ES2533185T3

ES2533185T3 - Identificación de linfocitos T reguladores mediante el regulador del gen global SatB1

Info

Publication number: ES2533185T3
Application number: ES12166847.9T
Authority: ES
Inventors: Joachim Ludwig Schultze; Marc Daniel Beyer; Noel Warner; Robert Balderas
Original assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn; Becton Dickinson and Co
Current assignee: Rheinische Friedrich Wilhelms Universitaet Bonn; Becton Dickinson and Co
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2010-04-06
Publication date: 2015-04-08
Anticipated expiration: 2030-04-06
Also published as: US20120171701A1; EP2503334A2; WO2010115863A1; EP2503334A3; EP2503334B1; EP2414832A1

Abstract

Un procedimiento de detección de linfocitos T reguladores inestables en una población de linfocitos T reguladores que tiene el potencial de conversión en funcionalidad de linfocitos T efectores, procedimiento que comprende detectar células con niveles elevados de expresión de proteínas SATB1 en la población de linfocitos T.

Description

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(derecha) después de 5 días (n=4). d: Evaluación por CBA de la secreción de citocinas IL6 y IFN- (n=7, media +/-DE).

Fig. 3: SATB1 se desregula in vivo en linfocitos Treg deficientes en FOXP3 a partir de ratones DEREG. a: Análisis de expresión de ARNm de SATB1 (media +/-DE; * p< 0,05) en Tconv y Treg derivados de ratones DEREG macho. Se muestra un representante de dos experimentos independientes. b: Tinción intracelular para SATB1 en un experimento representativo en Treg y Tconv de ratones DEREG. c: Tinción inmunofluorescente de timocitos para la expresión de proteínas SATB1 (rojo) en Treg GFP+ (verde) contrateñidos con DAPI (azul) y CD4 (magenta) de ratones DEREG macho y DEREG deficientes en FOXP3 (DEREG x scurfy) como se ha evaluado por tinción cuádruple. d: Expresión de ARNm de SATB1 (media +/-DE; * p< 0,05) en Tconv y Treg derivados de ratones DEREG x scurfy machos deficientes en FOXP3 evaluado por qRT-PCR. Se muestra un representante de dos experimentos independientes. e: Análisis de citometría de flujo de la expresión de proteínas SATB1 intracelulares en Treg GFP+ suficientes para FOXP3 (FOXP3+, izquierda) y deficientes (FOXP3-, derecha) de ratones DEREG hembra heterocigóticos para la mutación scurfy. f: Tinción inmunofluorescente para la expresión de proteínas SATB1 (rojo) y FOXP3 (verde) en Treg GFP+ clasificados de tejido de timo de ratones DEREG hembra heterocigóticos para la mutación scurfy contrateñidos con DAPI (azul).

Fig. 4: Supresión directa de la transcripción de ARNm de SATB1 por FOXP3. a: Representación de la región genómica de SATB1 genómica humana y el sitio de unión de FOXP3 conservado. b: Ensayo de desplazamiento por electromovilidad (EMSA) que evalúa la unión de FOXP3 a la región de SATB1 genómica (intrón 2). Extractos nucleares de Treg naturales humanos expandidos; oligo de SATB1: nucleótido específico para el sitio de unión a FOXP3 en la región genómica de SATB1; oligo de FKH: nucleótido que contiene el motivo forkhead general; oligo de mSATB1: nucleótido mutado para el sitio de unión de FOXP3 en la región de SATB1 genómica. c: Unión de FOXP3 a la región de SATB1 genómica en el intrón 2 evaluado por ChIP-qPCR. Se realizó PCR usando un conjunto de cebadores correspondiente a la región del intrón 2 de SATB1 y el anticuerpo para FOXP3 o IgG de control precipitó cromatina aislada de Treg naturales humanos expandidos. Se usó el sitio del promotor de IL7R como positivo, la región del intrón 4 de IL7R como control negativo. Aquí se muestra un experimento representativo de 2. d: Se evaluó la actividad de luciferasa por análisis luminométrico después de la transfección de una construcción indicadora que contiene el posible sitio de unión de FOXP3 en la región genómica de SATB1 en el intrón 2 o con un motivo mutado en células HEK293. Se evaluó la unión de FOXP3 en comparación entre células transfectadas con un vector de control o que expresa FOXP3 (media +/-DE; * p<0,05) en comparación con el motivo mutado. Se muestra un representante de tres experimentos independientes. e-g: Treg naturales humanos purificados por MACS tanto se transfectaron con un ARNip de control negativo como ARNip específico de FOXP3 y se evaluó 48 h después de la inactivación. e: Expresión de ARNm de SATB1 (media +/-DE; n=6, * p<0,05) en Treg naturales humanos primarios suficientes en FOXP3 (ARNip de control) y deficientes (ARNip de FOXP3) evaluados por qRT-PCR. f: Análisis de expresión de ARNm de IL-5 y IFN- (n=4, media +/-DE) en Treg naturales humanos primarios suficientes en FOXP3 (ARNip de control) y deficientes (ARNip de FOXP3) evaluados por qRT-PCR. g: Evaluación por CBA de la secreción de citocinas IL-4 y IFN- (triplicados, media +/-DE) de Treg naturales humanos primarios suficientes en FOXP3 (ARNip de control) y deficientes (ARNip de FOXP3) (n=4). h: Evaluación de la expresión de ARNm de IL-5 y IFN- (media +/-DE) en Treg naturales humanos primarios transfectados con ARNip específico de SATB1 después del silenciamiento de FOXP3 48 horas después de la inactivación. i: Análisis de la expresión de FOXP3 (izquierda) y SATB1 (derecha) en linfocitos T CD4+ empobrecidos en Treg convencionales humanos lentiviralmente transfectados con FOPX3 por qRT-PCR (media +/-DE, n=5, * p<0,05).

Fig. 5: Regulación de SATB1 por miARN. a: Expresión media de miR-155 en Treg naturales humanos en comparación con Tconv (media +/-DE; n=7, * p<0,05) como se ha evaluado por qPCR. b: Representación de la región genómica de SATB1 genómica humana y el sitio de unión de miR-155 conservado en 3' UTR (SEC ID Nº: 43). c: Se evaluó la actividad de luciferasa por análisis luminométrico después de la transfección de una construcción indicadora que contiene 3' UTR de SATB1 en células HEK293. La regulación de la expresión de SATB1 por miR-155 se evaluó por transfección de miR-155 en comparación con un miARN de control negativo (media +/-DE; * p<0,05). Se usó la mutación del motivo de miR-155 para demostrar la especificidad. Se muestra un representante de tres experimentos independientes. d: Treg naturales humanos purificados por MACS tanto se transfectaron con un ARNip de miR-122 (control) como ARNip específico de miR-155 y la regulación de la expresión de ARNm de SATB1 se evaluó 48 h después de la inactivación por qRT-PCR (media +/-DE, n=5, * p<0,05). f: Metilación de ADN de la isla CpG predicha en la región genómica de SATB1 en Treg y Tconv.

Fig. 6: Disposición de experimentos en micromatrices realizados para identificar la expresión de SATB1 y la regulación de microARN en Treg. Se evaluaron linfocitos T CD4+ humanos, Tconv CD4+ CD25-, Treg CD4+ CD25+ y Treg expandidos tanto directamente después del aislamiento (reposo), después de hasta 24 h de cultivo celular sin estimulación adicional (reposo), como después de la activación por diversos estímulos (activados). También se incluyen condiciones inhibidoras de linfocitos T CD4+ estimulados en presencia de señales inhibidoras que incluyen IL10, prostaglandina-E2 (PGE2), PD1, CTLA-4 o TGF1. Si no se indica de otro modo, las células se estimularon

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durante 8 h antes de recogerse para el análisis de micromatrices (véase también la Tabla 1).

Fig. 7: Evaluación de miR-155 por análisis de matrices. Expresión de miR-155 media en nTreg humanos en comparación con Tconv como se ha evaluado por análisis de micromatrices de miARN. Se estudiaron al menos 3 donantes y se representa la media +/-DE; * p<0,05.

Fig. 8: Influencia de la activación y estimulación de TGF sobre la secreción de citocinas TH1/TH2 en Tconv y Treq. Se purificaron nTreg CD4+ CD25alto CD127bajo por clasificación por MACS (>96 % de pureza). Se usaron Tconv CD4+ CD25-para la comparación. Se evaluó la influencia de la activación (perlas CD3 + CD28) y estimulación de TGF sobre la liberación de IL6 y IFN- en Tconv (barras grises) y Treg (barras blancas) por matrices de perlas citométricas. Se cultivaron células durante 72 h, se estudiaron 4 donantes y se representa la media +/-DE; * p< 0,05.

Fig. 9: Expresión de FOXP3 y función supresora de linfocitos T reguladores inducidos. Linfocitos T CD45RA+CCR7+CD4+ humanos sin tratamiento previo tanto se dejaron sin estimular (Tno est), se estimularon con perlas de CD3 y CD28 (Testim) como se estimularon en presencia de TGF para convertirse en linfocitos T reguladores inducidos (iTreg). Se estudiaron al menos 3 donantes y se representa la media +/-DE; * p< 0,05. a: Expresión de ARNm de FOXP3 (media +/-DE) como se ha evaluado por qRT-PCR después de 5 d (n= 6). b: Tinción intracelular de FOXP3 en un experimento representativo (izquierda) y expresión de FOXP3 media +/-DE (derecha) después de 5 d (n= 4). c: Análisis de citometría de flujo de la función reguladora de Tno est, Testim e iTreg como se ha evaluado por la inhibición de la proliferación de linfocitos T CD4+ alógenos a una relación 1:1; aquí se muestran la tinción por CFSE de un experimento representativo (izquierda) y la actividad supresora media +/-DE (n=9) de Tno est, Testim e iTreg (derecha). Los linfocitos T CD4+ convencionales en reposo sirvieron de control negativo, los linfocitos T alógenos estimulados con perlas CD3 y CD28 de control positivo.

Fig. 10: Análisis de citometría de flujo de la expresión de SATB1 en ratones DEREG. Se tiñeron Treg, además de Tconv, de ratones DEREG para CD4, FOXP3 y SATB1 y dependieron de la expresión de CD4, GFP y FOXP3. La expresión de SATB1 en linfocitos Treg y Tconv de nodos linfáticos (a) y timo (b) se evaluó por citometría de flujo. Los valores de MFI se presentan en las esquinas izquierda resp. derecha superiores para Treg resp. Tconv.

Fig. 11: Análisis de micromatrices de la expresión de SATB1 en Treg, de ratones ΔFOXP3. Se reanalizaron los datos de micromatrices de Williams, L. M. & Rudensky, A. Y., Nat Immunol 8, 277-284 (2007) para la expresión de SATB1 en linfocitos Treg y Treg inactivados de FOXP3.

Fig. 12: Conservación del sitio de unión de FOXP3 en el sitio SATB1 con respecto a varios mamíferos (SEC ID Nº: 35-42). El alineamiento de secuencias se realizó usando ClustalW.

Fig. 13: Inactivación de FOXP3 en Treg humanos primarios. Se transfectaron Treg humanos tanto con ARNip de control como ARNip específico de FOXP3 y se evaluaron 48 horas después de la inactivación. a: Expresión relativa de ARNm de FOXP3 (media +/-DE, n=6, * p<0,05). b: Análisis representativo de citometría de flujo de la expresión de FOXP3 intracelular 48 horas después de la inactivación de FOXP3 en Treg. c: Expresión de proteínas FOXP3 media (media +/-DE, n=6, * p<0,05). d: Función supresora de Treg tratados con ARNip de control o de FOXP3 evaluada en un ensayo supresor convencional usando linfocitos T alógenos CD4+ como lectura. Se muestra un experimento representativo. e: Capacidad inhibidora media (media +/-DE, n=3, * p<0,05).

Fig. 14: Diferenciación de TH1/TH2 de Treg de ratones DEREG x scurfy. Para evaluar si Treg que expresan SATB1 se diferencian en linfocitos T colaboradores que expresan citocinas TH1/TH2, los presentes inventores aislaron Treg GFP+ y se analizó la producción de ARNm de IL-6 (a) y IFN- (b) por Treg derivados de ratones DEREG o DEREG x scurfy. Se muestra un representante de dos experimentos independientes.

Fig. 15: Tconv transfectados con FOXP3 muestran producción reducida de citocina. Análisis de la expresión de IL-5 (izquierda) e IFN (derecha) en linfocitos T CD4+ empobrecidos en Treg convencionales humanos lentiviralmente transfectados con FOPX3 por qRT-PCR (media +/-DE, n=5, * p<0,05).

Fig. 16: miR-155 se expresa altamente en iTreg humanos. Análisis de la expresión de miR-155 en linfocitos Tno est, Testim y iTreg por PCR específica de miARN.

Fig. 17: miR-155 es una diana en la dirección 3' de FOXP3 en linfocitos T humanos. a: La regulación de miR-155 después de la inactivación de FOXP3 en nTreg humanos se analizó por PCR específica de miARN en comparación con un ARNip de control. b: Después de la transducción lentiviral de Tconv CD4+ con tanto FOXP3 como un vector de control se evaluó la expresión de miR-155 por PCR específica de miARN.

Fig. 18: Metilación de ADN de la isla CpG para el sitio FOXP3 en Treg y Tconv.

Fig. 19: Metilación de histonas en el sitio del gen SATB1. Se reanalizaron los datos publicados por Wei, G. y col.,

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PCR (media +/-DE, n= 5, * p< 0,05).

Fig. 23: La expresión de SATB1 reprograma linfocitos T reguladores en linfocitos T efectores. (a) Análisis de la función supresora de Treg humanos lentiviralmente transfectados con SATB1 (derecha, azul) o vector de control (dsRed, izquierda, rojo) mostrado para un donante representativo (izquierda) y como proliferación media de linfocitos T de CD8+ +/-DE (derecha, n= 3, * p< 0,05). (b) Evaluación por CBA de la secreción de citocinas IL-4 y IFN- de Treg transducidos con SATB1, además de transducidos con control, 4 y 16 h después de la estimulación con perlas recubiertas con CD3/CD28 (media +/-DE, * p<0,05). (c) Genes regulados por incremento y por disminución en Treg transducidos con SATB1. Los datos se normalizaron a la puntuación z. (d) Clasificación de genes inducidos por SATB1 según las comparaciones entre linfocitos Tconv y Treg, linfocitos T no estimulados y sin tratamiento previo estimulados con CD3/CD28 y genes comunes a ambos subconjuntos (Tconv y linfocitos T activados). (e) Patrón de expresión de genes dependientes de SATB1 que contribuyen posiblemente a la reprogramación de Treg en Tefector, clasificados en genes específicos para TH1, TH2 y TH17. Los datos se normalizaron a la puntuación z.

Fig. 24: Regulación de SATB1 por miARN. (a) Metilación de ADN de las islas CpG predichas en la región genómica de SATB1 en Treg y Tconv. (b) Representación de la 3' UTR de SATB1 genómica humana y los sitios de unión de miARN conservados. (c) Expresión de miARN media para miR-155, miR-21, miR-7, miR-34a y miR-18a en Treg naturales humanos en comparación con Tconv (media +/-DE; n= 5, * p< 0,05) como se ha evaluado por qPCR. (d) La correlación de la expresión de miARN con la expresión de ARNm de SATB1 se representa contra las veces de cambio de miARN (Treg frente a Tconv) para todos los 735 miARN evaluados. Se resaltan miR-155, miR-21, miR-7, miR-34a y miR-18a. (e) Unión de FOXP3 al sitio genómico de miR-155, miR-21 y miR-7 en linfocitos Treg naturales humanos como se define por matrices de baldosas ChIP de FOXP3. (f) Se evaluó la actividad de luciferasa por análisis luminométrico después de la transfección de una construcción indicadora que contiene la 3' UTR de SATB1. Se evaluó la regulación de la expresión de SATB1 por miARN por transfección del miARN correspondiente en comparación con un miARN de control (media +/-DE; * p< 0,05). Se usó mutación del motivo de miARN para demostrar la especificidad. Se muestra un representante de tres experimentos independientes. (g) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas SATB1 en Treg clasificadas de ratones con una pérdida de DICER completa específica de Treg (DICERfl/fl) en comparación con Treg DICERwt/fl.

Fig. 25: Disposición de experimentos en micromatrices realizados para identificar la expresión de SATB1 y regulación de microARN en Treg. Se evaluaron linfocitos T CD4+ humanos, Tconv CD4+ CD25-, Treg CD4+ CD25+ y Treg expandidos tanto directamente después del aislamiento (reposo), después de hasta 24 h de cultivo celular sin estimulación adicional (reposo) como después de la activación por diversos estímulos (activados). También se incluyeron condiciones inhibidoras de linfocitos T CD4+ estimulados en presencia de señales inhibidoras que incluyen IL-10, prostaglandina-E2 (PGE2), PD1, CTLA-4 o TGF1. Si no se indica de otro modo, se estimularon células durante 8 h antes de la recogida para el análisis de micromatrices (véase también la Tabla 1).

Figura 26: Evaluación citométrica del flujo de la expresión de proteínas SATB1 en Tconv y Treg estimulados. Análisis de citometría de flujo de la expresión de proteínas SATB1 en Tconv y Treg después de la estimulación con CD3 y IL-2

o CD3 y CD28 durante 3 d ejemplificado para un donante. Se presentan valores de MFI en la esquina derecha superior para Treg y Tconv, respectivamente.

Fig. 27: Análisis de la expresión de SATB1 en Treg murinos. (a) Se tiñeron Treg tímicos, además de Tconv de ratones DEREG, para CD4, CD8, FOXP3 y SATB1 y se seleccionaron para la expresión CD4, CD8, GFP y FOXP3. La expresión de SATB1 en linfocitos Treg y Tconv de tejido de timo se evaluó por citometría de flujo y se muestra para un donante representativo (izquierda) y como expresión de SATB1 media +/-DE (derecha, n=3). La expresión de SATB1 en timocitos positivos individuales CD4+ fue considerablemente superior a en Tconv CD4+ del bazo (datos no mostrados) ya que la expresión de SATB1 es esencial para el desarrollo de timocitos (Alvarez, J. D. y col., Genes Dev 14, 521-535 (2000)), todavía fue detectable una regulación por disminución significativa de SATB1 en Treg en ambos tejidos (datos no mostrados). Se presentan valores de MFI en la esquina superior izquierda o derecha para Treg y Tconv, respectivamente. (b) Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas SATB1 en Treg y Tconv murinos. (c) y (d) Tinción por inmunofluorescencia para la expresión de proteínas SATB1 (rojo) y GFP (verde) en timocitos de ratones DEREG macho contrateñidos con DAPI (azul).

Fig. 28: Evaluación de la unión de FOXP3 al sitio de SATB1. Las KD para la unión de FOXP3 al sitio de SATB1 se definieron por RIA para los motivos de unión de FOXP3 identificados en el sitio genómico de SATB1 en comparación con motivos mutados como se ejemplifica para BS5 y BS6.

Fig. 29: Inactivación de FOXP3 en Treg humanos primarios. Treg humanos tanto se transfectaron con ARNip de control como ARNip específico de FOXP3 y se evaluaron 48 h después de la inactivación. (a) Expresión relativa de ARNm de FOXP3 (media +/-DE, n=6, * p<0,05). (b) Análisis de citometría de flujo representativo de la expresión de FOXP3 intracelular 48 h después de la inactivación de FOXP3 en Treg. (c) Expresión de proteínas FOXP3 media

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(media +/-DE, n= 6, * p< 0,05). (d) Función supresora de Treg tratados con ARNip de control o de FOXP3 evaluada en un ensayo supresor estándar usando linfocitos T alógenos CD4+ como lectura. Se muestra un experimento representativo. (e) Capacidad inhibidora media (media +/-DE, n= 3, * p< 0,05).

Fig. 30: Diferenciación de TH1/TH2 de Treg de ratones DEREG x scurfy. Para evaluar si los Treg que expresan SATB1 se diferencian en linfocitos T colaboradores que expresan citocinas TH1/TH2, los presentes inventores aislaron Treg GFP+ y analizaron (a) la producción de ARNm de IL-6 y (b) de IFN- por Treg derivados de ratones DEREG o DEREG x scurfy. Se muestra un representante de dos experimentos independientes.

Fig. 31: Tconv transfectados con FOXP3 muestran producción reducida de citocinas. Análisis de la expresión de IL-5 (izquierda) y IFN- (derecha) en linfocitos T CD4+ empobrecidos en Treg convencionales humanos lentiviralmente transducidos con FOPX3 por qRT-PCR (media +/-DE, n= 5, * p< 0,05).

Fig. 32: Metilación de ADN de la isla CpG del sitio de FOXP3 en Treg y Tconv.

Fig. 33: Metilación de histonas en el sitio del gen SATB1. Se reanalizaron datos muy recientemente publicados sobre la metilación de histonas del genoma completo (Wei, G. y col., Immunity 30, 155-167, (2009)) para la expresión de mapas de SATB1 y de metilación de histonas en linfocitos T sin tratamiento previo murinos, Tefector (TH1, TH2, resp. TH17), iTreg y nTreg. (a) Expresión de SATB1 como se ha evaluado por análisis de micromatrices.

(b) y (c) Se reanalizaron los datos de secuenciación de ChIP para el sitio de SATB1. La trimetilación de H3K4 está asociada a la activación génica, mientras que la di-y trimetilación de H3K27 están asociadas a la represión génica. Se detectó trimetilación de baja a ausente de H3K27 en los subconjuntos de linfocitos T analizados, mientras que Tefector mostró altos niveles de metilación de H3K4 y Treg menor metilación. (b) Datos acumulados para T sin tratamiento previo, TH1, TH2, TH17, iTreg y nTreg. (c) Análisis de islas de trimetilación (rojo: H3K4, azul: H3K27) mapeadas sobre el sitio de SATB1 genómico.

Fig. 34: Expresión de SATB1 después del silenciamiento mediado por ARNip de miR-155 en Treg. Se transfectaron Treg naturales humanos purificados por MACS con tanto un inhibidor de control o de miR-155 y se evaluó la regulación de la expresión de ARNm de SATB1 48 h después de la inactivación por qRT-PCR (media +/-DE, n= 5,

* p< 0,05) en Treg no estimulados, estimulados con CD3 y IL-2, o CD3 y CD28.

Fig. 35: Expresión de SATB1 en Treg empobrecidos en miARN. Análisis de transferencia Western de la expresión de proteínas SATB1 en Treg clasificados de ratones con un pérdida de DICER completa específica de Treg (DICERfl/fl) en comparación con Treg DICERwt/fl.

Fig. 36: Modelo para el modo de acción de FOXP3. (a), (b) Modelo para la remodelación dependiente de SATB1 mediada por FOXP3 y miARN de los sitios genómicos respectivos para la liberación de citocinas TH1 y TH2 y la inducción de la función supresora de Treg.

Descripción detallada de la invención

Los procedimientos de los aspectos (1) a (5) de la invención identifican los linfocitos T reguladores en la población de células debido a la reducción significativa (o incluso ausencia) de la unión de tales linfocitos T reguladores a ligandos que se unen específicamente a SATB1 en comparación con las células restantes de la población de células. En otras palabras, todas las células (excepto los linfocitos T reguladores) de la población de células muestran la unión con dichos ligandos.

Los “ligandos” según la invención pueden ser anticuerpos o fragmentos de los mismos, que incluyen anticuerpos humanos, murinos, de conejo y cabra, y fragmentos de anticuerpos. Ligandos particularmente adecuados son anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos.

Según la los ligandos/anticuerpos llevan restos funcionales que permiten la detección, que incluyen, pero no se limitan a, marcas (tales como colorantes de fluorescencia y bioluminiscencia y marcas radiactivas), ligandos (tales como ADN, ARN y moléculas de proteínas, moléculas de fusión de Ig, moléculas de ARN bifuncional y moléculas penetrantes en la membrana celular que se acoplan a un ligando), toxinas (tales como ricina, lectina y toxina diftérica).

El procedimiento de la invención es aplicable a cualquier tipo de población de células que incluye, pero no se limita a, cultivo celular, sangre completa y fracciones de sangre completa, y células de cualquier origen que incluyen, pero no se limitan a, células de mamífero tales como células humanas y células murinas.

En una realización particularmente preferida, el procedimiento es adecuado para el control de calidad de poblaciones de linfocitos T, en particular de poblaciones de linfocitos T reguladores, en las que los linfocitos T efectores contaminantes se detectan en la población de linfocitos T reguladores, o una población de linfocitos T efectora, en la que los linfocitos T reguladores contaminantes se detectan en la población de linfocitos T efectores.

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una consecuencia de la inhibición directa por FOXP3. Se requiere la supresión de SATB1 mediada por FOXP3 para prevenir la expresión de citocinas Tefector en Treg murinos y humanos.

Se evaluó el potencial de miR-155 para controlar la expresión de SATB1. miR-155 se ha asociado al desarrollo y diferenciación de linfocitos B y T normales, pero también a tumorigénesis (Rodriguez, A. y col., Science 316:608-611 (2007; Thai, T.H. y col., Science 316:604-608; Eis, P.S. y col., Proc. Natl. Acad. Scie. USA 102:3627-3632 (2005)). Más recientemente se sugirió una diana en la dirección 3' de FOXP3 (Zheng, Y. y col., Nature 445:936-940 (2007); Lu, L.F. y col., Immunity 30:80-91 (2009)). miR-155 se expresa altamente en linfocitos T humanos, particularmente en nTreg (Fig. 5a), pero también en iTreg (Fig. 15) (Cobb, B.S. y col., J. Exp. Med. 203:2519-2527 (2006)). La inactivación mediada por ARNip de FOXP3 en linfocitos Treg humanos produjo una marcada disminución en la expresión de miR-155, mientras que la expresión en exceso de FOXP3 indujo la expresión de miR-155 que corrobora la regulación de miR-155 por FOXP3 (Fig. 16). La unión de sitios de la misma semilla se predijo computacionalmente usando miRBase Targets (Griffiths-Jones, S. y col., Nucleic Acids Res. 36:D154-158 (2008)), miRanda (Betel, D. y col., Nucleic Acids Res. 36:D149-153 (2008)), PicTar (Krek, A. y col., Nat. Genet. 37:495-500 (2005)) y TargetScan (Lewis, B.P. y col., Cell 115:787-798 (2003)) (Fig. 5b). Los presentes inventores fusionaron la 3' UTR de SATB1 con un gen indicador de luciferasa y determinaron la actividad de luciferasa en células 293T transfectadas con miR-155 sintético. La expresión en exceso de miR-155 reprimió significativamente la actividad de luciferasa, mientras que un miARN de control, que carece de un motivo de unión predicho, no tuvo efecto (Fig. 5c). A diferencia, la mutación del motivo de unión de miR-155 produjo una restauración de la actividad de luciferasa (Fig. 5c). Los experimentos de pérdida de función por inhibición mediada por oligonucleótidos antisentido de miR-155 en linfocitos Treg humanos primarios conducen a un aumento significativo en la expresión de ARNm de SATB1 (Fig. 5d). En conjunto, la expresión de SATB1 no solo se reduce a un nivel transcripcional por unión directa de FOXP3 al sitio genómico de SATB1, sino que la reducida expresión se estabiliza adicionalmente por el miR-155 regulado por FOXP3.

Para estudiar la regulación epigenética del sitio de SATB1, se seleccionó una región específica para el análisis de metilación basado en la densidad de CpG que se alinea con los 1600 pares de bases del promotor de SATB1 predicho en la dirección 5' del exón 1. Como control, también se analizó el sitio bien descrito de metilación diferencial en el sitio de FOXP3 (Floess, S. y col., PloS Biol. 5:e38 (2007); Baron, U. y col., Eur. J. Immunol. 37:2378-2389 (2007)) por secuenciación de bisulfito (Fig. 17). Aunque hubo una clara diferencia en la metilación del sitio de FOXP3 entre Treg y Tconv, el sitio de SATB1 se desmetiló similarmente en ambos tipos de células (Fig. 5e). Este hallazgo soporta que la metilación de motivos CpG dentro de un elemento seleccionado del sitio de SATB1 no contribuye a la expresión impedida de SATB1 en linfocitos Treg. Reanalizando un conjunto de datos de la secuenciación de ChIP para la metilación de histonas en subconjuntos de linfocitos T (Wei, G. y col., Immunity 30:155-167 (2009)), la trimetilación de H3 en el residuo de lisina 4 (H3K4me3), que es permisiva para la transcripción génica, fue detectable en iTreg y nTreg y adicionalmente elevada en linfocitos T y Tefector sin tratamiento previo. La trimetilación de H3 en el residuo de lisina 27 (H3K27me3), que se ha asociado al silenciamiento de genes, estuvo ausente en todo el subconjunto de linfocitos T (Fig. 18a, b). Tomados conjuntamente, la ausencia de silenciamiento de la metilación de histonas y de ADN es compatible con la accesibilidad del sitio de SATB1 para la transcripción de genes en Treg.

En conclusión, se estableció la represión transcripcional mediada por FOXP3 y postranscripcional mediada por miR-155 del organizador de cromatina global SATB1 en iTreg y nTreg en el hombre y ratones (Fig. 19 y 20). Estos datos implican que los Treg componen una red de circuitos reguladores continuamente activados que suprimen genes diana importantes, tales como SATB1, requeridos para la diferenciación de Tefector. Un bloqueo activo y continuo de la función de Tefector en lugar de la diferenciación terminal de Treg permite a los linfocitos T un mayor grado de plasticidad. Esto podría ser particularmente interesante en situaciones en las que hay una inducción temporal de linfocitos Treg adaptivos que puede obtener función de Tefector una vez FOXP3 se inactiva de nuevo. Datos recientes referentes a la regulación de factores de transcripción tales como IRF4 (Zheng, Y. y col., Nature (2009)) o la regulación epigenética de factores de transcripción asociados al linaje T (Wei, G. y col., Immunity 30:155-167 (2009)) también están de acuerdo con un modelo de redes reguladoras continuamente activas que moldea la función global de los linfocitos T en la periferia como una alternativa a la diferenciación terminal.

Ejemplo 2: Para identificar circuitos reguladores que participan en la inhibición mediada por FOXP3 de la diferenciación de Tefector, se realizó análisis del transcriptoma completo de linfocitos T FOXP3-CD25-convencionales (Tconv) en reposo o activados humanos y linfocitos T CD25+FOXP3+ reguladores naturales (nTreg) (Fig. 25 y Tabla 1). De los 47 genes que se diferencian específicamente entre Treg y Tconv, la proteína 1 de unión a secuencias ricas en AT especiales (SATB1) (Fig. 21a) estuvo entre los genes que siempre se expresaron a niveles significativamente menores en Treg en comparación con Tconv. La re-evaluación de los datos del transcriptoma de informes previos confirmó la observación de los inventores de que SATB1 era una posible diana de la expresión mediada por FOXP3 (Pfoertner, S. y col., Genome Biol 7, R54 (2006); Zheng, Y. y col., Nature 445, 936-940 (2007); Sugimoto, N. y col., Int Immunol 18, 1197-1209 (2006)). SATB1 es un factor de transcripción y el organizador de cromatina esencial para controlar un gran número de genes que participan en el desarrollo y la activación de linfocitos T (Alvarez, J. D. y col., Genes Dev 14, 521-535 (2000)). SATB1 regula la expresión génica reclutando directamente los factores de modificación de cromatina (Yasui, D. y col., Nature 419, 641

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645 (2002)) y anclando regiones de unión a la matriz a la matriz nuclear (Cai, S. y col., Nat Genet 34, 42-51 (2003)). En clones de TH2 murinos, se ha mostrado que SATB1 sirve de regulador transcripcional global que se ancla específicamente a la topología de bucle del sitio de citocinas TH2, un requisito previo para la inducción de ciertas citocinas TH2 (Cai, S. y col., Nat Genet 38, 1278-1288 (2006)). Como los timocitos deficientes en SATB1 no se desarrollan más allá del estadio positivo doble (Alvarez, J. D. y col. Genes Dev 14, 521-535 (2000); Cai, S. y col., Nat Genet 34, 42-51 (2003)), la función de SATB1 en linfocitos T periféricos, que incluye Treg, es todavía imprecisa. A continuación, los presentes inventores validaron los datos del transcriptoma iniciales en un mayor conjunto de muestras por qRT-PCR (Fig. 21b), transferencia Western (Fig. 21c) y tinción intranuclear (Fig. 21d) y pudieron demostrar claramente la expresión reducida de ARNm y de proteínas de SATB1 en nTreg humanos. Como el aumento en la expresión de SATB1 se asoció previamente a la activación /diferenciación de linfocitos T CD4+ (Lund, R. y col., Eur J Immunol 35, 3307-3319 (2005)), los presentes inventores evaluaron la regulación de SATB1 en Tconv y Treg durante la activación mediante el receptor de linfocitos T (usando mAb para CD3) en presencia de co-estimulación (mAb para CD28) o la citocina interleucina-2. El análisis de citometría de flujo de la expresión de SATB1 estableció una regulación por incremento dependiente de la estimulación de SATB1 en Tconv mientras que Treg en reposo mostraron expresión de SATB1 significativamente menor y ausencia de regulación por incremento dependiente de la estimulación (Fig. 21e y Fig. 26).

Como TGF es un estímulo importante para la inducción de Treg adaptivos o inducidos (iTreg) (Chen, W. y col., J Exp Med 198, 1875-1886 (2003)), los presentes inventores evaluaron la regulación de SATB1 bajo estas condiciones. Se estimularon linfocitos T CD25-CD45RA+ humanos sin tratamiento previo mediante TCR y CD28 con o sin TGF. Los linfocitos T estimulados en presencia de TGF presentaron los distintivos de iTreg, concretamente significativa expresión de ARNm de FOPX3, y proteína, además de función supresora de linfocitos T (datos no mostrados). Como se ha informado previamente, la estimulación de TCR y CD28 (Testim) también pudo inducir la expresión de FOXP3 transitoria y función supresora, sin embargo, esto fue variable y siempre inferior a iTreg. A diferencia, cuando se evalúa la expresión de SATB1, solo se observó expresión significativamente potenciada en Testim, pero no en iTreg o linfocitos T sin tratamiento previo después de 5 días de cultivo (Fig. 21f, g). De acuerdo con esta observación, las citocinas TH1 y TH2 solo se producen en células con expresión de SATB1 significativamente elevada (Fig. 21h). Tomados conjuntamente, la expresión de SATB1 reducida parece ser un distintivo novedoso de tanto iTreg como nTreg en seres humanos.

A continuación, se evaluó la expresión de SATB1 en Treg tímicos murinos en ratones que expresan GFP bajo el promotor de FOXP3 (Lahl, K. y col., J Exp Med 204, 57-63 (2007)) usando qPCR, transferencia Western, citometría de flujo y microscopía confocal. In vivo, la expresión de ARNm y de proteínas de SATB1 fue siempre inferior a Treg (Fig. 21i-k y Fig. 27), sugiriendo regulación conservada de SATB1 en Treg humanos y murinos. Similar a informes previos, los presentes inventores observaron localización nuclear de SATB1 en timocitos FOXP3-que forman una estructura similar a jaula dentro del núcleo (Cai, S. y col., Nat Genet 34, 42-51 (2003)). En Treg FOXP3+ GFP+, la localización y distribución de SATB1 fue comparable; sin embargo, la intensidad de fluorescencia fue siempre menor (Fig. 21j y Fig. 27c, d).

Para esclarecer adicionalmente SATB1 como posible gen diana de FOXP3, los presentes inventores analizaron Treg de ratones DEREG macho que alojan un alelo FOXP3 espontáneamente mutado (DEREG x scurfy). Los Treg clasificados por flujo de estos animales mostraron una expresión de SATB1 significativamente elevada en Treg en comparación con Treg competentes para FOXP3 (Fig. 21i). Estos hallazgos se validaron por la re-evaluación de tres conjuntos de datos del transcriptoma (GSE18387, GSE6681, GSE11775) (Williams, L. M. & Rudensky, A. Y., Nat Immunol 8, 277-284 (2007); Anz, D. y col., J Immunol 184, 939-946; Kuczma, M. y col., J Immunol 183, 3731-3741 (2009)) derivados de ratones con un gen FOXP3 mutado en Treg (datos no mostrados). En general, la pérdida de función de FOXP3 se asoció a elevada expresión de SATB1 en estos sistemas de modelo murino. Para tratar adicionalmente la función del control de FOXP3 sobre la expresión de SATB1 en Treg in vivo, los presentes inventores evaluaron la expresión de SATB1 en los llamados ' Treg exFOXP3 ' introducidos por Bluestone y colaboradores (Zhou, X. y col., Nat Immunol 10, 1000-1007 (2009)). En este modelo murino, pueden identificarse células que han perdido la expresión de FOXP3 durante su periodo de vida y han recuperado función efectora. Cuando se evaluaron estos 'Treg exFOXP3' bajo condiciones en reposo, la expresión de SATB1 fue todavía significativamente menor que en Tconv (datos no mostrados).

El control autónomo de células de SATB1 por FOXP3 se soportó adicionalmente por los hallazgos en ratones DEREG hembra heterocigóticos para el alelo scurfy mutado. Estos ratones alojan tanto Treg con función de FOXP3 normal como Treg con FOXP3 mutada. La evaluación al nivel de células individuales usando citometría de flujo y microscopía confocal reveló de nuevo el aumento de expresión de SATB1 en Treg con FOXP3 mutada, pero no en Treg que alojan FOXP3 normal (Fig. 22j, k).

La correlación inversa entre la expresión de FOXP3 y de SATB1 en linfocitos Treg murinos y humanos sugirió fuertemente que FOXP3 podría actuar directamente de represor transcripcional del sitio de SATB1. Los presentes inventores realizaron matrices de baldosas FOXP3-ChIP de Treg naturales humanos (Fig. 22a), además de predicción por ordenador bioinformática para identificar 8 lados para la validación de qPCR que se localizaron -5kb en la dirección 5' de TSS, además de en el sitio genómico de SATB1 (Fig. 22b). La unión de FOXP3 dentro de la región promotora o sitio genómico de SATB1 en Treg se demostró por la PCR cuantitativa acoplada a ChIP (ChIP-qPCR) (Fig. 22c) y ensayos de

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Claims

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