ES2533869T3

ES2533869T3 - Inulina de cadena larga

Info

Publication number: ES2533869T3
Application number: ES06724397.2T
Authority: ES
Inventors: Elke Hellwege; Roger Peeters; Jens Pilling
Original assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Current assignee: Bayer Intellectual Property GmbH
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-12
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2026-04-12
Also published as: WO2006108697A1; CA2603915C; JP2008535983A; US20080255249A1; MX2007012623A; BRPI0608781B1; AU2006233744B2; CA2603915A1; JP5249747B2; EP1902070A1; BRPI0608781A2; AU2006233744A1; DK1902070T3; US7959962B2; EP1902070B1; AR056313A1

Abstract

Inulina de alcachofa que tiene un grado medio de polimerización DPw de entre 54 y 61, medido por medio de cromatografía de permeabilidad en gel con dispersión de luz y detección de índice de refracción como se describe en los Métodos Generales en el párrafo 4.1.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

E06724397

26-03-2015

Se puede determinar el contenido de fructano de una muestra usando el estuche de "Procedimiento de Ensayo de Fructano" (de Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irlanda). El principio de este ensayo está basado en la hidrólisis de fructano hasta sus monómeros reductores glucosa y fructosa y la posterior determinación fotométrica (longitud de onda = 410 nm) del contenido de estos azúcares reductores (glucosa, fructosa) tras la formación de

5 color por medio del denominado "método de PAHBAH" (véase a continuación para los detalles del método).

En una primera etapa, se hidroliza la sacarosa presente en el extracto por medio de la enzima específica sacarasa para glucosa y fructosa. Además, de igual forma, los almidones y maltodextrinas presentes en el extracto se degradan hasta glucosa con una mezcla de enzimas -amilasa, pululanasa y maltasa altamente purificadas.

10 Posteriormente, se reducen los azúcares reductores resultantes hasta alcoholes de azúcar por medio de tratamiento con una disolución alcalina de borohidruro y, de este modo, se retiran de la disolución. La adición de ácido acético diluido neutraliza la disolución y retira el exceso de borohidruro. A continuación, se hidroliza el fructano con fructanasa purificada (exo-inulinasa) hasta fructosa y glucosa, y se determina el contenido de los monosacáridos resultantes por medio del método de PAHBAH.

15 Sustancias químicas y disoluciones en los estuches de "Procedimiento de Ensayo de Fructano"

1. 50 U de sacarasa (levadura), 500 U de -amilasa (B. cereus), 100 U de pululanasa (K. pneumoniae) y 1000 U

de maltasa (levadura) están presentes como polvo seco por congelación y se disuelven en 22 ml de tampón de 20 maleato de sodio de 0,1 M de pH 6,5 (referido como "enzima 1" a continuación) para la medición

2.: 8000 U de fructanasa (exo-inulinasa) están presentes como polvo seco por congelación y se disuelven en 22 ml de tampón de acetato de sodio de 0,1 M de pH 4,5 (referido como "enzima 2" a continuación) para la medición.

3.: Disolución patrón de fructosa (1,5 mg de fructosa/ml) disuelta en ácido benzóico de 0,2 %.

25 4. Polvo de control de fructano Fructano de dalia con contenido conocido de fructano, seco por congelación en presencia de alfa-celulosa.

Disoluciones no presentes en el estuche:

30 I. reactivo de PAHBAH Disolución A: se añaden 10 g de PAHBAH (hidrazida de ácido p-hidroxibenzoico, Sigma Nº. Orden H-9882) a 60 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 250 ml, y se añaden 10 ml de ácido clorhídrico concentrado a la suspensión al tiempo que se agita. Se lleva la disolución hasta 200 ml y se almacena a temperatura ambiente.

35 Disolución B: al tiempo que se agita, en primer lugar se disuelven por etapas 24,9 g de citrato de sodio y posteriormente 2,20 g de cloruro de calcio y finalmente 40 g de hidróxido de sodio en 500 ml de agua destilada. Tras la adición de hidróxido de sodio, la disolución puede ser lechosa, pero se vuelve transparente cuando se completa la disolución hasta 2l con agua. Se almacena la disolución a temperatura ambiente. Poco antes del uso, se añaden 20 ml de la disolución A a 180 ml de la disolución B y se mezcla de forma intensa

40 (= reactivo de PAHBAH). Se debe almacenar la disolución en hielo y se puede usar durante 4 horas.

II. Disolución de hidróxido de sodio 50 mM

III. Disolución alcalina de borohidruro de sodio 45 borohidruro de sodio de 10 mg/ml (Sigman, Nº Orden S-9125) en hidróxido de sodio de 50 mM.

IV. Ácido acético 100 mM.

Método de detección: 50

1. Control de Fructano (A) Se someten a extracción 20 mg de polvo de control de fructano en 1 ml de agua destilada dos veces en un bloque de calentamiento a 95 ºC durante 30 minutos. Tras la centrifugación (13 000 x g durante 5 minutos), se transfiere el sobrenadante a un nuevo recipiente de reacción, y se coloca el precipitado de nuevo en 1 ml de

55 agua destilada y se somete a extracción en el bloque de calentamiento a 95 ºC durante 30 minutos. Tras una centrifugación renovada (véase: anteriormente) se retira el sobrenadante y se combina con el primer sobrenadante.

(B) Se someten a extracción fructano purificado/inulina en 2 ml de agua destilada dos veces en un bloque de

calentamiento a 95 ºC durante 1 hora. Tras la centrifugación (13 000 x g durante 5 minutos), se transfiere el 60 sobrenadante a un nuevo recipiente y se usa para la medición.

2.: Se mezclan 200 l de muestra con 200 l de enzima y se incuba a 40 ºC durante 60 minutos (tiempo de incubación ampliado en 30 minutos a partir del protocolo de megaenzima).

3.: Se añaden 200 l de disolución alcalina de borohidruro de sodio, y se mezcla intensamente la disolución y se

incuba a 40 ºC durante 30 minutos con el fin de lograr una conversión completa de los azúcares reductores en 65 alcoholes de azúcar.

imagen6

E06724397

26-03-2015

de las enzimas anteriormente mencionadas, en reacción dependiente de NAD+, para dar lugar a 6-fosfogluconato. Se forman dos moléculas de NADH en la conversión de una molécula de sacarosa en 6-fosfogluconato. De igual forma, se mide la cantidad de NADH formado por medio de fotometría, y se calcula a partir del mismo el contenido de sacarosa usando el coeficiente de extinción molar de NADH.

5

4. Análisis de la distribución de peso molecular 4.1. Cromatografía de permeabilidad en gel con dispersión de luz y detección de índice de refracción (sistema GPC-RI-MALLS).

Se disuelven las inulinas/fructanos en agua con una concentración de un 0,5 % (peso/volumen). Se calientan las disoluciones a 95 ºC durante 10 minutos. Se analizan los polímeros usando los siguientes instrumentos: cromatógrafo de gel PL120 (de Polymer Laboratories, Alemania), Midas Autosampler (de Spark, Holanda), detector de dispersión de luz DAWN-EOS (Wyatt Technology, Santa Barbara, EE.UU.) con o = 690 nm y 16 detectores

15 dentro del intervalo de ángulos de 14,9 a 162,9º más célula de flujo de K5, detector de índice de refracciónviscosidad combinado -1002 (de: WGE Dr. Bures GmbH & CoKG, Alemania). Se separan los polímeros en las siguientes columnas: pre-columna TSK, TSK6000PW, TSK3000PW (de Tosoh BioScience GmbH, Stuttgart, Alemania). Se inyectaron 100 l de disolución. El fraccionamiento tuvo lugar a una temperatura de 30 ºC y con un caudal de 0,8 ml/minuto con NaNO3 de 0,3 M como eluyente. El programa Astra 4.90.08 (de Wyatt Technology Santa Barbara, EE.UU) analiza la distribución de peso molecular de las muestras en GPC-RI-MALLS-MALLS.

4.2. Determinación de DPn de inulina con hidrólisis de PCA

La inulina se hidroliza por completo con ácido percloro acético (PCA). A partir de la proporción de fructosa generada

25 con respecto a glucosa generada, se puede determinar el número medio de longitud de cadena (DPn) de la muestra de inulina.

Preparación de muestra:

Se pesaron exactamente 50,0 +/-5,0 mg de inulina en un matraz de 1 ml. Se añaden 700 l de Obidest para disolver. Posteriormente, se agita la muestra con el fin de despegar el material de la muestra de la parte inferior del recipiente de la mejor forma posible y posteriormente se deja reposar en un baño de agua en ebullición (99 ºC). Durante la incubación, se agita al matraz cada 30 segundos. Tras la incubación se enfría la muestra hasta temperatura ambiente con el fin de llenar con H2Obidest hasta la marca de 1 ml de calibración. La disolución de la muestra tiene

35 una concentración de inulina de 5,0 +/-0,5 %. Para la determinación del azúcar antes de la hidrólisis se retienen 200 l y se congela a -20 ºC. Antes del tratamiento del azúcar se descongela a temperatura ambiente, se mezcla, se disuelve durante 5 minutos bajo agitación a 1400 rpm en un bloque de calentamiento a 95 ºC y se centrifuga durante 2 minutos a 4000 rpm.

Hidrólisis y extracción de muestra:

Se proporcionan 250 l de disolución de inulina de  5 % en 250 l de PC de 18 % ya preparado (concentración final de inulina 2,5 %, PCA 9 %). Alternativamente, se proporcionan 900 l de disolución de inulina de 5 % en 100 l de PCA de 5 % ya preparado (concentración final de inulina 4,5 %, PCA 0,5 %). Se homogeneiza la mezcla de hidrólisis

45 y se centrifuga durante 1 minuto a 4000 rpm. Posteriormente, se coloca la mezcla de hidrólisis en un dispositivo de calentamiento (bloque de calentamiento) a 37 ºC o, alternativamente, 56 ºC. En diferentes momentos, tras la mezcla del hidrolizado de nuevo y la centrifugación durante 1 minuto a 4000 rpm, se extraen 100 l de muestra y se neutralizan de forma inmediata por medio de adición de una mezcla de neutralización de NaOH acuoso. Se comprueba el valor de pH de la muestra neutralizada con un indicador de pH (papel de pH). Los momentos de extracción de muestra son 50 minutos, 2 horas, 3 horas y 4 horas y 24 horas. Se congelaron todas las muestras neutralizadas a -20 ºC. Antes de la medición de los azúcares, se descongelan estas muestras a temperatura ambiente, se mezclan y centrifugan durante 2 minutos a 4000 rpm. Para la medición de fructosa se prepara una dilución de 1:10 por medio de adición de 10 l de hidrolizado neutralizado sobre 90 l de H2Obidest.

55 Medición de azúcares

Para la determinación de fructosa y glucosa liberadas durante la hidrólisis en todas las muestras, se lleva a cabo una medición fotométrica de glucosa-fructosa. En la muestra, antes de la hidrólisis, también se determina sacarosa además de glucosa y fructosa. La medición se lleva a cabo como determinación repetida en placas de microvaloración por medio del uso de un fotómetro SPECTRAmax (Molecular Devices). Se preparan todas las disoluciones de enzima empleadas en tampón de medición, que consiste en imidazol-HCl 50 mM pH 6,9, MgCl2 2,5 mM, ATP 1 mM y NADP 0,4 mM. Se observa la conversión de NADP en NADPH a 340 nm.

Para la medición de azúcares antes de la hidrólisis se usa la disolución de inulina no diluida de 5 %. Se proporcionan 65 10 l de esta disolución a 200 l de un tampón de medición. Se lleva a cabo la determinación de glucosa por medio

imagen7

imagen8

E06724397

26-03-2015

8. Preparación de las pastas de inulina

5 Se dispersan pastas de inulina (sustancia seca) en 59,5 ml (de agua o tampón de citrato de pH 4,0) en un vaso de precipitados de vidrio de 150 ml usando un batidor pequeño (3-bucle: 2 cm de ancho; 8,6 cm de largo) que se acciona por medio de un agitador básico IKA RW16 (IKA Werke GmbH und Co., KG, 79219 Staufen, Alemania) con un valor 6-7, por medio de adición continua de la inulina durante un período de 30 s. Posteriormente, se transfiere la dispersión a un cilindro de medición de 250 ml (diámetro de 35 mm; altura de 160 mm) y se somete a cizalladura usando un Ultra-Turrax T25 (dispositivo de dispersión básico T25) (IKA Werke GmbH und Co., KG, 79219 Staufen, Alemania) a 24 krpm durante 3 minutos. Los contenidos del recipiente no se enfrían. Posteriormente, se transfieren las pastas de inulina a un vaso de precipitados de vidrio de 100 ml, se cubren con una tapa de vidrio y se almacenan en un frigorífico a 13 ºC durante la noche. Antes de cada medición posterior, se acondicionan las pastas de inulina a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, se agitan hasta lograr una consistencia suave con un

15 agitador de paletas largas (2 paletas de agitación en un eje de 1 cm de ancho; anchura de paletas 1,4 cm; longitud de paletas 5,9 cm) accionado por un agitador básico IKA RW16 (IKA Werke GmbH und Co. KG, 79219 Staufen, Alemania) a 100 rpm durante 5 minutos. Inmediatamente después, se transfieren las pastas a los respectivos recipientes de medición.

9. Determinación de la estabilidad frente a la cizalladura de las pastas de inulina

Se mide la estabilidad frente a la cizalladura de las pastas de inulina acuosas usando un viscosímetro Rotovisco VT550 (de: antiguamente Thermo Haake GmbH, actualmente Thermo Electron GmbH, 63303 Dreieich, Alemania) a una temperatura de medición de 20-22 ºC usando un agitador de paletas inclinadas a 128 rpm en una copa de

25 medición (diámetro 42 mm; altura de 93 mm). Por este motivo, se agitaron las pastas de inulina en el Rotovisko durante 15 minutos y se midió la viscosidad de las pastas en cada caso al comienzo (punto más elevado de la curva) y al final del período de agitación. Posteriormente, se calcula la relación de la viscosidad al final del proceso de agitación (Visc 2) con respecto a la viscosidad al comienzo (Visc 1), y de este modo se determina la estabilidad frente a la cizalladura:

Estabilidad frente a la cizalladura [%] = Visc 2/Visc 1 * 100

10. Determinación de la estabilidad frente a ácidos de las pastas de inulina

35 Se preparan pastas de inulina en tampón de citrato de pH 4 para determinar la estabilidad frente a ácidos. La determinación de la estabilidad en un medio ácido tiene lugar por analogía a la determinación de la estabilidad frente al cizalladura, es decir, usando un dispositivo de ensayo de viscosidad Rotavisko VT550 a una temperatura de medición de 20-22 ºC usando un agitador de paletas inclinadas a 128 rpm en una copa de medición (diámetro 42 mm; altura 93 mm). Se agitan las pastas de inulina en el Rotovisko durante 15 minutos y se mide la viscosidad de las pastas en cada caso al comienzo y al final del período de agitación. A continuación, se calcula la relación de la viscosidad al final del período de agitación (Visc 2) con respecto a la viscosidad al comienzo (Visc 1), y la estabilidad frente a ácidos viene, de este modo, determinada por medio de:

45 Estabilidad frente ácidos [%] = Visc 2/Visc 1 * 100

11. Determinación de la estabilidad térmica de las pastas de inulina

Se determina la estabilidad térmica de las pastas de inulina en un reómetro DSC (antiguamente Bohlin Instruments GmbH, 75181 Pforzheim, Alemania; desde 10/2004; Malvern Instruments GmbH, 71083 Herrenberg, Alemania) con la siguiente configuración:

Sistema de medición: cono (4 º)/placa Tasa: 0,1 Hz Deformación: 0,001 Tensión inicial: 0,6 Pa Perfil de temperatura: 30 ºC-90 ºC (1 ºC/minuto)

La temperatura definida como la temperatura de fusión de las pastas de inulina es esa en la cual la viscosidad de los 55 geles es menor que 2 Pa.s.

12. Calorimetría de barrido diferencial de inulina

Se pesan por arco partes de 3 gramos de inulina (sustancia seca en tubos de polipropileno graduados de 50 ml (30,0 x 115 mm, de Greiner, número de orden 227261). Se añaden 18 ml de agua destilada dos veces al respectivo polvo y se agita. A continuación, se colocan todas las suspensiones disponibles en un baño de agua (95 ºC) y se

E06724397

26-03-2015

disuelven por medio de agitación varias veces. Se establece visualmente tras 20 minutos que todas las suspensiones experimentaron disolución completa. Posteriormente, se llevan las disoluciones disponibles hasta 20 ml por medio de la graduación del tubo de polipropileno para permitir una disolución de 15 % de concentración (peso/volumen).

5 A continuación, se colocaron las disoluciones, todavía calientes, de forma completa en placas de Petri (100 x 20 mm, de Grenier, número de orden 664102) y se secaron con la tapa abierta a 37 ºC durante 2 días. Transcurrido este tiempo, se transfiere el material seco disponible a un mortero y se muele durante 2-3 minutos. Posteriormente, se homogeneiza este polvo en un molino de martillos (MM 300 de Retsch) con un adaptador que comprende una bola de acero con un diámetro de 20 mm durante 30 s y a una frecuencia de 30 Hertz. A continuación, se transfiere el polvo a un recipiente que se puede cerrar y se emplea para las mediciones de DSC.

Se determina el contenido de agua de las muestras por medio de un dispositivo automático de valoración de Karl-Fischer (véase los métodos generales 7). Para la medición de DSC, se pesan aproximadamente 10 mg de sustancia

15 seca de inulina en una cazoleta de acero inoxidable (volumen 50 l), se determina el peso exacto, y se añaden 30 l de agua destilada. Posteriormente, se sellan herméticamente las cazoletas. Se usa una cazoleta de acero inoxidable como referencia. La muestra se calienta en un aparato de DSC con un dispositivo automático de toma de muestras (Perkin Elmer; Diamond) de 10-160 ºC a una velocidad de calentamiento de 10 ºC/minuto. Se lleva a cabo el análisis de datos por medio de un programa de soporte lógico de PYRIS 7.0 (Perkin Elmer, 63110 Rodgau-Jügesheim, Alemania). En este caso, se determinaron To (aparición) y la entalpía libre dH.

13. Determinación de la viscosidad

Disoluciones de inulina a una temperatura de 90 ºC: Viscosidad frente a concentración.

25 Se produjo una disolución acuosa de inulina por medio de llenado de la cantidad de inulina con el respectivo volumen de agua destilada (peso por volumen). Se calentó la suspensión resultante y se disolvió en un baño de agua hasta 95 ºC con agitación constante.

Se ejecutaron las mediciones en un reómetro CVO 120HR Bohlin/Malvern aplicando el modo de viscosimetría de isoterma (90 ºC) en un sistema de cono-placa CP 4ºC/40 mm. A modo de pre-cizalladura, se aplicó una velocidad de cizalladura de 10/segundo durante 60 segundos con un tiempo de relajación de 10 segundos. Se midió la cizalladura en el modo de velocidad de cizallamiento con etapas de tipo barrido logarítmico. La velocidad de cizallamiento de partida fue de 20/segundo, velocidad de cizallamiento final 30 /segundo, en una rampa ascendente con 20 segundos

35 de tiempo de mantenimiento y 10 segundos de tiempo de integración. Se tomaron los datos a una velocidad de cizallamiento de 20 s-1 .

14. Determinación de la resistencia de gel y comportamiento viscoelástico

Se llenaron 70 g de una suspensión de 10-25 % en peso de suspensión de inulina en agua (destilada) en una copa de medición MV de un viscosímetro Haake Rotovisco VT 550. Posteriormente, se insertó un agitador de álabes y se instaló en un dispositivo precalentado (camisa de temperatura, 90 ºC). Posteriormente, se calentó la preparación durante 15 minutos bajo agitación a 128 rpm.

45 Trascurridos 15 minutos, se transfirió la preparación a 90 ºC a un recipiente que consistía en una parte inferior y una pared de dos anillos cilíndricos a partir de vidrio acrílico (cada uno de 20 mm de altura, 30 mm de diámetro) que descansaban uno sobre otro y fijados uno a otro por medio de una cinta adhesiva (19 mm de anchura). Se llenó la preparación en un recipiente hasta un nivel de aproximadamente 5 mm por debajo del borde superior sin burbujas. Posteriormente, se selló herméticamente el recipiente con papel de aluminio y se dejó a temperatura ambiente (23 ºC) durante la noche.

La medición de la resistencia de gel se hizo tras el almacenamiento durante aproximadamente 20 horas a temperatura ambiente (23 ºC) con un Texture Analyser TA XT2. Con el fin de permitir una medición de resistencia de gel a una superficie lisa y no seca, en primer lugar se retira la cinta adhesiva que matenía unidos los dos anillos

55 cilíndricos del recipiente. Posteriormente, se cortó el gel entre los anillos con un cuchillo de manera que la parte inferior del gel mostrara un superficie suave.

Se llevó a cabo la medición de la resistencia de gel con un Texture Analyser TA XT2 por medio de penetración (profundidad de 1 mm) de una placa giratoria plana (24,5 mm de diámetro) en el gel. Los ajustes del Analizador de Textura fueron los siguientes:

Principio de medición: fuerza en la dirección de presión Pre-velocidad: 2 mm/s Velocidad de ensayo: 2 mm/s Valor de accionamiento: 0,01 N Velocidad de retorno: 2 mm/s

imagen9

E06724397

26-03-2015

Lactobacilos con sonda Lab158 (Harmsen et al., 1999 Microbiol. Ecol. Health Dis. 11:3-12) por medio de conteo manual debido a las reducidas valoraciones celulares esperadas.

Detección de la Producción de H2

5 Se llevó a cabo la detección de hidrógeno con un cromatógrafo de gases HP Serie 6900 II que tenía una columna capilar 5A-tamiz molecular HP-19091P-MS4 (30 m x 0,32 mm x 12 m de espesor de película) con un detector de conductividad térmica. Como gas portador, se usó N2 con un flujo de 1 ml/min. La temperatura del horno de columna fue de 40 ºC, la temperatura del detector fue de 205 ºC. Se ajustó la división en 1:10 y el volumen de inyección fue

10 de 0,5 ml.

Determinación de fructosa

Se determinó el contenido de fructosa con el Estuche de Ensayo de Fructano (Megazyme Cat. Nº: K-FRUC) bajo 15 ajuste para proporcionar volúmenes de muestra. El contenido de fructosa es una medición de la inulina residual en las muestras de fermentación ya que se la inulina se convierte en fructosa.

16. Preparaciones de alimentos

20 a) Aliño para Ensaladas de Bajo Contenido de Grasa Recetas

Tipo de inulina usada: Alcachofa, DPw 56 medio --(control) Fibra de Cargill Oliggo LC/HT Fibra de Cargill Oliggo F97 Orafti Raftlline HP

Ingredientes1): Peso (g) Peso (g) Peso (g) Peso (g) Peso (g)

Fase de aceite:

Aceite de soja: 92,45 302,45 92,45 92,45 92,45

Huevos, enteros, pasteurizados: 23,00 23,00 23,00 23,00 23,00

Yemas de huevo, pasteurizadas: 18,00 18,00 18,00 18,00 18,00

Fase Acuosa:

Leche desnatada, sintética, de bajo contenido graso: 89,45 89,45 89,45 89,45 89,45

Agua: 190,45 40,45 190,45 190,45 190,45

Vinagre, blanco destilado: 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00

Perejil, escamas enteras, deshidratado: 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

Sorbato de potasio: 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

Mezcla A seca

Sal: 3,73 3,75 3,75 3,75 3,75

Harina de Mostaza: 1,50 1,50 1,50 1,50 1,50

Mezcla B seca

Inulina: 60,00 -- 60,00 60,00 60,00

Azúcar, granulado: 8,00 8,00 8,00 8,00 8,00

Sal: 2,25 2,25 2,25 2,25 2,25

Pimienta negra, media: 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

Polvo de ajo: 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

E06724397

26-03-2015

Polvo de cebolla: 0,50 0,50 0,50 0,50 0,50

Goma Xantán: 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05

1) Suministradores (todos los nombres de suministradores y nombres de producto son marcas registradas): Aceite de Soja de AC Humko. Huevos enteros y yemas de huevo (10 % de sal) de Sysco Vinagre de Fleischmenn´s (20 % de acidez) Escamas de perejil entero y pimienta negra de McCornick Sorbato de potasio de ADM Sal de Morton Harina de mostaza de French´s (82841) Azúcar granulado de C&H Polvo de ajo y polvo de cebolla de ConAgra/Gilroy Goma xantán de KelCo (Keltrol 521)

Preparación:

1. Disolver el sorbato de potasio en agua

: 5 2. Añadir la mezcla B bajo cizalladura

3.: Añadir vinagre seguido de leche desnatada bajo cizalladura

4.: Añadir yemas de huevo y huevo entero

5.: Añadir la mezcla A seca bajo cizalladura

6.: Añadir lentamente mezcla de aceite bajo cizalladura

: 10 7. Envolver las escamas de perejil al tiempo que se mezcla a baja velocidad o a mano.

8. Mantener refrigerado

b) Pan Blanco

15 Recetas

Ingredientes1): Peso (g) Peso (g) Peso (g) Peso (g) Peso (g)

Harina de pan, 12,6 % de proteína: 357,20 391,80 357,20 357,20 357,20

Agua: 300,30 300,30 300,30 300,30 300,30

Harina de repostería, 9,5 % de proteína: 135,80 148,90 135,80 135,80 135,80

Grasa comestible, hidrogenada: 48,40 48,40 48,40 48,40 48,40

Azúcar, granulado: 48,40 48,40 48,40 48,40 48,40

Inulina: 47,70 -- 47,70 47,70 47,70

Azúcar invert: 29,80 29,80 29,80 29,80 29,80

Leche seca sin grasa, Nth Inst Bulk: 14,90 14,90 14,90 14,90 14,90

Levadura, instantánea: 8,60 8,60 8,60 8,60 8,60

Sal: 6,00 6,00 6,00 6,00 6,00

Monoglicérido Destilado: 1,70 1,70 1,70 1,70 1,70

Emulsionante: 1,10 1,10 1,10 1,10 1,10

Enzima Repostería: 0,10 0,10 0,10 0,10 0,10

E06724397

26-03-2015

(continuación)

1) Suministradores (todos los nombres de suministradores y nombres de producto son marcas registradas): Harina de pan y harina de repostería de General Mills (Superlative #53521; Superlative # 58431) Grasa comestibles de Loders Croaklaar (321) Azúcar granulado de C&H Azúcar Invert de LSI (Nulomoline) Leche seca sin materia grasa de Kerry (I1532) Levadura instantánea de Fleischmann´s (2139) Sal (Tabla) de Morton Monoglicérido destilado (Domodan PH 300 K-A), Emulsionante (Panodan Datem 205 K) y Enzima de Reposterías (Grindamy Max-Life U4) de Danisco

Preparación

1. Pesar todos los ingredientes secos excepto la sal en un recipiente KitchenAid.

: 5 2. Añadir azúcar Invert, grasa comestible y agua y mezclar durante 1 minuto a velocidad de "agitación".

3.: Añadir la sal y continuar la mezcla durante 1 minuto a velocidad de "agitación" y 6 minutos a velocidad "1".

4.: Cerrar de forma estanca durante 1,5 horas a 29 ºC en un recipiente tapado.

5.: Empujar hacia abajo la masa y conformar para dar lugar rebanadas de pan de molde y colocar el pan de molde con grasa.

: 10 6. Dejar cerrado hasta alcanzar el doble de tamaño en aproximadamente 1,5 horas.

7.: Cocer a 200 ºC en un horno de convección durante 30 minutos, hasta obtener un ligero color dorado y que la temperatura interna sea de 96 ºC -100 ºC.

8.: Rotar la cazoleta una vez durante la cocción.

9. Enfriar sobre una rejilla durante 5 minutos, retirar la cazoleta de pan de molde y enfriar a temperatura 15 ambiente.

Ejemplo 1

Caracterización de la inulina procedente de raíces de alcachofa

20

1. Cultivo de plantas de alcachofa

Se cultivaron plantas de alcachofa de la variedad Nun9444 (también denominada N9444) en las proximidades de Valencia, España. Se sembraron las semillas en Junio en cajas de plantas con 104 huecos (8 x 13 orificios, 4 x 4 25 cm) en un invernadero de malla. Se cultivaron las plantas en cajas de plantas durante seis semanas. Se plantaron en una parcela a una densidad de 10 000 plantas/hectárea a principios de Agosto. Se recolectaron todas las plantas en Julio del año siguiente. Se separaron las raíces de la parte aérea y se limpió el suelo adherido con agua (a presión) y de forma adicional a mano. Se secaron las raíces en un sustrato fijo a la sombra durante 3 días. A continuación, se transportaron las raíces sin enfriamiento alguno desde España a Alemania. Se almacenaron las

30 raíces a -80 ºC hasta la extracción de la inulina.

2. Preparación de inulina a partir de raíces de alcachofa

Para la preparación de inulina, se descongelaron raíces de alcachofa de la variedad Madrigal (antiguamente Nun

35 9444) a temperatura ambiente y se cortaron en trozos. Se extrajo la inulina y se purificó como se describe en el método de "Purificación de inulina y fraccionamiento" descrito anteriormente. Se combinó la inulina purificada a partir de una pluralidad de preparaciones para proporcionar una muestra.

3. Determinación de la pureza de la inulina preparada

40 Se determinó la pureza de la inulina de alcachofa preparada por medio de la determinación de los contenidos de agua y fructano del material seco por congelación. Se determinó un contenido de agua de un 5,4 % para la inulina de alcachofa (véase el método de "Determinación del contenido de agua").

45 Para determinar el contenido de fructano/inulina, se incubaron 20 mg de alcachofa en 2 ml de agua destilada dos veces con agitación en un bloque de calentamiento a 95 ºC durante una hora. Se determinó el contenido de fructano/inulina por un lado (1) con el estuche de "Procedimiento de Ensayo de Fructano" (véase método 2.1) y (2) por medio de hidrólisis de la inulina usando exo-inulinasa y posterior Determinación enzimática del contenido de glucosa y fructosa liberadas (véase método 2.2. Se diluyeron las muestras 1:5 con agua destilada dos veces para

50 (1). Se determinó la pureza basada en materia seca (DM) a partir del contenido de fructano y el contenido de agua. Pureza = contenido de fructano x 100/(100 -contenido de agua).

imagen10

E06724397

26-03-2015

4a Determinación del peso molecular con hidrólisis de ácido percloro acético (PCA) Tabla 2a

DPn: 1. medición 2. medición

Inulina de alcachofa: 51 48

Raftilne HP: 27 -

Inulina de dalia: - 35

1. medición: 4,5 % de concentración final de inulina, 0,5 % de concentración final de TCA, 24 h, 56 ºC 2. medición: 2,5 % de concentración final de inulina, 9 % de concentración final de TCA, 4b, 37 ºC

5 5. Resultados de la determinación de glucosa, fructosa y sacarosa

Para determinar la proporción de glucosa, fructosa y sacarosa en la inulina de alcachofa purificada, se prepararon disoluciones acuosas de inulina de concentraciones 1 % y 2 % y se incubaron a 95 ºC durante una hora. Esto vino seguido de determinación fotométrica de los azúcares como se describe en el método 3 ("determinación de azúcar").

10 Como resulta evidente a partir de la Tabla 3, la fructosa se puede detectar en la inulina de alcachofa purificada únicamente con un contenido de 0,1 %. No se detectaron glucosa y sacarosa en las condiciones descritas con el método de detección fotométrico.

Material: Glucosa (g/100 g de polvo de inulina) Fructosa (g/100 g de polvo de inulina) Sacarosa (g/100 g de polvo de inulina)

Inulina de alcachofa: No detectable 0,1 No detectable

Tabla 3: Contenido de glucosa, fructosa y sacarosa en inulina de alcachofa purificada

15

6. Determinación del contenido en porcentaje de oligofructanos con una longitud de cadena de DP = 3 a DP = 10 en la Inulina total por medio de HPAEC-PAD

Para calcular el contenido en porcentaje de oligofructanos con una longitud de cadena de DP = 3 a DP = 10 en la

20 inulina total, se prepararon disoluciones acuosas de 2 % (peso/volumen) de la inulina de alcachofa purificada y se separaron por medio de HPAEC-PAD (método 5), y se calcularon las proporciones de oligofructanos por medio del método 6. Los valores resultantes de esto son los siguientes.

Oligómero de inulina: Contenido (g/100 g de polvo)

DP3: 0,007

DP4: 0,016

DP5: 0,012

DP6: 0,013

DP7: 0,024

DP8: 0,029

DP9: 0,044

DP10: 0,072

Total: 0,217

25 Ejemplo 2

Caracterización de las pastas de inulina

1. Determinación de la estabilidad de las pastas de inulina

30 Los análisis de estabilidad de las pastas de inulina (procedimiento: véase métodos) mostraron que el comportamiento de estabilidad de la inulina de alcachofa se ve alterado en comparación con la procedente de achicoria (Raftiline HP) y dalia (véase la Tabla 4). A las velocidades de cizalladura usadas en la presente memoria, la inulina de alcachofa mostró la estabilidad más grande con más de un 90 % del valor inicial. El análisis de la

35 estabilidad frente a la viscosidad de las pastas de inulina en un medio ácido (estabilidad frente a ácidos) mostró de manera adicional que la inulina de alcachofa muestra el cambio más pequeño tras almacenamiento durante 2 semanas a partir del valor inicial tras 24 horas, y la viscosidad aumentó únicamente un 6,7 %. Al contrario, la viscosidad de la pasta de inulina de dalia aumentó en medio ácido en más de un 15 % y la de la Raftiline HP en más de un 32 %. Este espesamiento posterior resulta no deseado en muchas aplicaciones del sector alimentario. La

40 temperatura de fusión de las pastas de inulina de alcachofa fue de 73 ºC, que es más elevado que la de las sustancias de comparación, es decir, 62,3 ºC para Raftiline HP (de Orafti, lote: HPBNO3DNO3) y 65,5 ºC para inulina de dalia (de Sigma, número de artículo 1-3754, lote: 75H7065). Una elevada estabilidad térmica de las pastas de inulina es una ventaja muy grande en muchos procesos térmicos del sector alimentario.

45

imagen11

imagen12

E06724397

26-03-2015

La tabla muestra que después de 24 horas de fermentación hubo más inulina residual en la muestra de la invención (inulina de alcachofa, DPw medio 58) que en la muestra con Raftiline HP. De este modo, la inulina de alcachofa con un DP de 58 experimenta fermentación por parte de las bacterias fecales de manera más lenta que Raftiline HP comercial. Cabría esperar una inulina de cadena muy larga fermentada más lentamente, como la inulina de la

5 invención, para ejercer efectos metabólicos y prebióticos en las partes más distales del colon, en comparación con las inulinas comerciales. La fermentación en el colon distal resulta beneficiosa, ya que muchas enfermedades intestinales (por ejemplo, la colitis ulcerosa, enfermedad de divertículos) se desarrollan principalmente en esa zona.

b) Efectos prebióticos

10 La siguiente tabla muestra el aumento del número de Lactobacilos (Lab) tras 24 horas provocados por fermentación, corregido frente a una muestra de blanco (sin inulina) en porcentaje, y la proporción en número de Lactobacilos con respecto a Eubacterias (Eub) tras 24 horas de fermentación (valores medios de preparaciones de fermentación independientes para cada uno de los sustratos, n = 10).

15

Tabla 11

Muestra: Aumento de lactobacilos (%) Lab/Eub

Raftiline HP: 81 0,62

Inulina de alcachofa lote A: 119 0,87

Inulina de alcachofa lote B: 100 0,81

La inulina de alcachofa de la invención estimuló los números de Lactobacilos a niveles más elevados que Raftiline HPl. El efecto superior de inulina de alcachofa frente a Raftilne HP con respecto a la estimulación de Lactobacilos,

20 se vuelve más coherente si se considera la proporción de Lactobacilos/Eubacterias, que es significativamente más elevada con la inulina de la invención. Este valor es incluso más apropiado para expresar el efecto simulador específico sobre los Lactobacilos deseados.

Ejemplo 5

25

Aplicaciones en alimentos

a) Aderezo para ensaladas de bajo contenido en grasa

30 Tabla 12

Inulina (Fuente): Inulina de acuerdo con la invención procedente deAlcachofa -(control) FibraTM de Cargill OliggoLC/HT (Achicoria) FibraTM de Cargill OliggoF97 (Achicoria) Orafd Raftlline HP (Achicoria)

DPw media: 56 > 20 70 % es < 10 25

Mono & Disacáridos: < 0,5 % 1,0 % 3,0 %

Contenido de Humedad: 5,40 % 4,00 % 5,00 % 3,00 %

Atributos Organolépticos:

Aspecto: Ligeramente más espesoque el control;adhesión similar Ranch típico; cremoso, color blanquecino; permanece en la ensalada Ligeramente más fino que elcontrol; adhesión similar Mucho más fino que elcontrol; no se adhiere a la ensalada Más espeso que el control;no colable

Aroma: Similar al control Típico Similar al control Similar al control Similar al control

Textura: n/a* Completamente graso,sensación cremosa en boca Sensación en boca fina, ausencia de plenitud de contenido graso Sensación en boca muy fina Sensación en boca espesa,contiene plenitud de contenido graso

Aceptación frente al Control: Aceptable en cuanto a aspecto Aceptable en cuanto a aspecto Inaceptable Inaceptable

E06724397

26-03-2015

Formación de viscosidad:

Como se observa a partir de la tabla anterior, el aderezo con inulina de la invención únicamente fue ligeramente más espeso que el Control pero todavía suave y colable. Se comportó mejor que los aderezos de inulinas de los ejemplos

5 comparativos en cuanto a consistencia visual, formando un aderezo típico de Ranch suave, espeso y colable. El aderezo de Inulina Cargill Oliggo-FiberTM LC/HT fue el más próximo en cuanto a consistencia a la inulina de la invención y al control, pero tuvo un consistencia ligeramente más fina. Orati Raftiline HP mostró una consistencia mucho más espesa, más similar a una crema de queso y el aderezo con Cargil Oliggo-FiberTM F-97 fue mucho más fino que el Control y se separó tras almacenamiento durante la noche.

10

Sustitución de Grasa & Emulsionado:

El aderezo con inulina de la invención se comportó de forma comparable a Cargill Oliggo-FiberTM LC/HT y Orafti Raftiline HP en cuanto a capacidad de emulsionado y de forma superior al aderezo con Cargil Oliggo-FiberTM F-97

15 que se separó tras almacenamiento durante la noche.

b) Pan Blanco

Tabla 13

Inulina (Fuente): Inulina de acuerdo con la invención procedente deAlcachofa -(control) FibraTM de Cargill OliggoLC/HT(Achicoria) FibraTM de Cargill OliggoF97 (Achicoria) Orafd Raftlline HP (Achicoria)

DPw media: 56 > 20 70 % es < 10 25

Mono & Disacáridos: < 0,5 % 1,0 % 3,0 %

Contenido de Humedad: 3,40 % 5,00 % 3,00 %

Atributos Organolépticos:

Aspecto: Similar a control, miga más uniforme, ligeramentemás denso Pan típico; buen oscurecimiento y crecimiento,formación de miga irregular Similar al control Sin crecimiento, migadesmoronable Similar al control, grupos más gruesos

Aceptación frente al Control: Aspecto aceptable Aceptable Aceptable Aceptable

Especificaciones Cuantitativas (pancocido):

Contenido de Humedad: 32,34 % 33,60 % 31,98 % 31,85 % 32,93 %

Contenido de Grasas: 6,79 % 6,57 % 6,68 % 6,87 % 6,51 %

Actividad de Agua: 0,910 0,890 0,907 0,906 0,898

Estructura de Miga (visual): 0,5-2,0 mm 0,5-3,0 mm 1,0-2,0 mm 0,5-2,0 mm 0,5-2,0 mm

Facilidad de uso:

Manipulación: Pulverulento Ligera forma de polvo Ligera forma de polvo Ligera forma de polvo

Mezcla: Sin problema Sin problema Sin problema Sin problema

Solubilidad/Dispersión: Masa ligada Masa húmeda pero suave Batido muy húmedo Masa húmeda pero suave

Cocción: Sin problema Sin crecimiento

20 La inulina de la invención ligó más agua y formó una masa más firme que el control y las inulinas competitivas. Por tanto, la masa que resulta de la inulina de la invención tuvo una capacidad de unión más elevada dando como resultado una masa más compacta y firme con miga más uniforme.

25 La masa con la inulina de la invención experimentó mejor cocción con buena altura y buen color frente al control. La masa de Cargill Oliggo-FiberTM LC/HT y el pan fueron similares al Control. La masa de Orafti Raftiline HP fue similar al Control, no obstante el pan cocido fue más basto pero con miga más uniforme. El Cargil Oliggo-FiberTM F

E06724397

26-03-2015

97 no tuvo propiedades de unión suficientes dando como resultado una masa que no creció o experimentó cocción en buenas condiciones.

La inulina de la invención proporcionó el aspecto de miga más uniforme y una textura más densa. El Control y Cargill 5 Oliggo-FiberTM LC/HT tuvieron un aspecto de miga no uniforme, la masa de Orafti Rafftiline HP tuvo un aspecto de miga basto y Cargill Oliggo-FiberTM F-97 tuvo un aspecto de miga desmoronable.

Como resultado de ello, la inulina de la invención resultó preferida con respecto a las inulinas competitivas en cuanto a aspecto y generación de miga.

10

15

Claims

imagen1