ES2582680T3

ES2582680T3 - Ensayo para la detección de la familia de fenilpiperazina

Info

Publication number: ES2582680T3
Application number: ES13156414.8T
Authority: ES
Inventors: Elouard Benchikh; Peter Fitzgerald; Philip Lowry; Ivan McConnell
Original assignee: Randox Laboratories Ltd
Current assignee: Randox Laboratories Ltd
Priority date: 2012-02-24
Filing date: 2013-02-22
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2033-02-22
Also published as: US20130224882A1; EP2631231B1; GB201203266D0; EP2631231A1; US10253006B2; US20160229824A1

Abstract

Inmunógeno que comprende un hapteno de estructura general: **Fórmula** en la que uno de X e Y es H y el otro es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une al anillo aromático; en el que A se selecciona de -C(O)-, O y NH; en el que m >= 0 ó 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10 o resto arileno; en el que n >= 0 ó 1; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehído; estando acoplado dicho hapteno a un material portador que confiere antigenicidad seleccionado de un polipéptido sintético, un polipéptido semisintético, un fragmento de proteína o una proteína.

Description

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DESCRIPCION

Ensayo para la deteccion de la familia de fenilpiperazina Antecedentes

En los ultimos anos, los derivados de piperazina han surgido como una nueva clase de drogas de diseno, obteniendo popularidad especialmente entre la gente joven en el ambiente de la musica dance en donde se conocen comunmente como “pastillas de fiesta”. Se comercializan a menudo como productos “naturales” o “fitoterapicos”, pero de hecho son productos qmmicos completamente sinteticos. Junto con su facil disponibilidad y estado legal variable en todo el mundo, esto puede crear la concepcion erronea de que estas drogas son seguras y no tienen los riesgos comunmente asociados con las drogas callejeras tradicionales. Se encuentran habitualmente derivados de piperazina en formas de dosificacion ilfcitas como comprimidos o capsulas, aunque tambien pueden producirse polvos sueltos y mas raramente disoluciones. Los comprimidos a menudo portan logotipos similares a los observados en comprimidos de extasis y a menudo se venden enganosamente como extasis o como alternativas aparentemente “mas seguras” y “legales”. Su nombre se deriva del heterociclo de piperazina que es una caractenstica comun y pueden dividirse en dos subclases; las bencilpiperazinas, tales como la propia 1- bencilpiperazina (BZP), y las fenilpiperazinas que incluyen 1-(3-clorofenil)piperazina (mCPP), 1-(4- metoxifenil)piperazina (MeOPP) y 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina (TFMPP) (la figura 1 muestra la estructura de estos y otros derivados de fenilpiperazina).

Las fenilpiperazinas se metabolizan de manera extensa siendo la reaccion metabolica principal la alteracion del anillo aromatico, o bien mediante hidroxilacion (mCPP, TFMPP) o bien mediante O-desmetilacion del resto metoxilo (MeOPP) (Maurer et al., 2004). Tambien se observa la degradacion metabolica del resto piperazina para dar los correspondientes derivados de etilendiamina o anilina. Las reacciones metabolicas de fase II son glucuronidacion o sulfatacion parcial de los metabolitos fenolicos, metilacion de los catecoles y acetilacion parcial de los derivados de anilina (Maurer et al., 2004).

Una de las fenilpiperazinas mas extendidas, mCPP, es un metabolito activo del farmaco antidepresivo trazodona y farmacos terapeuticos relacionados. mCPP es un agonista del receptor de 5-HT con propiedades estimulantes y alucinogenas similares a 3,4-metilendioxi-N-metanfetamina (MDMA; el principio activo del extasis), a diferencia de MDMA no provoca un aumento en la frecuencia cardiaca o la tension arterial. Hay dos isomeros de posicion de mCPP, 1-(4-clorofenil)piperazina y 1-(2-clorofenil)piperazina. En 2006, se estimo que casi el 10 % de los comprimidos ilfcitos vendidos en la UE, como parte del mercado ilfcito del extasis, conteman mCPP (European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, EMCDDA). Se ha sugerido ahora a partir de informes anecdoticos de usuarios en lmea que al menos el 50 % de las pastillas de extasis vendidas en el Reino Unido y el resto de Europa pueden contener mCPP como principio activo primario (EMCDDA). Tras la administracion oral de mCPP a voluntarios masculinos humanos sanos, la semivida de eliminacion oscila entre 2,6 y 6,1 horas con una amplia variacion en los niveles en sangre maximos y la biodisponibilidad (EMCDDA). Los efectos negativos de mCPP, a menudo tfpicos de un smdrome de serotonina, incluyen ansiedad, mareo, confusion, escalofnos, sensibilidad a la luz y el ruido, miedo a perder el control, migrana y crisis de angustia (EMCDDA).

Otro derivado de piperazina encontrado comunmente en pastillas de fiesta es TFMPP. TFMPP actua como agonista del receptor de serotonina no selectivo, ademas de estimular los niveles de serotonina sinapticos bloqueando la recaptacion de serotonina y aumentando su liberacion (Nikolova & Danchev, 2008). No tiene uso terapeutico, pero se ha vendido como droga recreativa usada como alternativa “legal” a drogas ilfcitas tales como dietilamida de acido lisergico (LSD) y MDMA. TFMPP tiene propiedades similares a los efectos estimulantes del extasis, pero tomada en dosis mas grandes promueve reacciones alucinogenas (Nikolova & Danchev, 2008). Se encuentra casi siempre en combinacion con BZP, con la que tiene una relacion sinergica. La combinacion de BZP/TFMPP conduce a aumentos en los niveles de dopamina y serotonina mayores que los observados cuando se toma cualquiera individualmente (Baumann et al., 2005). Esto permite a los fabricantes disminuir la dosis de cada uno sin poner en peligro el efecto de las drogas. Se ha mostrado que TFMPP se metaboliza de manera extensa (Staack et al., 2003), principalmente mediante hidroxilacion del anillo aromatico y mediante degradacion del resto piperazina para dar N-(3- trifluorometilfenil)etilendiamina, N-(hidroxiltrifluorometilfenil)etilendiamina, 3-trifluorometilanilina e hidroxil-3- trifluorometilanilina, mientras que las reacciones de fase II inclrnan glucuronidacion, sulfatacion y acetilacion de metabolitos de fase I.

MeOPP (sinonimos: 1-(4-metoxifenil)piperazina, Paraperazina, 4-MeOPP) es otro derivado de piperazina que se ha vendido como componente en “pastillas de fiesta”, inicialmente en Nueva Zelanda y posteriormente en otros pafses de todo el mundo (Maurer et al., 2004). Tiene efectos similares a los del extasis aunque mucho menos potentes (Nikolova & Danchev, 2008). Como TFMPP, se encuentra comunmente en combinacion con BZP potenciando sus efectos. De hecho se han observado diversas mezclas de derivados de piperazina consistiendo la mayona en variaciones de BZP, TFMPP, mCPP y dibencilpiperazina (DBZP), algunas veces mezcladas con otras sustancias tales como anfetamina, cocama, ketamina, MDMA y cafema (EMCDDA; Drug Enforcement Administration [DEA], informe de 2009). Con la creciente criminalizacion de derivados de fenilpiperazina tales como los comentados anteriormente, existe la necesidad de una tecnica sencilla y rapida que permita realizar pruebas sistematicas de estas drogas.

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Los metodos analtticos que se han usado para detectar o determinar derivados de piperazina incluyen CG-EM y CLEM (Staack & Maurer 2003; Antia et al., 2010). Peters et al., (2010) presentan una revision de la toxicologfa analftica de las drogas emergentes, entre ellas las piperazinas. Una desventaja de los metodos basados en espectrometna de masas es que requieren un equipo caro y un personal muy bien formado. Se conocen en la tecnica inmunoensayos como alternativas relativamente economicas, simples y rapidas al analisis basado en espectrometna de masas. Se ha mostrado que una prueba de inmunoensayo enzimatico disponible comercialmente, el ensayo de extasis EMIT II plus (SYVA/Dade Behring), tiene reactividad cruzada con TFMPP y mCPP a concentraciones de 5.000-10.000 ng/ml (Logan et al., 2010). Los fabricantes no incluyen informacion sobre la reactividad cruzada con mCPP o TFMPP en el encarte del kit y los niveles de deteccion de este kit son insuficientes para los fines de las pruebas. La publicacion de la patente internacional n.° WO2010142974 describe anticuerpos y metodos para diferenciar entre mCPP metabolica como resultado de que un individuo tome farmacos antidepresivos y mCPP que se toma de manera ilfcita. Sin embargo, estos anticuerpos no reaccionan de manera cruzada con otros derivados de fenilpiperazina. Por tanto, sigue sin haber una prueba de deteccion facilmente disponible espedfica para derivados de fenilpiperazina y por tanto para solucionar este problema se requiere un metodo rapido y economico para detectar y determinar la gama de derivados de fenilpiperazina encontrados en drogas de diseno.

El documento EP2261259 describe un anticuerpo, generado a partir del inmunogeno I, que se une a un epftopo de una N-(3-clorofenil)piperazina N'-sustituida o no sustituida, para su uso en la deteccion o determinacion de N-(3- clorofenil)piperazina y N-(3-clorofenil)piperazinas N'-sustituidas en una disolucion o una muestra in vitro tomada de un paciente.

Bibliograffa

Antia, U., Tingle, M.D., Russell, B.R. (2010) J Forensic Sci, 55(5):1311-8.

Baumann, M. et al. (2005) Neuropsychopharmacology, 30: 550-560.

DEA report -
http://www.justice.gov/dea/programs/forensicsci/microgram/mg0509/mg0509.pdf.

EMCDDA -
http://www.emcdda.europa.eu/publications/drug-profiles/bzp.

Fitzgerald S.P. et al. (2005). Clin. Chem., 51: 1165-1176.

Logan, B.K. et al. (2010) J Anal Toxicol, 34:587-589.

Maurer, H.H. et al. (2004) Ther Drug Monit, 26(2): 127-131.

Nikolova, I. & Danchev, N. (2008) Biotechnol & Biotechnol Eq, 22: 652-655.

Peters, F.T. et al. (2010) Ther Drug Monit, 32(5): 532-539.

Staack, R.F. & Maurer, H.H. (2003) J Anal Toxicol, 27(8):560-568.

Staack, R.F. et al. (2003) J Mass Spectrom, 38(9): 971-981.

Documento WO2010142974 - Benchikh, E. et al.

Sumario de invencion

La presente invencion describe inmunogenos novedosos que se usan en la produccion de anticuerpos novedosos con propiedades de union unicas porque reaccionan de manera cruzada con diversos derivados de fenilpiperazina. Estos anticuerpos permiten metodos y kits para detectar y/o determinar derivados de fenilpiperazina (por ejemplo mCPP, TFMPP y MeOPP) en una muestra in vitro que son ventajosos con respecto a los metodos analfticos disponibles actualmente en cuanto a coste, facilidad de uso, velocidad y sensibilidad.

Descripcion de los dibujos

Figura 1 Estructuras de derivados de fenilpiperazina Figura 2 Estructuras de los haptenos A y B Figura 3 Preparacion del hapteno B Descripcion detallada

A menos que se establezca otra cosa, los terminos tecnicos del presente documento se utilizan segun el uso convencional conocido por los expertos en la tecnica.

Un primer aspecto de la presente invencion se refiere a un hapteno de estructura general:

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en la que uno de X e Y es H y el otro es -(A)m-B-D, estando A unido al anillo aromatico, y en el que; A es -C(O)-, O o NH y m=0 o 1; B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6, o resto arileno, y D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimida, un resto hidroxilo, un resto tiol o un resto aldehndo.

Opcionalmente, A se une al anillo aromatico. Ademas opcionalmente, A se une a la posicion 3 del anillo aromatico. Todavfa ademas opcionalmente, A se une a la posicion meta del anillo aromatico. Alternativamente, A se une a la posicion 4 del anillo aromatico. Todavfa ademas opcionalmente, A se une a la posicion para del anillo aromatico.

Opcionalmente, A se selecciona de -C(O)-, O y NH.

Opcionalmente, m = 0 o 1.

Opcionalmente, B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6. Ademas opcionalmente, B es un resto arileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6.

Opcionalmente, D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo.

Opcionalmente, X es H e Y es -(A)m-B-D, en el que A se une a la posicion 4 del anillo aromatico; en el que A se selecciona de -C(O)-, O y NH; en el que m = 0 o 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6 o resto arileno; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo.

Opcionalmente, Y es H y X es -(A)m-B-D, en el que A se une a la posicion 3 del anillo aromatico; en el que A se selecciona de -C(O)-, O y NH; en el que m = 0 o 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6 o resto arileno; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo.

Opcionalmente, uno de X e Y es H y el otro es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une al anillo aromatico; en el que A se selecciona de -C(O)-, O y NH; en el que m = 0 o 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6 o resto arileno; en el que n = 0 o 1; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo.

Opcionalmente, Y es H; X es -(A)m-(B)n-D; en el que m = 0; en el que n = 0; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo. Ademas opcionalmente, Y es H; X es -(A)m-(B)n-D; en el que m = 0; en el que n = 0; y en el que D es un resto carboxilo.

Opcionalmente, X es H; Y es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une a la posicion 4 del anillo aromatico; en el que A es O; en el que m = 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C6; en el que n = 1; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldehfdo. Ademas opcionalmente, X es H; Y es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une a la posicion 4 del anillo aromatico; en el que A es O; en el que m = 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada no sustituido C1; en el que n = 1; y en el que D es un resto carboxilo.

El termino “hapteno” tal como se usa en el presente documento describe una molecula preinmunogena que estimula la produccion de anticuerpos solo cuando se conjuga con una molecula portadora mas grande.

Un segundo aspecto de la presente invencion se refiere a un inmunogeno que comprende un hapteno tal como se describio anteriormente conjugado con un material portador que confiere antigenicidad (accm). El accm puede acoplarse al anillo aromatico. Opcionalmente, el accm se acopla a la posicion 3 del anillo aromatico. Ademas opcionalmente, el accm se acopla a la posicion meta del anillo aromatico. Alternativamente, el accm se acopla a la posicion 4 del anillo aromatico. Todavfa ademas opcionalmente, el accm se acopla a la posicion para del anillo aromatico. En la realizacion preferida de la presente invencion el accm se acopla a D, cuando X o Y es -(A)m-B-D. Se entiende que el accm forma un enlace, opcionalmente un enlace covalente, con D. El termino “inmunogeno” tal como se usa en el presente documento describe una entidad que induce una respuesta inmunitaria tal como

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produccion de anticuerpos o una respuesta de celulas T en un animal huesped. El accm puede ser cualquier material que haga que todo o parte del hapteno sea susceptible al reconocimiento y la union por anticuerpos. Por ejemplo el accm puede ser una protema, un fragmento de protema, un polipeptido sintetico o un polipeptido semisintetico. Ejemplos ilustrativos de materiales portadores utiles que confieren antigenicidad son albumina serica bovina (BSA), ovoalbumina de huevo, gammaglobulina bovina, tiroglobulina bovina (BTG), hemocianina de lapa californiana (KLH), etc. Preferiblemente el accm es BTG.

Opcionalmente, el inmunogeno comprende:

(a) un hapteno que tiene la estructura general descrita anteriormente; en la que Y es H; X es -(A)m-(B)n-D; en el que m = 0; en el que n = 0; en el que D es un resto carboxilo; y

(b) un accm seleccionado de albumina serica bovina (BSA), ovoalbumina de huevo, gammaglobulina bovina, tiroglobulina bovina (BTG) y hemocianina de lapa californiana (KLH).

Opcionalmente, el inmunogeno comprende:

(a) un hapteno que tiene la estructura general descrita anteriormente; en la que X es H; Y es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une a la posicion 4 del anillo aromatico; en el que A es O; en el que m = 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal no sustituido Ci; en el que n = 1; en el que D es un resto carboxilo; y

Una realizacion preferida de la presente invencion es un inmunogeno tal como se comento anteriormente que es o bien 1-(3-carboxifenil)piperazina (hapteno - A, figura 2) o bien 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno - B, figura 2) acoplado a un material portador que confiere antigenicidad. Ejemplos de materiales portadores adecuados son BTG, BSA o KLH.

Los inmunogenos obtenidos en la presente invencion se administran entonces a huespedes mairnferos para provocar la produccion de anticuerpos espedficos, opcionalmente anticuerpos policlonales, que entonces se usan para desarrollar inmunoensayos para derivados de fenilpiperazina, empleando conjugados marcados como reactivos de deteccion.

Otro aspecto de la presente invencion es un anticuerpo generado contra un inmunogeno tal como se describio anteriormente. Un anticuerpo preferido de la presente invencion es un anticuerpo generado contra un inmunogeno tal como se describio anteriormente que comprende un hapteno en el que Y=H y X=-(A)m-(B)n-D; estando A unido al anillo aromatico, y en el que A es -C(O)-, O o NH y m=0 o 1; B es un resto alquileno de cadena lineal sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6, o resto arileno; n = 0 o 1; D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimida, un resto hidroxilo, un resto tiol o un resto aldehfdo, y el hapteno se conjuga con un material portador que confiere antigenicidad. Un anticuerpo incluso mas preferido de la presente invencion es un anticuerpo generado contra 1-(3-carboxifenil)piperazina (hapteno A, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad y que tiene especificidad para 1-(3-metilfenil)piperazina con un valor de CI50 de menos de 50 ng/ml, preferiblemente menos de 10 ng/ml, lo mas preferiblemente alrededor de 1 ng/ml, que se caracteriza ademas opcionalmente por tener reactividad cruzada con al menos uno de 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-fenilpiperazina, 1-(4- metoxifenil)piperazina, 1 -(4-hidroxifenil) piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina, 1-(3-hidroxifenil)piperazina y 1-(3- trifluorometilfenil)piperazina.

Un anticuerpo preferido adicional de la presente invencion es un anticuerpo generado contra un inmunogeno tal como se describio anteriormente que comprende un hapteno en el que X=H e Y= -(A)m-B-D, estando A acoplado al anillo aromatico y en el que A es -C(O)-, O o NH y m=0 o 1; B es un resto alquileno de cadena lineal sustituido o no sustituido C1-C10, preferiblemente C1-C6, o resto arileno; D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimida, un resto hidroxilo, un resto tiol o un resto aldehfdo, y el hapteno se conjuga con un material portador que confiere antigenicidad. Un anticuerpo incluso mas preferido es el generado contra un inmunogeno que es 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno B, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad y que tiene especificidad para 1-(3-metilfenil)piperazina con un valor de CI50 de alrededor de menos de 50 ng/ml, preferiblemente menos de 10 ng/ml, lo mas preferiblemente alrededor de 1 ng/ml, que se caracteriza ademas opcionalmente por tener reactividad cruzada con al menos uno de 1-(3-clorofenil)piperazina, 1- fenilpiperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina, 1-(3- hidroxifenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina.

El termino “anticuerpo” tal como se usa en el presente documento se refiere a una inmunoglobulina o molecula similar a inmunoglobulina. En una realizacion preferida de la presente invencion los anticuerpos son anticuerpos monoclonales pero el experto entendera que puede usarse cualquier tipo de molecula de inmunoglobulina o fragmento de la misma, por ejemplo anticuerpos policlonales, fragmentos Fab, fragmentos scFv y cualquier otro fragmento de union a antfgeno todos los cuales se encuentran dentro del alcance de la presente invencion. Pueden producirse anticuerpos monoclonales mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica (tal como se describe en “Monoclonal antibody production techniques and application” de L.B Schook, 1987, Dekker, ISBN

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0824776402). Puede usarse cualquier animal huesped adecuado, preferiblemente un animal mairnfero, por ejemplo, pero sin limitarse a una oveja, un conejo, un raton, una cobaya o un caballo.

Cuando se usa en relacion con un anticuerpo, la palabra “espedfico” o “especifiddad” en el contexto de la presente invencion se refiere al analito al que se une preferiblemente el anticuerpo, tal como se evalua mediante una medicion adecuada tal como la reactividad cruzada. Tal como conoce un experto en la tecnica, para que la reactividad cruzada sea de uso practico, el anticuerpo espedfico de analito debe presentar una alta sensibilidad tal como se mide mediante una medicion adecuada tal como la CI50. La CI50 es una medida comun de la sensibilidad del anticuerpo para inmunoensayos. Para la presente invencion, una alta sensibilidad es una CI50 de menos de 50 ng/ml, preferiblemente menos de 10 ng/ml, lo mas preferiblemente alrededor de 1 ng/ml. En la presente invencion una CI50 de “alrededor de 1 ng/ml” se refiere a anticuerpos con valores de CI50 de desde aproximadamente 0,5 ng/ml hasta aproximadamente 1,5 ng/ml. Los expertos en la tecnica reconocen que para inmunoensayos que utilizan un formato de competencia, el valor de CI50 exacto vana ligeramente segun la naturaleza del agente de deteccion usado para competir con el analito en la muestra.

Los anticuerpos de la invencion pueden usarse aislados o en combinaciones en un metodo para detectar o determinar uno o mas derivados de fenilpiperazina en una muestra (se presentan ejemplos en la figura 1). Lo mas preferiblemente los anticuerpos de la invencion se usan en un metodo para detectar o determinar uno o mas de 1- fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3- metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina y 1-(2- metoxifenil)piperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con el anticuerpo o combinacion de los anticuerpos y opcionalmente uno o mas agentes de deteccion, deducir la presencia de o la cantidad de uno o mas de 1-fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4- metoxifenil)piperazina, 1-(3-metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4- fluorofenil)piperazina y 1-(2- metoxifenil)piperazina; opcionalmente midiendo el/los agente(s) de deteccion y deduciendo a partir de un calibrador la presencia de o la cantidad de uno o mas de 1-fenilpiperazina, 1-(4- hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3-metilfenil)piperazina, 1-(3- trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina. En una realizacion preferida la combinacion es un anticuerpo generado contra un inmunogeno que consiste en 1-(3- carboxifenil)piperazina (hapteno A, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad y un anticuerpo generado contra un inmunogeno que consiste en 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno B, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad. El accm preferido es BTG. Inesperadamente esta combinacion de dos anticuerpos derivados de inmunogenos conjugados a traves de dos posiciones adyacentes en los haptenos y un unico conjugado o agente de deteccion marcado, produjo un ensayo sensible capaz de detectar o determinar una amplia gama de derivados de piperazina (tabla 1).

Otra realizacion preferida de la invencion es un metodo para detectar o determinar uno o mas derivados de fenilpiperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un anticuerpo generado contra un inmunogeno que consiste en 1-(3-carboxifenil)piperazina (hapteno A, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad y opcionalmente uno o mas agentes de deteccion que deducen la presencia de o la cantidad de uno o mas derivados de fenilpiperazina, opcionalmente midiendo el/los agente(s) de deteccion y deduciendo a partir de un calibrador la presencia de o la cantidad de uno o mas derivados de fenilpiperazina.

Una realizacion adicional de la invencion es un metodo para detectar o determinar uno o mas derivados de fenilpiperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con un anticuerpo generado contra un inmunogeno que consiste en 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno B, figura 2) acoplado con un material portador que confiere antigenicidad y uno o mas agentes de deteccion, medir el/los agente(s) de deteccion y deducir a partir de un calibrador la presencia de o la cantidad de uno o mas derivados de fenilpiperazina.

Los terminos “detectar” o “deteccion” tal como se usan en el presente documento se refieren a analizar cualitativamente la presencia o ausencia de una sustancia, mientras que “determinar” se refiere a analizar cuantitativamente la cantidad de una sustancia presente. Puesto que los anticuerpos de la presente invencion pueden unirse a varias moleculas, el analisis cuantitativo adoptara la forma de medir el valor equivalente de calibrador. El experto en la tecnica tambien reconocera que para los fines de un ensayo positivo, podna implementarse un valor de punto de corte adecuado. La muestra en la presente invencion puede ser cualquier muestra biologica a partir de la cual pueda detectarse un derivado de fenilpiperazina. Preferiblemente la muestra se toma del grupo de sangre completa, plasma, suero y orina, sin embargo puede usarse cualquier muestra biologica a partir de la cual podna detectarse una fenilpiperazina, por ejemplo cabello o saliva.

Los agentes de deteccion de la presente invencion comprenden un hapteno, preferiblemente uno tal como se describe en el presente documento, conjugado con un agente de marcaje detectable. Preferiblemente el agente de marcaje se selecciona de una enzima, una sustancia luminiscente, una sustancia radiactiva o una mezcla de las mismas. Mas preferiblemente el agente de marcaje es una enzima, preferiblemente una peroxidasa y lo mas preferiblemente peroxidasa del rabano. Lo mas preferiblemente el agente de deteccion es 1-(4- carboximetileterfenil)piperazina unida covalentemente a un agente de marcaje detectable. Un ejemplo de un agente de marcaje adecuado es peroxidasa del rabano.

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La invencion tambien describe kits para detectar o determinar uno o mas derivados de fenilpiperazina. Preferiblemente el kit es uno en el que el uno o mas derivados de piperazina detectados o determinados son 1- fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3- metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina y 1-(2- metoxifenil)piperazina. En una realizacion preferida de la presente invencion el kit comprende uno o mas de los anticuerpos derivados de los inmunogenos descritos anteriormente y al menos un agente de deteccion.

En una realizacion adicional preferida el kit comprende un anticuerpo derivado de hapteno A (figura 2) y un anticuerpo derivado de hapteno B (figura 2) junto con al menos un agente de deteccion, y el uno o mas derivados de piperazina detectados o determinados son 1-fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1- (4-metoxifenil)piperazina, 1-(3-metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4- fluorofenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina. Los anticuerpos de los kits preferiblemente estan anclados a un soporte solido adecuado tal como un chip. Aunque el soporte solido puede ser de cualquier conformacion adecuada tal como una perla o un portaobjetos y de cualquier material adecuado tal como silicio, vidrio o plastico, el soporte solido es preferiblemente un chip de ceramica. El kit puede incluir ademas calibradores y uno o mas agentes de deteccion y opcionalmente incluye instrucciones para el uso de los anticuerpos del kit y, si se incorporan, los calibradores y agentes de deteccion, para detectar y determinar derivados de fenilpiperazina.

Metodos generales, ejemplos y resultados

Desarrollo del inmunoensayo

El proceso de desarrollo de un inmunoensayo lo conoce bien el experto en la tecnica (tal como se describe en “Immunoassay: A practical guide” de Brian Law, Taylor & Francis Ltd, ISBN 0-203-48349-9). En resumen, para un inmunoensayo competitivo en el que el analito diana es una molecula no inmunogena tal como un hapteno, se realiza el siguiente procedimiento: se producen anticuerpos inmunizando un animal, preferiblemente un animal mairnfero, mediante la administracion repetida de un inmunogeno. Se recoge el suero del animal inmunizado cuando el tftulo de anticuerpo es suficientemente alto. Se anade un agente de deteccion a una muestra que contiene el analito diana y los anticuerpos generados, y el agente de deteccion y el analito compiten por la union a los anticuerpos. El procedimiento puede comprender fijar dichos anticuerpos sericos a un sustrato de respaldo tal como un soporte solido de poliestireno o un chip de ceramica. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales usando tecnicas convencionales. La senal emitida en el inmunoensayo es proporcional a la cantidad de agente de deteccion unido a los anticuerpos que a su vez es inversamente proporcional a la concentracion de analito. La senal puede detectarse o cuantificarse mediante comparacion con un calibrador.

Preparacion de haptenos, inmunogenos y agentes de deteccion

Aunque los haptenos proporcionan epttopos estructurales definidos, no son por sf mismos inmunogenos y por tanto es necesario conjugarlos con materiales portadores, que provocaran una respuesta inmunogena cuando se administran a un animal huesped. Los materiales portadores apropiados contienen comunmente segmentos de poli(aminoacido) e incluyen polipeptidos, protemas y fragmentos de protema. Ejemplos ilustrativos de materiales portadores utiles son albumina serica bovina (BSA), ovoalbumina de huevo, gammaglobulina bovina, tiroglobulina bovina (BTG), hemocianina de lapa californiana (KLH), etc. Alternativamente, pueden emplearse poli(aminoacidos) sinteticos que tengan un numero suficiente de grupos amino disponibles, tales como lisina [^ejemplos de poli(aminoacidos) sinteticos?], como tambien cualquier otro material polimerico natural o sintetico que lleve grupos funcionales reactivos [^ejemplos de materiales polimericos naturales o sinteticos?]. Tambien pueden conjugarse hidratos de carbono, levaduras o polisacaridos con el hapteno para producir un inmunogeno. Los haptenos tambien pueden acoplarse a un agente de marcaje detectable tal como una enzima (por ejemplo, peroxidasa del rabano), una sustancia que tiene propiedades fluorescentes o un marcador radiactivo para la preparacion de agentes de deteccion (conjugados) para su uso en los inmunoensayos. La sustancia fluorescente puede ser, por ejemplo, un residuo monovalente de fluorescema o un derivado de la misma. La formacion de inmunogenos para la invencion descrita en el presente documento implica qmmica de conjugacion convencional tal como se describe en “Bioconjugation Techniques” de Greg T. Hennanson, Academic Press, paginas 419-455 y “Bioconjugation” de Mohammed Aslam y Alastair Dent, ISBN 1-56159-161-0 (1998) paginas 364-482. Con el fin de confirmar que se ha logrado una conjugacion adecuada del hapteno con el material portador, antes de la inmunizacion, se evalua cada inmunogeno usando espectroscopfa de masas de desorcion/ionizacion por laser UV asistida por matriz y tiempo de vuelo (MALDI-TOF MS). En el caso de los materiales portadores preferidos, BSA, BTG y KLH, se prefiere un mmimo de seis moleculas de hapteno por molecula de material portador.

Procedimiento general para el analisis de inmunogenos por MALDI-TOF.

Se realizo la espectrometna de masas MALDI-TOF usando un espectrometro de masas de desorcion por laser Voyager STR Biospectrometry Research Station acoplado con extraccion retardada. Se diluyo una alfcuota de cada muestra que iba a analizarse en acido trifluoroacetico (TFA) acuoso al 0,1 % (Sigma) para crear disoluciones de muestra de 1 mg/ml. Se analizaron alfcuotas (1 |il) usando una matriz de acido sinapmico (Sigma) y se uso albumina serica bovina (Fluka) como calibrador externo.

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Preparacion de antisueros

Con el fin de generar antisueros policlonales, se preparan 2 mg de un inmunogeno de la presente invencion en PBS, mezclado a una razon del 50 % de inmunogeno en PBS con el 50 % de adyuvante completo de Freund (Sigma, numero de producto -F5881) y se emulsiona haciendo pasar repetidamente la mezcla a traves de una punta en el extremo de una jeringa de 1 ml, hasta que alcanza la consistencia semisolida requerida. Entonces se inyecta 1 ml de la mezcla en un animal huesped, tal como conejo, oveja, raton, cobaya o caballo. Las ovejas son el animal huesped preferido. Se administran inyecciones adicionales (refuerzos) mensualmente (se prepara 1 mg de inmunogeno en PBS y se mezcla a una razon del 50 % de inmunogeno en PBS con el 50 % de adyuvante incompleto de Freund, numero de producto de Sigma -F5506) hasta que se logra el tftulo requerido. Se toman muestras de suero para la evaluacion del tftulo de anticuerpo.

En resumen, se recoge sangre aplicando presion a la vena yugular expuesta e insertando una aguja hipodermica limpia de calibre 14 para extraer 500 ml de sangre por oveja, con gravedad. Se almacena la sangre a 37 °C durante un mmimo de una hora antes de separar los coagulos de los laterales de los frascos de centnfuga usando pipetas desechables de 1 ml (oscilacion). Se almacenan las muestras a 4 °C durante una noche.

Despues se centrifugan las muestras a 4200 rpm durante 30 minutos a 4 °C. Se vierte el suero y se centrifuga de nuevo, a 10.000 rpm durante 15 minutos a 4 °C, antes de tomar aftcuotas y almacenar a <-20 °C.

Se extrae la fraccion de inmunoglobulina (Ig) de los antisueros por medio de precipitacion con acido capnlico/sulfato de amonio de la inmunoglobulina.

Se evalua el tftulo de anticuerpo recubriendo una placa de microtitulacion (Thermo Fisher Scientific NUNC, 468667) con anticuerpo (125 |il/pocillo) en tampon de recubrimiento (Tris 10 mM pH 8,5) a 37 °C durante 2 horas. Entonces se lava la placa cuatro veces a lo largo de 10 minutos con TBST a concentracion de trabajo. Se anaden 50 |il de muestra/patron (1-fenilpiperazina) a los pocillos apropiados por triplicado, seguido por 75 |il de conjugado de hapteno-HRP y se incuba a 25 °C durante una hora. Entonces se lava la placa y se anaden 125 |il de TMB (Randox, 4380-15) a cada pocillo y se deja a temperatura ambiente durante 20 minutos en la oscuridad. Se detiene la reaccion usando 125 |il de acido sulfurico 0,2 M. Se leen las absorbancias a 450 nm con un lector de microplacas de ELISA (BIO-TEK Instruments, Elx800) y se calculan las medias. Entonces puede determinarse la sensibilidad del anticuerpo.

Cuando se ha logrado el tftulo optimo, se extrae sangre del animal huesped para producir un volumen adecuado de antisuero espedfico (globalmente esto da como resultado 20 extracciones de sangre en total, lograndose aproximadamente 200 ml de antisuero por extraccion de sangre). El grado de purificacion de anticuerpo requerido depende de la aplicacion prevista. Para muchos fines, no hay ningun requisito para la purificacion, sin embargo, en otros casos, tales como cuando el anticuerpo va a inmovilizarse sobre un soporte solido, pueden adoptarse etapas de purificacion para retirar material no deseado y eliminar la union no espedfica.

Si se requiere estan disponibles diversas etapas de purificacion, entre ellas la precipitacion de inmunoglobulina (tal como se describio anteriormente), la purificacion por afinidad espedfica de antfgeno, la cromatograffa de exclusion molecular y la cromatograffa de intercambio ionico.

Ejemplos

(Los numeros en negrita se refieren a estructuras en la figura 3)

Ejemplo 1: Conjugacion de 3-(carboxifenil)piperazina (hapteno-A) con BSA (para formar el inmunogeno-I)

A una disolucion de 3-(carboxifenil)piperazina (hapteno-A) (30,9 mg, 0,15 mM) en DMF (1,0 ml) se le anadio N,N- diciclohexilcarbodiimida (DCC) (33,08 mg, 0,16 mM) y N-hidroxisuccinimida (18,7 mg, 0,16 mM) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro la diciclohexilurea formada mediante filtracion y se anadio la disolucion gota a gota a una disolucion de BSA (150 mg, 2,3 |imol) en disolucion de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 ml). Entonces se agito la mezcla durante una noche a 4° C. Despues se dializo la disolucion frente a tampon fosfato 50 mM pH 7,2 (tres cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se seco por congelacion para dar el inmunogeno-I. Los resultados de MALDI mostraron que se habfan conjugado 14,07 moleculas de hapteno-A con una molecula de BSA.

Ejemplo 2: Conjugacion de 3-(carboxifenil)piperazina (hapteno-A) con BTG (para formar el inmunogeno-II)

A una disolucion de 3-(carboxifenil)piperazina (hapteno-A) (41,8 mg, 0,203 mmol) en DMF (1,0 ml) se le anadio N,N- diciclohexilcarbodiimida (DCC) (46,01 mg, 0,223 mmol) y N-hidroxisuccinimida (25,66 mg, 0,223 mmol) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro la diciclohexilurea formada mediante filtracion y se anadio la disolucion gota a gota a una disolucion de BTG (150 mg, 2,25 |imol) en disolucion de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 ml). Entonces se agito la mezcla durante una noche a 4 °C. Despues se dializo la disolucion frente a tampon fosfato 50 mM pH 7,2 (tres cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se seco por congelacion para dar el inmunogeno-II.

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Ejemplo 3: Coniugacion de 3-(carboxifenil)piperazina (hapteno-A) con HRP

Se disolvio clorhidrato de EDC (10 mg) en agua (0,5 ml) y se anadio inmediatamente a una disolucion de 3- (carboxifenil)piperazina (hapteno-A) (2 mg) en DMF (0,2 ml). Tras mezclar, se anadio gota a gota esta disolucion a una disolucion de HRP (20 mg) en agua (1 ml). Se anadio sulfo-NHS (5 mg) y se incubo la mezcla de reaccion en la oscuridad a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro el hapteno en exceso con columnas PD-10 dobles (Pharmacia) en serie, preequilibradas con PBS a pH 7,2. Entonces se dializo el conjugado de hapteno-A-HRP durante una noche frente a 10 l de PBS a pH 7,2 a 4 °C.

Eiemplo 4: Preparacion de 4-BOC-1-(4-hidroxifenil)piperazina 2

A una suspension de 1-(4-hidroxifenil)piperazina 1 (8,91 g, 0,05 mol) en diclorometano (200 ml) se le anadio TEA (10,5 ml, 0,075 mol) y anhfdrido BOC (9,8 g, 0,052 mol) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Entonces se lavo la disolucion con agua (1x100 ml), salmuera (1x100 ml), se seco sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro hasta sequedad. Se purifico el producto en bruto obtenido mediante cromatograffa ultrarrapida sobre gel de sflice usando acetato de etilo / hexano (50/50) para dar la 4-boc-1-(4-hidroxifenil)piperazina 2 (10,1 g, 77 %).

Eiemplo - 5: Preparacion del ester 3

A una suspension de hidruro de sodio (NaH) (1,53 g, 0,046 mol) en DMF (50 ml) bajo nitrogeno se le anadio gota a gota una disolucion de N-boc-4-hidroxibencilpiperazina 3 (8,0 g, 0,038 mol) en DMF (50 ml) y se agito la mezcla y se calento a 60 °C durante una hora. Entonces se enfrio la mezcla hasta temperatura ambiente y a la misma se le anadio gota a gota una disolucion de bromoacetato de terc-butilo (11,1 g, 0,057) en DMF (25 ml) y se agito la mezcla y se calento a 60 °C durante cuatro horas. Despues se enfrio la disolucion hasta TA y se elimino la DMF a vado. Se anadio acetato de etilo (250 ml) al producto en bruto y entonces se lavo con agua (100 ml) y salmuera (100 ml). Entonces se seco la disolucion sobre sulfato de sodio, se filtro y se concentro hasta sequedad. Se purifico el producto en bruto obtenido mediante cromatograffa sobre gel de sflice usando acetato de etilo / hexano (1/1) para dar el ester 3 (9,6 g, 67,1 %) en forma de aceite transparente.

Eiemplo - 6: Preparacion de la sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B)

A una disolucion del ester 3 (3,5 g, 0,009 mol) en diclorometano (100 ml) se le anadio acido trifluoroacetico (TFA) (30 ml) y se agito la disolucion a temperatura ambiente durante una noche. Se concentro la disolucion hasta sequedad y se trituro el producto en bruto obtenido con eter para dar un solido blanco del hapteno-B como sal de TFA (2,3 g, 73 %) en forma de sal de TFA (figura 3).

Eiemplo 7: Coniugacion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) con BSA (para formar el inmunogeno-III)

A una disolucion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) (52,5 mg, 0,15 mM) en DMF (1,0 ml) se le anadio N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (33,08 mg, 0,16 mM) y N-hidroxisuccinimida (18,7 mg, 0,16 mM) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro la diciclohexilurea formada mediante filtracion y se anadio la disolucion gota a gota a una disolucion de BSA (150 mg, 2,3 |imol) en disolucion de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 ml). Entonces se agito la mezcla durante una noche a 4 °C. Despues se dializo la disolucion frente a tampon fosfato 50 mM pH 7,2 (tres cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se seco por congelacion para dar el inmunogeno-III. Los resultados de MALDI mostraron que se habfan coniugado 6,03 moleculas de hapteno-B con una molecula de BSA.

Eiemplo 8: Coniugacion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) con BTG (para formar el inmunogeno-IV)

A una disolucion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) (71,1 mg, 0,203 mmol) en DMF (1,0 ml) se le anadio N,N-diciclohexilcarbodiimida (DCC) (46,01 mg, 0,223 mmol) y N-hidroxisuccinimida (25,66 mg, 0,223 mmol) y se agito la mezcla a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro la diciclohexilurea formada mediante filtracion y se anadio la disolucion gota a gota a una disolucion de BTG (150 mg, 2,25 |imol) en disolucion de bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) (10 ml). Entonces se agito la mezcla durante una noche a 4 °C. Despues se dializo la disolucion frente a tampon fosfato 50 mM pH 7,2 (tres cambios) durante 24 horas a 4 °C, y se seco por congelacion para dar el inmunogeno-IV.

Eiemplo 9: Coniugacion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) con HRP

Se disolvio clorhidrato de EDC (10 mg) en agua (0,5 ml) y se anadio inmediatamente a una disolucion de sal de TFA de 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina (hapteno-B) (2 mg) en DMF (0,2 ml). Tras mezclar, se anadio gota a gota esta disolucion a una disolucion de HRP (20 mg) en agua (1 ml). Se anadio Sulfo-NHS (5 mg) y se incubo la mezcla de reaccion en la oscuridad a temperatura ambiente durante una noche. Se retiro el hapteno en exceso con columnas PD-10 dobles (Pharmacia) en serie, preequilibradas con PBS a pH 7,2. Entonces se dializo el coniugado de hapteno-HRP durante una noche frente a 10 l de PBS a pH 7,2 a 4 °C.

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Ejemplo 10: Inmunoensayos para derivados de piperazina

Se uso un analizador Evidence Investigator semiautomatizado (Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Reino Unido) como plataforma para un ensayo de biochip para la deteccion de fenilpiperazinas. Se administraron inmunogenos a ovejas Suffolk de 16 meses de edad mensualmente para proporcionar antisueros policlonales espedficos. Se preparo la mezcla de inmunizacion anadiendo 2 mg de inmunogeno preparado en PBS a una razon del 50 % de Inmunogeno/PBS con el 50 % de adyuvante completo de Freund (Sigma, numero de producto - F5881) y emulsionando la mezcla para preparar el producto final para la inmunizacion. En el dfa 0, se administro por via intramuscular 1 ml de la mezcla descrita anteriormente a ovejas adultas. Se administraron por via intramuscular refuerzos posteriores (un total de 20 refuerzos) a cada oveja cada 30 dfas. Se uso adyuvante completo de Freund (Sigma, numero de producto - F5881) para las inmunizaciones primarias y adyuvante incompleto de Freund (numero de producto de Sigma - F5506) para todas las inyecciones posteriores. Se tomaron muestras de sangre sistematicas entre los refuerzos para verificar el tftulo de anticuerpo y la sensibilidad, usando hapteno B conjugado con peroxidasa del rabano en un ELISA de competencia, que somete a prueba la reactividad cruzada con 1-(3- clorofenil)piperazina. En el caso del inmunoensayo de combinacion, se administraron los inmunogenos II y IV a ovejas separadas y se combinaron los antisueros resultantes en una razon 1:1 para formar la combinacion de anticuerpos (se combino 1 ml de antisueros de las ovejas a las que se les administro inmunogeno II con 1 ml de antisueros de las ovejas a las que se les administro inmunogeno IV). Se extrajo IgG de los antisueros y se purifico tal como se describio anteriormente, y se inmovilizaron los anticuerpos purificados sobre un biochip (9 mm x 9 mm) (Randox Laboratories Ltd). El ensayo se basaba en la competencia por los sitios de union de un anticuerpo policlonal entre conjugado de hapteno B-HRP (ejemplo 9) y fenilpiperazinas y posibles compuestos con reaccion cruzada. Se inmovilizaron los anticuerpos y se estabilizaron sobre la superficie del biochip tal como se describio anteriormente (Fitzgerald et al., 2005). Se anadieron diluyente de ensayo (155 |il), calibrador/fenilpiperazina o posible compuesto con reaccion cruzada (25 |il) seguido por conjugado de hapteno-B (120 |il) al biochip apropiado. Entonces se incubaron los biochips durante 30 minutos a 30 °C en un agitador termico fijado a 370 rpm. Despues se sometieron los biochips a dos ciclos de lavado rapidos usando el tampon de lavado proporcionado, seguido por cuatro ciclos de lavado de dos minutos. Entonces se anadieron 250 |il de senal (luminol + peroxido 1:1, v/v) a cada biochip, y tras dos minutos se obtuvieron imagenes del portador de biochip en el analizador Evidence Investigator.

Resultados

Se generaron curvas de calibracion usando el inmunoensayo basado en biochip. Se calcularon valores de CI50 a partir de las graficas tomando el 50 % de la senal desde el calibrador cero y leyendo el valor correspondiente en el eje x, equivalente a la concentracion de ligando no marcado que reduce en un 50 % la union espedfica de ligando marcado. Tambien se sometio a prueba la especificidad (medida como el porcentaje de reactividad cruzada - [CI50 (analito)/CI50 (compuesto con reaccion cruzada)]x100) frente a una gama de derivados de piperazina y otros compuestos que comparten caractensticas estructurales (vease la tabla 1).

Tabla 1 Porcentaje de reactividad cruzada para dos anticuerpos de la presente invencion (anticuerpo 1 generado contra el inmunogeno IV y anticuerpo 2 generado contra el

inmunogeno II) normalizado con respecto a monoclorhidrato de 1-(3-clorofenil)piperazina.

: Anticuerpo 1 Anticuerpo 2 Combinacion de anticuerpos 1 y 2

Analito: Reactividad cruzada (%) Cl50 (ng/ml) Reactividad cruzada (%) Cl50 (ng/ml) Reactividad cruzada (%) Cl50 (ng/ml)

1-(3-Clorofenil)piperazina (mCPP): 100 0,907 100 2,554 100 2,075

1-(3-Metilfenil)piperazina (mMPP): 129 0,840 230 1,697 191 1,418

1-fenilpiperazina: 106 1,017 140 2,795 125 2,163

1-(4-Metoxifenil)piperazina (pMeOPP): 68 0,868 20 19,771 26 10,226

1-(4-hidroxifenil)piperazina: 57 1,029 10 28,195 18 15,032

1-(4-Fluorofenil)piperazina: 54 1,085 38 7,646 51 5,113

1-(3-hidroxifenil)piperazina: 31 3,469 156 2,504 95 2,848

1-(3-Trifluorometilfenil)piperazina (mTFMPP): 13 7,620 61 4,831 44 5,958

4-(4-Clorofenil)-4-hidroxipiperidina: <1 218,980 <1 NA <1 NA

1-bencilpiperazina (BZP): <1 232,706 <1 NA <1 NA

1-(2-Metoxifenil)piperazina: <1 335,160 34 8,770 17 15,553

Mefedrona: <1 NA <1 NA <1 NA

Mescalina: <1 NA <1 NA <1 NA

(+)-Pseudoefedrina: <1 NA <1 NA <1 NA

MDPBP: <1 NA <1 NA <1 NA

JWH-018: <1 NA <1 NA <1 NA

JWH-250: <1 NA <1 NA <1 NA

Salvinorina A: <1 NA <1 NA <1 NA

Piperazina: <1 NA <1 NA <1 NA

1 -Metil-3-fenilpiperazina: <1 NA <1 NA <1 NA

Trazadona: <1 NA <1 NA <1 NA

MCPCP: <1 NA <1 NA <1 NA

3-Amino-2-hidroxibenzotrifluoruro: <1 NA <1 NA <1 NA

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REIVINDICACIONES

1. Inmunogeno que comprende un hapteno de estructura general:

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en la que uno de X e Y es H y el otro es -(A)m-(B)n-D; en el que A se une al anillo aromatico; en el que A se selecciona de -C(O)-, O y NH; en el que m = 0 o 1; en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C10 o resto arileno; en el que n = 0 o 1; y en el que D se selecciona de un resto carboxilo, un resto ditiopiridilo, un resto maleimidilo, un resto hidroxilo, un resto tiol y un resto aldetudo; estando acoplado dicho hapteno a un material portador que confiere antigenicidad seleccionado de un polipeptido sintetico, un polipeptido semisintetico, un fragmento de protema o una protema.
2. Inmunogeno segun la reivindicacion 1, en el que el material portador que confiere antigenicidad se selecciona de albumina serica bovina, tiroglobulina bovina, hemocianina de lapa californiana, ovoalbumina de huevo y gammaglobulina bovina.
3. Inmunogeno segun la reivindicacion 1, en el que B es un resto alquileno de cadena lineal o ramificada sustituido o no sustituido C1-C6 o resto arileno.
4. Inmunogeno segun la reivindicacion 2, en el que D de -(A)m-B-D se acopla al material portador que confiere antigenicidad.
5. Inmunogeno segun la reivindicacion 4, que es o bien 1-(3-carboxifenil)piperazina o bien 1-(4- carboximetileterfenil)piperazina acoplada al material portador que confiere antigenicidad.
6. Anticuerpo generado contra el inmunogeno segun la reivindicacion 5.
7. Anticuerpo segun la reivindicacion 6, generado contra el inmunogeno 1-(3-carboxifenil)piperazina segun la reivindicacion 5 que tiene especificidad para 1-(3-metilfenil)piperazina con un valor de CI50 de alrededor de 1 ng/ml, que se caracteriza adicionalmente por tener reactividad cruzada con 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-fenilpiperazina, 1- (4-metoxifenil)piperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina, 1-(3-hidroxifenil)piperazina, 1-(3- trifluorometilfenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina.
8. Anticuerpo segun la reivindicacion 6, generado contra el inmunogeno 1-(4-carboximetileterfenil)piperazina segun la reivindicacion 5 que tiene especificidad para 1-(3-metilfenil)piperazina con un valor de CI50 de alrededor de 1 ng/ml, que se caracteriza adicionalmente por tener reactividad cruzada con 1-(3-clorofenil)piperazina, 1- fenilpiperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(4-fluorofenilpiperazina, 1-(3- hidroxifenil)piperazina y 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina.
9. Metodo de deteccion y/o determinacion de uno o mas derivados de piperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con uno o mas anticuerpos segun la reivindicacion 6, y al menos un agente de deteccion; detectar o determinar el/los agente(s) de deteccion y deducir a partir de una curva de calibracion la presencia de y/o la cantidad de, el uno o mas derivados de piperazina en la muestra.
10. Metodo segun la reivindicacion 9 para detectar y/o determinar uno o mas derivados de piperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con el anticuerpo segun la reivindicacion 7 y el anticuerpo segun la reivindicacion 8, y al menos un agente de deteccion; detectar o determinar el/los agente(s) de deteccion y deducir a partir de una curva de calibracion la presencia de y/o la cantidad de, el uno o mas derivados de piperazina en la muestra.
11. Metodo segun la reivindicacion 9 para detectar o determinar una o mas de 1-fenilpiperazina, 1-(4- hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3-metilfenil)piperazina, 1-(3- trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina en una muestra in vitro, comprendiendo el metodo poner en contacto la muestra con al menos un anticuerpo seleccionado del anticuerpo segun la reivindicacion 7, y el anticuerpo segun la reivindicacion 8 y al menos un agente de deteccion, detectar o determinar el/los agente(s) de deteccion y deducir a partir de una curva de calibracion la presencia de o la cantidad de una o mas de 1-fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3-metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1- (4-fluorofenil)piperazina y 1-(2-metoxifenil)piperazina.
12. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que la muestra se selecciona de sangre completa, plasma, suero y orina.
13. Kit para detectar o determinar uno o mas derivados de piperazina en una muestra que comprende uno o mas anticuerpos seleccionados del anticuerpo segun la reivindicacion 7, y el anticuerpo segun la reivindicacion 8; y al

5 menos un agente de deteccion.
14. Kit segun la reivindicacion 13, en el que el uno o mas derivados de piperazina detectados o determinados son 1-fenilpiperazina, 1-(4-hidroxifenil)piperazina, 1-(3-clorofenil)piperazina, 1-(4-metoxifenil)piperazina, 1-(3- metilfenil)piperazina, 1-(3-trifluorometilfenil)piperazina, 1-(4-clorofenil)piperazina, 1-(4-fluorofenil)piperazina y 1-(2- metoxifenil)piperazina.

10 15. Kit segun la reivindicacion 14, que comprende el anticuerpo segun la reivindicacion 7 y el anticuerpo segun la

reivindicacion 8.