en la posición 33-43 de SAA.

En otra forma de realización preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende además aditivos o sustancias auxiliares farmacéuticas y, preferiblemente, un soporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

En un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona una cantidad de SAA sola o fragmentos activos de la misma o sales farmacéuticamente aceptables de la misma para uso en el tratamiento de septicemia.

Según la presente invención, el término “amiloide A de suero” (SAA) se refiere a las moléculas de SAA de longitud completa conocidas como SAA1, SAA2, etc. El término también contempla análogos o fragmentos funcionales de SAA, en particular de SAA humana de No. De acceso a Gene Bank NM_000331 (Seq. ID. No. 5), y NM_030754 (Seq. ID. No. 7), P02735.

Como se usa en el presente documento, el término “proteína reactiva C” (CRP) se refiere a la proteína de longitud completa, por ejemplo la proteína humana NM_000567 (Seq. ID. No. 9), P02741. La presente invención contempla análogos así como fragmentos funcionales de proteína reactiva C.

El término “CXCL1” como se usa en el presente documento se refiere a la quimioquina CXCL1 también conocida como KC o GR01 que tiene el número de acceso de Gene Bank J03561 y NM 001511 (forma humana), Seq. ID. No. 3, P09341. La presente invención contempla análogos así como fragmentos funcionales de CXCL1.

Como se usa en el presente documento, el término “un fragmento funcional de la misma” se refiere a un fragmento de la respectiva proteína, por ejemplo, un péptido que muestra la misma actividad. En el presente documento, el término “SAA”, “CRP” y “CXCL1” incluye fragmentos respectivos de las mismas a menos que se indique de otra manera. Además a menos que se indique explícitamente, dichos términos incluyen sales o solvatos de los compuestos.

El término “análogo” como se usa en el presente documento se refiere a moléculas que tienen la misma actividad que SAA, CRP y CXCL1, respectivamente. En particular, un análogo tiene la misma actividad que las respectivas proteínas de longitud completa en activar y movilizar MDSC. El término “SAA”, “CRP” y “CXCL1” incluye análogos respectivos que pueden estar presentes en forma de sal o solvato a menos que se indique de otra manera.

En una forma de realización preferida, las moléculas de SAA, CRP y CXCL1 son proteínas de SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, respectivamente.

Los principios activos descritos en el presente documento pueden estar en forma de sales farmacéuticamente aceptables no tóxicas de los mismos u otras preparaciones galénicas. Las sales incluyen sales de adición ácida, tales como sales con ácidos inorgánicos o con ácidos orgánicos y también sales formadas con iones catiónicos, como iones metálicos, en particular metal alcalino o alcalinotérreo o NH4+. Además, los principios activos pueden estar presentes en forma de solvatos de los mismos (por ejemplo, hidratos).

Además, la composición farmacéutica que comprende como principio activo SAA sola es útil en la terapia de síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, septicemia, septicemia grave, choque séptico, síndrome de disfunción multiorgánica o síndrome de trasplante agudo.

Además, se prefiere que la composición farmacéutica comprenda como principio activo una cantidad eficaz de SAA sola o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

En formas de realización preferidas, la composición farmacéutica comprende además aditivos o sustancias auxiliares farmacéuticas, preferiblemente, un soporte, excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable.

El término “composición farmacéutica” significa una composición adecuada para uso farmacéutico en un sujeto o individuo, incluyendo un animal o ser humano. Una composición farmacéutica generalmente comprende una cantidad eficaz de un agente o principio activo y un soporte, incluyendo, por ejemplo, un soporte farmacéuticamente aceptable.

Un “tratamiento terapéutico” es un tratamiento administrado a un sujeto o un individuo que muestra síntomas o signos de patología, enfermedad o trastorno tratamiento que se administra al sujeto con el fin de disminuir o eliminar esos signos o síntomas de patología, enfermedad o trastorno.

Como se usa en el presente documento, el término “soporte” se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo.

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para aliviar el dolor en el sitio de inyección. En general, los ingredientes se suministran bien por separado o mezclados en una forma farmacéutica unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado sin agua en un recipiente herméticamente sellado tal como una ampolla o bolsita que indica la cantidad del agente activo. Donde la composición se va a administrar por infusión, se puede dispensar con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Donde la composición se administra por inyección, se puede proporcionar una ampolla de agua para inyección o solución salina estéril de modo que los ingredientes se puedan mezclar antes de la administración.

La composición farmacéutica para uso según la invención se puede formular como formas neutras o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con aniones tales como los derivados de ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con cationes tales como los derivados de hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína, etc.

Estas y otras formas de realización se divulgan y están abarcadas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Se puede recuperar bibliografía adicional respecto a cualquiera de los métodos, usos y compuestos que se van a emplear según la presente invención de bibliotecas públicas, usando, por ejemplo, dispositivos electrónicos.

En una forma de realización adicional, la presente invención se refiere al uso de una cantidad eficaz de SAA sola o sales farmacéuticamente aceptables de la misma para la activación y movilización así como para la supervivencia de MDSC, por ejemplo, para tratar enfermedades inflamatorias desreguladas excesivas.

Es decir, cuando se producen enfermedades inflamatorias desreguladas excesivas, como es el caso en septicemia, en un individuo, se administran los compuestos según la presente invención a dicho individuo afectado con una enfermedad inflamatoria desregulada excesiva para aliviar para ralentizar dicha inflamación, o para reducir la intensificación de la inflamación o para terminar las respuestas inflamatorias.

Además, se puede usar una cantidad eficaz de SAA sola o sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de la misma para suprimir la inflamación en individuos afectados con enfermedades o afecciones inflamatorias desreguladas.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la invención adicionalmente.

Ejemplos

Materiales y métodos

Ratones. Se han usado ratones macho gp130f/f, gp130Δhepa, gp130StatΔhepa y gp130RasΔhepa a la edad de 812 semanas, como se ha descrito previamente (Klein et al., 2005). Todos los experimentos fueron aprobados por El Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional. Todos los experimentos se llevaron a cabo según la ‘Guide for the Care and Use of Laboratory Animals’ (publicación del NIH 86-23, revisada en 1985).

Ligadura y punción cecal (CLP). Se indujo septicemia polimicrobiana por CLP. Brevemente, se anestesiaron los ratones; el ciego se ligó y punzó dos veces con una aguja de 20G. Los ratones se controlaron cada 6 h durante 24 h y después cada 12 h hasta el final del experimento (entre 5 y 10 días).

Choque endotóxico inducido por LPS. Los ratones recibieron LPS 20 mg/kg por vía intraperitoneal y se controlaron cada 6 horas durante y después cada 12 h hasta el final del experimento (entre 3 y 5 días).

Aislamiento y cultivo de células. Se aislaron MDSC de bazos de ratones gp130f/f 5 días después de CLP. Después del sacrificio, los bazos se explantaron y se aislaron esplenocitos por digestión con colagenasa. Se lisaron glóbulos rojos usando tampón de lisis Pharmlyse (BD Biosciences). Se purificaron MDSC de suspensión celular por separación celular magnética (MACS, Miltenyi Biotec) usando bolas magnéticas conjugadas a anti-CD11b (Miltenyi Biotec). Se determinó la pureza por citometría de flujo. Solo se usaron preparaciones celulares con una pureza de >90% para experimentos adicionales. Alternativamente, los ratones se inyectaron con LPS 5 mg/kg i.p. y 5 días después se purificaron esplenocitos CD11b+Gr1+ por separación de FACS (separador celular Influx, BD Biosciences). Para experimentos de cultivo durante la noche, las células se mantuvieron en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero fetal de ternera inactivado por calor al 10% (Sigma). Se cultivaron MDSC con las siguientes sustancias como se indica, TNF alfa murino (Peprotech), LPS (Sigma), SAA (Peprotech).

Para la generación de macrófagos intraperitoneales, los ratones se inyectaron con 1 ml de tioglicolato (BD Biosciences) por vía intraperitoneal. Se recogieron las células totales después de 72 h y se sembraron a 1x106/ml en RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con suero fetal de ternera al 10% (Sigma) y penicilina/estreptomicina al 1% (Invitrogen). Después de cultivar durante la noche las células no adherentes se eliminaron y la pureza de los macrófagos se confirmó por tinción de F4/80 y citometría de flujo.

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Se aislaron hepatocitos primarios de ratones gp130f/f y gp130Δhepa por perfusión con colagenasa como se ha descrito previamente (Klein et al., 2005), se cultivaron 1x106 células en placas de cultivo de 6 cm con DMEM (Invitrogen) que contenía glucosa 4,5 g/l, SFT al 10%, y penicilina/estreptomicina durante la noche. Las células se estimularon con factor inhibidor de leucemia LIF 50 ng/ml (Peprotech) durante 6 h, y los sobrenadantes se recogieron y almacenaron a -80ºC.

Cultivo in vitro de MDSC. Las condiciones de cultivo se han usado previamente (Delano et al., 2007). Después de la purificación por MACS de MDSC esplénicas de ratones gp130f/f control cinco días después de CLP. Las células se sembraron a 106 células/ml en RPMI 1640 suplementado con suero fetal de ternera al 10%, l-glutamina 2 mM, penicilina 200 U/ml, y estreptomicina 50 µg/ml, y se cultivaron durante la noche con los compuestos indicados. Para los ensayos de suspensión in vitro, se cocultivaron MDSC purificadas con macrófagos peritoneales o derivados de médula ósea, se estimularon con LPS (Sigma) y la posterior liberación de citoquinas se midió por ELISA. En algunos casos las MDSC se separaron de los macrófagos en placas transwell (tamaño de poro 0,4 µm, Corning Inc). Para los estudios de migración in vitro, se sembraron células CD11b+Gr1+ esplénicas o derivadas de médula ósea en placas transwell (tamaño de poro 3 µm, Corning Inc.) y se añadieron cantidades crecientes de KC recombinante (Peprotech) al pocillo inferior. Después de 3 h se contaron las células migradas en un hemocitómetro y se calculó el índice de migración de células migradas/no migradas.

Transferencia de MDSC adoptivas. Se aislaron MDSC como se ha descrito anteriormente, los ratones gp130Δhepa recibieron 5x106 MDCS por vía intravenosa 1 h y 24 h después de CLP. Se trataron ratones control con volúmenes iguales de NaCl.

Eliminación de células Gr1+. Se han usado anticuerpos monoclonales contra Gr1 de células de hibridoma RB68C5 (Tepper, R.I., et al, 1992, Science 257, 548-551) y ratones gp130f/f recibieron 10 mg/kg de anticuerpos 24 h antes y 24 h después de CLP. La eficacia de la eliminación se siguió por FACS. Los ratones control recibieron anticuerpos IgG de isotipo no específicos.

Tratamiento de animales con SAA, KC e IL1Ra recombinantes. Los ratones recibieron 0,8 mg/kg de SAA recombinante (Peprotech) o 40 µg/kg de KC (Peprotech) o una combinación de ambas por vía intravenosa 1 h y 24 h después de CLP. Los ratones control recibieron el mismo volumen de solución salina. Se inyecto IL-1Ra (Anakinra) (Kineret, Amgen) por vía subcutánea cada 4 h durante un periodo de 24 h.

Neutralización sistémica de SAA. Los ratones recibieron 50 mg/kg de una combinación de anticuerpos monoclonales anti-SAA (mc29 y mc4, 1:1) dirigidos contra la región muy conservada (invariable) de SAA (véase anteriormente) i.p. 12 h antes de 33 mg/kg 12 h después de CLP. Los ratones control recibieron cantidades equivalentes de anticuerpos control inactivos (mc1). Los tres anticuerpos se describen en Linke et.al., J. Histochem, Cytochem. 32. 322328 (1984).

Medidas de citoquinas. Se recogieron muestras de suero por sangrado a los tiempos indicados. Se midieron IL-6, TNF, IFN-γ y KC por ELISA (R&D Systems). SAA se midió por ELISA (Biosource). Se midieron IL-6, TNF, IL-12 e IL10 de sobrenadantes de cultivo celular por ELISA (R&D systems).

Citometría de flujo. Se incubaron suspensiones celulares con los anticuerpos conjugados a fluorocromos enumerados a continuación y se analizaron con un BD FACS Canto II (BD Biosystems). CD45, Gr1 (ambos BD Biosciences), CD11b (eBioscience).

Análisis por micromatrices génicas y PCR en tiempo real. Se sacrificaron ratones gp130f/f y gp130Δhepa sin tratamiento previo o 12 h después de CLP. Se explantaron los hígados y muestras de tejido se congelaron inmediatamente. Se usaron muestras de ARN de hígado de 3 ratones por grupo experimental para análisis por micromatrices. Las muestras de ARN se prepararon e hibridaron en matrices Affymetrix GeneChip Mouse Genome 430 2.0. Los niveles de expresión génica se calcularon aplicando el algoritmo medio multichip robusto corregido por contenido en GC (GCRMA) y un fichero Gene Chip Description File (CDF) remodelado. Se identificaron genes diferencialmente expresados usando estadística Limma. Los genes con un valor de p corregido similar o por debajo de 0,05 y/o cambio en veces por encima de 1,5 o por debajo de -1,5 se consideraron significativamente regulados. Las descripciones detallas de los métodos aplicados están disponibles a petición. Se usaron Ingenuity Pathway Analysis (v5.5, Ingenuity Systems) y ErmineJ Gene Score Resampling para identificar las rutas de señalización canónicas más significativamente cambiadas o procesos biológicos Gene Ontology (GO) en ratones gp130f/f y gp130Δhepa 12 h después del inicio de la septicemia, usando un valor de p similar a o por debajo de 0,05 como criterio de entrada. Los cambios en veces de genes seleccionados se visualizaron en un diagrama de mapa de calor.

Se realizó análisis de PCR en tiempo real para confirmar los datos de la matriz génica. Se aisló ARN usando columnas RNeasy (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La síntesis de la primera hebra se realizó con cebadores de oligo dT y la transcripción inversa con transcriptasa inversa de M-MLV (Invitrogen). La PCR en tiempo real cuantitativa se realizó usando SYBR Green Reagent (Invitrogen Corp.) en un sistema de PCR en tiempo real ABI-Prism 7300 (Applied Bioscience). Las reacciones se realizaron en duplicado y se usaron valores de GADPH para normalizar la expresión génica.

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