ES2560097T3

ES2560097T3 - Procedimientos y composiciones de tratamiento de trastornos mitocondriales

Info

Publication number: ES2560097T3
Application number: ES09707233.4T
Authority: ES
Inventors: Haya Galski-Lorberboum; Matan Rapoport; Oriy Elpeleg; Ann Saada
Original assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Hadasit Medical Research Services and Development Co; Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 2008-02-04
Filing date: 2009-02-03
Publication date: 2016-02-17
Anticipated expiration: 2029-02-03
Also published as: EP2300614B1; PL2300614T3; WO2009098682A3; US20110177051A1; US20180311318A1; WO2009098682A2; DK2300614T3; PT2300614E; SI2300614T1; US20170224783A1; HUE026750T2; EP2300614A2; HRP20160024T1

Abstract

Una proteína de fusión para su uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno mitocondrial en un sujeto, comprendiendo dicha proteína de fusión, un dominio de transducción de proteínas (PTD) fusionado a un componente funcional de una enzima mitocondrial y una secuencia de direccionamiento mitocondrial (MTS), en el que dicha MTS está situada entre dicho PTD y dicho componente funcional y en el que dicha MTS es una MTS de otra enzima mitocondrial codificada por un gen nuclear, en el que dicha enzima es una enzima mitocondrial de un complejo enzimático multicomponente mitocondrial, y en el que dicho dominio de transducción de proteínas es un péptido TAT, en el que dicho tratamiento comprende la administración de dicha proteína de fusión a dicho sujeto y es un tratamiento prolongado continuo para una enfermedad crónica o comprende una única o unas pocas administraciones temporales para el tratamiento de un trastorno agudo.

Description

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Los trastornos mitocondriales son trastornos hereditarios o adquiridos, aunque rara vez pueden ser el resultado de una mutación espontánea en el desarrollo temprano del embrión. Los dos patrones de herencia más comunes de citopatías mitocondriales son la mendeliana y la materna. Algunos ejemplos representativos de enfermedades mitocondriales se representan en la siguiente tabla.

Enfermedad: Proteína afectada OMIM

Deficiencia de ornitina transcarbamilasa (hiperamonemia) (OTCD: Ornitina transcarbamilasa (P00480) 311250

Deficiencia de carnitina Opalmitoiltransferasa II (CPT2): Carnitina O-palmitoiltransferasa II (P23786) 255110

Deficiencia de fumarasa: Fumarato hidratasa (P07954) 606812

Deficiencia de citocromo c oxidasa asociada con síndrome de Leigh: Proteína del locus surfeit 1 (SURF1) (Q15526) 220110

Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (MSUD): 1. Subunidad alfa de la 2oxoisovalerato deshidrogenasa (ceto-ácido deshidrogenasa E1α de cadena ramificada) (P12694) 2. Subunidad beta de la 2oxoisovalerato deshidrogenasa (ceto-ácido deshidrogenasa E1 β de cadena ramificada) (P21953) 248600

Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media (MCAD): Acil-CoA deshidrogenasa, específica de cadena media (P1310) 201450

Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (LCAD): Acil-CoA deshidrogenasa, específica de cadena muy larga (P49748) 201475

Deficiencia de proteína trifuncional: 1. Subunidad alfa de la enzima trifuncional (3-hidrioxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCHAD) (P40939) (HADHA). 2. Subunidad beta de la enzima trifuncional (hidrioxiacil-CoA deshidrogenasa/3-cetoacil-CoA tiolasa/enoil-CoA hidratasa (P55084)(HADHB) 609015

Oftalmoplejía externa progresiva con deleciones de ADN mitocondrial (POLG): Subunidad gamma de la ADN polimerasa 1 (P54098) 157640

DGUOK: Desoxiguanosina quinasa 601465

TK2: Timidina quinasa-2 188250

Deficiencia de piruvato descarboxilasa: Subunidad beta del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa E1 (P11177) Subunidad alfa del componente E1 de la piruvato deshidrogenasa (P08559) 312170

Síndrome de Leigh (SL): El síndrome de Leigh puede ser una característica de una deficiencia de cualquiera de los complejos de la cadena respiratoria mitocondrial: I (OMIM: 252010), II (OMIM: 252011), III (OMIM: 124000), IV (citocromo c oxidasa; OMIM: 220110) o V (OMIM: 604273).

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Figura 5. Co-localización de PDHC y actividad enzimática en las células de pacientes tratadas con TAT-LAD. (A) Las células D479V se trataron con TAT-LAD marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) o LAD (fluorescencia verde, columna central), se lavaron, fijaron, permeabilizaron y se incubaron con anticuerpo antiE1α. Las células se lavaron a continuación y se incubaron con anticuerpo anti-Cy5 de ratón (fluorescencia roja, columna izquierda). Se analizaron las células en cuanto a la co-localización mediante microscopía confocal (amarillo en la superposición, columna derecha). Aumentos originales: 60 (LAD) y 100 (TATLAD). (B-C) Las células fueron incubadas con TAT-LAD (0,1 µg/µl, concentración final) durante 3, 6, o 24 horas. Los ensayos de actividad de PDHC se realizaron como se describe en Materiales y Procedimientos. (B) Actividad de PDHC en células de pacientes E375K tratadas. Los valores de actividad se presentan como nmol/min/mg de proteína. (C) Actividad de PDHC en células de pacientes E375K y D479V tratadas. Los valores de actividad se presentan como el porcentaje de la actividad normal de PDHC medida en fibroblastos sanos en los mismos experimentos. Los ensayos de actividad se repitieron tres veces. Los valores presentados en B y C son valores medios ± DE. PDHC, complejo piruvato deshidrogenasa. La co-localización también se observó en células de pacientes G229C/Y35X tratadas.

Figura 6. Actividad enzimática de LAD en el plasma de ratones E3 inyectados con TAT-LAD. El comportamiento y estabilidad de la TAT-LAD inyectada fueron seguidos en el plasma de los ratones inyectados mediante la medición de la actividad enzimática de la LAD. Se extrajeron muestras de sangre de los ratones E3 inyectados en diferentes puntos temporales y se preparó el plasma.

Figura 7. A. Actividad de TAT-LAD en diversos órganos de los ratones E3 tratados con TAT-LAD: dependencia del tiempo. La actividad de LAD se presenta como aumento porcentual de la actividad basal medida en los ratones E3 no tratados (inyectados con PBS). B-D. Efecto de TAT-LAD frente a proteína de control LAD en el hígado (B), cerebro (C) y corazón (D).

Figura 8. A. Actividad de PDHC en los órganos de ratones E3 tratados con TAT-LAD. Los resultados se presentan como el aumento porcentual de la actividad basal de PDHC en el mismo órgano que los ratones E3 no tratados (inyectados con PBS). B-D. Efecto de TAT-LAD frente a proteína de control LAD en el hígado (B), cerebro (C) y corazón (D).

Figura 9. Actividad de PDHC frente a actividad de LAD en los órganos de los ratones E3 tratados con TAT-LAD.

A. hígado. B. cerebro. C. corazón.

Figura 10. La actividad del complejo I se restaura en células de pacientes con deficiencia del complejo I que son tratadas con TAT-ORF66. “PBS” se refiere a células no tratadas.

Descripción detallada de la invención

En una realización, la presente invención proporciona una proteína de fusión para su uso en un procedimiento de tratamiento como se define en las reivindicaciones. En ciertas realizaciones preferidas, la proteína de fusión se produce por técnicas recombinantes. Tal como se establece en el presente documento, la administración de proteínas de fusión con PTD que contienen un dominio catalítico de una enzima mitocondrial a un sujeto en necesidad del mismo es capaz de tratar y aliviar trastornos metabólicos mitocondriales.

La proteína de fusión comprende una secuencia de direccionamiento mitocondrial (MTS). La MTS es una MTS de otra enzima mitocondrial que es codificada por el ADN nuclear, traducida/producida en el citoplasma y transportada a la mitocondria. Los expertos en la técnica entenderán que las MTS de diversas enzimas mitocondriales sintetizadas a partir de genes nucleares son en gran parte, si no completamente, intercambiables, y por lo tanto pueden ser utilizadas de manera intercambiable en los procedimientos y composiciones de la presente invención.

La MTS está situado entre el PTD y el componente funcional según el caso. En ciertas realizaciones más preferidas, la porción de la proteína de fusión C-terminal a la MTS consiste en el componente funcional de una enzima. En otra realización, no están presentes residuos heterólogos en la enzima en la porción C-terminal a la MTS. En esta realización, la escisión de la MTS genera una enzima con la secuencia nativa, por lo tanto capaz de integrarse fácilmente en un complejo enzimático multicomponente conformacionalmente sensible.

El PTD es un péptido TAT. En el presente documento se citan ejemplos no limitantes representativos de secuencias de PTD adecuadas.

Cada tipo de proteína de fusión para su uso en el procedimiento de tratamiento representa una realización separada de la presente invención.

En el presente documento se describe una composición farmacéutica para tratar o aliviar un trastorno mitocondrial, que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y como principio activo la proteína de fusión.

También se describe aquí el uso de una proteína de fusión de la presente invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mitocondrial.

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También se describe aquí un procedimiento para tratar un trastorno mitocondrial, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de la presente invención, tratando de este modo un trastorno mitocondrial. Cuando entra en una mitocondria del sujeto, la proteína de fusión restaura la actividad enzimática que falta.

También se describe en el presente documento un procedimiento para la introducción de una actividad enzimática mitocondrial en una mitocondria de un sujeto, comprendiendo el procedimiento la etapa de administrar a un sujeto en necesidad de tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de fusión de la presente invención, introduciendo de este modo una actividad enzimática mitocondrial en una mitocondria de un sujeto en necesidad del mismo.

Conforme a lo dispuesto en el presente documento en los Ejemplos 1-4, TAT-LAD es capaz de entrar en las células y en sus mitocondrias rápida y eficientemente. Por otra parte, es capaz de elevar la actividad de la LAD dentro de las células deficientes en LAD, devolviendo a sus mitocondrias a los valores de la actividad normal y superior. Y lo que es más importante, es capaz de reemplazar la enzima mutada e incorporarse naturalmente en los complejos de αcetoácido deshidrogenasa como el PDHC. Mostramos aquí que la actividad de PDHC de células deficientes en LAD tratadas con TAT-LAD cambió de ~ 10 % al 70-75 % de la actividad normal después de tan solo 3 horas de incubación. Estos elevados valores de actividad enzimática disminuyeron después de 24 h de incubación pero permanecieron estables muy por encima de la actividad basal. Por lo tanto, en un contexto clínico, una sola aplicación puede ser suficiente para un paciente que presenta un episodio de descompensación potencialmente mortal.

Una ventaja del uso de las proteínas de fusión con TAT para el tratamiento de trastornos mitocondriales es su capacidad para ser administradas en prácticamente todas las células sin ninguna especificidad. Cuando se intenta reemplazar una enzima mitocondrial mutado no hay necesidad de direccionamiento específico, sino más bien la administración de la enzima en cada célula/tejido, alcanzando principalmente de tejidos que tienen gran demanda de energía como los músculos, el hígado y sistema nervioso central (SNC), que son habitualmente los más afectados en este tipo de trastornos.

Por otra parte, LAD-TAT exhibió un modo muy rápido de acción, aumentando la actividad de LAD de células enteras en células deficientes en LAD hasta valores normales después de tan solo 30 minutos de incubación y hasta valores aún más altos cuando el tratamiento se prolongaba (Figura 2D-E). La actividad de LAD normal en fibroblastos oscila entre 60-140 nmol/min/mg y en portadores asintomáticos de la deficiencia de LAD entre 25-50 nmol/min/mg (Berger, 1996).

El PDHC es una máquina enzimática multi-componente macromolecular. Su proceso de ensamblaje implica numerosas subunidades diferentes. El posicionamiento óptimo de los componentes individuales dentro de este complejo multi-subunidad afecta directamente a la eficiencia de la reacción enzimática en general y a la estabilidad de sus intermedios (Vettakkorumakankav, 1996; Berger, 1996; Del Gaizo 2003b). Dada la estructura del complejo, no cabría esperar que la restauración de la actividad de un complejo completo reducida debido a un único componente que no funciona mutado fuera tratable mediante la administración exógena del componente mutado. Curiosamente, como se demuestra en el presente documento, el reemplazo del componente E3 mediado por TAT era suficiente para aumentar la actividad enzimática del complejo entero del PDHC (Figura 5).

Conforme a lo dispuesto en el presente documento, las proteínas de fusión con PTD para su uso de la presente invención provocaron la actividad de PDHC de cuatro a cinco veces de forma sostenida, hasta el último punto temporal de las 24 horas (Figura 5B). Cuando se trata una enfermedad metabólica como la deficiencia de LAD, no hay necesidad de volver a aumentar la actividad enzimática hasta el 100 %; más bien, lo que se necesita es elevarla por encima del umbral energético requerido para un metabolismo normal. Aunque un ligero aumento de la actividad de LAD puede elevar la tasa de síntesis de ATP y puede afectar favorablemente a la afectación neurológica en la deficiencia de LAD. Por lo tanto los cambios demostrados en el presente documento en la actividad de LAD, es probable que la relación LAD/CS y la actividad de PDHC puedan afectar significativamente a la presentación clínica en los pacientes, al menos, hasta el nivel de los portadores de deficiencia de LAD asintomáticos.

Hoy en día, una gran impedimento de la TRE es la incapacidad de la enzima administrada para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE). Este obstáculo fundamental ha limitado fuertemente el desarrollo de la TRE para los trastornos metabólicos en los cuales está afectado el SNC (Brady, 2004). Las proteínas de fusión con TAT son capaces de atravesar la BHE, lo que las convierte en una opción favorable para el desarrollo de la TER para los trastornos metabólicos relacionados con el SNC.

Conforme a lo dispuesto en el presente documento en los Ejemplos 5-7, la deficiencia de LAD de los ratones E3 es tratable con proteínas PTD-LAD para su uso de la presente invención. Es de destacar que los experimentos con ratones E3 han establecido pruebas sustanciales de que las alternancias en las α-cetoácido deshidrogenasas (los complejos que contienen LAD) pueden desempeñar un papel en la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas. La disminución de la actividad de los complejos α-cetoglutarato deshidrogenasa y piruvato deshidrogenasa asociados a LAD en el cerebro, representa un elemento común en varias enfermedades neurodegenerativas asociadas a la edad, incluidas las enfermedades de Alzheimer y Parkinson (Gibson y col., 2000

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se indica por la tinción amarilla en la superposición (columna derecha).

Ejemplo 4: Una proteína de fusión PTD-LAD aumenta la actividad del PDHC en células deficientes de LAD

La prueba final y más crucial para demostrar la capacidad de TAT-LAD para tratar con éxito la deficiencia de LAD por la TRE es la capacidad de la enzima para sustituir a la enzima endógena mutada, incluyendo la integración con éxito en sus complejos enzimáticos multicomponente naturales, tales como el complejo piruvato deshidrogenasa (PDHC). La deficiencia de LAD afecta a tres complejos enzimáticos multicomponente mitocondriales, cuya actividad podría ser restaurada por la TAT-LAD. La capacidad de la TAT-LAD para reemplazar con éxito la enzima defectuosa endógena y aumentar la actividad del PDHC se ensayó en células D479V y E375K.

La actividad del PDHC aumentó en las dos células genotípicamente diferentes. En las células E375K, la actividad del PDHC aumentó significativamente en 12 veces después de 3 horas de incubación (desde 0,029 hasta 0,367 nmol/min/mg), permaneciendo aproximadamente a unos niveles cuatro a cinco veces superiores a los valores basales bajos durante al menos 24 horas (Figura 5B). Presentado como un porcentaje de la actividad del PDHC normal de los fibroblastos sanos, la actividad del PDHC en las células D479V aumentó desde el 9 % hasta el 69 % de la actividad normal después de 3 horas de incubación, manteniéndose en 50 % del nivel normal durante al menos 24 horas. En las células E375K, la actividad del PDHC aumentó desde el 5 hasta el 75 % de la actividad normal después de 3 horas de incubación, disminuyendo hasta aproximadamente el 30 % después de 24 horas de incubación (Figura 5C). Es de destacar que estos valores de actividad del PDHC están en estrecha correlación con los valores de actividad enzimática LAD medidos en las mitocondrias de las células tratadas, alcanzando niveles máximos después de una incubación de 3 Hr' con TAT-LAD.

Las proteínas de fusión PTD-LAD son, por lo tanto, capaces de tratar la deficiencia de LAD aumentando la actividad del PDHC en las células deficientes en LAD.

Ejemplo 5: Actividad enzimática de la LAD en plasma de ratones E3 inyectados con TAT-LAD

MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES (EJEMPLOS 5-6)

El modelo de ratón de la deficiencia de LAD se describe en Klivenyi, P. y col. (Mice deficient in dihydrolipoamide dehydrogenase show increased vulnerability to MPTP, malonate and 3-nitropropionic acid neurotoxicity. J Neurochem 88: 1352-1360, 2004) y Johnson, MT y col. (Targeted disruption of the murine dihydrolipoamide dehydrogenase gene (Dld) results in perigastrulation lethality. Proc Natl Acad Sci USA 94: 14512-14517, 1997). Estos ratones son heterocigotos para una mutación de pérdida de función recesiva que afecta a la expresión del gen de la LAD (Dld, en ratones) a nivel del ARNm (inestabilidad) (ratones Dld+/-o ratones E3). Los ratones homocigotos mueren en el útero en una etapa muy temprana de la gastrulación. Estos ratones son fenotípicamente normales, aunque su actividad de la LAD se reduce en ~ 50 %, lo que afecta a todos los complejos enzimáticos dependientes de LAD. Del mismo modo, los seres humanos heterocigotos para deficiencia de LAD exhiben ~ 50 % la actividad de la LAD, pero por lo general no tienen síntomas clínicos. Estos ratones se utilizan actualmente en experimentos en el campo de los trastornos neurodegenerativos como el Alzheimer, el Parkinson y la enfermedad de Huntington.

Una dosis única (0,2 mg por ratón) de TAT-LAD altamente purificada se inyectó en la vena de la cola de los ratones E3 y se extrajeron y analizaron varios tejidos en cuanto a las actividades de LAD y PDHC en diferentes puntos temporales. En cada punto temporal se usaron varios ratones.

RESULTADOS

Para probar la capacidad de TAT-LAD para tratar la deficiencia de LAD in vivo, se inyectó por vía intravenosa TAT-LAD purificada en ratones E3 y se midió su efecto sobre las actividades de la LAD y el PDHC en varios tejidos. Este experimento se concentró en nuestros 3 órganos principales que tienen las mayores demandas de energía y, por lo tanto, son los que a menudo se ven afectados en los trastornos mitocondriales, el hígado, el corazón (músculos) y el cerebro.

En primer lugar se caracterizaron el comportamiento y la estabilidad de la proteína de fusión TAT-LAD en el plasma de ratones inyectados mediante la medición de la actividad enzimática de LAD. Se extrajeron muestras de sangre de ratones inyectados E3 en diferentes puntos temporales y se prepararon los plasmas.

No hay presente actividad de la LAD en el plasma de ratones sanos normales, ni de ratones E3, de modo que se establece como referencia la actividad de LAD en el primer punto temporal. Después del primer punto temporal, se observó a lo largo del tiempo una disminución en la actividad de la LAD en el plasma de ratones E3 (Figura 6). Para determinar si existe un componente o factor en el plasma que reduce la actividad de LAD lo largo del tiempo, se incubó plasma de ratón con TAT-LAD in vitro en las mismas condiciones: a 37 °C y en los mismos períodos de tiempo. La actividad de la LAD se mantuvo estable en estas muestras de plasma. Por lo tanto, la disminución de la actividad enzimática de LAD en el plasma fue el resultado de la administración de TAT-LAD en los órganos y tejidos de los ratones. De hecho, estos resultados se correlacionan con la actividad de LAD medida dentro de los órganos (Figura 7 siguiente). La proteína de control LAD, que carece de la fracción de administración TAT, también disminuyó con el tiempo su actividad, lo que sugiere en este caso posibles mecanismos de eliminación.

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Claims

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