ES2559422T3 - Antagonistas de resistina y su uso - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo aislado reactivo con un epítope localizado en los residuos 78 a 93 definidos por SEC ID Nº: 4 de resistina humana.

Description

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Antagonistas de resistina y su uso

Descripcion

Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a antagonistas de resistina tales como anticuerpos y a su uso en el tratamiento de enfermedades con patologias fibroticas y a antigenos utiles para generar anticuerpos anti-resistina.

Antecedentes de la invencion

La enfermedad pulmonar intersticial (ILD) es un termino colectivo para mas de 100 enfermedades diferentes con caracteristicas clinicas, radiologicas y fisiologicas similares. Las causas subyacentes pueden ser debidas a enfermedad sistemica o exposicion ocupacional. Sin embargo, algunas ILD tienen etiologia subyacente desconocida. Estas enfermedades pulmonares fibroticas son dificiles de tratar, requiriendose biopsias para el diagnostico.

La enfermedad pulmonar fibrotica mas comun es la UIP (neumonia intersticial usual) con una incidencia de entre 329 por 100.000 (Coultas et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 150:967-72 (1994)). La UIP se desarrolla insidiosamente durante algunos meses a varios anos y frecuentemente los cambios radiologicos aparecen antes que los sintomas clinicos. Los hallazgos histologicos caracteristicos de UIP incluyen la presencia de fibrosis pulmonar heterogenea en parches que, a medida que avanza la enfermedad, puede producir colapso alveolar, bronquiectasia y patron de abeja. La neumonia intersticial no especifica (NSIP) presenta sintomas clinicos similares a la UIP. Sin embargo, aunque ciertos hallazgos histologicos son similares, este grupo de pacientes tiende a tener menos fibrosis (MacDonald et al., Radiology 221:600-5 (2001)). Ademas, los pacientes con NSIP son mas sensibles a corticosteroides y en un estudio los pacientes con NSIP tuvieron pronostico considerablemente mejorado (Daniil et al., Am. J. Respir. Crit. Care. 160:899-905 (1999)).

Ha habido informes en la bibliografia de que hay diferencias en los fibroblastos obtenidos de enfermedad pulmonar fibrotica en comparacion con celulas obtenidas de enfermedad pulmonar no relacionada con la fibrosis, tal como muestras aisladas de los margenes normales de resecciones de tumor pulmonar. Las secciones de tejido de pacientes con UIP expresan elevados niveles de CXCL8 (tambien conocidas como interleucina 8 o IL8), una quimiocina angiogenica y niveles reducidos de una quimiocina angiostatica CXCL10 (proteina inducible por IFN de 10 kDa, IP10), sugiriendo asi un desequilibrio en la angiogenesis neta en los pulmones de pacientes con UIP (Keane et al., J. Immunol. 159:1437-43 (1997)). Ademas, los fibroblastos de estos pacientes tambien expresaron CXCL8 elevado, sugiriendo que el fibroblasto es la principal celula efectora que causa el desequilibrio angiogenico (Keane et al., arriba). Mas recientemente se ha mostrado que los fibroblastos de pacientes con UIP expresan y secretan elevados niveles de CCL7 (proteina 3 quimiotactica de monocitos, MCP3) (Choi et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. 170:508-15 (2004)). Los estudios que comparan la expresion genica inducida por TGFp1 en fibroblastos de tejido no fibrotico, UIP y fibrosis pulmonar inducida por esclerodermia tambien han demostrado distintos fenotipos y respuestas de fibroblastos dependiendo del entorno del que se han aislado las celulas (Renzoni et al., Respir. Res. 5:24 (2004)).

La resistina es un factor secretado que pertenece a la familia de las proteinas FIZZ (encontradas en la zona inflamatoria, tambien conocidas como RELM) que contiene un dominio rico en Cys del extremo conservado (Steppan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:502-506 (2001)). Se describio originalmente en ratones como un polipeptido derivado de adipocitos que proporciono el enlace entre la obesidad y la resistencia a la insulina (Steppan et al., Nature 409:307-312 (2001)). La resistina humana, por otra parte, es un factor derivado de macrofagos/monocitos reconocido como un potente factor proinflamatorio. La resistina humana induce la liberacion de citocinas de diversas celulas de origen inmune, regula por incremento la expresion de moleculas de adhesion y promueve la angiogenesis en celulas endoteliales (Burnett et al., Atherosclerosis 182:241-8 (2005); Mu et al., Cardiovasc. Res. 70:146-57 (2006); Verma et al., Circulation 108:736-40 (2003); Bokarewa et al., J. Immunol. 174:5789-95 (2005)). El efecto de la resistina esta probablemente mediado por la via de NF-Kb (Bokarewa et al., arriba).

Actualmente se han identificado cuatro miembros de la familia de FIZZ en roedores y dos en seres humanos. Entre ellos, FIZZ1 (RELMa) participa en el desarrollo de fibrosis pulmonar en ratones. Se descubrio FIZZ1 en Kquido de lavado en un modelo pulmonar alergico murino (Holcomb et al., EMBO J. 19:4046-55 (2000)). Ademas, se encontro la regulacion por incremento de los genes FIZZ1 en pulmon de ratones fibroticos inducidos por bleomicina (Liu et al., Am. J. Pathol. 164):1315-26 (2004)). La inyeccion intravenosa de FIZZ1 en ratones mostro un marcado aumento de los macrofagos CD68 positivos en los pulmones (Yamaji-Kegan et al., J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. August 4, 2006 e-print). Estudios in vitro mostraron que FIZZ1 tiene propiedades mitogenicas y puede mediar en la fibrosis mediante la estimulacion de la proliferation de celulas de musculo liso y la induction de la deposition de actina y colageno en fibroblastos de pulmon (Teng et al., Circ. Res. 92:1065-7 (2003)). La instilacion intratraqueal de FIZZ1 produjo un aumento significativo de la production de VEGF, sugiriendo la funcion de FIZZ1 en la angiogenesis pulmonar (Tong et al., Respir. Res. 7:37 (2006)). No se ha identificado un ortologo de FIZZ1 en el genoma humano. De forma interesante, la resistina humana (FIZZ3) muestra una mayor similitud en el patron de expresion con FIZZ1 murina, sugiriendo entonces la resistina murina una posible similitud funcional. Sin embargo, la relation entre la

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resistina humana y la fibrosis pulmonar sigue estando ampliamente sin explorar.

No se ha identificado un receptor de resistina, que limita el entendimiento de la biologla de la resistina. Recientemente, se ha resuelto la estructura tridimensional de la resistina de raton (Patel et al., Science 304:1154-8 (2004). La resistina de raton forma oligomeros trlmeros no covalentes que pueden agregarse en estructuras hexameras enlazadas por disulfuro. No hay information estructural sobre la resistina humana.

Asl, en vista de lo anterior, existe la necesidad de informacion estructural sobre la resistina humana y de terapeuticos, tales como antagonistas de resistina, para tratar fibrosis pulmonar y sus slntomas asociados.

El documento WO 03/085093 describe anticuerpos y moleculas relacionadas que se unen inmunoespeclficamente a peptidos GMAD antigenicos.

Breve descripcion de los dibujos

La Fig. 1 muestra niveles de resistina en biopsias de pulmon de pacientes con UIP, NSIP y no fibroticos.

Las Fig. 2A, B y C muestran los efectos de la resistina sobre la induction de la expresion genica de procolageno I y a-actina de musculo liso (aSMA) en fibroblastos derivados de pulmon fibrotico y pulmon no fibrotico y despues de tratar fibroblastos de pulmon primarios aislados de biopsia de pulmon fibrotico con resistina recombinante.

Las Fig. 3A y B muestran el efecto de la resistina sobre la expresion genica de factores de crecimiento pro- fibroticos y receptores del factor de crecimiento en fibroblastos de pulmon primarios.

Las Fig. 4a y B muestran la induccion del nivel de expresion de varios genes relacionados con la matriz extracelular (4a) y el gen IL-6 (4B) en fibroblastos de pulmon.

Las Fig. 5A, B y C muestran el aumento en la liberation de citocinas pro-inflamatorias IL-6 (5A), IL-8 (5B) y MCP-1 (5C) despues de que fibroblastos primarios de pulmon humano se trataran con resistina recombinante. La Fig. 6 muestra la secretion de resistina de monocitos primarios humanos. Monocitos no adherentes o adherentes no se trataron o se estimularon con moduladores pro-fibroticos, * indica valor de p < 0,05.

Las Fig. 7A y B muestran la co-localization de resistina con celulas similares a macrofagos en secciones de tejido de UIP.

La Fig. 8 muestra un alineamiento de secuencias de aminoacidos de resistina humana y de raton.

La Fig. 9 muestra la union de anticuerpos policlonales C2815 y C2816 a resistina humana de longitud completa.

Las Fig. 10A y B muestran el efecto de anticuerpos policlonales C2815 y C2816 sobre la liberacion de MCP-1 mediada por resistina humana de celulas mononucleares de sangre primaria (CMSP) humanas aisladas.

Las Fig. 11A y B muestran el efecto de los anticuerpos policlonales C2815 y C2816 sobre la liberacion de MCP- 1 mediada por resistina de raton de CMSP humanas aisladas.

Sumario de la invencion

La invencion se refiere a un antagonista de resistina tal como un anticuerpo aislado reactivo con resistina que neutraliza al menos una de sus actividades biologicas.

Un aspecto de la invencion es un anticuerpo aislado reactivo con un epitope localizado en los residuos 78 a 93 (SEC ID N°: 4) de resistina humana.

Otro aspecto de la invencion es una composition farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del antagonista de resistina de la invencion y un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invencion es la composicion farmaceutica de la invencion para su uso en un metodo de modification de la actividad biologica de resistina en un mamlfero que comprende administrar la composicion farmaceutica al mamlfero. Otro aspecto de la invencion es la composicion farmaceutica de la invencion para su uso en un metodo de tratamiento, o alivio, de los slntomas de las enfermedades con actividad de fibroblastos aberrante que incluyen enfermedades pulmonares intersticiales, cicatriz hipertrofica, cicatriz queloide, esclerodermia, fibrosis hepatica, fibrosis renal y fibrosis cardiaca que comprende administrar la composicion farmaceutica a un paciente en necesidad de la misma.

Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion se refiere a la funcion de resistina, una citocina, como novedosa diana terapeutica para antagonistas de resistina para tratar enfermedades asociadas a patologias fibroticas tales como ILD, esclerodermia, cicatriz hipertrofica, ademas de enfermedades asociadas a una significativa remodelacion en el pulmon tales como asma y trastorno pulmonar obstructivo cronico (EPOC).

En la presente divulgation se ha mostrado que la proteina resistina se detecta en pulmones fibroticos. La inmunohistoquimica con anticuerpos monoclonales anti-resistina indica que la resistina se expresa en celulas de

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monocito/macrofago que participan en procesos fibroticos y de remodelacion. La secrecion de resistina se induce por moduladores pro-fibroticos, sugiriendo que elevados niveles locales de resistina podrian estar presentes en pulmon fibrotico. La resistina afecta directamente los fibroblastos de pulmon primarios, induciendo genes asociados a la acumulacion de matriz extracelular (ECM) y diferenciacion de miofibroblastos, dos procesos que contribuyen a la patogenesis de la fibrosis pulmonar. La resistina tambien induce la expresion de factores de crecimiento pro- fibroticos y sus receptores en fibroblastos de pulmon. Ademas, la resistina estimula la respuesta inflamatoria en fibroblastos de pulmon, aumentando la liberacion de citocinas pro-inflamatorias. La resistina afecta las celulas fibroticas mas que los fibroblastos no fibroticos, sugiriendo que la senalizacion de resistina esta regulada por incremento en fibroblastos enfermos. Finalmente, en la presente divulgacion se muestra que la expresion y secrecion de resistina se inducen por moduladores pro-fibroticos. Tomados conjuntamente, estos datos sugieren que la resistina es capaz de agravar la fibrosis, contribuyendo a la activacion de fibroblastos e inflamacion pulmonar. Por consiguiente, la inhibition de resistina sera beneficiosa para el tratamiento de enfermedades asociadas a la funcion aberrante de fibroblastos.

Ademas, la presente divulgacion describe un modelo de la estructura tridimensional de resistina humana que se baso en la estructura cristalina de la proteina de raton. Este modelo se usa para predecir un posible sitio de union al receptor basado en la similitud estructural con la superfamilia C1q/TNF. Se han producido dos anticuerpos policlonales contra peptidos que abarcan el sitio de union al receptor predicho y la actividad neutralizante de anticuerpos se confirmo en el ensayo funcional in vitro. Los datos sugieren que los epitopes identificados son importantes para la funcion de la resistina y pueden usarse para la generation de agentes terapeuticos que neutralizan resistina.

En una realization de la divulgacion, los peptidos de epitope estan conjugados con una proteina transportadora o fusionada con un andamiajes de proteina mayor para su uso como antigeno para la inmunizacion y/o para la inmunopurificacion de presentation en fagos para la generacion de anticuerpo anti-resistina neutralizante. Los epitopes funcionales desvelados pueden usarse para cribar un panel de anticuerpos para identificar aquellos con actividad neutralizante.

Polipeptidos y composiciones de anticuerpo

La presente invention proporciona un antagonista contra resistina. En una realizacion, el antagonista de resistina es un anticuerpo que tiene las propiedades de union a resistina y que neutraliza al menos una actividad biologica de resistina.

El termino “antagonista” se usa en el sentido mas amplio e incluye una molecula que es capaz de contrarrestar, reducir o inhibir, directamente o indirectamente, parcialmente o completamente, una o mas actividades biologicas de la resistina.

El termino “anticuerpo” se usa en el sentido mas amplio e incluye inmunoglobulina o moleculas de anticuerpo que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales que incluyen anticuerpos monoclonales murinos, humanos, humanizados y quimericos y fragmentos de anticuerpos.

En general, los anticuerpos son proteinas o polipeptidos que presentan especificidad de union a un antigeno especifico. Los anticuerpos intactos son glicoproteinas heterotetramericas, compuestas de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas identicas. Normalmente, cada cadena ligera esta enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el numero de enlaces disulfuro varia entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera tambien tiene puentes de disulfuro entre las cadenas regularmente separados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (Vh) seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable (Vl) en un extremo y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera esta alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera esta alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Cadenas ligeras del anticuerpo de cualquier especie de vertebrado pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, concretamente kappa (k) y lambda (A), basandose en las secuencias de aminoacidos de sus dominios constantes. Las inmunoglobulinas pueden asignarse a cinco clases principales, concretamente IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoacidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA e IgG se subclasifican adicionalmente como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

El termino “fragmentos de anticuerpos” significa una portion de un anticuerpo intacto, generalmente la region de union al antigeno o variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, y moleculas de anticuerpo monocatenario.

“CDR” se definen como las secuencias de aminoacidos de la region determinante de la complementariedad de un anticuerpo que son las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Vease, por ejemplo, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987). Hay tres CDR de la cadena pesada y tres de la cadena ligera o regiones CDR en la porcion variable de una inmunoglobulina. Asi, “CDR” como se usa en el presente documento se

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refiere a las tres CDR de la cadena pesada, o las tres CDR de la cadena ligera, o tanto a todas las CDR de la cadena pesada como la ligera, si es apropiado.

Las CDR proporcionan la mayorla de los residuos de contacto para la union del anticuerpo al antlgeno o epitope. Las CDR de interes en la presente invencion se derivan de secuencias de cadenas pesadas y ligeras variables de anticuerpo donante, e incluyen analogos de las CDR que existen de forma natural, analogos que tambien comparten o retienen la misma especificidad de union al antlgeno y/o capacidad neutralizante como anticuerpo donante del que se derivaron.

El termino “anticuerpo monoclonal” (mAb) como se usa en el presente documento significa un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una poblacion de anticuerpos sustancialmente homogeneos. Los anticuerpos monoclonales son altamente especlficos, estando normalmente dirigidos contra un unico determinante antigenico. El modificador “monoclonal” indica el caracter sustancialmente homogeneo del anticuerpo y no requiere la produccion del anticuerpo por cualquier metodo particular. Por ejemplo, pueden prepararse mAb murinos por el metodo de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-497 (1975). Los mAb quimericos que contienen una region variable de la cadena ligera y de la cadena pesada derivada de un anticuerpo donante (normalmente murino) en asociacion con regiones constantes de la cadena ligera y pesada derivada de un anticuerpo aceptor (normalmente otra especie de mamlfero tal como humana) pueden prepararse por el metodo desvelado en la patente de EE.UU. N° 4.816.567. Los mAb humanizados que tienen CDR derivadas de una inmunoglobulina humana no donante (normalmente murina) y las restantes partes derivadas de inmunoglobulina de la molecula que se derivan de una o mas inmunoglobulinas humanas, que opcionalmente tienen residuos de soporte de la region estructural alterados para preservar la afinidad de union, pueden obtenerse por las tecnicas desveladas en Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:1002910032 (1989) y Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991). Secuencias de la region estructural humana a modo de ejemplo utiles para la humanizacion se desvelan en, por ejemplo,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast;www.atcc.org/phage/hdb.html;
www.mrc-cpe.cam.ac.uk/ALIGNMENTS.php; www.kabatdatabase.com/top.html;
ftp.ncbi.nih.gov/repository/kabat; www.sciquest.com;
www.abcam.com; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html;
www.public.iastate.edu/~pedro/research_tools.html; www.whfreeman.com/immunology/CH05/kuby05.htm;
www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab; www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html;mcb.harvard.edu/BioLinks/Immunology.html; www.immunologylink.com;pathbox.wustl.edu/~hcenter/index.html;
www.appliedbiosystems.com;

www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody;www.rn.ehime-u.ac.jp/~yasuhito/Elisa.html;
www.biodesign.com; www.cancerresearchuk.org;www.biotech.ufl.edu;www.isac-net.org;baserv.uci.kun.nl/-jraats/links1.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu;www.mrc-cpe.cam.ac.uk;
www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html;
http://www.bioinf.org.uk/abs; antibody.bath.ac.uk; www.unizh.ch;
www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s;

www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.html;
www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html;www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html;
www.jerini.de; imgt.cines.fr; y Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1987).

Pueden prepararse mAb completamente humanos que carecen de cualquier secuencia no humana a partir de ratones transgenicos para inmunoglobulina humana por tecnicas citadas en, por ejemplo, Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851 (1996) y Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997). Los mAb humanos tambien pueden prepararse y optimizarse a partir de bibliotecas de presentacion en fagos por tecnicas citadas en, por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86 (2000) y Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 (2001).

La presente invencion se refiere a antagonistas de resistina capaces de unirse a resistina humana y modular la serialization mediada por NF-Kb. La presente invencion tambien se refiere a antagonistas de resistina capaces de unirse a resistina humana y modular las actividades mediadas por resistina que incluyen, pero no se limitan a, activation aberrante de fibroblastos, induction de la expresion genica pro-fibrotica, estimulacion de respuestas inflamatorias. Tales antagonistas incluyen anticuerpos anti-resistina que tienen las propiedades de union a resistina y modulation de la senalizacion de resistina. Un aspecto de la invencion es un anticuerpo reactivo con resistina humana que inhibe la liberation mediada por resistina de otras citocinas inflamatorias que incluyen, pero no se limitan a, MCP-1, IL-8 y IL-6. Estos anticuerpos son utiles como reactivos de investigation, reactivos de diagnostico y agentes terapeuticos. En particular, los anticuerpos de la invencion son utiles como agentes terapeuticos para tratar fibrosis o aliviar slntomas de fibrosis.

Anticuerpos a modo de ejemplo pueden ser anticuerpos de los isotipos IgG, IgD, IgGA o IgM. Adicionalmente, tales anticuerpos pueden modificarse postraduccionalmente por procesos tales como glicosilacion, isomerization, aglicosilacion o modification covalente que no existen de forma natural, tales como la adicion de restos de polietilenglicol (pegilacion) y lipidacion. Tales modificaciones pueden producirse in vivo o in vitro. Moleculas completamente humanas, humanizadas y maduradas por afinidad de anticuerpo o fragmentos de anticuerpos estan dentro del alcance de la invencion ya que son mimeticuerpos, protelnas de fusion y protelnas quimericas.

Los anticuerpos de la invencion pueden unirse al epitope de resistina humana 78CGSWDVRAETTCHCQC93 (SEC ID N°: 4). Este epitope de resistina puede aislarse y modificarse para su uso como un antlgeno para producir y cribar anticuerpos monoclonales contra resistina humana. Por ejemplo, la secuencia de epitope puede modificarse para

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eliminar los residuos de cistelna para prevenir el enlace disulfuro. Estos residuos pueden sustituirse con serina.

Los anticuerpos de la invencion pueden unirse a resistina humana con una Kd inferior a o igual a aproximadamente

7 o 'q 10 11 i2 1

10' , 10' , 10' , 10' , 10' o 10' M. La afinidad de un anticuerpo dado contra resistina humana puede determinarse

experimentalmente usando cualquier metodo adecuado. Tales metodos pueden utilizar instrumentacion Biacore o KinExA, ELISA o ensayos de union competitiva conocidos para aquellos expertos en la materia. Moleculas de anticuerpo que se unen a resistina humana con una afinidad deseada pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos por tecnicas que incluyen maduracion por afinidad de anticuerpos y otras tecnicas reconocidas en la materia adecuadas.

Otro aspecto de la presente invencion es composiciones farmaceuticas que comprenden al menos un anticuerpo para resistina y un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable conocido en la tecnica. El vehlculo o diluyente puede ser una disolucion, suspension, emulsion, coloide o polvo.

Un anticuerpo para resistina de la invencion se formula como una composition farmaceutica en una cantidad terapeuticamente eficaz. El termino “cantidad eficaz” generalmente se refiere a las cantidades de anticuerpo necesarias para terapia eficaz, es decir, el alivio parcial o completo del slntoma o trastorno para el que se busca el tratamiento. Incluida dentro de la definition de terapia eficaz estan tratamientos profilacticos previstos para reducir la probabilidad de aparicion de los slntomas o trastornos anteriormente descritos.

Acidos nucleicos. vectores y lineas celulares

Otro aspecto de la presente divulgation es moleculas de acidos nucleicos aisladas que comprenden, complementarias a o que tienen identidad significativa con un polinucleotido que codifica una cadena pesada o ligera de anticuerpo que tiene secuencias de aminoacidos CDR. Otros polinucleotidos que, dada la degeneration del codigo genetico o la preferencias de codones en un sistema de expresion dado, codifican CDR de la region variable de la cadena pesada o ligera tambien estan dentro del alcance de la divulgacion.

Normalmente, los acidos nucleicos de la presente divulgacion se usan en vectores de expresion para la preparation de los polipeptidos de anticuerpo de resistina de la invencion. Los vectores dentro del alcance de la divulgacion proporcionan elementos necesarios para la expresion eucariota, que incluye los vectores conducidos por el promotor viral, tales como los vectores conducidos por el promotor del CMV, por ejemplo, pcDNA3.1, pCEP4 y sus derivados, vectores de expresion de baculovirus, vectores de expresion de Drosophila y vectores de expresion que son conducidos por promotores del gen de mamlfero, tales como los promotores del gen Ig humana. Otros ejemplos incluyen vectores de expresion procariotas, tales como vectores conducidos por el promotor T7, por ejemplo, pET41, vectores conducidos por el promotor de lactosa y vectores conducidos por el promotor del gen arabinosa.

La presente divulgacion tambien se refiere a lineas celulares que expresan anticuerpos para resistina. Las celulas huesped pueden ser celulas procariotas o eucariotas. Celulas eucariotas a modo de ejemplo son celulas de mamlfero, tales como, pero no se limitan a, COS'1, COS'7, HEK293, BHK21, CHO, BSC'1, HepG2, 653, SP2/0, NS0, 293, HeLa, mieloma, celulas de linfoma, o cualquier derivado de las mismas. Lo mas preferentemente, las celulas huesped son celulas HEK293, NS0, SP2/0 o CHO. Las lineas celulares pueden generarse por procedimientos de transfection estable o transitoria que son muy conocidos en la tecnica.

La presente divulgacion proporciona ademas metodos para expresar un anticuerpo para resistina que comprende cultivar las lineas celulares en condiciones en las que el anticuerpo para resistina se expresa en cantidades detectables o recuperables. La presente divulgacion tambien proporciona metodos para generar anticuerpo para resistina que comprenden traducir los acidos nucleicos del anticuerpo para resistina que codifican en condiciones in vitro o in situ, de forma que el anticuerpo para resistina se exprese en cantidades detectables o recuperables. La presente divulgacion tambien engloba un anticuerpo para resistina producido por los metodos anteriores.

Un anticuerpo para resistina puede recuperarse y purificarse por metodos muy conocidos que incluyen, pero no se limitan a, purification en proteina A, precipitation con sulfato de amonio o etanol, extraction con acido, cromatografia de intercambio anionico o cationico, cromatografia en fosfocelulosa, cromatografia de interaction hidrofoba, cromatografia de afinidad, cromatografia en hidroxilapatita y cromatografia en lectina. Tambien puede emplearse cromatografia de liquidos de alta resolution (HPLC) para la purificacion.

Metodos terapeuticos para tratar o aliviar sfntomas de fibrosis

Los anticuerpos para resistina son utiles como, entre otros, reactivos de investigation y agentes terapeuticos. En un aspecto, la presente invencion se refiere a un metodo de modification de las actividades biologicas de resistina que comprende proporcionar anticuerpo para resistina de la presente invencion a un mamlfero en necesidad del mismo. Ejemplos de tales actividades biologicas de resistina incluyen activation aberrante de fibroblastos, estimulacion de la diferenciacion de mioblastos, induction de genes profibroticos, liberation de citocinas pro'inflamatorias, induction de la acumulacion de colageno I, ademas de otras actividades conocidas para aquellos expertos en la materia. Especificamente, el anticuerpo para resistina puede disminuir o inhibir las cascadas de serialization celular

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mediadas por resistina, tales como, pero no se limitan a, la via NF-Kb.

La presente invention proporciona ademas metodos de alivio de los slntomas de o tratamiento de fibrosis que comprenden administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una composition farmaceutica de anticuerpo para resistina a un paciente en necesidad del mismo tambien. Como se ha descrito anteriormente, tal composicion comprende una cantidad eficaz de anticuerpo para resistina y un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable. La cantidad eficaz para una terapia dada, si es curativa o preventiva, generalmente dependera de muchos factores diferentes, incluyendo medios de administration, sitio diana y otros medicamentos administrados. Asl, las dosis de tratamiento necesitaran ajustarse para optimizar la seguridad y eficacia. Ademas, el anticuerpo para resistina puede administrarse individualmente o en combination con al menos un compuesto, protelna o composicion adicional utiles para tratar fibrosis.

El modo de administracion puede ser cualquier via adecuada para administrar la cantidad farmaceuticamente eficaz de anticuerpo para resistina de la presente invencion a un huesped. Por ejemplo, el anticuerpo para resistina puede administrarse mediante administracion parenteral, tal como administracion subcutanea, intratraqueal, intramuscular, intradermica, intravenosa o intranasal, o cualquier otro medio conocido en la tecnica.

La presente invencion se describe adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son simplemente para ilustrar aspectos de la presente invencion y no pretenden ser limitaciones de la presente invencion.

Ejemplo 1

La resistina esta presente en el pulmon

Se homogeneizaron muestras de biopsia de pulmon de UIP, NSIP y los margenes normales de tumores de pulmon en PBS que contienen inhibidor de la proteasa completo (Roche). Los niveles de resistina se midieron por ELISA (Linco Research Inc., St. Charles, MO) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se midio la protelna total en cada muestra de biopsia de pulmon usando el ensayo de protelna BCA (Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL). Entonces se normalizaron los niveles de resistina a la cantidad de protelna en cada muestra de paciente y se muestran en la Fig. 1. La protelna resistina se detecto en homogeneizados derivados de todos los especlmenes de biopsia de pulmon. No se observo diferencia significativa entre los grupos no fibroticos y fibroticos.

Ejemplo 2

La resistina estimula la expresion de genes asociados a fibrosis

Se aislaron fibroblastos pulmonares de biopsias de pulmon tomadas de pacientes con UIP (n=4); ahora denominados en el presente documento “fibroblastos fibroticos” o 'fibroblastos de UIP'. Los fibroblastos tambien se aislaron de tejido de pulmon tomado durante la resection de tumor pulmonar (n=5) y se confirmo que estas muestras eran no fibroticas por analisis histologico. Estos fibroblastos derivados de tejido no fibrotico se denominan en el presente documento “fibroblastos no fibroticos” (NF).

Se sembraron fibroblastos de pulmon humanos en placas de 24 pocillos (Costar, Corning, NY) a 100.000 celulas/pocillo y se dejaron adherir durante 8 horas. Las celulas se lavaron entonces con PBS y se cultivaron durante la noche en medio libre de suero (DMEM con l-glutamina, Pen/Estrep). Las celulas se estimularon entonces durante 24 h en presencia o ausencia de TGFp-1 (1 o 10 ng/ml) o resistina (1 o 10 ug/ml). Se compro resistina humana recombinante de Peprotech, Inc (Rocky Hill, NJ). La pureza de la protelna se confirmo usando SDS-PAGE y espectroscopla de masas y se encontro que los niveles de endotoxina eran bajos (0,9 UE/ mg). Los sobrenadantes se eliminaron y se analizaron para protelna resistina usando ELISA comercialmente disponible o Luminex. Posteriormente se aislo ARN usando RNeasy Plus Mini-Kits (QIAGEN, Valencia, CA) segun instrucciones del fabricante y se transcribio de forma inversa en ADNc usando reactivos de transcription inversa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se determino la expresion genica profibrotica por PCR en tiempo real usando la mezcla maestra de PCR Taqman® Universal (Applied Biosystems) y los ensayos de expresion genica Taqman® previamente desarrollados (Applied Biosystems) segun instrucciones del fabricante. La expresion genica cuantitativa se calculo usando el metodo comparativo de Ct, en el que los valores de Ct se determinan como el numero de ciclos umbrales para el que primero se detecto la expresion genica. Los cambios en veces de la expresion genica para los genes de interes se normalizaron primero al gen de mantenimiento 18S, dando valores de ACT. Los cambios en veces en la expresion genica debido a la estimulacion in vitro se calcularon por AACt = AOr(sin estimular)-ACT(estimulada), donde la muestra sin estimular sirvio de calibrador. Para investigar las posibles actividades pro-fibroticas de la resistina, el nivel de expresion de procolageno I, alfa-actina de musculo liso (aSMA), CTGF, TGFp1, TGFbR, PDGFR, receptor de hialuronano CD44, fibrilina (fbn1), fibronectina (fn1) y IL-6 se evaluo en fibroblastos de pulmon sin tratar y tratados con resistina.

La acumulacion de la deposition de colageno y la presencia de miofibroblastos son dos distintivos clave de la fibrosis. TGFp1, un modulador pro-fibrotico conocido usado como control positivo en el estudio, indujo una

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regulacion por incremento de tanto el procolageno I como aSMA en fibroblastos de pulmon (Fig. 2). Similarmente, el tratamiento de fibroblastos de pulmon con resistina recombinante produjo la induccion de procolageno I y la expresion de aSMA (Fig. 2). Y, lo que es mas importante, este efecto de la resistina es especlfico para fibroblastos aislados de pacientes fibroticos, ya que la resistina no afecto la expresion genica en fibroblastos no fibroticos. Estos datos sugieren que el receptor/senalizacion de resistina esta regulado por incremento/activado en celulas fibroticas.

Como se muestra en la Fig. 3A, la resistina indujo una regulacion por incremento de genes CTGF y TGFp1, moduladores pro-fibroticos conocidos. Ademas, la resistina tambien indujo una regulacion por incremento de la expresion genica del receptor de TGFp y receptor de PDGF (Fig. 3B). Al igual que con los otros genes ya descritos, la resistina solo aumento la expresion genica en fibroblastos fibroticos.

Alteraciones en los componentes de la matriz extracelular (ECM), ademas del recambio de matriz aberrante, son distintivos de diversas enfermedades fibroticas o enfermedades asociadas a la remodelacion de tejido. Se evaluo el efecto de la resistina sobre varios de los genes ECM que incluyen el receptor de hialuronano CD44, fibrilina (fbnl) y fibronectina (fn 1). La resistina potencio la expresion de CD44, fibrilina y fibronectina especlficamente en fibroblastos fibroticos (Fig. 4A). La expresion genica inducida por resistina fue mas pronunciada a baja concentracion (1 ug/ml). La resistina tambien indujo un aumento en la expresion de IL-6 en tanto fibroblastos fibroticos como no fibroticos (Fig. 4B).

Ejemplo 3

La resistina promueve un entorno pro-inflamatorio mediante la induccion de la liberacion de citocinas

Se analizaron sobrenadantes libres de celulas de los fibroblastos aislados de las biopsias de pulmon que se estimularon in vitro con resistina humana recombinante para niveles de citocina por el kit de citocina humana LlNCO (Linco Research). La resistina estimulo la liberacion de IL-6 (Fig. 5A), IL-8 (Fig. 5B) y MCP-1 (Fig. 5C) de fibroblastos de pulmon. Otras citocinas analizadas estuvieron por debajo del nivel de deteccion. Estos datos sugieren que la resistina es capaz de iniciar una respuesta inflamatoria en fibroblastos de pulmon que puede, a su vez, contribuir al desarrollo y la progresion de fibrosis. Los datos sugieren que la resistina es un potente factor pro-inflamatorio que es capaz de estimular la liberacion de citocinas de celulas inmunitarias.

Ejemplo 4

La secrecion de resistina esta regulada por incremento por mediadores pro-fibroticos

Se compraron monocitos CD14+ humanos purificados de celulas mononucleares de sangre primarias recientemente aisladas de AllCells, LLC (Emeryville, CA). Las celulas se sembraron en placa de fondo en U de 96 pocillos a una densidad de 75.000 celulas por pocillo en RPMI que contiene 10 % de suero bovino fetal (FBS). Las celulas se trataron con 0 o 1 ng/ml de TGFp (R&D Systems, Mineapolis, MN) y PDGF (R&D Systems). Despues de 48 h de cultivo, los niveles de resistina en los sobrenadantes se midieron por el kit de ELISA. Para inducir la diferenciacion de macrofagos, los monocitos se sembraron en placa en RPMI que contenla 10 % de FBS en placas de fondo plano de 96 pocillos y se dejo que se adhirieran, entonces las celulas se trataron similarmente a como se ha descrito. Los datos en la Fig. 6 se expresan como media ± EEM, n=3, * indica valor de p < 0,05.

Como se muestra en la Fig. 6, la resistina se expresa y se secreta de monocitos primarios y monocitos adherentes. El tratamiento de TGFp1 y PDGF indujo la produccion de resistina en tanto monocitos como monocitos adherentes. La resistina no se detecto en fibroblastos de pulmon u otras celulas inmunitarias que incluyen linfocitos T o B (datos no mostrados). Estos datos indican que los factores de crecimiento que incluyen TGFp1 y PDGF que estan presentes en sitios de remodelacion pueden inducir la produccion de resistina de monocitos y macrofagos infiltrantes.

Ejemplo 5

La resistina se expresa en celulas de macrofago en pulmon

Se tineron muestras de biopsia de pulmon de cualquiera de los margenes normales de tumores de pulmon, pacientes con UIP o NSIP (total n=9; n=3 de cada cohorte de pacientes) con un anticuerpo anti-resistina (R&D Systems) a concentracion 2 pg/ml. En especlmenes de pulmon, la protelna resistina se detecto en macrofagos, histiocitos (macrofagos limitados a tejido) y mastocitos. La co-tincion de especlmenes de pulmon no fibrotico con alto grado de inflamacion con anticuerpo CD68 mostro que la resistina se co-localizo con celulas de macrofago CD68 positivas (Fig. 7A). La expresion de resistina humana en monocitos y celulas de macrofago se ha informado previamente (Jung et al., Cardiovasc. Res., 69:76-85 (2006); Lehrke et al., PLoS Med., 1:e45 (2004)) ademas de confirmado por nuestro hallazgo (Fig. 6). Un ejemplo representativo de tincion con anticuerpo anti-resistina de especlmenes de pulmon de pacientes con UIP y NSIP se muestra en la Fig. 7B. No se observo una clara diferencia en la tincion con resistina entre especlmenes de pulmon no fibroticos y fibroticos.

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Ejemplo 6

Modelado de la estructura tridimensional de resistina humana

Se obtuvieron secuencias de aminoacidos de resistina humana (SEC ID N°: 1) y de raton (SEC ID N°: 2) de Swiss- Prot bajo los codigos de acceso Q9HD89 y Q99P87, respectivamente, y se alinearon. La Fig. 8 muestra el alineamiento de secuencias entre resistina humana y de raton; la identidad de secuencias total es del 55 %.

La estructura cristalina de la resistina de raton (Patel et al., arriba) esta disponible de Protein Data Bank bajo el codigo de acceso 1RFX. Basandose en esta estructura, se construyo un modelo 3D de resistina humana reemplazando aminoacidos segun el alineamiento de secuencias. El programa informatico COOT (Emsley, Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60:2126-32 (2004)) se uso para este fin. La conformacion de la cadena lateral se ajusto para evitar contactos estrechos con otros residuos. Siempre que fuera posible se eligieron los rotameros mas energeticamente favorables. No fueron necesarios cambios en la conformacion de cadena principal. El modelo resultante no contuvo residuos en la conformacion prohibida, sin choques estericos, y ningun residuo en un entorno desfavorable, tal como cargas sin compensar en el interior de la molecula, o amplios parches hidrofobos sobre la superficie de la molecula. Dado que la similitud de secuencias con la protelna de raton es relativamente alta y se cumplen los criterios estereoqulmicos, el modelo tridimensional resultante proporciona una buena aproximacion de la estructura real.

La cadena de polipeptidos de resistina esta plegada en una helice a del extremo N (residuos 22-47), seguido de un dominio globular (residuos 48-108), que tiene una estructura de un tipo rollo de gelatina. Tres monomeros de protelna forman un trlmero en el que las helices a forman una bobina en espiral y los dominios globulares forman una cabeza compacta con una amplia interfase que cubre aproximadamente el 30 % de la superficie de cada monomero. Un modelo teorico anterior de la resistina esta disponible de Protein Data Bank bajo el codigo de acceso 1LV6. Este modelo anterior no esta de acuerdo con los datos de la estructura cristalina ahora disponibles para la resistina de raton.

Ejemplo 7

Prediccion de los sitios de union del receptor de resistina hipotetico

Varias llneas de evidencia sugieren que la superficie lateral de los dominios globulares del trlmero es un posible sitio de union al receptor. Por ejemplo, la resistina es activa en una forma trlmera (Patel et al., arriba), por tanto, solo la superficie accesible al disolvente en el trlmero se considera como posible sitio de union al receptor. Ademas, como parte de la superfamilia estructural C1q/TNF de protelnas, la resistina pueden unirse a su receptor de una forma comun a otros miembros de la familia que esta en la superficie lateral del dominio globular. La superfamilia C1q/TNF esta registrada en la base de datos Pfam bajo el codigo de acceso CL0100. Incluye varias citocinas, tales como adiponectina, TNFa y p, y CD40L. Miembros de la superfamilia tienen un pliegue helicoidal/en rollo de gelatina caracterlstico y una estructura homotrlmera de bobina en espiral. Estan disponibles estructuras cristalinas para muchos miembros de la superfamilia, ademas de para sus complejos con los receptores correspondientes. Estas estructuras indican que la union del receptor se produce en la superficie lateral de los dominios globulares, normalmente en la interfase del dominio, como se observa, por ejemplo, en APO2L+DR5 y TNFfi+TNFR55. Nunca se observo que el receptor estuviera unido a la parte superior del dominio globular o al dominio helicoidal.

Por tanto, la similitud de secuencias en la familia resistina de protelnas es mucho mayor dentro del dominio globular que en el dominio helicoidal, sugiriendo su importancia funcional. La homologla de aminoacidos entre resistina humana y de raton es ~36 % en el dominio helicoidal frente al ~66 % en el dominio globular. Similarmente, la homologla entre resistina humana y bovina o porcina es ~28 % en el dominio helicoidal frente al ~85 % en el dominio globular.

Finalmente, la simetrla de tres pliegues de la cabeza globular del trlmero de resistina implica que el receptor, si se une a la parte superior de la cabeza, debe tener una simetrla de tres pliegues interna de su sitio de reconocimiento, que es muy poco probable. Esto elimina practicamente la posibilidad de union a la parte superior de la cabeza.

Hay solo dos fragmentos de la cadena de polipeptidos de resistina humana que estan sobre la superficie lateral del dominio globular y que son accesibles al disolvente en la forma trlmera. Estos incluyen los residuos 50-65 (SEC ID N°: 3) y 78-93 (SEC ID N°: 4). Ambos peptidos contienen dos tipos de residuos, aquellos que son accesibles y por tanto pueden interaccionar con el receptor, y aquellos que estan enterrados y, por tanto, no pueden participar en la interaccion. Los aminoacidos que no estan sobre la superficie podrlan sustituirse con el fin de lograr mejores propiedades bioflsicas de peptido. Las siguientes sustituciones se hicieron en los peptidos para evitar la reticulacion de disulfuro no especlfica: C51S, C63S (peptido 1) y C78S, C89S, C91S, C93s (peptido 2) resultantes en las siguientes secuencias de epitopes de peptidos:

Peptido 2815: ESQSVTSRGDLATSPR (SEC ID N°: 5)

Peptido 2816: SGSWDVRAETTSHSQS (SEC ID N°: 6)

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Juntos, estos dos peptidos cubren el 64 % de la superficie del dominio globular. Una ventaja del peptido 2815 es que todos los residuos, excepto las dos cisteinas, estan expuestos en la resistina, de manera que independientemente del plegamiento del peptido en la forma libre, los posibles residuos de epitopes estaran disponibles para la generacion de anticuerpos. El peptido 2816 forma una horquilla p en la proteina. Solo una cara de la horquilla p puede participar en el reconocimiento de receptor. Los residuos clave aqui son R84-A85-E86. Otra ventaja del peptido 2816 es que esta region esta el 100 % conservada en mamiferos superiores y el 75 % conservada con respecto a resistina murina. Dada la alta similitud de secuencias en este fragmento, es posible producir un anticuerpo que reaccionara de forma cruzada con proteina resistina de multiples especies.

Ejemplo 8

Confirmacion de la importancia funcional de epitopes identificados

Generacion de anticuerpos policlonales: Los peptidos de epitope 2815 y 2816 se sintetizaron quimicamente en un sintetizador de peptidos ABI433A usando RINK Resin SS (Advanced ChemTech, SA5030, Lote n° 17046). El peptido se escindio de la resina, se precipito, se filtro, se lavo y se seco. Los peptidos se enviaron a Invitrogen Corporation (Carlsburg, CA) donde se fusionaron con la proteina KLH para la inmunizacion. Se inmunizaron dos conejos por peptido usando los procedimientos convencionales (Cat. numero M0300). Los ensayos de ELISA sobre el peptido indicaron los titulos de anticuerpos y los conejos se sangraron terminalmente despues del procedimiento de inmunizacion de cuatro semanas. El anticuerpo se purifico por afinidad usando el peptido conjugado con albumina de suero. El anticuerpo policlonal producido contra los peptidos 2815 y 2816 se denomina C2815 y C2816, respectivamente.

Union a resistina humana de longitud completa: La capacidad de los anticuerpos policlonales C2815 y C2816 para unirse a resistina humana de longitud completa se probo usando un formato de ELISA de sandwich estandar. Se recubrio una placa con 2 pg/ml de C2815 o C2816 en tampon carbonato-bicarbonato 0,2 M, pH 8,5, durante la noche a 4 °C. Para eliminar la union no especifica, las placas se bloquearon con 280 pl de 0,5 % de albumina de suero bovino en PBS durante 2 horas a 37 °C. Se anadio la resistina humana a diferentes concentraciones a la placa y se incubo durante la noche a 4 °C. Para la detection se anadio el anticuerpo anti-resistina marcado con biotina BAM1359 (R&D Systems, Mineapolis, MN) con europio, seguido de disolucion de potenciamiento. La senal de fluorescencia se leyo sobre el lector de placas Victor y se representaron los datos en GraphPad Prism.

Los resultados en la Fig. 9 muestran la union de anticuerpos policlonales C2815 y C2816 a resistina humana de longitud completa con una Kd de 3,9 y 0,8 pg/ml, respectivamente.

Actividad neutralizante: La actividad neutralizante de C2816 y C2815 se evaluo en un ensayo de liberation de citocinas. Brevemente, se incubaron 2 ug/ml de resistina humana o de raton con concentraciones crecientes de cada anticuerpo a temperatura ambiente durante veinte minutos. La mezcla resistina-anticuerpo se anadio a celulas mononucleares de sangre primarias (CMSP) humanas aisladas y se incubaron durante veinticuatro horas. Se recogieron sobrenadantes libres de celulas y se detectaron niveles de MCP-1 por un kit de ELISA comercialmente disponible (R&D Systems, Mineapolis, MN).

Los resultados en las Figs. 10A y B muestran el efecto de los anticuerpos policlonales C2815 y C2816 sobre la liberacion de MCP-1 mediada por resistina humana de CMSP humanas aisladas. Los resultados indican que los anticuerpos fueron capaz de inhibir independientemente de la dosis la actividad de resistina humana en el ensayo de liberacion de MCP-1 confirmando que los epitopes identificados son importantes para la actividad de resistina. C2816 (CI50 65 pg/ml) demostro actividad neutralizante superior en comparacion con C2515. Sin embargo, eso podria explicarse parcialmente por la mayor afinidad de C2816 con la proteina resistina humana de longitud completa (Fig. 9).

Las Fig. 11A y B muestran el efecto de los anticuerpos policlonales C2815 y C2816 sobre la liberacion de MCP-1 mediada por resistina de raton de celulas mononucleares de sangre primarias humanas aisladas. Los resultados indican que los anticuerpos fueron capaces de inhibir dependientemente de la dosis la actividad de resistina de raton en el ensayo de liberacion de MCP-1. Los datos sugieren que C2815 y C2816 reaccionan de forma cruzada con resistina de raton de acuerdo con el alto nivel de conservation de secuencias en los epitopes seleccionados.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> CENTOCOR, INC.

<120> ANTAGONISTAS DE RESISTINA Y SU USO

<130> CEN5194PCT

<140> PCT/US2008/076934 <141 >

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<150> 60/974.607 <151 >

<160>6

<170> FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> 1 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 1

Met

Lys Ala Leu Cys Leu Leu Leu Leu Pro Val Leu Gly Leu Leu Val

1

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Ser

Ser

Lys Thr Leu Cys Ser Met Glu Glu Ala lie Asn Glu Arg lie

20 25 30

Gin

Glu Val Ala Gly Ser Leu He Phe Arg Ala lie Ser Ser lie Gly

35 40 45

Leu

Glu Cys Gin Ser Val Thr Ser Arg Gly Asp Leu Ala Thr Cys Pro

50 55 60

Arg

Gly Phe Ala Val Thr Gly Cys Thr Cys Gly Ser Ala Cys Gly Ser

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70 75 80

Trp

Asp Val Arg Ala Glu Thr Thr Cys His Cys Gin Cys Ala Gly Met

85 90 95

Asp

Trp Thr Gly Ala Arg Cys Cys Arg Val Gin Pro

100 105

<210>2 <211> 114 <212> PRT <213> Mus musculus

<400> 2

Met

Lys Asn Leu Ser Phe Pro Leu Leu Phe Leu Phe Phe Leu Val Pro

1

5 10 15

Glu

Leu Leu Gly Ser Ser Met Pro Leu Cys Pro lie Asp Glu Ala lie

20 25 30

Asp

Lys Lys lie Lys Gin Asp Phe Asn Ser Leu Phe Pro Asn Ala lie

35 40 45

Lys

Asn lie Gly Leu Asn Cys Trp Thr Val Ser Ser Arg Gly Lys Leu

50 55 60

Ala

Ser Cys Pro Glu Gly Thr Ala Val Leu Ser Cys Ser Cys Gly Ser

65

70 75 80

Ala

Cys Gly Ser Trp Asp lie Arg Glu Glu Lys Val Cys His Cys Gin

85 90 95

Cys

Ala Arg lie Asp Trp Thr Ala Ala Arg Cys Cys Lys Leu Gin Val

100 105 110

Ala Ser

<210>3 <211 > 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 3

Glu Cvs Gin Ser Val Thr Ser Arg Gly Asp Leu Ala Thr Cys Pro Arg 15 10 15

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20

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35

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65

<211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Cys Gly Ser Trp Asp Val Arg Ala Glu Thr Thr Cys His Cys Gin Cys

15 10 15

<210>5 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 5

Glu Ser Gin Ser Val Thr Ser Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ser Pro Arg 15 10 15

<210>6 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 6

Ser Gly Ser Trp A.sp Val Arg Ala Glu Thr Thr Ser His Ser Gin Ser 15 10 15

Claims (4)

1. 5

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   50

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   60

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   Reivindicaciones

   1. Un anticuerpo aislado reactivo con un epitope localizado en los residuos 78 a 93 definidos por SEC ID N°: 4 de resistina humana.
2. 2. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz del antagonista de resistina segun la reivindicacion 1 y un vehlculo o diluyente farmaceuticamente aceptable.
3. 3. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 2 para su uso en un metodo de modification de la actividad biologica de resistina en un mamlfero que comprende administrar la composicion farmaceutica al mamlfero.
4. 4. La composicion farmaceutica de la reivindicacion 3 para su uso en un metodo de tratamiento, o alivio, de los slntomas de las enfermedades con actividad de fibroblastos aberrante que incluyen enfermedades pulmonares intersticiales, cicatriz hipertrofica, cicatriz queloide, esclerodermia, fibrosis hepatica, fibrosis renal y fibrosis cardlaca que comprende administrar la composicion farmaceutica a un paciente en necesidad de la misma.