ES2554470T3

ES2554470T3 - Anticuerpos de unión de manera genérica con múltiples aplicaciones

Info

Publication number: ES2554470T3
Application number: ES12172190.6T
Authority: ES
Inventors: Elouard Benchikh; Peter Fitzgerald; Philip Lowry; Ivan McConnell
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2011-06-16
Filing date: 2012-06-15
Publication date: 2015-12-21
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: EP2535333B1; US20120322089A1; GB201110164D0; US8735556B2; EP2535333A1

Abstract

Inmunógeno de estructura**Fórmula** en la que el accm es un material portador que confiere antigenicidad.

Description

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DESCRIPCIÓN

Anticuerpos de unión de manera genérica con múltiples aplicaciones Antecedentes de la invención

El fármaco carbamazepina (CBZ) se prescribe ampliamente para el tratamiento de diversos estados incluyendo trastorno por déficit de atención, trastorno bipolar, esquizofrenia y epilepsia. En los pacientes, CBZ tiene una semivida notificada de 18-65 horas y se metaboliza principalmente en 10,11-epóxido de carbamazepina (CBZ-E).

10.11- dihidro-10-hidroxicarbazepina (10-OH-CBZ), 10,11-dihidro-10,11-dihidroxicarbazepina (10,11-diOH-CBZ) y en cantidades minoritarias de los glucurónidos correspondientes. El producto de excreción urinaria mayorítario es

10.11- diOH-CBZ (80%). Se notifica que el intervalo terapéutico es de 2-10 pg/ml para carbamazepina total, es decir libre y unida a proteina, y de 0.5-3.6 pg/ml para carbamazepina libre, siendo los valores tóxicos correspondientes mayores de 12,00 pg/ml y 4,00 pg/ml, respectivamente (Mayo Clinic, Mayo Medical Laboratories, 2011). Las concentraciones tóxicas pueden provocar somnolencia, cefaleas, afectar a la función motora y en casos extremos son mortales. Este indice terapéutico estrecho, junto con la variabilidad entre pacientes en la capacidad de respuesta al fármaco requiere que la concentración en sangre de CBZ y su principal metabolito activo, CBZ-E, se monitoricen en pacientes que siguen una terapia con CBZ. El inmunoensayo es un formato de prueba analitica común usado para la monitorización terapéutica de fármacos (therapeutic drug monitoríng, TDM) de pacientes que toman fármacos tales como CBZ y se basa en anticuerpos que se unen al/a los analito(s) diana. Se describen varios inmunoensayos/componentes de inmunoensayo que se unen a carbamazepina y uno o más metabolitos a diversas concentraciones, por ejemplo los documentos EP1216994, US 5851779, EP0584854, EP0583820, US6803040. El documento US5821342 describe haptenos de carbamazepina e inmunógenos correspondientes derivados de una hidrazida de carbamazepina útiles en aplicaciones de inmunoensayo; la derivatización para formar el hapteno se produce a través del átomo de N terminal del grupo hidrazida. El documento US6368814 describe métodos de inmunoensayo para fármacos antidepresivos triciclicos basados en anticuerpos/conjugados derivados de haptenos e inmunógenos de amitríptilina y desipramina. Están disponibles varios kits de inmunoensayo comerciales de especificidad variable, muchos de los cuales describen un uso de TDM para pacientes que siguen una terapia con carbamazepina (tabla 1) Parant et al (2000) describen la reactividad cruzada frente a CBZ-E, oxcarbazepina y 10- OH-CBZ de los inmunoensayos de carbamazepina automatizados PETINIA y EMIT 2000; el único readante cruzado encontrado era CBZ-E en el ensayo PETINIA. Las aplicaciones de TDM basadas en inmunoensayos son las más idóneas debido a anticuerpos que tienen alta especificidad por o bien el fármaco original o bien un metabolito adivo para permitir mediciones precisas de su concentración, mientras que las aplicaciones toxicológicas no tienen necesariamente este requisito de especificidad.

La oxcarbazepina es un fármaco antiepiléptica reciente que se metaboliza rápidamente en 10-OH-CBZ y se considera un candidato para TDM (Brlng y Ensom 2008; Krasowski 2010). Podría usarse un anticuerpo que se une a oxcarbazepina/10-OH-CBZ en un inmunoensayo para monitorizar muestras ¡n vitrn de pacientes que están sometiéndose a terapia farmacológica con oxcarbazepina. Un anticuerpo de este tipo también podría aplicarse en un inmunoensayo para la TDM de otros fármacos de la familia de carbamazepina que producen 10-OH-CBZ como metabolito Los inmunoensayos que incorporan tales anticuerpos podrian tener también otras aplicaciones, tales como en toxicologia. Ninguno de los inmunoensayos descritos en la técnica anterior (incluyendo los ensayos comerciales descritos en la tabla 1) tienen reactividad cruzada sustancial hacia oxcarbazepina/10-OH-CBZ y, por tanto, no son adecuados para tales fines Los perfiles de reactividad cruzada de los ensayos comerciales presentados en la tabla 1 sugieren que los inmunógenos usados para generar los anticuerpos de los ensayos se derivaron a través de derivatización en la carboxamida/posición 1 de un hapteno de carbamazepina/de tipo carbamazepina (molécula pequeña, preinmunógena). La extensión del consumo de productos farmacéuticos ha dado como resultado preocupaciones con respecto a los niveles de fármacos y sus metabolitos en el entorno acuático, uno de los cuales es carbamazepina. Es deseable la detección de medicamentos tales como carbamazepina en masas de agua potable y agua ambiental para determinar sus efectos ecotoxicológicos. Un inmunoensayo de CBZ descrito recientemente que incorpora un anticuerpo monoclonal detectó CBZ y CBZ-E pero tenia reactividad cruzada insignificante hacia oxcarbazepina, 10-OH-CBZ y 10,11-di-OH-CBZ (Bahlmann et al. 2009). Es probable que la cantidad de carbamazepina en masas de agua se subestimase por este inmunoensayo ya que el anticuerpo mostraba una unión insignificante al metabolito urinario mayoritario de carbamazepina, 10,11-di- OH-CBZ. Los anticuerpos de inmunoensayos de carbamazepina actuales no reaccionan de manera cruzada con

10.11- di-OH-CBZ y, por tanto, subestimarían los niveles del fármaco carbamazepina en el entorno acuático. Un inmunoensayo preferido encontraría aplicación en la TDM de carbamazepina, de fármacos basados en carbamazepina más nuevos y para la monitorización de fármacos basados en carbamazepina en el entorno. Es evidente que los inmunoensayos actuales, en los que los anticuerpos de ensayo tienen alta afinidad con CBZ y CBZ- E, no presentan esta amplia aplicabilidad.

Bibliografía

Bring P. y Ensom M.H.H. 2008. Clin. Pharmac., 47: 767-778 Bahlmann A. etal. 2009. Anal. Bioanal. Chem., 395: 1809-1820.

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Krasowski M.D. 2010. Pharmaceuticals, 3: 1909-1935.

Mayo Clinic,
http://www.mayomedicallaborator¡es com/test-catalog/print.php?un¡t code=81770, el 25 de marzo de 2011.

Parant et al. (2003). Ther. Drug Monit., 25: 41-45 Dibujos

Figura 1. Estructuras de carbamazepina y metabolitos mayoritarios Figura 2 Preparación de haptenos A y B.

Tabla 1. Inmunoensayos de carbamazepina disponibles comercialmente*

Proveedor: Analizador/método Reactividad cruzada

Abbott Diagnostics: Axsym CBZ-E 5 83,0%


: Desipramina < 540,0%

Roche Diagnostics: TDM en línea** CBZ-E 14,0%


: 10-OH-CBZ 1,2%


: Oxcarbazepina 1,0%

Siemens: ADVIA CBZ-E 21,8%


: Amitriptilina 5,2%


: Nortríptilina 5,2%

Beckman Coulter (BC): Analizadores de BC CBZ-E 7,4%


: Amitriptilina 18,6%


: Nortríptilina 17,2%


: Fenotiazina 8.6%


: Imipramina 5,6%


: Diazepam 4,8%

* Datos tomados de las fichas técnicas de los fabricantes o FDA 512(k) ** A 6 pg/ml de carbamazepina_____________________________________

Sumario de la invención

La invención describe inmunógenos usados en la producción de anticuerpos policlonales novedosos con propiedades de unión únicas que superan las limitaciones de aplicación de inmunoensayos descritos actualmente permitiendo métodos y kits para la detección y cuantificacíón de oxcarbazepina/10,11-dihidro-10-hidroxicarbazepina en muestras de pacientes in vitro y pruebas de inmunoensayo de entornos acuáticos más precisas del nivel de fármacos de la familia de carbamazepina, incluyendo 10,11-dihidro-10,11-dihidroxicarbazepina. Además, la reactividad cruzada genérica de los anticuerpos permite que se efectúe un inmunoensayo de carbamazepina/10,11- epóxido de carbamazepina convencional.

Descripción detallada de la invención

La invención proporciona un inmunógeno de estructura

accm

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en la que el agente de reticulación es preferiblemente

o bien

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en los que X es un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido o un oxigeno unido a un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido e Y es un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido; los grupos alquilo o alquileno de X e Y son preferiblemente Cmo, lo más preferiblemente C^; Z es o bien carbonilo o bien amino y se une al accm. El agente de reticulación preferido es cuando X es -0-CH2- y Z es carbonilo, uniéndose el grupo metileno de X a Z. En el campo del desarrollo de anticuerpos, se considera generalmente que la longitud óptima del grupo de unión que une el analito que va a detectarse al accm (longitud de cadena lineal y sin incluir átomos de hidrógeno) es de aproximadamente 1-10 átomos, más habitualmente de aproximadamente 1-6 átomos. Para el fin de la invención, el agente de reticulación es la cadena de átomos que une la posición 10 del anillo triciclico al accm. El accm es un material portador que confiere antigenicidad y es cualquier material que haga que la totalidad o parte de la fracción carbamazepina sea susceptible al reconocimiento y la unión por el anticuerpo. Por ejemplo, el accm puede ser una proteina, un fragmento de proteina, un polipéptido sintético o un polipéptido semisintético. El accm es preferiblemente tiroglobulina bovina (BTG)

La invención también describe anticuerpos sensibles con reactividad cruzada genérica novedosa que permiten por primera vez una utilidad de múltiples aplicaciones, es decir, que van a usarse en TDM, toxicologia y detección ambiental.

Por tanto, otro aspecto de la invención son anticuerpos que se unen a un epitopo de carbamazepina, 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10,11 -dihidro-10.11-

dihidroxicarbamazepina caracterizados porque tienen sensibilidad suficiente como para usarse en aplicaciones toxicológicas y ambientales. La capacidad de los anticuerpos para reconocer CBZ y CBZ-E permite una prueba de TDM para pacientes que siguen una terapia con CBZ; el reconocimiento de oxcarbazepina y 10-OH-CBZ permite una prueba de TDM para pacientes que toman oxcarbazepina; el reconocimiento de 10,11-di-ÓH-CBZ permite un kit de monitorización de entornos acuáticos; además, la alta sensibilidad de los anticuerpos con respecto a oxcarbazepina, CBZ y 10-OH-CBZ permite el uso de los anticuerpos en aplicaciones toxicológicas. El experto es consciente de que la reactividad cruzada genérica de anticuerpos no proporciona necesariamente un anticuerpo apropiado para aplicación industrial a menos que la sensibilidad asociada esté dentro de un intervalo que puede ser de uso práctico. Una medida común de la sensibilidad de anticuerpos para inmunoensayos es la CI50. También se reconoce que para inmunoensayos que utilizan un formato de competencia, el valor de CI50 exacto varia ligeramente dependiendo de la naturaleza del conjugado usado para competir con el analito en la muestra.

Un aspecto adicional de la invención son anticuerpos que tienen una CI50 de aproximadamente 2 ng/ml para carbamazepina, de aproximadamente 3 ng/ml para 10,11-epóxido de carbamazepina, de aproximadamente 3 ng/ml para 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, de aproximadamente 1 ng/ml para oxcarbazepina y de aproximadamente 15 ng/ml para 10,11 -dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina.

Un aspecto todavia adicional de la invención son anticuerpos que tienen una CI50 de al menos 2,135 ng/ml para carbamazepina, de al menos 3,125 ng/ml para 10,11-epóxido de carbamazepina. de al menos 3,167 ng/ml para

10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, de al menos 0,714 ng/ml para oxcarbazepina y de al menos 15,269 ng/ml para 10,11-d¡hidro-10,11-dihidroxicarbamazep¡na. El experto en la técnica sabe que, variando la concentración de anticuerpo a través de dilución, pueden ajustarse los valores de CIsg dependiendo de la aplicación. Tal como se estableció anteriormente, la TDM de CBZ se implementa generalmente a una concentración de pg/ml.

Otro aspecto de la invención son los anticuerpos descritos anteriormente generados a partir de uno o más de los ¡nmunógenos descritos anteriormente.

Los anticuerpos de la invención son preferiblemente policlonales, pero pueden ser derivados modificados por ingeniería genética y/o de manera sintética tales como anticuerpos monoclonales o fragmentos variables de cadena sencilla (scFv).

La invención también proporciona métodos de detección o determinación de uno o más de carbamazepina, 10,11- epóxido de carbamazepina, 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10,11 -dihidro-10,11-

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dihidroxicarbamazeplna en una muestra in vitro de un individuo o una muestra ambiental que comprende: poner en contacto la muestra con uno o más agentes de detección y uno o más anticuerpos de la invención; detectar, o determinar la cantidad de, el uno o más agentes de detección; y deducir a partir de calibradores la presencia de o la cantidad de uno o más de carbamazepina, 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11 -dihidro-10- hidroxicarbamazepina, oxcarbazeplna y 10,11-dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina en la muestra.

“Detectar" significa analizar cualitativamente la presencia o ausencia de una sustancia, “determinar" significa analizar cuantitativamente la cantidad de una sustancia. El agente de detección es una molécula pequeña (generalmente de estructura similar a una molécula que va a detectarse), conjugada con un agente de mareaje, que puede unirse a uno de los anticuerpos de la invención. El agente de mareaje se selecciona de una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia radiactiva, o una mezcla de las mismas. Preferiblemente, el agente de mareaje es una enzima, preferiblemente una peroxidasa, lo más preferiblemente peroxidasa del rábano (HRP). Alternativa o adicionalmente, la sustancia luminiscente puede ser un material bioluminiscente, quimioluminiscente o fluorescente. Para los fines de la invención, la muestra del paciente que va a usarse para análisis in vitro puede ser cabello o un liquido biológico periférico pera es preferiblemente sangre completa, suero, plasma u orina. Si la historia de la muestra se desconoce, por ejemplo si es una muestra de sangre u orina tomada de un paciente inconsciente, el método será semicuantitativo, es decir podrían detectarse varias moléculas y cualificarse una cantidad "equivalente normalizada". Si la historia de la muestra se conoce, por ejemplo si es una muestra de orina de un individuo que sigue una terapia con oxcarbazepina, el método puede clasificarse como esencialmente cuantitativo ya que se detectará 10-OH-CBZ, representando la molécula original sin cambios menos del 1% del producto excretado

Un aspecto adicional de la invención es un kit para detectar o determinar uno o más de carbamazepina, 10,11- epóxido de carbamazepina, 10,11 -dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10.11 -dihidro-10,11- dihidroxicarbamazepina, que comprende uno o más anticuerpos de la invención Opcionalmente, los kits pueden contener uno o más agentes de detección y uno o más calibradores.

Pueden usarse anticuerpos, métodos y kits de la invención en diversas aplicaciones tales como TDM, toxicologia y para la monitorización ambiental más precisa de estos fármacos.

Métodos generales, ejemplos y resultados

Preparación de haptenos, inmunógenos y agentes de detección

Aunque las moléculas pequeñas diana proporcionan epitopos estructurales, no son por si mismas inmunógenas y, por tanto, es necesario conjugarlas con materiales portadores, lo que provocará una respuesta inmunogénica cuando se administran a un animal huésped. Los materiales portadores apropiados contienen comúnmente segmentos de poli(aminoácidos) e incluyen polipéptidos, proteínas y fragmentos de proteina. Ejemplos ilustrativos de materiales portadores útiles son albúmina sérica bovina (BSA), ovoalbúmina de huevo, gammaglobulina bovina, tiroglobulina bovina (BTG), hemocianina de lapa califomiana (KLH), etc. Alternativamente, pueden emplearse poli(aminoácidos) sintéticos que tienen un número suficiente de grupos amino disponibles, tales como lisina, como también otros materiales poliméricos sintéticos o naturales que portan grupos funcionales reactivos. Además, pueden conjugarse hidratos de carbono, levaduras o polisacáridos con el hapteno para producir un inmunógeno. Los haptenos también pueden acoplarse con un agente de mareaje detectable tal como una enzima (por ejemplo, peroxidasa del rábano), una sustancia que tenga propiedades fluorescentes o un marcador radiactivo para la preparación de agentes de detección para su uso en los inmunoensayos. La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo, un residuo monovalente de fluoresceína o un derivado del mismo. La formación de inmunógenos para la invención descrita en el presente documento implica quimica de conjugación convencional. Con el fin de confirmar que se ha logrado una conjugación adecuada del hapteno con el material portador, antes de la inmunización, cada inmunógeno se evalúa usando espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser UV asistida por matriz (EM MALDI-TOF).

Procedimiento general para el análisis por MALDI-TOF de inmunógenos.

Se realizó espectrometría de masas MALDI-TOF usando un espectrómetro de masas de desorción láser Voyager STR Biospectrometry Research Station acoplado con extracción retardada. Se diluyó una alícuota de cada muestra que iba a analizarse en ácido trifluoroacético (TFA) acuoso al 0,1% para crear disoluciones de muestra de 1 mg/ml. Se analizaron alícuotas (1 pl) usando una matriz de ácido sinapinico y albúmina sérica bovina (Fluka) como calibrante externo.

Preparación de antisueros

Con el fin de generar antisueros policlonales, se mezcla un inmunógeno de la presente invención con adyuvante de Freund y se inyecta la mezcla en un animal huésped, tal como conejo, oveja, ratón, cobaya o caballo. Las ovejas son el animal huésped preferido Se realizan inyecciones adicionales (refuerzos) y se toman muestras de suero para la evaluación del titulo de anticuerpos. Cuando se ha alcanzado el titulo óptimo, se extrae sangre del animal huésped para producir un volumen adecuado de antisuero especifico. El grado de purificación de anticuerpos

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requerido depende de la aplicación prevista Para muchos fines, no hay ningún requisito para la purificación; sin embargo, en otros casos, tales como cuando el anticuerpo va a inmovilizarse sobre un soporte sólido, pueden adoptarse etapas de purificación para retirar material no deseado y eliminar la unión no especifica.

Desarrollo del inmunoensavo

El procedimiento de desarrollo de un inmunoensayo lo conoce bien el experto en la técnica. En resumen, para un inmunoensayo de competencia en el que el analito diana es una molécula no inmunógena tal como un hapteno, se realiza el siguiente procedimiento: se producen anticuerpos inmunizando un animal, preferiblemente un animal mamífero, mediante la administración repetida de un inmunógeno. El suero del animal inmunizado se recoge cuando el titulo de anticuerpos es suficientemente alto Se añade un agente de detección a una muestra que contiene el analito diana y los anticuerpos generados, y el agente de detección y el analito compiten por la unión a los anticuerpos. El procedimiento puede comprender fijar dichos anticuerpos séricos a un sustrato de apoyo tal como un soporte sólido de poliestireno o un chip de cerámica. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales usando técnicas convencionales. La señal emitida en el inmunoensayo es proporcional a la cantidad de agente de detección unido a los anticuerpos, que a su vez es inversamente proporcional a la concentración de analito. La señal puede detectarse o cualificarse mediante comparación con un calibrador.

Ejemplos

Ejemplo 1: Síntesis de 7-carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno Al

A una disolución de oxcarbazepina 1 (2,52 g, 10 mM) en piridina seca (50 mi) bajo nitrógeno se le añadió hemiclorhidrato de carboximetoxilamina (1,31 g, 12 mM) y se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente La mezcla era turbia al principio pero se volvió de color amarillo transparente tras unas pocas horas. Se eliminó el disolvente a vado y se purificó el residuo obtenido mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de silice usando el 10% de metanol / el 90% de cloroformo para dar 2,3 g del producto como una espuma. Entonces se trituró el producto con acetato de etilo / hexano (1/1), se filtró el sólido blanco formado y se secó para dar 2 g de 7- carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno A). P.F. 205 °C (dése). 13C-RMN (CD3OD) (8: ppm): 171,21, 156,17, 154,49, 143,45, 141,16, 134,25, 130,77, 130,66, 130,57, 129,70, 128,64, 128,58, 128,31, 128,06, 127,6, 71,09 y 32,17.

Ejemplo 2: Síntesis de tiolactona de homocisteina de 7-carboximetiloxima de oxcarbazepina 3 (hapteno B1

A una disolución bajo nitrógeno de 7-carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno A) (1 g, 3,07 mM) en piridina seca (25 mi) se le añadió clorhidrato de tiolactona de homocisteina (568 mg, 3,7 mM) y clorhidrato de EDC (710 mg, 3,7 mM) y se agitó la mezcla durante la noche a temperatura ambiente; la CCF indicó que se completó la reacción. Se eliminó la piridina a vacio y se purificó el residuo obtenido mediante cromatografía ultrarrápida sobre gel de silice usando el 15% de metanol / el 85% de cloroformo para proporcionar 885 mg de la tiolactona de homocisteina de 7- carboximetiloxima de oxcarbazepina 3 pura (hapteno B) como un sólido espumoso blanquecino.

13C-RMN (CD3OD) (8: ppm): 205,53, 170,56, 156,62, 142,55, 131,37, 131,19, 130,88, 129,33, 129,11, 128,42, 73,81, 60,78, 59,44, 32,10, 28,91, 21,43.

Ejemplo 3: Conjugación del hapteno A con BSA (inmunógeno 0

A una disolución de 7-carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno A) (38,73 mg, 0,112 mmol) en DMF (1,0 mi) se le añadió N,N-diciclohex¡lcarbodi¡mida (DCC) (25,35 mg, 0,123 mmol) y N-hidroxisuccinimida (14,13 mg, 0,123 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se retiró la diciclohexilurea formada mediante filtración y se añadió la disolución gota a gota a una disolución de BSA (150 mg, 2,3 pmol) en disolución de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 mi). Entonces se agitó la mezcla durante la noche a 4 “C. Entonces se dializó la disolución frente a tampón fosfato 50 mM pH 7,2 (3 cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se secó por congelación. Los resultados de MALDI mostraron que se habian conjugado 24,99 moléculas de hapteno A con una molécula de BSA.

Ejemplo 4: Conjugación del hapteno A con BTG (inmunógeno III

A una disolución de 7-carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno A) (43,91 mg, 0,135 mmol) en DMF (1,0 mi) se le añadió N N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (30,7 mg, 0,149 mmol) y N-hidroxisuccinimida (17,13 mg, 0,149 mmol) y se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche. Se retiró la diciclohexilurea formada mediante filtración y se añadió la disolución gota a gota a una disolución de BTG (150 mg) en disolución de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 mi). Entonces se agitó la mezcla durante la noche a 4 °C. Entonces se dializó la disolución frente a tampón fosfato 50 mM pH 7,2 (3 cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se secó por congelación.

Ejemplo 5: Conjugación del hapteno A con HRP

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Se disolvió clorhidrato de EDC (10 mg) en agua (0,5 mi) y se añadió inmediatamente a una disolución de 7- carboximetiloxima de oxcarbazepina 2 (hapteno A) (2 mg) en DMF (0,2 mi) Tras mezclar, se añadió esta disolución gota a gota a una disolución de HRP (20 mg) en agua (1 mi). Se añadió sulfo-NHS (5 mg) y se incubó la mezcla de reacción en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche. Se retiró el hapteno en exceso con columnas PD-10 dobles (Pharmacia) en serie, preequilibradas con PBS a pH 7,2. Entonces se dializó el conjugado de hapteno-HRP durante la noche frente a 10 I de PBS a pH 7,2 a 4 °C.

Ejemplo 6: Conjugación del hapteno B con HRP modificada con maleimida

Se disolvió el hapteno B (2 mg) en una mezcla de DMF/agua (100 pl) y a esta disolución se le añadió hidróxido de potasio (2 M) (10 pl). Se permitió que la mezcla estuviera en reposo durante 10 minutos. Se añadió tampón fosfato (100 pl) para extinguir la reacción y se ajustó el pH a 7 mediante la adición de HCI 0,1 M. Se añadió esta disolución gota a gota a HRP modificada con maleimida (20 mg) disuelta en tampón fosfato (1 mi) y se agitó la disolución a 4 °C durante la noche (protegida de la luz). Se retiró el hapteno en exceso con columnas PD-10 dobles (Pharmacia) en serie, preequilibradas con PBS a pH 7,2. Entonces se dializó el conjugado de hapteno-HRP con 10 I de PBS a pH 7,2 a 4 °C.

Ejemplo 7: Desarrollo de un ELISA de competencia

Se conjugó carbamazepina con tiroglobulina bovina (BTG). Se administró el inmunógeno resultante a ovejas adultas mensualmente para proporcionar antisueros policlonales específicos de diana. Se extrajo IgG de los antisueros por medio de precipitación de inmunoglobulina con sulfato de amonio/ácido caprilico. Se recubrió una placa de microtitulación (Thermo Fisher Scientific NUNC, 468667) con anticuerpo (125 pl/pocillo) en tampón de recubrimiento (Tris 10 mM pH 8,5) a 37 °C durante 2 horas. Entonces se lavó la placa 4 veces a lo largo de 10 minutos con TBST a concentración de trabajo Se añadieron 50 pl de muestra/patrón (carbamazepina, Sigma C4024; 10,11-epóxido de carbamazepina, TRC C175850; 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, TRC D449135; rac-trans-10,11-dihidro-

10,11-dihidroxicarbamazepina, TRC D449040; oxcarbazepina, TRC 0869250; imipramina, Sigma 17379 y amitriptilina, Sigma A8404) a los pocilios apropiados por triplicado, seguido por 75 pl de conjugado de hapteno-HRP y se incubó a 25 °C durante 1 hora. Entonces se lavó la placa y se añadieron 125 pl de TMB (Randox, 4380-15) a cada pocilio y se dejó a temperatura ambiente durante 20 min en la oscuridad. Se detuvo la reacción usando 125 pl de ácido sulfúrico 0,2 M. Se leyeron las absorbancias a 450 nm con un lector de microplacas de ELISA (BIO-TEK Instruments, Elx800) y se calcularon las medias. Entonces se determinaron la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos.

Resultados

Empleando cada serie de patrones, se generaron curvas de calibración y se usaron éstas para determinar la especificidad del inmunoensayo para la carbamazepina, oxcarbazepina, metabolitos y moléculas relacionadas estructuralmente. Los resultados de este estudio se presentan en la tabla 2, calculándose la reactividad cruzada según la siguiente fórmula:

% de RC = Clso, carbamazepina / Clso, se X 100

en la que % de RC es el porcentaje de reactividad cruzada, Clso, carbamazepina es la concentración de carbamazepina que provoca un desplazamiento del 50% de la señal y Clso, rc es la concentración de carbamazepina/metabolitos/moléculas relacionadas estructuralmente que provoca un desplazamiento del 50% de la señal. Los resultados muestran un anticuerpo de alta sensibilidad de molécula individual y reactividad cruzada genérica, lo que permite que se use en una gama diversa de aplicaciones.

Tabla 2. Caracterización de anticuerpos usando antisuero generado frente al inmunógeno II y agente de detección derivado del hapteno A en una forma de ensayo de competencia (RC basada en el 100% para carbamazepina)

Analito: CI50 ng/ml % de reactividad cruzada

CBZ: 2,135 100,00

CBZ-E: 3,125 68,30

10-OH-CBZ: 3,167 67,40

10,11-diOH-CBZ: 15,269 14,00

Oxcarbazepina: 0.714 299,00

Amitriptilina: »200 «1,10

Imipramina: »200 «1,10

Claims

Inmunógeno de estructura

imagen1

en la que el accm es un material portador que confiere antigenicidad Inmunógeno según la reivindicación 1, en el que el agente de reticulación es

imagen2

en los que X es un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido o un oxígeno unido a un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido e V es un grupo alquilo, alquileno o arileno sustituido o no sustituido, en los que los grupos alquilo o alquileno de X e Y son preferiblemente C-mc, lo más preferiblemente C2-6; Z es o bien carbonilo o bien amino y se une al accm.

Inmunógeno según la reivindicación 2, en el que el agente de reticulación es

X

en el que X es -0-CH2- y Z es carbonilo.

Anticuerpos que se unen a un epitopo de carbamazepina, 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11 -dihidro- 10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10,11-dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina, caracterizándose los anticuerpos por haberse generado frente a un inmunógeno según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

Anticuerpos según la reivindicación 4, caracterizados además por tener suficiente sensibilidad como para usarse en aplicaciones de monitorización terapéutica de fármacos (TDM). toxicológicas y ambientales.

Anticuerpos según la reivindicación 4, que tienen una CI50 de aproximadamente 2 ng/ml para carbamazepina, de aproximadamente 3 ng/ml para 10,11-epóxido de carbamazepina, de aproximadamente 3 ng/ml para 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, de aproximadamente 1 ng/ml para oxcarbazepina y

de aproximadamente 15 ng/ml para 10,11 -dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina.

Método de detección o determinación de una o más de carbamazepina, 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10,11 -dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina en una muestra in viíro de un individuo o una muestra ambiental que comprende: poner en contacto la muestra con uno o más anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; detectar o determinar la cantidad del uno o más agentes de detección que compiten por la unión con uno o más de los anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6; y deducir la presencia de o la cantidad de uno o más de carbamazepina. 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11-dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina, y 10,11 -dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina en la muestra.

Kit para detectar o determinar uno o más de carbamazepina. 10,11-epóxido de carbamazepina, 10,11- dihidro-10-hidroxicarbamazepina, oxcarbazepina y 10,11-dihidro-10,11-dihidroxicarbamazepina, que comprende uno o más anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

Anticuerpos según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que son anticuerpos policlonales.