2Polimorfismos para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral.CAMPO DE LA INVENCIÓNLa presente invención se encuentra dentro del campo de la biomedicina y la biotecnología, y se refiere a un método de obtención de datos útiles para predecir o pronosticar la respuesta 5al tratamiento con interferón pegilado más ribavirinaen pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301, estudiando la variabilidad genética del epítopo inmunodominante NS3 del virus de lahepatitis C (VHC).ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN10El virus de la hepatitis C (VHC) es una de las causas más frecuentes de hepatitis viral crónica, cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular, siendo la indicación más común para el trasplante hepático (Lauer et al., 2001. N. Engl. J. Med.345 (1), 41-52).Actualmente, la terapia más común consiste en una combinación de interferón pegilado alfa (IFN-peg) y ribavirina (RBV), que logra una tasa de respuesta del 48-88% (Poynard et al., 152003. Lancet 362, 2095-2100).Se cree que tanto el huésped como el virus, incluyendo regiones genómicas virales, son de importancia a la hora de generar una respuesta eficaz al tratamiento antiviral (Feld et al., 2005. Nature436: 967-972). De esta forma, la respuesta al tratamiento depende del genotipo del virus, ya que algunas variedades del virus son resistentes al tratamiento 20(Hnatyszyn, 2005. Antivir. Ther.10, 1-11) y además, los pacientes infectados con un mismo genotipo, tienen respuesta al tratamiento variable, lo que indica que otros factores como la IL28B o los antígenos leucocitarios humanos (HLA) podrían influenciar en la respuesta a la terapia antiviral (Ali et al., 2010. Journal of General Virology91, 1931-1938).Determinados trabajos muestran que la respuesta celularinmune al VHC implica a las 25células T CD4+(Nascimbeni et al., 2003.J. Virol.77, 1107-1124). Se ha comprobado que los individuos presentan un aclaramiento viral gracias a la estimulación del sistema inmune debido a la respuesta que desencadenan proteínas no estructurales del virus (NS3, NS4 y NS5). Concretamente, NS3 provoca una respuesta mayor (Lloyd et al., 2007 Immunol. Cell Bio.85, 24-32; Fanning et al., 2001. Hum. Immunol.65, 745-751). Además, los pacientes 30con el VHC genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301 tienen una mayor
3proliferación de células CD4+, desencadenado por la unión del alelo DQB1*0301 a su epítopo inmunomodulador altamente conservado, situado en la región NS3 del VHC (Lamonaca et al., 1999. Hepatology30(4),1088-1098; Diepolder et al., 1997. J Virol.71, 6011-6019).Aún así, todos los pacientes que presentan el alelo HLA-DQB1*0301 no tienen una RVS al 5tratamiento viral combinado. Por tanto, se podría deber a modificaciones (mutaciones) en el epítopo inmunodominante de la región NS3 del virus que hacen que el reconocimiento con el HLA no se produzca de manera óptima.Se conoce que los epítopos inmunodominantes son potenciales candidatos para el estudio de las relaciones virus-huésped y el diseño de agentes terapéuticos basados en la 10estimulación de los linfocitos T CD4+y CD8+(Langet al., 2008. Vaccine26, 6225-6231; Gerlachet al.,2005. J. Virol.79, 12425-12433).El 23% de los pacientes de nuestra población con Hepatitis Crónica C presentan el alelo HLA-DQB1*0301 (Muñoz de Rueda et al., 2011. Am. J. Gastroenterol. 106(7), 1246-54). Por tanto, se podría plantear un estudio del papel que juega la variabilidad genética del epítopo 15inmunodominante del VHC en la resistencia al tratamiento antiviral combinado en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA de clase II DQB1*0301, que permita predecir o pronosticar la respuesta.Este estudio solo beneficiaría a un determinado porcentaje de la población, pero además que supondría un ahorro en el gasto sanitario, sería una contribución más al campo de los 20tratamientos personalizados para distintas poblaciones de pacientes infectados por el VHC que son difíciles de tratar.BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓNLos autores de la presente invención han localizado una serie de mutaciones que son útiles 25para determinar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en individuos con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301.Por tanto, un primer aspectode la invención se refiere al uso de las mutaciones L5P, L7P y/o L15S del epítopo inmunodominante de la región NS3para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con 30hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301.
4En una realización preferida, el uso de las mutaciones L5P, L7P y L15S es simultáneo.Un segundo aspectode la invención se refiere a un método, de ahora en adelante primer método de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301 que comprende:5i) obtener una muestra biológica aislada de un individuoii) detectar la presencia de la mutación: L5P en el epítopo inmunodominante de la región NS3del virus de la hepatitis C.iii) asignar al individuo al grupo de pacientes no respondedores con no respuesta viral sostenida (no-RVS) si se detectan los polimorfismos descritos en ii) comparándolos con una 10muestra control.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) además comprende la detección de la mutación L7PEn una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) además comprende la detección de L15S15En una realización preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) comprende la detección de las mutaciones L5P, L7P Y L15S de manera simultánea.En otra realización preferida, la muestra biológica es una muestra de suero sanguíneo.En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de las mutaciones se realiza por técnicas de PCR o técnicas inmunológicas20En otra realización preferida, la detección de las mutaciones aminoacídicas se realiza mediante secuenciación directa.En otra realización aún más preferida, la detección de las mutaciones se realiza por pirosecuenciación.Un tercer aspectode la invención se refiere a el uso de una composición farmacéutica que 25comprende interferón pegilado,ribavirina, y un inhibidor de proteasa del virus de la hepatitis C, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo del grupo de pacientes no respondedores clasificados por el método de la invención.
5En una realización preferida deeste aspecto de la invención, el inhibidor de la proteasa del virus de la hepatitis C se selecciona de la lista que comprende BocepreviryTelaprevir.Uncuarto aspectode la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo además 5comprende las secuencias nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3y/o SEQ ID NO:4, o cualquier combinación de las mismas.Un quinto aspectode la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microarray además 10comprende las secuencias nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:4, o cualquier combinación de las mismas.Un sexto aspectode la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, de la micromatriz, o el microarray de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que 15presentan el alelo HLA-DQB1*0301.Un séptimo aspectode la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento 20legible comprende al menos una secuencia comprendidaen las sondas de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendido cualquiera de las sondas de la invención.25Un octavo aspectode la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.30
6DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURASFigura 1. Haplotipos asociados a la No-RVS.La técnica de pirosecuenciación ha revelado la existencia de tres haplotipos que sólo están presentes en los pacientes con no-RVS (no-RVS= 4/16; RVS: 0/21; p=0.02), identificados como haplotipo 7, 11 y 15, los cuales muestran un cambio de aminoácido en la posición 5 (aa5, L5P), 7 (aa7, L7P) y 15 (aa15, L15S) 5respectivamente. Figura 2. Porcentaje de lecturas de haplotipos por cada muestra. Haplotipos con un % de lectura inferior al 2% no aparecen en la figura. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN10Los autores de la presente invención han analizado las mutaciones del epítopo inmunodominante del VHC en individuos con alelo HLA-DQB1*0301 y han generado un método de predicción o pronóstico de no-RVS de los pacientes con tratamiento antiviral de interferón pegilado más ribavirina).La presente invención se refiere a un método y a un kit o dispositivo para su uso en la 15predicción o pronóstico de la no-RVS en pacientes con VHC.Portanto, un primer aspectode la invención se refiere al uso de las mutaciones L5P, L7P y/o L15S del epítopo inmunodominante de la región NS3, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301.20En una realización preferida, el uso de las mutaciones L5P, L7P y L15S es simultáneo.Un segundo aspectode la invención se refiere a un método, de ahora en adelante primer métodode la invención, para predecir o pronosticar la respuesta al tratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301 que comprende:25i) obtener una muestra biológica aislada de un individuoii) detectar la presencia de la mutación: L5P en el epítopo inmunodominante de la región NS3del virus de la hepatitis C.
7iii) asignar al individuo al grupo de pacientes no respondedores con no respuesta viral sostenida (no-RVS) si se detectan los polimorfismos descritos en ii) comparándolos con una muestra control.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) además comprende la detección de la mutación L7P5En una realización aún más preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) además comprende la detección de L15SEn una realización preferida de este aspecto de la invención, el paso ii) comprende la detección de las mutaciones L5P, L7P Y L15S de manera simultánea.En el caso de la invención, elepítopoinmunodominante corresponde a la región NS3, 10concretamente a la región que comprende del aa 1253 al 1272, del VHC.En otra realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica es una muestra de suero sanguíneo.En una realización preferida de este aspecto de la invención, la detección de las mutaciones se realiza por técnicas de PCR o técnicas inmunológicas.15En otra realización preferida, la detección de las mutaciones aminoacídicas se realiza mediante secuenciación directa.En otra realización aún más preferida, la detección de las mutaciones se realiza por pirosecuenciación.Los pasos (ii) y/o (iii) del método descrito anteriormente pueden ser total o parcialmente 20automatizados, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la presencia en el paso (ii) o la clasificación computerizada en el paso (iii).Una “muestra biológica aislada” incluye, pero sin limitarnos a, células, tejidos y/o fluidos biológicos de un organismo, obtenidos mediante cualquiermétodo conocido por un experto en la materia. Preferiblemente, la muestra biológica aislada de un individuo del paso (i) es 25suero sanguíneo.El término “individuo”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos,y más preferiblemente, humanos. El término “individuo” en esta memoria, es sinónimo de “paciente”, y no pretende ser limitativo en ningún aspecto, pudiendo ser éste de cualquier edad, sexo y condición física.30
8El término “comparación”, tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación del resultado de la amplificación de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una amplificación de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La 5comparación descrita en el apartado (iii) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.El término “PCR” corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa mediante la cual se pueden obtener millones de copias de las regiones de ADN deseadas. Se caracteriza por el empleo de parejas de cebadores que acotan la región de la que se 10realizarán millones de copias, lo que también se conoce como "amplificar ADN" durante la PCR. La PCR está compuesta por un número determinado de ciclos, compuestos a su vez por tres fases en las que las hebras de ADN se separan, se unen los cebadores y se elongan las nuevas hebras de ADN. En cada ciclo, si la eficiencia de la reacción es del 100% se produce un crecimiento exponencial de los fragmentos de ADN objeto de la 15amplificación.En el caso de la invención, el término “pirosecuenciación” es una tecnología de secuenciación masiva, aplicable a genomas completos mediante luminiscencia. Se caracteriza por utilizar una placa multipocillo que permite trasmitir la luz producida por quimioluminiscencia durante la reacción de secuenciación hasta una cámara de captación 20de imágenes. Normalmente, se utiliza para secuenciar de 500-1000 nucleótidos por pocillo. Cada fragmento se amplifica hasta 10 millones de veces y se detecta la señal. No es necesario el empleo de geles ni marcadores fluorescentes o ddNTPs.Por “HLA o antígenos leucocitarios humanos” en esta memoria, se entiende los antígenosformados por moléculasque se encuentran en la superficie de casi todas las célulasde los 25tejidosde un individuo, y incluyendo los leucocitos de la sangre. Este conjunto de moléculas están implicadas en el reconocimiento inmunológico y en la señalización entre células del sistema inmunitario. Concretamente, el grupo “HLA-DQ” constituye un grupo de unos 50 antígenos que pueden encontrarse en el lugar HLA-DQ.Por “virus” en esta memoria, se entienden todos los agentes infecciosos microscópicos 30acelulares que solo pueden multiplicarse dentro de las células de otros organismos.El VHC pertenece al género Hepacivirus, que se engloba dentro del Dominio Acytota, Grupo IV: Virus ARN monocatenario positivo, Familia Flaviviridae.
9La familia Flaviviridae es una familia de virus propagados principalmente por vectores artrópodos. Incluye los géneros Flavivirus, Hepacivirusy Pestivirus. Estos virus contienen un genoma de ARN monocatenario positivo, su genoma es lineal, no segmentado y con una longitud de 9,6 a 12,3 kb. Las partículas virales presentan envoltura y son esféricas, de alrededor de 40-60 nm de diámetro. Las principales enfermedades que causan los virus de 5esta familia son: Dengue, encefalitis japonesa, enfermedad de Kyasanur, encefalitis del Valle de Murray, encefalitis de San Luis, meningoencefalitis de garrapata, encefalitis del Nilo, fiebre amarilla y hepatitis C.Concretamente, la proteína NS3 del VHC, también llamada p70, es una proteína no estructural del virus, que tiene un peso molecular de 70 kDa. Posee tres actividades 10enzimáticas: actividad serino proteasa, localizada en un tercio de NS3, hacia el extremo N-terminal y posee un potencial catalítico trivalente, similar a la tripsina. La actividad helicasa-nucleósido trifosfatasa fue identificada en la mitad del extremo C-terminal de la proteína NS3, y está involucrada en la replicación y posiblemente en la traducción del genoma viral (Jin y Peterson, 1995. Archives of Biochemistry and Biophysics323, 47-53).15La terapia antiviral va dirigida básicamente a lograr unos objetivos virológicos, bioquímicos e histológicos. La evaluación de la respuesta al tratamiento, se basa en el efecto del mismo sobre el estado virológico, no sólo al terminar el tratamiento sino, lo que es más importante, en su seguimiento después de finalizado el mismo. Tal y como se entiende en esta memoria, se denomina “respuesta virológica sostenida” o “respuesta viral sostenida” (RVS) la 20negativización de la viremia (ARN viral negativo mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa –PCR–) que se mantiene al menos 24 semanas después de finalizado el tratamiento; o dicho de otra manera, la ausencia en el suero del ARN-VHC a los 6 meses de finalizado el tratamiento.La negativización de la viremia al final del tratamiento, con reaparición del ARN una vez 25terminado el mismo, define la “respuesta virológica con recaída”. La ausencia de negativización de la viremia al final del tratamiento define la “no respuesta virológica” al tratamiento.El “interferón alfa” (IFN-α) es una citocina inmunomoduladora que posee actividad antiviral, propiedades antiangiogénicas y antiproliferativas. El IFN-Peg se obtiene mediante la unión 30fisicoquímica de polietilenglicol (PEG) al interferón alfa (peginterferón α-2a y α-2b) recombinante, lo que aumentan su permanencia en la sangre requiriendo menor frecuencia de inyecciones.
10Actualmente existen dos tipos de interferones pegilados comerciales cuya aplicación se ha extendido: peginterferón alfa–2a (Pegasys®, Roche) y peginterferón alfa–2b (Pegintron®, Schering–Plough). Estos dos productos son semejantes con respecto a su eficacia y seguridad pero sus regímenes de dosificación difieren levemente.La ribavirina (1-β-D-ribofuranosil-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamida)es un nucleótido sintético 5análogo de la guanidina, con propiedades antivirales y actividad inmunorreguladora. Fue una de las primeras drogas que demostró su eficacia para reducir la capacidad de reproducción de virus. Está descrita en el Índice Merck, compuesto N º 8199, undécima edición. Su fabricación y formulación se describen en la patente de EE.UU. n. No. 4.211.771.La rápida captación eritrocitaria de la ribavirina y su fosforilación son responsables de la 10importante anemia hemolítica dependiente dela dosis. Con el fin de evitar este efecto indeseado, el diseño de los nuevos fármacos contempla que no sean captados o fosforilados por los eritrocitos o que sean captados rápidamente y fosforilados en el hígado. Ambos enfoques tienen la desventaja potencial de que pueden anular pasos fundamentales que contribuyen con la eficacia terapéutica de la ribavirina.15Otros derivados, profármacos o análogos de la ribavirina son la viramidina y la levovirina.La viramidina es un profármaco de la RBV, en el hígado se convierte en RBV por acción de la adenosindeaminasa hepática. La RBV y viramidina son rápidamente eliminadas, sus moléculas y los metabolitos son excretados por el riñón y tienen una Tmax de 1,5-3 h. Experimentalmente, la retención hepática de la RBV derivada de una dosis oral de 20viramidina es 3 veces mayor que la RBV oral. En cambio, la concentración de fosfatos de RBV en los hematíes es mucho menor, de ahí que se pueda mantener una concentración más estable de hemoglobina. Es un fármaco seguro y se tolera bien. Los efectos adversos con dosis de 200, 600 y 1.200 mg fueron: 0, 26 y 50%, respectivamente; la mayoría leves y desaparecieron sin secuelas.25La levovirina es la L-enantiomero de la RBV y no origina anemia hemolítica. Tiene una actividad inmunomoduladora similar a la RBV, pero no tiene actividad antiviral directa.Otros posibles análogos se describen, por ejemplo, pero sin limitarnos, en la patente WO 2010/135520.La ribavirina por sí sola no es eficaz contra el VHC, pero cuando se la combina con 30interferón, los índices de erradicación viral son mucho mejores comparados con aquellos logrados solamente con interferón.
11En una realización preferida de la invención, el inhibidor de la proteasa del virus de la hepatitis C es boceprevir. En otra realización preferida de la invención, el inhibidor de la proteasa del virus es telaprevir.El genotipo tiene importancia clínica ya que determina la respuesta potencial de la terapia actual y la duración que va a requerir la misma. Los genotipos 1 y 4 responden menos a 5dicho tratamiento que los otros (genotipos 2, 3, 5 y 6). La duración de la terapia estándar basada en el interferón para los genotipos 1 y 4 es de 48-72 semanas, mientras que para los genotipos 2 y 3 es solo de 12-24 semanas. En resumen, algunos genotipos del VHC, tales como los tipos 2 y 3, son más fáciles de erradicar que el tipo 1.Se denomina “carga viral plasmática del VHC”, a la cantidad de ARN del VHC en la sangre 10(suero). Su presencia es indicativa de una infección activa con reproducción viralen curso. La carga viral suele expresarse en unidades logarítmicas [log10 IU/ml].Para el pronóstico se considera que a mayor carga viral basal, menor probabilidad de una respuesta sostenida. La respuesta al tratamiento antiviral se evalúa con una carga viral basal (pre-tratamiento) y al menos una carga viral al término de éste y a las 24 semanas 15post tratamiento. Se considera una respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al término del tratamiento y una carga viral indetectable y/o ARN cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta viral sostenida). Igualmente se ha determinado que una caída de la carga viral temprana (respuesta viral precoz), con descenso de 2 log10 UI/ml o más a las 12 semanas intra-tratamiento, permite evaluar anticipadamente la 20probabilidad de obtener una respuesta virológica sostenida al término de la terapia.En la presente invención "pronóstico" se entiende como la evolución esperada de una enfermedad y se refiere a la valoración de la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad así como a la valoración de su inicio, estado de desarrollo, evolución, o de su regresión, y/o el pronóstico del curso de la enfermedad en el futuro. Como entenderán los 25expertos en la materia, tal valoración, aunque se prefiere que sea, normalmente puede no ser correcta para el 100% de los sujetos que se va a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que una parte estadísticamente significativa de los sujetos se pueda identificar como que padecen la enfermedad o que tienen predisposición a la misma. Si una parte es estadísticamente significativa se puede determinar sin más por el experto en la materia 30usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de valores p, prueba tde Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son al menos el 50%,
12al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.Por "predicción de la respuesta" se entiende, en el contexto de la presente invención, la determinación de la probabilidad de que el paciente responda de forma favorable o desfavorable a una terapia o a un tratamiento determinado. Especialmente, el término 5"predicción", como se usa aquí, se refiere a una evaluación individual de cualquier parámetro que pueda ser útil en determinar la evolución de un paciente. Como entenderán los expertos en la materia, la predicción de la respuesta clínica al tratamiento, aunque se prefiere que sea, no necesita ser correcta para el 100% de los sujetos a ser diagnosticados o evaluados. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte 10estadísticamente significativade los sujetos como que tienen una probabilidad aumentada de tener una respuesta positiva. El experto en la materia puede determinar fácilmente si un sujeto es estadísticamente significativo usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación de los valores de p, prueba t de Student, prueba de Mann Whitney, etc. Los 15intervalos de confianza preferidos son al menos del 50%>, al menos del 60%>, al menos del 70%>, al menos del 80%>, al menos del 90%), al menos del 95%>. Los valores de pson, preferiblemente, 0,2, 0,1 ó 0,05. La predicción de la respuesta clínica se puede hacer utilizando cualquier criterio de valoración usado y conocido por el experto en la materia.A su vez, atendiendo al método de la presente invención, se podrían establecer otras 20subclasificaciones dentro de esta principal, facilitando, por tanto, la elección y el establecimiento de regímenes terapéuticos o tratamiento adecuados. Esta discriminación tal y como es entendida por un experto en la materia no pretende ser correcta en un 100% de las muestras analizadas. Sin embargo, requiere que una cantidad estadísticamente significativa de las muestras analizadas sean clasificadas correctamente. La cantidad que es 25estadísticamente significativa puede ser establecida por un experto en la materia mediante el uso de diferentes herramientas estadísticas, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante la determinación de intervalos de confianza, determinación del valor significación P, test de Student o funciones discriminantes de Fisher, medidas no paramétricas de Mann Whitney, correlación de Spearman, regresión logística, regresión lineal, área bajo la curva de ROC 30(AUC). Preferiblemente, los intervalos de confianza son almenos del 90%, al menos del 95%, al menos del 97%, al menos del 98% o al menos del 99%. Preferiblemente, el valor de p es menor de 0,1, de 0,05, de 0,01, de 0,005 o de 0,0001. Preferiblemente, la presente invención permite detectar correctamente la enfermedad de forma diferencial en al menos el 60%, más preferiblemente en al menos el 70%, mucho más preferiblemente en al menos el 35
1380%, o aún mucho más preferiblemente en al menos el 90% de los sujetos de un determinado grupo o población analizada.En una realización preferida las secuencias nucleotídicaso sondasusadas para la detección de las mutacionesson:a)SEQ ID NO: 1: CAA GTG GCA CAT CTA CAC GCG CCC ACA GG5b)SEQ IDNO: 2: TGG CAC TCA TCA CAT ATT ATG ATG TCA TAG GCc)SEQ ID NO: 3: GGG AAG AGT ACT AAG GTG CCG GCT GCG TAT GCd)SEQ ID NO: 4: CAA CCA CCG TCA GCT AGG AAC TTG CCG TAT GTEn una realización preferida se realiza una PCR anidada, donde las sondas (externas) de la primera PCR corresponden a las SEQ ID NO:1 (sentido) y SEQ ID NO:2 (antisentido), y las 10sondas (internas) de la segunda PCR corresponden a las SEQ ID NO:3(sentido) y SEQ ID NO:4(antisentido).En el contexto de la presente invención, la “PCR anidada” es una variante de la PCR convencional que comprendedos rondas de amplificación con distintos pares de cebadores en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad y la especificidad de la detección. 15Primero se realiza una reacción con los cebadores externos para amplificar una región de ADN más extensa, que contiene el segmento diana. Después, este producto de amplificación se utiliza como molde de una segunda PCR con los cebadores internos para amplificar la región específica.En el contexto de la presente invención, el término “sonda” se define como un 20oligonucleótido que es complementario o sustancialmente complementario a la secuencia del amplicón, dentro de los límites de los cebadores. En la presente forma de realización preferida, la sonda de captura no se encuentra provista de la adición de una cola, pero podría añadirse una cola, con desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos. La sonda se puede producir preferiblemente sintéticamente o como un subconjunto de ADN obtenido 25naturalmente, preparados por metodologías estándar (por ejemplo, pero sin limitarnos, mediante digestión por endonucleasas de restricción o síntesis directa).Por lo tanto, no existe, excepto para la función pretendida, ninguna diferencia fundamental entre un "oligonucleótido" o una "sonda" según la invención.
14Así, las sondas pueden ser de entre 10 y 200 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 12 y 50 nucleótidos, y aún más preferiblemente del número de nucleótidos de las sondas de la invención. Un tercer aspectode la invención se refiere a el uso de una composición farmacéutica que comprende interferón pegilado, ribavirina, y un inhibidor de proteasa del virus de la hepatitis 5C, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un individuo del grupo de pacientes no respondedores clasificados por el método de la invención.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el inhibidor de la proteasa del virus de la hepatitis C se selecciona de la lista que comprende Boceprevir y Telaprevir.Uncuarto aspectode la invención se refiere a un kit o dispositivo que comprende la 10secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivoademás comprende las secuencias nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:4, o cualquier combinación de las mismas.En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el kit o dispositivo además 15comprende los elementos necesarios para detectar el alelo HLA-DQB1*0301.El kit de la invención puede incluir controles positivos y/o negativos. El kit además puede contener, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc.Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta 20en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención.Es también posible que el (los) oligonucleótido(s) o sondas estén inmovilizados en manchas sobre una superficie (preferiblemente sólida).En una de sus realizaciones, el kit comprende una micromatriz, o micromatriz de la invención. Una micromatriz de ARN es una matriz 25sobre un sustrato sólido (normalmente un porta de vidrio o una celda de una película fina de silicio) que evalúa grandes cantidades de diferentes ARN que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre manchas sobre un sustrato sólido. Cada mancha contiene una secuencia específica de ácido nucleico, que normalmente corresponde a una secuencia concreta de ADN. Aunque el número de manchas no está limitado de manera 30
15alguna, existe una realización preferida en la que la micromatriz se personaliza para los procedimientos de la invención.Un quinto aspectode la invención se refiere a un microarray, de ahora en adelante microarray de la invención, que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 1.En una realización preferida de este aspecto de la invención, el microarray además 5comprende las secuencias nucleotídica SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:3 y/o SEQ ID NO:4, o cualquier combinación de las mismas.En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el microarrayademás comprende loselementos necesarios conocidos para detectar el alelo HLA-DQB1*0301.Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidos son construidas en la superficie de un 10chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía. Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.15Así, las sondas pueden ser de entre 10 y 200 nucleótidos, más preferiblemente, de entre 12 y 50 nucleótidos, y aún más preferiblemente del número de nucleótidos de las sondas de la invención. La síntesis in situ sobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían 20ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehídos o epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.Un sexto aspectode la invención se refiere al uso del kit o dispositivo, de la micromatriz, o 25el microarray de la invención, para predecir o pronosticar la respuesta altratamiento antiviral con interferón pegilado más ribavirina en pacientes con hepatitis crónica C genotipo 1 que presentan el alelo HLA-DQB1*0301.Un séptimoaspectode la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un 30ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.
16En una realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible comprende al menos una secuencia comprendida en las sondas de secuencia SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4.En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el medio de almacenamiento legible además comprende los elementos necesarios para detectar el alelo HLA-5DQB1*0301.En otra realización preferida de este aspecto de la invención que comprende oligonucleótidos o microarreglos de canal único diseñados a partir de al menos una secuencia conocida o un ARNm comprendido cualquiera de las sondas de la invención.Un octavo aspectode la invención se refiere a una señal transmisible que comprende 10instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método de la invención.Así, por ejemplo, las secuencias de oligonucleótidospueden ser construidas en la superficie un chip mediante el elongamiento secuencial de una cadena en crecimiento con un sólo nucleótido utilizando fotolitografía.Así, los oligonucleótidos son anclados por el extremo 3' 15mediante un método de activación selectiva de nucleótidos, protegidos por un reactivo fotolábil, mediante la incidencia selectiva de luz a través de una fotomáscara. La fotomáscara puede ser física o virtual.La síntesis in situsobre un soporte sólido (por ejemplo, vidrio), podría hacerse mediante tecnología chorro de tinta (ink-jet), lo que requiere sondas más largas. Los soportes podrían 20ser, pero sin limitarse, filtros o membranas de NC o nylon (cargadas), silicio, o Portas de vidrio para microscopios cubiertos con aminosilanos, polilisina, aldehídoso epoxy. La sonda es cada una de las muestras del chip. El target es la muestra a analizar: RNA mensajero, RNA total, un fragmento de PCR, etc.Una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender las cinco bases que 25aparecen biológicamente (adenina, guanina, timina, citosina y uracilo) y/o bases distintas de las cinco que aparecen biológicamente. Estas bases pueden servir para distintos propósitos, por ejemplo, para estabilizar o desestabilizar la hibridación; para estimular o inhibir la degradación de la sonda; o como puntos de unión para restos detectables o restos de apantallamiento. Por ejemplo, un polinucleótido de la invención puede contener uno o más 30restos de base modificados, no estándar, derivatizados, incluyendo, pero sin limitarse a, N6-metil-adenina, N6-terc-butil-bencil-adenina, imidazol, imidazoles sustituidos, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-
17(carboxihidroximetil) uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo,beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina,1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-5metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético, wybutoxosina, pesudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo (es decir, timina), éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, 2,6-diaminopurina, y 5-propinil pirimidina. Otros ejemplos de restos de bases modificados, no estándar, o 10derivatizados pueden encontrarse en las Patentes de EEUU Nos. 6.001.611; 5.955.589; 5.844.106; 5.789.562; 5.750.343; 5.728.525; y 5.679.785. Además, una secuencia de ácido nucleico o polinucleótido puede comprender uno o más restos de azúcares modificados incluyendo, pero sin limitarse a, arabinosa, 2-fluoroarabinosa, xilulosa, y una hexosa.Los términos “polinucleótido” y “ácido nucleico” se usan aquí de manera intercambiable, 15refiriéndose a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos (ARN ó RNA) como desoxirribonucleótidos (ADN ó DNA). Los términos “secuencia aminoacídica”, “péptido”, “oligopéptido”, “polipéptido” y “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden ser codificantes o no codificantes, química o bioquímicamente modificados.20A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluirotras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que 25sean limitativos de la presente invención.EJEMPLOS DE LA INVENCIÓNMaterial y métodosSe ha pirosecuenciado el epítopo inmunodominante NS3 (aa 1253-1272) del VHC(Figura 301),mediante el ultrasecuenciador FLX 454 (Roche S.L.), de 37 pacientes: 21 con Respuesta Virológica Sostenida (RVS), 6 Recidivantes (RC) y 10 No respondedores (NR). Los pacientes RC y NR se han considerado no-RVS. Se ha realizado un estudio de: 1) Número
18de quasiespecies (haplotipos) por muestra; 2) Número de mutaciones por quasiespecies (haplotipos);y 3) Número de sitios polimórficos.ResultadosSe ha realizado una media de lectura de 18.197,7 secuencias (min-max: 4.815-42.788), con una media de longitud de lectura de 185,54 (min-max: 22-553). Aplicando los controles de 5calidad, finalmente nos encontramos con 34 quasiespecies diferentes. En la tabla 1 y 2 aparecen el número de quasiespecies (Haplotipos), mutaciones por quasiespecies y de sitios polimórficos por grupo. A pesar de que los pacientes con RVS presentan una media de menos quasiespecies que los no-RVS, no encontramos diferencias significativas. En la figura 1 se representa el número de haplotipos (quasiespecies) por muestra, y en la tabla 3 10de manerapormenorizada (resultados de la pirosecuenciación).Sin embargo observamos que los pacientes con RVS tienen menor número de mutaciones por quasiespecies, y menor número de sitios polimórficos que los No-RVS (P=0,01 y P=0,02, respectivamente). En la tabla 4 se expone el porcentaje de mutaciones respecto a la secuencia de referencia por muestra secuenciada (resultados de la pirosecuenciación).Estudiando las posiciones del 15epítopo inmunodominante más susceptibles de encontrarse mutadas y su posible relación con la respuesta, observamos dos posiciones que únicamente se encuentran mutadas en los pacientes con No-RVS, aa 5 (L/P) (Haplotipo 7; Figura 1) y aa 7 (L/P) (Haplotipo 11; Figura 1) (No-RVS= 4/16; RVS: 0/21; en ambos casos), encontrando diferencias estadísticamente significativas en ambos casos (p=0,02). Por otro lado, el aa 15 (L/S*) 20(Haplotipo 15; Figura 1) se encuentra mutado en 2/21 con RVS, y en 7/16 no-RVS, (P=0,02). En este último aa 15, 4/16 con no-RVS son L/S, mientras que este cambio no aparece en los pacientes RVS (0/21).Tabla 1. Estudio mediante pirosecuenciación del epítopoinmunodominante de VHC-NS3 (aa 1253-1272) frente al alelo HLA-DQB1*0301, en pacientes con Hepatitis Crónica C 25genotipo 1 tratados con IFNpeg/RBV con Respuesta VirológicaSostenida (RVS), Recidivantes (RC) y No respondedores (NR).RVS(n=21)RC(n=6)NR(n=10)pNúmero de quasiespecies2,19 ± 0,25,17 ± 2,34,5 ± 1,3n.s.Número de mutaciones/quasiespecies0,48 ± 0,11,24 ± 0,71,24 ± 0,80,03Número de sitios polimórficos1,43 ± 0,34,5 ± 1,94,6 ± 1,3n.s.
19Tabla 2. Estudio mediante pirosecuenciación del epítopoinmunodominante de VHC-NS3 (aa 1253-1272) frente al alelo HLA-DQB1*0301, en pacientes con Hepatitis Crónica C genotipo 1 tratados con IFNpeg/RBV con Respuesta VirológicaSostenida (RVS) frente a no-RVS (RC+NR)RVS(n=21)No-RVS(n=16)pNúmero de quasiespecies2,19 ± 0,24,75 ± 1,1n.s.Número de mutaciones/quasiespecies0,48 ± 0,11,24 ± 0,60,01Número de sitios polimórficos1,43 ± 0,34,56 ± 10,025Tabla 3.Haplotipos encontrados por muestra secuenciada. Cada haplotipo lleva su identificación y numero de lecturas encontradas por pirosecuenciación. Pacientes RVSHaplotipos encontrados por muestra y %Muestra 26GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Muestra261661.37GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra261191998.32Muestra 27GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra27577599.6Muestra 29GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra291186294.93GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra29510.41Muestra 30GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra30920.67GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra301296494.6GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra30600.44
20Muestra 31GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra31540.35GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Muestra31600.39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra311452694.55Muestra 32GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra321575394.48GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra32680.41GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra32570.34Muestra 33GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra332159097.14GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra33500.22GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra33790.36GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Muestra33600.27Muestra 34GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra34 1558495.82GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra34560.34Muestra 35GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra351190099.68Muestra 37GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra371045497.85Muestra 38GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Muestra38500.24GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Muestra38820.4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra381928994.28
21GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra38960.47GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra38590.29Muestra 39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra39495399.42Muestra 40GYKVLVLNPSVASTLGFGAY haplo31 Muestra401280.75GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra401571392.16GYKVLVLNPSVTATLGFGAY haplo32 Muestra40840.49GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Muestra40560.33GYKVLVLNPSVAATLGSGAY haplo33 Muestra40670.39Muestra 41GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra41500.34GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra411374494.56GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra411631.12Muestra 42GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra42770.46GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra42780.47GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1Sample421590095.16GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5Sample421100.66Muestra 43GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra43759278.06GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra43181018.61
22Muestra 44GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Muestra445099.02GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra44487586.41Muestra 45GYKVLVLNPAVAATLGFGAY haplo8 Muestra45550.26GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra452105699.16Muestra 46GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra46936299.81Muestra 47GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra47648999.08Muestra 48GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Muestra482363.31GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra48646190.54Muestra 49GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra49228497.32Muestra 50GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra50377096.67GYKVLVLNPSVAATLGCGAY haplo34 Muestra50761.95Pacientes RCMuestra 1GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Muestra1650.31GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra1520.25GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra11965494.85GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra1950.46GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Muestra1530.26
23GYKVLVLNPSAAATLGFGAY haplo6 Muestra1510.25Muestra 4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra41165696.04Muestra 7GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra7641997.69Muestra 8GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra8698796.79GYKVLVLNPSVAATLGFEAY haplo21 Muestra81812.51Muestra 9GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra91294594.18GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra9830.6GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra9630.46GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra9560.41Muestra 14GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra143018093.95GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Muestra141110.35GYKVLVLNPSVAATLGFGAC haplo26 Muestra14600.19GYRVLVLNPSVAATLGFGAY haplo10 Muestra14630.2GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Muestra14790.25GYKALVLNPSVAATLGFGAY haplo24 Muestra14720.22GYKVLVLNPSVVATLGFGAY haplo23 Muestra141580.49GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra141790.56
24GCKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo12 Muestra14880.27GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra14760.24GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Muestra14670.21GYKVLVLNPTVAATLGFGAY haplo25 Muestra14690.21GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Muestra14960.3GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Muestra14860.27GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra14530.16GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Muestra14560.17Muestra 16GYKVLVLSPSVAAT****** haplo28 Muestra16930.61GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra161032567.74GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra16419727.53GYKVLALNPSVAAT****** haplo29 Muestra16540.35Muestra 17GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra171331.41GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra17916997.3Muestra 18GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra18539297.84Muestra 21GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra21960999.72Pacientes NRMuestra 2GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5
25Muestra21340.42GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra22993394.1RYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo14 Muestra2570.18GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Muestra2590.19GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Muestra2800.25GYRVLVLNPSVAATLGFGAY haplo10 Muestra2800.25GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Muestra2770.24GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra21350.42GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Muestra2710.22GCKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo12 Muestra2590.19GYKVLVLNPAVAATLGFGAY haplo8 Muestra2 99 0.31GYKVLVLNPSAAATLGFGAY haplo6 Muestra2660.21GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Muestra2530.17GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra21070.34Muestra 3GYKVLVLNPSVAATLVFGAY haplo16 Muestra3600.84GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra3 671194.07Muestra 5GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra5520.39
26GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra51250194.12Muestra 6GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra6510.34GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra6580.39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra61406193.96GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Muestra6630.42GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra6670.45GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Muestra6700.47Muestra 10GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra10638498.79Muestra 13GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra13650.4GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra13680.42GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Muestra13660.4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra131539894.01GYKVLVLNPSVAATLGLGAY haplo22 Muestra13550.34Muestra 11GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra11710.27GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Muestra11760.29GYKVLVLNPPVAATLGFGAY haplo17 Muestra11830.32GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Muestra11540.21
27GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Muestra11 53 0.2GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra11530.2GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Muestra11720.28GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra111070.41GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra112470894.47Muestra 12GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra12907185.5GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra125244.94GYKVLVLNPSVAATLGFGVY haplo19 Muestra124614.34RYKVLVLNPSVAAT****** haplo20 Muestra121221.15Muestra 15GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra154395.32GYKVLVLNPSVAAT****** haplo18 Muestra15750990.99Muestra 20GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Muestra202013.16GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra20593893.22Muestra 22GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Muestra22670.46GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1Sample221374094.83GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Muestra22780.54GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Muestra22520.36
28Muestra 23GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Muestra23495393.72Muestra 24GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra24552591.78GYKVLVLNPSVAATLGLGAY haplo22 Muestra242614.34Muestra 25GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Muestra25900094.8Tabla 4. Porcentaje de mutaciones respecto a la secuencia de referencia por muestra secuenciada. Posición, con respecto a la secuencia de referencia, donde ocurre la mutación en los diferentes haplotipos contenidos por muestras.Nucleótidode referencia y cambio por mutación. Porcentaje de haplotipos en los que ocurren las mutaciones. 5Porcentaje de mutaciones por muestraPosición en secuenciade ReferenciaReferenciaCambio de aminoácidoNúmeroHaplotipo (%)Pacientes RVSMuestra 268ND1 (50,0%)Muestra 296VA1 (50,0%)Muestra 306VA1 (33,33%)15L*1 (33,33%)16G*1 (33,33%)17F*1 (33,33%)18G*1 (33,33%)19A*1 (33,33%)Muestra 318NS1 (33,33%)13AT1 (33,33%)Muestra 326VA1 (33,33%)8NS1 (33,33%)
29Muestra 333KE1 (25,0%)6VA1 (25,0%)8NS1 (25,0%)Muestra 346VA1 (50,0%)Muestra 386VA1 (20,0%)8NS1 (20,0%)9PL1 (20,0%)13AT1 (20,0%)Muestra 408ND1 (20%)12AT1 (20%)13AS1 (20%)17FS1 (20%)Muestra 416VA1 (33,33%)8NS1 (33,33%)Muestra 425LP1 (25,0%)6VA1 (25,0%)8NS1 (25,0%)Muestra 4315L*1 (50,0%)Muestra 4420YH1 (50,0%)Muestra 4510SA1 (50,0%)Muestra 4816GS1 (50,0%)Muestra 5017FC1 (50,0%)Pacientes RCMuestra 13KE1 (16,67%)6VA1 (16,67%)8NS1 (16,67%)11VA1 (16,67%)20YH1 (16,67%)Muestra 818GE1 (50,0%)Muestra 95LP1 (25,0%)6VA1 (25,0%)15L*1 (25,0%)16G*1 (25,0%)
3017F*1 (25,0%)18G*1 (25,0%)19A*1 (25,0%)20Y*1 (25,0%)Muestra 142YC1 (6,25%)3KE1 (6,25%)3KR1 (6,25%)4VA1 (6,25%)5LP1 (6,25%)6VA1 (6,25%)7LP1 (6,25%)8ND1 (6,25%)8NS1 (6,25%)10ST1 (6,25%)12AV1 (6,25%)13AT1 (6,25%)15LS1 (6,25%)20YC1 (6,25%)20YH1 (6,25%)Muestra 166VA1 (25,0%)8NS1 (25,0%)15L*3 (75,0%)16G*3 (75,0%)17F*3 (75,0%)18G*3 (75,0%)19A*3 (75,0%)20Y*3 (75,0%)Muestra 1715L*1 (50,0%)16G*1 (50,0%)17F*1 (50,0%)18G*1 (50,0%)19A*1 (50,0%)20Y*1 (50,0%)
31Pacientes NRMuestra 21GR1 (7,14%)2YC1 (7,14%)3KE1 (7,14%)3KR1 (7,14%)5LP1 (7,14%)6VA1 (7,14%)7LP1 (7,14%)8ND1 (7,14%)8NS1 (7,14%)9PL1 (7,14%)10SA1 (7,14%)11VA1 (7,14%)15LS1 (7,14%)Muestra 316GV1 (50,0%)Muestra 56VA1 (50,0%)Muestra 65LP1 (16,67%)6VA1 (16,67%)7LP1 (16,67%)8NS1 (16,67%)15LS1 (16,67%)Muestra 115LP1 (11,11%)6VA1 (11,11%)7LP1 (11,11%)8NS1 (11,11%)10SP1 (11,11%)15LS1 (11,11%)15L*1 (11,11%)16G*1 (11,11%)17F*1 (11,11%)18G*1 (11,11%)19A*1 (11,11%)20YH1 (11,11%)
3220Y*1 (11,11%)Muestra 121GR1 (25,0%)15L*2 (50,0%)16G*2 (50,0%)17F*2 (50,0%)18G*2 (50,0%)19AV1 (25,0%)19A*2 (50,0%)20Y*2 (50,0%)Muestra 136VA1 (20,0%)8NS1 (20,0%)15LS1 (20,0%)17FL1 (20,0%)Muestra 1515L*1 (50,0%)16G*1 (50,0%)17F*1 (50,0%)18G*1 (50,0%)19A*1 (50,0%)20Y*1 (50,0%)Muestra 209PL1 (50,0%)Muestra 226VA1 (25,0%)8NS1 (25,0%)16GS1 (25,0%)Muestra 2316GS1 (100,0%)Muestra 2417FL1 (50,0%)Los pacientes DQB1*0301 que presentan No-RVS, tienen mayor número de mutaciones por quasiespecie, ymayor número de sitios polimórficos en su epítopo inmunodominante de VHC (NS3 aa 1253-1272), que los pacientes con RVS, impidiendo su correcta unión a la molécula de HLA-DQB1*0301, y por tanto inhibiendo la proliferación CD4+.5
33El cambio aminoacídico a Prolina podría provocar un cambio conformacional en dicho epítopo que causaría la ausencia de interacción con la hendidura del HLA-DQB1*0301, y por tanto, de la no respuesta inmunológica, explicando la ausencia de RVS.
2 Polymorphisms to predict or predict the response to antiviral treatment. FIELD OF THE INVENTION The present invention is within the field of biomedicine and biotechnology, and refers to a method of obtaining useful data to predict or predict the response to treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 who present the HLA-DQB1 * 0301 allele, studying the genetic variability of the immunodominant NS3 epitope of hepatitis C virus (HCV). BACKGROUND OF THE INVENTION10 Hepatitis C virus (HCV) is one of the most frequent causes of chronic viral hepatitis, liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma, being the most common indication for liver transplantation (Lauer et al. , 2001. N. Engl. J. Med. 345 (1), 41-52). Currently, the most common therapy consists of a combination of pegylated interferon alfa (IFN-peg) and ribavirin (RBV), which achieves a response rate of 48-88% (Poynard et al. , 152003. Lancet 362, 2095-2100). It is believed that both the host and the virus, including viral genomic regions, are of importance in generating an effective response to antiviral treatment (Feld et al. , 2005. Nature436: 967-972). Thus, the response to treatment depends on the genotype of the virus, since some varieties of the virus are resistant to treatment 20 (Hnatyszyn, 2005. Antivir. Ther. 10, 1-11) and in addition, patients infected with the same genotype have a response to variable treatment, which indicates that other factors such as IL28B or human leukocyte antigens (HLA) could influence the response to antiviral therapy ( Ali et al. , 2010. Journal of General Virology91, 1931-1938). Certain studies show that the cellular immune response to HCV involves the CD4 + T cells (Nascimbeni et al. , 2003. J. Virol 77, 1107-1124). It has been proven that individuals have a viral clearance thanks to the stimulation of the immune system due to the response that trigger non-structural proteins of the virus (NS3, NS4 and NS5). Specifically, NS3 provokes a greater response (Lloyd et al. , 2007 Immunol. Cell Bio. 85, 24-32; Fanning et al. , 2001. Hum. Immunol 65, 745-751). In addition, 30 patients with HCV genotype 1 presenting the HLA-DQB1 * 0301 allele have a higher
3proliferation of CD4 + cells, triggered by the binding of the DQB1 * 0301 allele to its highly conserved immunomodulatory epitope, located in the NS3 region of HCV (Lamonaca et al. , 1999. Hepatology30 (4), 1088-1098; Diepolder et al. , 1997. J Virol. 71, 6011-6019). Even so, all patients presenting with the HLA-DQB1 * 0301 allele do not have an SVR at combined viral treatment. Therefore, it could be due to modifications (mutations) in the immunodominant epitope of the NS3 region of the virus that make recognition with HLA not optimal. It is known that immunodominant epitopes are potential candidates for the study of virus-host relationships and the design of therapeutic agents based on the stimulation of CD4 + and CD8 + T lymphocytes (Langet al. , 2008. Vaccine26, 6225-6231; Gerlachet al. , 2005. J. Virol 79, 12425-12433). 23% of patients in our population with Chronic Hepatitis C have the HLA-DQB1 * 0301 allele (Muñoz de Rueda et al. , 2011. A.M. J. Gastroenterol 106 (7), 1246-54). Therefore, a study of the role of the genetic variability of the HCV 15 immunodominant epitope in resistance to combined antiviral treatment in patients with chronic hepatitis C genotype 1 who present the class II HLA allele DQB1 * 0301, which allows to predict or predict the answer. This study would only benefit a certain percentage of the population, but it would also be a saving in health spending, it would be a further contribution to the field of personalized treatments for different populations of HCV infected patients that are difficult to treat. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION The authors of the present invention have located a series of mutations that are useful for determining the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in individuals with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the HLA-DQB1 * 0301 allele. Therefore, a first aspect of the invention relates to the use of the L5P, L7P and / or L15S mutations of the immunodominant epitope of the NS3 region to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the HLA-DQB1 * 0301 allele.
4In a preferred embodiment, the use of the L5P, L7P and L15S mutations is simultaneous. A second aspect of the invention relates to a method, hereafter the first method of the invention, to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the HLA-DQB1 allele * 0301 comprising: 5i) obtaining an isolated biological sample from an individual ii) detecting the presence of the mutation: L5P in the immunodominant epitope of the NS3 region of hepatitis C virus. iii) assign the individual to the group of nonresponders with no sustained viral response (non-SVR) if polymorphisms described in ii) are detected by comparing them with a control sample. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) further comprises the detection of the L7PE mutation In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) further comprises the detection of L15S15 In a preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) comprises the detection of the L5P, L7P and L15S mutations simultaneously. In another preferred embodiment, the biological sample is a blood serum sample. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the detection of the mutations is performed by PCR techniques or immunological techniques20 In another preferred embodiment, the detection of the amino acid mutations is performed by direct sequencing. In another even more preferred embodiment, the detection of mutations is performed by pyrosequencing. A third aspect of the invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising pegylated interferon, ribavirin, and a hepatitis C virus protease inhibitor, in the preparation of a medicament for the treatment of an individual from the group of patients not responders classified by the method of the invention.
In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the hepatitis C virus protease inhibitor is selected from the list comprising BocepreviryTelaprevir. A fourth aspect of the invention relates to a kit or device comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit or device further comprises the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4, or any combination thereof. A fifth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the microarray further comprises the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4, or any combination thereof. A sixth aspect of the invention relates to the use of the kit or device, of the microarray, or the microarray of the invention, to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 that represent the HLA-DQB1 * 0301 allele. A seventh aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer carry out the steps of the method of the invention. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the readable storage medium comprises at least one sequence comprised of the sequence probes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4. In another preferred embodiment of this aspect of the invention comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from at least one known sequence or an mRNA comprising any of the probes of the invention. An eighth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of the method of the invention. 30
6 DESCRIPTION OF THE FIGURES Figure 1. Haplotypes associated with Non-RVS. The pyrosequencing technique has revealed the existence of three haplotypes that are only present in patients with non-SVR (non-SVR = 4/16; SVR: 0/21; p = 0. 02), identified as haplotype 7, 11 and 15, which show an amino acid change at position 5 (aa5, L5P), 7 (aa7, L7P) and 15 (aa15, L15S) 5 respectively. Figure 2 Percentage of haplotype readings for each sample. Haplotypes with a% of reading less than 2% do not appear in the figure. DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION 10 The authors of the present invention have analyzed the mutations of the immunodominant HCV epitope in individuals with HLA-DQB1 * 0301 allele and have generated a method of prediction or prognosis of non-SVR of patients with antiviral treatment of pegylated interferon plus ribavirin). The present invention relates to a method and a kit or device for use in the prediction or prognosis of non-SVR in patients with HCV. Therefore, a first aspect of the invention relates to the use of the L5P, L7P and / or L15S mutations of the immunodominant epitope of the NS3 region, to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the HLA-DQB1 * 0301 allele. In a preferred embodiment, the use of the L5P, L7P and L15S mutations is simultaneous. A second aspect of the invention relates to a method, hereafter the first method of the invention, to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the HLA-DQB1 * allele 0301 comprising: 25i) obtaining an isolated biological sample from an individual ii) detecting the presence of the mutation: L5P in the immunodominant epitope of the NS3 region of hepatitis C virus.
7iii) assign the individual to the group of nonresponders with no sustained viral response (non-SVR) if the polymorphisms described in ii) are detected by comparing them with a control sample. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) further comprises the detection of the L7P5 mutation In an even more preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) further comprises the detection of L15S in a preferred embodiment of this aspect of the invention, step ii) comprises the detection of the L5P, L7P and L15S mutations simultaneously. In the case of the invention, the electropoimmunodominant corresponds to the NS3 region, 10 specifically to the region comprising aa 1253 to 1272, of HCV. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the biological sample is a blood serum sample. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the detection of mutations is performed by PCR techniques or immunological techniques. In another preferred embodiment, the detection of amino acid mutations is performed by direct sequencing. In another even more preferred embodiment, the detection of mutations is performed by pyrosequencing. Steps (ii) and / or (iii) of the method described above can be fully or partially automated, for example, by means of a robotic sensor device for detecting the presence in step (ii) or computerized classification in the step (iii). An "isolated biological sample" includes, but is not limited to, cells, tissues and / or biological fluids of an organism, obtained by any method known to one skilled in the art. Preferably, the isolated biological sample of an individual from step (i) is blood serum. The term "individual", as used in the description, refers to animals, preferably mammals, and more preferably, humans. The term "individual" in this report is synonymous with "patient", and is not intended to be limiting in any aspect, and may be of any age, sex and physical condition. 30
8The term "comparison", as used in the description, refers to, but is not limited to, the comparison of the result of the amplification of the biological sample to be analyzed, also called the biological problem sample, with an amplification of one or more Desirable reference samples. The reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample. The comparison described in section (iii) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer. The term "PCR" corresponds to the acronym of polymerase chain reaction whereby millions of copies of the desired DNA regions can be obtained. It is characterized by the use of pairs of primers that delimit the region from which millions of copies will be made, which is also known as "amplifying DNA" during PCR. The PCR is composed of a certain number of cycles, in turn composed of three phases in which the DNA strands are separated, the primers are joined and the new DNA strands are elongated. In each cycle, if the reaction efficiency is 100%, exponential growth of the DNA fragments subject to amplification occurs. In the case of the invention, the term "pyrosequencing" is a massive sequencing technology, applicable to entire genomes by luminescence. It is characterized by using a multiwell plate that allows the light produced by chemiluminescence to be transmitted during the sequencing reaction to an image capture chamber. Normally, it is used to sequence 500-1000 nucleotides per well. Each fragment is amplified up to 10 million times and the signal is detected. The use of gels or fluorescent markers or ddNTPs is not necessary. By "HLA or human leukocyte antigens" herein, it is understood the antigens formed by molecules that are found on the surface of almost every cell of an individual's tissues, and including blood leukocytes. This set of molecules are involved in immune recognition and signaling between cells of the immune system. Specifically, the "HLA-DQ" group constitutes a group of about 50 antigens that can be found at the HLA-DQ site. By "virus" herein, all microscopic 30acellular infectious agents are understood that can only multiply within the cells of other organisms. HCV belongs to the genus Hepacivirus, which is part of the Acytota Domain, Group IV: Single-stranded positive RNA virus, Family Flaviviridae.
9The Flaviviridae family is a family of viruses propagated primarily by arthropod vectors. It includes the genera Flavivirus, Hepacivirus and Pestivirus. These viruses contain a positive single-stranded RNA genome, their genome is linear, non-segmented and with a length of 9.6 to 12.3 kb. Viral particles are enveloped and spherical, about 40-60 nm in diameter. The main diseases that cause the viruses of this family are: Dengue, Japanese encephalitis, Kyasanur disease, Murray Valley encephalitis, St. Louis encephalitis, tick meningoencephalitis, Nile encephalitis, yellow fever and hepatitis C. Specifically, the HCV NS3 protein, also called p70, is a non-structural virus protein, which has a molecular weight of 70 kDa. It has three enzymatic activities: serine protease activity, located in a third of NS3, towards the N-terminal end and has a trivalent catalytic potential, similar to trypsin. The helicase-nucleoside triphosphatase activity was identified in the middle of the C-terminal end of the NS3 protein, and is involved in the replication and possibly in the translation of the viral genome (Jin and Peterson, 1995. Archives of Biochemistry and Biophysics323, 47-53). 15 Antiviral therapy is basically aimed at achieving virological, biochemical and histological objectives. The evaluation of the response to the treatment, is based on the effect of the same on the virological state, not only at the end of the treatment but, more importantly, in its follow-up after the end of the treatment. As understood herein, it is called "sustained virological response" or "sustained viral response" (SVR) the viraemia negative (negative viral RNA by polymerase chain reaction techniques -PCR-) that is maintained at least 24 weeks after the end of treatment; In other words, the absence of HCV-RNA in the serum 6 months after the end of treatment. The negativization of the viremia at the end of the treatment, with the reappearance of the RNA once it has been determined, defines the “virological response with relapse”. The absence of viremia negativization at the end of the treatment defines the "virological non-response" to the treatment. "Interferon alfa" (IFN-α) is an immunomodulatory cytokine that has antiviral activity, antiangiogenic and antiproliferative properties. IFN-Peg is obtained by the physicochemical binding of polyethylene glycol (PEG) to recombinant interferon alfa (peginterferon α-2a and α-2b), which increases its permanence in the blood requiring less frequency of injections.
There are currently two types of commercial pegylated interferons whose application has been extended: peginterferon alfa – 2a (Pegasys®, Roche) and peginterferon alfa – 2b (Pegintron®, Schering – Plow). These two products are similar with respect to their efficacy and safety but their dosage regimens differ slightly. Ribavirin (1-β-D-ribofuranosyl-1H-1, 2,4-triazol-3-carboxamide) is a synthetic nucleotide analogue of guanidine, with antiviral properties and immunoregulatory activity. It was one of the first drugs that demonstrated its effectiveness in reducing the ability to reproduce viruses. It is described in the Merck Index, compound No. 8199, eleventh edition. Its manufacture and formulation are described in US Pat. UU. n. Do not. Four. 211. 771 The rapid erythrocyte uptake of ribavirin and its phosphorylation are responsible for the important dose-dependent hemolytic anemia. In order to avoid this unwanted effect, the design of the new drugs contemplates that they are not captured or phosphorylated by erythrocytes or that they are rapidly captured and phosphorylated in the liver. Both approaches have the potential disadvantage that they can override fundamental steps that contribute to the therapeutic efficacy of ribavirin. 15 Other derivatives, prodrugs or analogs of ribavirin are viramidine and levovirin. Viramidine is a prodrug of RBV, in the liver it is converted to RBV by the action of hepatic adenosinedeaminase. RBV and viramidine are rapidly eliminated, their molecules and metabolites are excreted by the kidney and have a Tmax of 1.5-3 h. Experimentally, hepatic retention of RBV derived from an oral dose of 20 viramidine is 3 times higher than oral RBV. In contrast, the concentration of RBV phosphates in red blood cells is much lower, hence a more stable hemoglobin concentration can be maintained. It is a safe drug and is well tolerated. Adverse effects with doses of 200, 600 and 1. 200 mg were: 0, 26 and 50%, respectively; mostly mild and disappeared without sequelae. 25 Levovirin is the L-enantiomer of RBV and does not cause hemolytic anemia. It has an immunomodulatory activity similar to RBV, but it has no direct antiviral activity. Other possible analogs are described, for example, but not limited to, in WO 2010/135520. Ribavirin alone is not effective against HCV, but when combined with interferon, viral eradication rates are much better compared to those achieved only with interferon.
11In a preferred embodiment of the invention, the hepatitis C virus protease inhibitor is boceprevir. In another preferred embodiment of the invention, the virus protease inhibitor is telaprevir. The genotype is of clinical importance since it determines the potential response of the current therapy and the duration that it will require. Genotypes 1 and 4 respond less to that treatment than the others (genotypes 2, 3, 5 and 6). The duration of standard interferon-based therapy for genotypes 1 and 4 is 48-72 weeks, while for genotypes 2 and 3 it is only 12-24 weeks. In summary, some HCV genotypes, such as types 2 and 3, are easier to eradicate than type 1. The amount of HCV RNA in the blood 10 (serum) is called “HCV plasma viral load”. Its presence is indicative of an active infection with viral reproduction course. The viral load is usually expressed in logarithmic units [log10 IU / ml]. For the prognosis, the higher the baseline viral load, the lower the likelihood of a sustained response. The response to antiviral treatment is evaluated with a baseline viral load (pre-treatment) and at least one viral load at the end of it and at 24 weeks after treatment. A response to antiviral treatment is considered if an undetectable viral load is obtained at the end of the treatment and an undetectable viral load and / or qualitative negative RNA at 24 weeks (sustained viral response). Likewise, it has been determined that a fall in the early viral load (early viral response), with a decrease of 2 log10 IU / ml or more at 12 weeks intra-treatment, allows an early evaluation of the probability of obtaining a sustained virological response at the end of the therapy. In the present invention "prognosis" is understood as the expected evolution of a disease and refers to the assessment of the probability according to which a subject suffers from a disease as well as the assessment of its onset, developmental status, evolution, or its regression, and / or the prognosis of the course of the disease in the future. As the experts in the field will understand, such assessment, although it is preferred, may not be correct for 100% of the subjects to be diagnosed. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having the disease or having a predisposition to it. If a part is statistically significant, it can be determined by the person skilled in the art 30 using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p values, Student's t test, Mann-Whitney test, etc. Preferred confidence intervals are at least 50%,
12 at least 60%, at least 70%, at least 80%, at least 90%, at least 95%. P values are preferably 0.2, 0.1, 0.05. "Prediction of the response" means, in the context of the present invention, the determination of the probability that the patient responds favorably or unfavorably to a particular therapy or treatment. Especially, the term 5 "prediction", as used herein, refers to an individual evaluation of any parameter that may be useful in determining the evolution of a patient. As those skilled in the art will understand, the prediction of the clinical response to treatment, although it is preferred, does not need to be correct for 100% of the subjects to be diagnosed or evaluated. The term, however, requires that a statistically significant part of the subjects can be identified as having an increased probability of having a positive response. The person skilled in the art can easily determine if a subject is statistically significant using several well-known statistical evaluation tools, for example, determination of confidence intervals, determination of p-values, Student's t-test, Mann Whitney test, etc. . The preferred 15 confidence intervals are at least 50%>, at least 60%>, at least 70%>, at least 80%>, at least 90%), at least 95%>. Pson values, preferably 0.2, 0.1 or 0.05. The prediction of the clinical response can be made using any assessment criteria used and known by the person skilled in the art. In turn, according to the method of the present invention, other subclassifications could be established within this principal, thus facilitating the choice and establishment of appropriate therapeutic regimens or treatment. This discrimination, as understood by one skilled in the art, is not intended to be correct in 100% of the samples analyzed. However, it requires that a statistically significant amount of the analyzed samples be classified correctly. The amount that is statistically significant can be established by a person skilled in the art by using different statistical tools, for example, but not limited, by determining confidence intervals, determining the significance value P, Student's test or discriminant functions. Fisher, non-parametric measurements of Mann Whitney, Spearman correlation, logistic regression, linear regression, area under the ROC 30 curve (AUC). Preferably, the confidence intervals are at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98% or at least 99%. Preferably, the value of p is less than 0.1, 0.05, 0.01, 0.005 or 0.0001. Preferably, the present invention makes it possible to correctly detect the disease differentially by at least 60%, more preferably at least 70%, much more preferably at least 35%.
1380%, or even more preferably in at least 90% of the subjects of a particular group or population analyzed. In a preferred embodiment the nucleotide sequences probed for the detection of mutations are: a) SEQ ID NO: 1: CAA GTG GCA CAT CTA CAC GCG CCC ACA GG5b) SEQ IDNO: 2: TGG CAC TCA TCA CAT ATT ATG ATG TCA TAG GCc ) SEQ ID NO: 3: GGG AAG AGT ACT AAG GTG CCG GCT GCG TAT GCd) SEQ ID NO: 4: CAA CCA CCG TCA GCT AGG AAC TTG CCG TAT GTE In a preferred embodiment a nested PCR is performed, where the probes (external ) of the first PCR correspond to SEQ ID NO: 1 (direction) and SEQ ID NO: 2 (antisense), and the 10 (internal) sensors of the second PCR correspond to SEQ ID NO: 3 (direction) and SEQ ID NO: 4 (antisense). In the context of the present invention, the "nested PCR" is a variant of the conventional PCR comprising amplification rounds with different pairs of primers in each, in order to increase the sensitivity and specificity of the detection. First, a reaction is carried out with the external primers to amplify a more extensive region of DNA, which contains the target segment. Then, this amplification product is used as a template for a second PCR with the internal primers to amplify the specific region. In the context of the present invention, the term "probe" is defined as a oligonucleotide that is complementary or substantially complementary to the amplicon sequence, within the limits of the primers. In the present preferred embodiment, the capture probe is not provided with the addition of a tail, but a tail could be added, with deoxyribonucleotides or ribonucleotides. The probe can preferably be produced synthetically or as a subset of naturally obtained DNA, prepared by standard methodologies (eg, but not limited to, by restriction endonuclease digestion or direct synthesis). Therefore, there is, except for the intended function, no fundamental difference between an "oligonucleotide" or a "probe" according to the invention.
14 Thus, the probes can be between 10 and 200 nucleotides, more preferably, between 12 and 50 nucleotides, and even more preferably the number of nucleotides of the probes of the invention. A third aspect of the invention relates to the use of a pharmaceutical composition comprising pegylated interferon, ribavirin, and a hepatitis 5C virus protease inhibitor, in the preparation of a medicament for the treatment of an individual from the non-patient group. responders classified by the method of the invention. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the hepatitis C virus protease inhibitor is selected from the list comprising Boceprevir and Telaprevir. A fourth aspect of the invention relates to a kit or device comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit or device further comprises the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4, or any combination thereof. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the kit or device further comprises the elements necessary to detect the HLA-DQB1 * 0301 allele. The kit of the invention may include positive and / or negative controls. The kit may also contain, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc. On the other hand, the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization. Preferably, the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention. It is also possible that the oligonucleotide (s) or probes are immobilized in spots on a (preferably solid) surface. In one of its embodiments, the kit comprises a microarray, or microarray of the invention. An RNA microarray is a matrix on a solid substrate (usually a glass holder or a cell of a thin silicon film) that evaluates large amounts of different RNAs that are detectable by specific probes immobilized on spots on a solid substrate. Each stain contains a specific nucleic acid sequence, which normally corresponds to a specific DNA sequence. Although the number of spots is not limited so 30
However, there is a preferred embodiment in which the microarray is customized for the methods of the invention. A fifth aspect of the invention relates to a microarray, hereafter referred to as a microarray of the invention, comprising the nucleotide sequence SEQ ID NO: 1. In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the microarray further comprises the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and / or SEQ ID NO: 4, or any combination thereof. In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the microarray further comprises the necessary elements known to detect the HLA-DQB1 * 0301 allele. Thus, for example, oligonucleotide sequences are constructed on the surface of a 10chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography. Thus, the oligonucleotides are anchored at the 3 'end by a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask. The photomask can be physical or virtual. Thus, the probes can be between 10 and 200 nucleotides, more preferably, between 12 and 50 nucleotides, and even more preferably the number of nucleotides of the probes of the invention. Synthesis in situ on a solid support (for example, glass) could be done using ink-jet technology, which requires longer probes. The supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, aldehydes or epoxy. The probe is each of the chip samples. The target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc. A sixth aspect of the invention relates to the use of the kit or device, of the microarray, or the microarray of the invention, to predict or predict the response to antiviral treatment with pegylated interferon plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C genotype 1 presenting the allele. HLA-DQB1 * 0301. A seventh aspect of the invention relates to a computer-readable storage medium comprising program instructions capable of having a computer perform the steps of the method of the invention.
In a preferred embodiment of this aspect of the invention, the readable storage medium comprises at least one sequence comprised in the sequence probes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 . In another preferred embodiment of this aspect of the invention, the readable storage medium further comprises the elements necessary to detect the HLA-5DQB1 * 0301 allele. In another preferred embodiment of this aspect of the invention comprising oligonucleotides or single channel microarrays designed from at least one known sequence or an mRNA comprising any of the probes of the invention. An eighth aspect of the invention relates to a transmissible signal comprising program instructions capable of causing a computer to carry out the steps of the method of the invention. Thus, for example, oligonucleotide sequences can be constructed on the surface of a chip by sequential elongation of a growing chain with a single nucleotide using photolithography. Thus, the oligonucleotides are anchored by the 3'15 end through a method of selective activation of nucleotides, protected by a photolabile reagent, by the selective incidence of light through a photomask. The photomask can be physical or virtual. Synthesis in situ using a solid support (for example, glass), could be done using ink-jet technology, which requires longer probes. The supports could be, but not limited to, filters or membranes of NC or nylon (charged), silicon, or glass slides for microscopes covered with aminosilanes, polylysine, epoxy aldehyde. The probe is each of the chip samples. The target is the sample to be analyzed: messenger RNA, total RNA, a PCR fragment, etc. A nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise the five bases that appear biologically (adenine, guanine, thymine, cytosine and uracil) and / or bases other than the five that appear biologically. These bases can serve different purposes, for example, to stabilize or destabilize hybridization; to stimulate or inhibit probe degradation; or as junction points for detectable debris or screening debris. For example, a polynucleotide of the invention may contain one or more modified, non-standard, derivatized base charges, including, but not limited to, N6-methyl-adenine, N6-tert-butyl-benzyl-adenine, imidazole, substituted imidazoles , 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5-
17 (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylkeosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylthinosine, 2,2-dimethinosine, 2,2-dimethinosine, 2,2-dimethinosine, 2,2-dimethynosine, 2,2 2-methylguanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylkeosine, 5'-5-methoxycarboxymethyluracil, 5-methoxyuracyl -N6-isopentenyladenine, uracil-5-oxyacetic acid, wybutoxosine, pesudouracil, queosine, 2-thiocytosine, 5-methyl-2-thiouracil, 2-thiouracil, 2-thiouracil, 4-thiouracil, 5-methyluracil (i.e. ), uracil-5-oxyacetic acid methyl ester, 3- (3-amino-3-N-2-carboxypropyl) uracil, (acp3) w, 2,6-diaminopurine, and 5-propynyl pyrimidine. Other examples of modified, non-standard, or derivatized base moieties can be found in US Pat. Nos. 6. 001. 611; 5. 955 589; 5. 844 106; 5. 789. 562; 5. 750 343; 5. 728 525; and 5. 679. 785. In addition, a nucleic acid or polynucleotide sequence may comprise one or more modified sugar moieties including, but not limited to, arabinose, 2-fluoroarabinous, xylulose, and a hexose. The terms "polynucleotide" and "nucleic acid" are used interchangeably herein, referring to polymeric forms of nucleotides of any length, both ribonucleotides (RNA or RNA) and deoxyribonucleotides (DNA or DNA). The terms "amino acid sequence", "peptide", "oligopeptide", "polypeptide" and "protein" are used interchangeably herein, and refer to a polymeric form of amino acids of any length, which may be coding or non-coding, Chemically or biochemically modified. Throughout the description and the claims the word "comprises" and its variants are not intended to exclude other technical characteristics, additives, components or steps. For those skilled in the art, other objects, advantages and features of the invention will be derived partly from the description and partly from the practice of the invention. The following examples and drawings are provided by way of illustration, and are not intended to be limiting of the present invention. EXAMPLES OF THE INVENTION Material and methods The immunodominant epitope NS3 (aa 1253-1272) of HCV has been pyrosequenced (Figure 301), using the FLX 454 ultrasequencer (Roche S. L. ), of 37 patients: 21 with Sustained Virological Response (SVR), 6 Relapsers (CR) and 10 Non-responders (NR). RC and NR patients have been considered non-SVR. A study of: 1) Number has been carried out
18 of quaspecies (haplotypes) per sample; 2) Number of mutations by quaspecies (haplotypes); and 3) Number of polymorphic sites. Results An average reading of 18 has been performed. 197.7 sequences (min-max: 4. 815-42. 788), with an average reading length of 185.54 (min-max: 22-553). Applying quality controls, we finally found 34 different quaspecies. Table 1 and 2 show the number of quaspecies (Haplotypes), quaspecies mutations and polymorphic sites per group. Although patients with SVR have an average of less quaspecies than non-SVR, we found no significant differences. Figure 1 shows the number of haplotypes (quaspecies) per sample, and table 3 10 in detail (pyrosequencing results). However, we observe that patients with SVR have fewer quaspecies mutations, and fewer polymorphic sites than Non-SVRs (P = 0.01 and P = 0.02, respectively). Table 4 shows the percentage of mutations with respect to the reference sequence per sequenced sample (pyrosequencing results). Studying the positions of the immunodominant epitope more susceptible to being mutated and its possible relationship with the response, we observed two positions that are only mutated in patients with Non-SVR, aa 5 (L / P) (Haplotype 7; Figure 1) and aa 7 (L / P) (Haplotype 11; Figure 1) (Non-SVR = 4/16; SVR: 0/21; in both cases), finding statistically significant differences in both cases (p = 0.02). On the other hand, aa 15 (L / S *) 20 (Haplotype 15; Figure 1) is mutated in 2/21 with RVS, and in 7/16 non-RVS, (P = 0.02). In the latter aa 15, 4/16 with non-RVS are L / S, while this change does not appear in RVS patients (0/21). Table 1. Study by pyrosequencing of the HCV-NS3 epitopoimmunodominant (aa 1253-1272) against the HLA-DQB1 * 0301 allele, in patients with Chronic Hepatitis C 25 genotype 1 treated with IFNpeg / RBV with Sustained Virological Response (SVR), Recurrent (RC) and No responders (NR). SVR (n = 21) CR (n = 6) NR (n = 10) p Number of quaspecies 2.19 ± 0.25.17 ± 2.34.5 ± 1.3n. s. Number of mutations / quaspecies 0.48 ± 0.11.24 ± 0.71.24 ± 0.80.03 Number of polymorphic sites 1.43 ± 0.34.5 ± 1.94.6 ± 1.3n. s.
19 Table 2. Study by pyrosequencing of the HCV-NS3 epitopoimmunodominant (aa 1253-1272) against the HLA-DQB1 * 0301 allele, in patients with Chronic Hepatitis C genotype 1 treated with IFNpeg / RBV with Sustained Virological Response (RVS) versus non-RVS (RC + NR) SVR (n = 21) Non-SVR (n = 16) p Number of quaspecies 2.19 ± 0.24.75 ± 1.1n. s. Number of mutations / quaspecies 0.48 ± 0.11.24 ± 0.60.01 Number of polymorphic sites 1.43 ± 0.34.56 ± 10.025 Table 3. Haplotypes found by sequenced sample. Each haplotype carries its identification and number of readings found by pyrosequencing. Patients SVRHapotypes found by sample and% Sample 26GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Sample261661. 37GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample261191998. 32Show 27GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample27577599. 6Show 29GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample291186294. 93GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 29510. 41 Sample 30GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 30920. 67GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 301296494. 6GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 30600. 44
20Show 31GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample31540. 35GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Sample31600. 39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample311452694. 55 Sample 32GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 321575394. 48GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 32680. 41GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample32570. 34 Shows 33GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample332159097. 14GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample33500. 22GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample33790. 36GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Sample33600. 27 Sample 34GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 34 1558495. 82GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample34560. 34 Displays 35GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 351190099. 68 Sample 37GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 371045497. 85 Sample 38GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Sample 38500. 24GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Sample 38820. 4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 381928994. 28
21GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 38960. 47GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 38590. 29 Sample 39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 39495399. 42 Shows 40GYKVLVLNPSVASTLGFGAY haplo31 Sample 401280. 75GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 401571392. 16GYKVLVLNPSVTATLGFGAY haplo32 Sample 40840. 49GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Sample 40560. 33GYKVLVLNPSVAATLGSGAY haplo33 Sample 40670. 39 Sample 41GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 41500. 34GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 411374494. 56GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 411631. 12Show 42GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample42770. 46GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample42780. 47GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1Sample421590095. 16GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5Sample421100. 66 Sample 43GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 43759278. 06GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample43181018. 61
22 Sample 44GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Sample 445099. 02GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 44487586. 41 Sample 45GYKVLVLNPAVAATLGFGAY haplo8 Sample 45550. 26GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 452105699. 16 Displays 46GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 46936299. 81 Sample 47GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 47648999. 08 Sample 48GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Sample 482363. 31GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 48646190. 54 Shows 49GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 49228497. 32 Displays 50GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 50377096. 67GYKVLVLNPSVAATLGCGAY haplo34 Sample 50761. 95 RC patients Sample 1GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Sample 1650. 31GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample1520. 25GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample11965494. 85GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample1950. 46GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Sample 1530. 26
23GYKVLVLNPSAAATLGFGAY haplo6 Sample1510. 25 Displays 4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 41165696. 04 Displays 7GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample7641997. 69 Sample 8GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 8698796. 79GYKVLVLNPSVAATLGFEAY haplo21 Sample 81812. 51 Sample 9GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 91294594. 18GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample 9830. 6GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample9630. 46GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 9560. 41 Sample 14GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 143018093. 95GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Sample141110. 35GYKVLVLNPSVAATLGFGAC haplo26 Sample14600. 19GYRVLVLNPSVAATLGFGAY haplo10 Sample 14630. 2GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Sample 14790. 25GYKALVLNPSVAATLGFGAY haplo24 Sample 14720. 22GYKVLVLNPSVVATLGFGAY haplo23 Sample 141580. 49GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample141790. 56
24GCKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo12 Sample14880. 27GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample 14760. 24GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Sample 14670. 21GYKVLVLNPTVAATLGFGAY haplo25 Sample 14690. 21GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Sample 14960. 3GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Sample 14860. 27GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 14530. 16GYKVLVLNPSVATTLGFGAY haplo27 Sample 14560. 17Show 16GYKVLVLSPSVAAT ****** haplo28 Sample16930. 61GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample161032567. 74GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample16419727. 53GYKVLALNPSVAAT ****** haplo29 Sample 16540. 35 Sample 17GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 171331. 41GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 17916997. 3Show 18GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample18539297. 84 Sample 21GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 21960999. 72 NR Patients Displays 2GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5
25 Sample 2,140. 42GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 22993394. 1RYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo14 Sample 2570. 18GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Sample 2590. 19GYKVLVLDPSVAATLGFGAY haplo9 Sample 2800. 25GYRVLVLNPSVAATLGFGAY haplo10 Sample 2800. 25GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Sample 2770. 24GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 2150. 42GYEVLVLNPSVAATLGFGAY haplo3 Sample 2710. 22GCKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo12 Sample 2590. 19GYKVLVLNPAVAATLGFGAY haplo8 Sample2 99 0. 31GYKVLVLNPSAAATLGFGAY haplo6 Sample 2660. 21GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Sample2530. 17GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample 21070. 34 Sample 3GYKVLVLNPSVAATLVFGAY haplo16 Sample 3600. 84GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample3 671194. 07Show 5GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample5520. 39
26GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 51250194. 12Show 6GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample6510. 34GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 6580. 39GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample61406193. 96GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Sample 6630. 42GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample 6670. 45GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Sample 6700. 47 Shows 10GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 10638498. 79 Sample 13GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample13650. 4GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample13680. 42GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Sample13660. 4GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample131539894. 01GYKVLVLNPSVAATLGLGAY haplo22 Sample13550. 34 Sample 11GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 11710. 27GYKVPVLNPSVAATLGFGAY haplo7 Sample 11760. 29GYKVLVLNPPVAATLGFGAY haplo17 Sample11830. 32GYKVLVLNPSVAATSGFGAY haplo15 Sample 11540. twenty-one
27GYKVLVLNPSVAATLGFGAH haplo4 Sample 11 53 0. 2GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 11530. 2GYKVLVPNPSVAATLGFGAY haplo11 Sample 11720. 28GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 111070. 41GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample112470894. 47 Sample 12GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 12907185. 5GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 125244. 94GYKVLVLNPSVAATLGFGVY haplo19 Sample 124614. 34RYKVLVLNPSVAAT ****** haplo20 Sample 121221. 15 Shows 15GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample154395. 32GYKVLVLNPSVAAT ****** haplo18 Sample 15750990. 99 Shows 20GYKVLVLNLSVAATLGFGAY haplo13 Sample202013. 16GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample20593893. 22 Sample 22GYKVLALNPSVAATLGFGAY haplo2 Sample 22670. 46GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1Sample221374094. 83GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Sample 22780. 54GYKVLVLSPSVAATLGFGAY haplo5 Sample 22520. 36
28 Sample 23GYKVLVLNPSVAATLSFGAY haplo30 Sample 233495393. 72 Sample 24GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 24552591. 78GYKVLVLNPSVAATLGLGAY haplo22 Sample 242614. 34 Displays 25GYKVLVLNPSVAATLGFGAY haplo1 Sample 25900094. 8 Table 4. Percentage of mutations with respect to the reference sequence per sequenced sample. Position, with respect to the reference sequence, where the mutation occurs in the different haplotypes contained by samples. Reference nucleotide and change by mutation. Percentage of haplotypes in which mutations occur. 5 Percentage of mutations per sample Sequence position of Reference Reference Amino acid change Number Hapotype (%) RVS patients Sample 268 ND1 (50.0%) Sample 296VA1 (50.0%) Sample 306VA1 (33.33%) 15L * 1 (33.33%) 16G * 1 (33.33%) 17F * 1 (33.33%) 18G * 1 (33.33%) 19A * 1 (33.33%) Sample 318NS1 (33.33%) 13AT1 (33.33%) Sample 326VA1 (33.33%) 8NS1 (33.33%)
29 Sample 333KE1 (25.0%) 6VA1 (25.0%) 8NS1 (25.0%) Sample 346VA1 (50.0%) Sample 386VA1 (20.0%) 8NS1 (20.0%) 9PL1 (20.0 %) 13AT1 (20.0%) Sample 408ND1 (20%) 12AT1 (20%) 13AS1 (20%) 17FS1 (20%) Sample 416VA1 (33.33%) 8NS1 (33.33%) Sample 425LP1 (25, 0%) 6VA1 (25.0%) 8NS1 (25.0%) Sample 4315L * 1 (50.0%) Sample 4420YH1 (50.0%) Sample 4510SA1 (50.0%) Sample 4816GS1 (50.0% ) Sample 5017FC1 (50.0%) RC patients Sample 13KE1 (16.67%) 6VA1 (16.67%) 8NS1 (16.67%) 11VA1 (16.67%) 20YH1 (16.67%) Sample 818GE1 (50 , 0%) Sample 95LP1 (25.0%) 6VA1 (25.0%) 15L * 1 (25.0%) 16G * 1 (25.0%)
3017F * 1 (25.0%) 18G * 1 (25.0%) 19A * 1 (25.0%) 20Y * 1 (25.0%) Sample 142YC1 (6.25%) 3KE1 (6.25% ) 3KR1 (6.25%) 4VA1 (6.25%) 5LP1 (6.25%) 6VA1 (6.25%) 7LP1 (6.25%) 8ND1 (6.25%) 8NS1 (6.25%) 10ST1 (6.25%) 12AV1 (6.25%) 13AT1 (6.25%) 15LS1 (6.25%) 20YC1 (6.25%) 20YH1 (6.25%) Sample 166VA1 (25.0%) 8NS1 (25.0%) 15L * 3 (75.0%) 16G * 3 (75.0%) 17F * 3 (75.0%) 18G * 3 (75.0%) 19A * 3 (75.0 %) 20Y * 3 (75.0%) Sample 1715L * 1 (50.0%) 16G * 1 (50.0%) 17F * 1 (50.0%) 18G * 1 (50.0%) 19A * 1 (50.0%) 20Y * 1 (50.0%)
31 NR Patients Displays 21GR1 (7.14%) 2YC1 (7.14%) 3KE1 (7.14%) 3KR1 (7.14%) 5LP1 (7.14%) 6VA1 (7.14%) 7LP1 (7.14% ) 8ND1 (7.14%) 8NS1 (7.14%) 9PL1 (7.14%) 10SA1 (7.14%) 11VA1 (7.14%) 15LS1 (7.14%) Sample 316GV1 (50.0% ) Sample 56VA1 (50.0%) Sample 65LP1 (16.67%) 6VA1 (16.67%) 7LP1 (16.67%) 8NS1 (16.67%) 15LS1 (16.67%) Sample 115LP1 (11, 11%) 6VA1 (11.11%) 7LP1 (11.11%) 8NS1 (11.11%) 10 SP1 (11.11%) 15LS1 (11.11%) 15L * 1 (11.11%) 16G * 1 (11.11%) 17F * 1 (11.11%) 18G * 1 (11.11%) 19A * 1 (11.11%) 20YH1 (11.11%)
3220Y * 1 (11.11%) Sample 121GR1 (25.0%) 15L * 2 (50.0%) 16G * 2 (50.0%) 17F * 2 (50.0%) 18G * 2 (50, 0%) 19AV1 (25.0%) 19A * 2 (50.0%) 20Y * 2 (50.0%) Sample 136VA1 (20.0%) 8NS1 (20.0%) 15LS1 (20.0%) 17FL1 (20.0%) Sample 1515L * 1 (50.0%) 16G * 1 (50.0%) 17F * 1 (50.0%) 18G * 1 (50.0%) 19A * 1 (50, 0%) 20Y * 1 (50.0%) Sample 209PL1 (50.0%) Sample 226VA1 (25.0%) 8NS1 (25.0%) 16GS1 (25.0%) Sample 2316GS1 (100.0%) Sample 2417FL1 (50.0%) DQB1 * 0301 patients with Non-RVS have a higher number of quasi-species mutations, and a greater number of polymorphic sites in their immunodominant HCV epitope (NS3 aa 1253-1272), than patients with SVR, preventing its correct binding to the HLA-DQB1 * 0301 molecule, and thus inhibiting CD4 + proliferation. 5
33 The amino acid change to Proline could cause a conformational change in said epitope that would cause the absence of interaction with the cleft of the HLA-DQB1 * 0301, and therefore, of the non-immune response, explaining the absence of SVR.