ES2532848T3 - Uso de secuencias de ácidos nucleicos para el tratamiento de enfermedades neurológicas y psiquiátricas, vectores y composiciones - Google Patents

Abstract

Uso de uno o más vectores de expresión víricos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican una combinación de (i) NPY y galanina, o fragmentos funcionales de los mismos, (ii) NPY y receptor de NPY Y2, o fragmentos funcionales de los mismos, o (iii) NPY y receptor de NPY Y5, o fragmentos funcionales de los mismos, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central.

Description

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Galanina. La galanina es otro neuropéptido distribuido a lo largo del cerebro, principalmente en fibras que surgen de neuronas colinérgicas del septum y noradrenérgicas del locus coeruleus, en las que sirve como un cotransmisor. Estimula el consumo de alimento, y también regula la liberación de insulina y hormona del hipotálamo-suprarrenal. Los efectos son mediados por la unión a tres receptores acoplados a proteína G (GALR1, GALR2, GALR3). Recientemente, se observaron efectos anticonvulsivos potentes después de inyección intrahipocampo de galanina durante el estado epiléptico (SE, status epilepticus) en ratas. En línea con estas observaciones, se ha mostrado que el galnon, un agonista no peptídico de galanina, y el exceso de expresión de la galanina en las fibras noradrenérgicas bajo el promotor de la dopamina-beta-hidroxilasa, aumentan la resistencia de ratones al estado epiléptico (SE), convulsiones por kainato y pentilentetrazol (Mazarati et al. (2001) Neuroscientist 7:506-17). Por consiguiente, los antagonistas de la galanina facilitan las convulsiones en estos modelos. Además, la alteración dirigida del gen de la galanina aumenta la susceptibilidad a las convulsiones en los modelos de SE, kainato y PTZ. Igualmente, los ratones que no expresan el receptor 1 de galanina (GALR1), y las ratas con reducción de la expresión selectiva del receptor 2 de galanina (GALR2) mediante oligonucleótido de sentido contrario, son más susceptibles a las convulsiones en diferentes modelos de epilepsia. Los mecanismos subyacentes en los efectos supresores de convulsiones de la galanina no se entienden bien. Sin embargo, se ha demostrado que la galanina ejerce efecto principalmente inhibidor en la formación del hipocampo, por hiperpolarización directa de las células principales (p. ej., neuronas piramidales CA3) o por inhibición de la liberación de glutamato por activación de los canales de K+ dependientes de ATP presinápticos. Los autores de la invención han demostrado que el exceso de expresión ectópico de la galanina bajo el promotor de PDGF-B en células granulares dentadas y neuronas piramidales del hipocampo y corticales, retrasa la generación de convulsiones durante la activación propagada, un modelo para las convulsiones parciales complejas humanas, que indica que la galanina podría tener valor terapéutico para la epilepsia (Kokaia et al. (2001) PNAS 98:14006-11). No se conocen los mecanismos exactos de este efecto de la galanina en la activación propagada, pero parece que está implicada la inhibición de la liberación de glutamato de los terminales axónicos de células granulares.

Hay cada vez más pruebas de que la galanina como el NPY tiene efectos antidepresivos. Por lo tanto, la administración intraperitoneal del agonista de la galanina Galmic tienen efecto antidepresivo sustancial en la prueba de nado forzado en roedores. La inyección directa de galanina (2-11), un agonista de GALR2, en el núcleo dorsal del rafe producía una menor gravedad de las convulsiones y mayores concentraciones de serotonina en la formación del hipocampo. La serotonina es un neurotransmisor importante en relación con la depresión. Muchos fármacos antidepresivos actúan aumentando las concentraciones de serotonina en las regiones diana del cerebro.

Transferencia de genes

El cerebro es difícil de manipular farmacológicamente debido a la impermeabilidad de la barrera hematoencefálica a muchos fármacos. Además, el cerebro está compuesto de muchas áreas y núcleos con diferente función que pueden responder de forma muy diferente al estímulo farmacológico. Además, células con diferentes funciones (p. ej., células gliales o neuronas) residen muy cerca complicando el asunto todavía más. Consideradas juntas, estas circunstancias demuestran la necesidad de desarrollar nuevos paradigmas terapéuticos innovadores. Una forma de manejar estos problemas sería usar métodos de transferencia de genes para influir localmente en el cerebro o dirigirse a poblaciones celulares específicas.

La transferencia de genes es una de las principales tecnologías usadas en la neurociencia moderna para entender las funciones de las diferentes proteínas. Permite la manipulación y control de la expresión de genes extraños en poblaciones grandes de células neuronales en cultivos disociados, cortes cultivados e in vivo. Esto abre la posibilidad de usar la transferencia de genes directa e indirecta no solo para propósitos experimentales, sino también para medios terapéuticos. Uno de los métodos más eficaces de transferencia de genes a células neuronales es el uso vectores víricos recombinantes. Hay dos procedimientos principales para transferir genes al SNC, procedimiento indirecto (ex vivo) y directo (in vivo). En el suministro de genes ex vivo, el vector se suministra a células inmaduras in vitro y estas células después se trasplantan al cerebro a la zona elegida. Este método tiene la ventaja de que no hay integración de ADN extraño que pueda introducir desregulación del genoma en las células del hospedante. Desde una perspectiva terapéutica, la posibilidad de caracterizar las células transducidas antes de trasplante también ofrece formas de añadir seguridad al procedimiento.

Por otra parte, el suministro de genes directo in vivo, se basa en vectores víricos recombinante que pueden transducir células que no se dividen tales como vectores adenovíricos, vectores víricos adenoasociados, vectores de HSV, y vectores lentivirales (Washbourne y McAllister (2002) Curr. Opin. Neurobiol. 12:566-73). El vector se inyecta directamente en el parénquima cerebral y modifica genéticamente las células hospedantes residentes. Hasta la fecha, la transferencia de genes in vivo es el único medio para modificar genéticamente neuronas postmitóticas en el sitio y esto representa una poderosa herramienta experimental.

Estos vectores víricos se han usado con éxito en muchas aplicaciones diferentes, siendo las más prometedoras vectores de AAV y de lentivirus. Por ejemplo, tanto los vectores de AAV como de lentivirus se han usado para transferir el gen de GDNF in vivo, el cual se ha mostrado que previene la neurotoxicidad en modelos de primates y ratones de la enfermedad de Parkinson. Además, estos vectores se han usado para desarrollar modelos genéticos de las enfermedades de Parkinson y Huntington.

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Transferencia de genes en la epilepsia

Transferencia de genes in vivo. El campo de la transferencia de genes directa en la epilepsia está todavía en estado embrionario. Hay un número limitado de publicaciones que muestran el estudio demostrativo preliminar para el concepto de terapia génica en la epilepsia, hasta ahora. Los datos disponibles se refieren principalmente a neuropéptidos y algunos factores neurotróficos en modelos animales de epilepsia.

La expresión del gen prepro-NPY humano se logró usando el serotipo 2 o una mezcla de serotipos 1 y 2 de vectores de AAV (Richichi et al. (2004) J. Neurosci. 24:3051-9). El gen para el NPY se dirigió bilateralmente a la formación del hipocampo de ratas y el serotipo híbrido (1/2) mostró expresión mejor y uniforme del producto génico a lo largo de toda la formación del hipocampo. Este exceso de expresión del NPY se asoció con al menos 50% de disminución de las convulsiones de la EEG inducidas por kainato y un retraso en la activación propagada de la epileptogénesis.

Las primeras publicaciones sobre la transferencia del gen galanina en modelos de epilepsia experimental aparecieron en 2003 (Haberman et al. (2003) Nature Med. 9:1076-80; Lin et al. (2003) Eur. J. Neurosci. 18:2087-92). Haberman et al. (2003) usaron una construcción de fusión de genes donde la secuencia del gen de la galanina de rata se acoplaba con la secuencia señal secretora de la fibronectina. Puesto que la fibronectina normalmente es secretada por las células, el acoplamiento de su señal secretora con el gen de la galanina inducía la liberación constitutiva de la galanina de las células transducidas. Se usó el vector de AAV regulable desactivado por doxicilina para suministrar esta construcción en el colículo inferior de rata. La intensidad umbral de corriente para la inducción de convulsiones con carrera incontrolada, inducida por estimulación eléctrica del colículo inferior, aumentó significativamente en aquellos animales a los que se transdujo la secuencia de AAV-FIB-Galanina, comparado con las secuencias de AAV-Galanina y AAV-FIB-GFP de control. Además, cuando se añadió doxicilina al agua para beber de los animales el umbral disminuyó a los niveles de control y posteriormente volvió a aumentar cuando se retiró la doxiciclina. Considerados juntos, estos datos apoyan el concepto de que la liberación constitutiva de la galanina expresada en exceso mediada por el vector vírico, puede suprimir la actividad de convulsiones en modelos animales de epilepsia. Sin embargo, esta conclusión debe tomarse con cierta precaución, puesto que el vector de AAV-FIB-Galanina cuando se infundió en la región hiliar de la formación del hipocampo no inhibió las convulsiones inducidas por kainato, aunque protegía a las células hiliares de la degeneración. La falta de efecto en las convulsiones podría ser una zona limitada de la transfección (hilio), o el hecho de que el vector se infundió de forma unilateral. La prueba que apoya que el exceso de expresión bilateral del gen de la galanina usando el vector AAV podría conducir a un efecto inhibidor en las convulsiones inducidas por kainato viene del estudio de Lin et al., 2003 (Lin et al. (2003) Eur. J. Neurosci. 18:2087-92). En este caso, se infundió un vector de AAV-gen de galanina humano (serotipo 2) en la formación de hipocampo bilateralmente y se usaron electrodos implantados intrahipocampo para controlar las convulsiones inducidas por kainato. Este tratamiento dio como resultado la reducción sustancial del número de episodios de convulsiones así como la actividad ictal comparado con animales a los que se infundió vector de galanina vacío. El análisis histológico posterior mostró poca transfección del gen de la galanina en la formación del hipocampo, evaluado por el claro exceso de expresión de inmunorreactividad de tipo galanina, principalmente en las células hiliares y granulares dentadas. Estos datos refuerzan la idea de que, en el futuro, la transferencia del gen del neuropéptido podría ser una alternativa posible a los tratamientos farmacológicos y quirúrgicos de la epilepsia y otras enfermedades cerebrales.

En conclusión, según la presente invención, el suministro y expresión de una combinación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican el NPY y uno o más de sus receptores (Y2, Y5), o NPY y galanina tiene un efecto mucho mejor que el suministro y expresión del NPY solo como en la patente PCT WO 2005/037211 A2 y será más eficaz en el tratamiento de enfermedades como la epilepsia y trastornos psiquiátricos.

Ejemplos

La razón principal para la presente solicitud de patente es el tratamiento de la epilepsia y enfermedad psiquiátrica mediante el reforzamiento de señalización para los ligandos neuropeptídicos NPY y/o galanina en el SNC, por la expresión en exceso de los neuropéptidos y sus correspondientes receptores en diferentes combinaciones al mismo tiempo. Además, este procedimiento también minimizará el riesgo de regulación por disminución de los receptores debido al mayor efecto del ligando neuropeptídico.

Los autores de la invención ahora han producido vectores lentivirales para los genes del NPY, receptores Y2 e Y5. También han adquirido en el comercio vectores de AAV serotipo ½ que expresan el NPY, Y2, y galanina. Transfectarán hipocampo u otras regiones del cerebro de ratón y rata uni o bilateralmente mediante una combinación de estos genes: p. ej., NPY+Y2 o NPY+Y5 o NPY+Y2+Y5 o NPY+galanina.

Los experimentos se llevan a cabo o se han llevado a cabo como sigue:

Ejemplo I: Activación propagada eléctrica tradicional en ratones

Se implantan electrodos de estimulación en ratones adultos en el hipocampo izquierdo y se lleva a cabo la activación propagada de acuerdo con el protocolo tradicional, una estimulación al día. Una vez que se ha completado la activación propagada de los ratones (después de aproximadamente 3-4 semanas), se ensaya el umbral para la inducción de convulsiones generalizadas. Después de la última estimulación de activación propagada, es decir,

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detección del umbral, se infundieron a los ratones combinaciones de vectores víricos (véase antes) en el hipocampo bilateralmente. De 4 a 5 semanas después, se ensaya el umbral para la inducción de convulsiones y, posteriormente, se suministran 5 estimulaciones de activación propagada por el método tradicional. Se analizan la gravedad de las convulsiones, periodo de latencia a las convulsiones conductuales, duración de la postdescarga y duración y número de postdescargas secundarias, y se comparan con los valores antes de transfección. Se usa un grupo de control de ratones con la infusión de vectores víricos que carecen de los genes correspondientes como controles adicionales. Otro grupo de control consiste en una infusión de vector vírico solo para el gen del NPY solo.

Resultados esperados I

Se espera que después de infusión del vector vírico los ratones aumenten el umbral para la inducción de convulsiones (fig. 63), disminuya la duración (fig. 64) y gravedad (fig. 65) de las postdescargas y convulsiones, respectivamente, así como que aumente el periodo de latencia a las convulsiones conductuales (fig. 66). Este efecto será más pronunciado comparado con infusiones de vectores víricos de NPY solo. Además, el grupo de control de ratones que reciben vector vírico que carece de los correspondientes genes no presentará estos cambios.

Ejemplo II: Convulsiones por kainato en ratones

En la siguiente serie de experimentos, estas combinaciones de vectores víricos se ensayan en el modelo de estado epiléptico (SE) inducido por kainato. Los vectores se infunden en el hipocampo uni o bilateralmente y después de 45 semanas, se inyecta kainato (20-40 mg/kg) por vía intraperitoneal y se observa en los ratones las convulsiones motoras, gravedad y duración de las convulsiones, periodo de latencia a las convulsiones y mortalidad. Estos parámetros se comparan con el grupo de control de ratones a los que se infunden vectores víricos de NPY solo o vacíos.

Resultados esperados II

Se espera que los ratones a los que se infundieron vectores víricos de NPY+Y2, NPY+Y5 y NPY+Y2+Y5 presenten un menor número de convulsiones motoras, mayor periodo de latencia de las convulsiones (fig. 67), menor mortalidad (fig. 68) y menor gravedad de las convulsiones comparado con ratones a los que se infundió vector vírico de NPY solo o vacío.

Ejemplo III: Umbrales de postdescarga en ratas sin tratamiento anterior de convulsiones y epilépticas

Ratas macho adultas Sprague Dawley (B&K, Sweden), que pesaban 250 g al inicio del experimento, se anestesiaron con inyección intraperitoneal de ketamina (80 mg/kg)-xilazina (15 mg/kg), y se fijaron en un marco esterotáxico. Antes y después de cirugía se aplicó el analgésico local Marcain de forma local alrededor de la herida. Las ratas se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas con acceso libre a alimento y agua. Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Agencia Sueca del bienestar animal y fueron aprobadas por el Comité ético local de experimentación animal. Se inyectaron bilateralmente los siguientes vectores víricos en el hipocampo dorsal y ventral: 1) rAAV-NPY (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda), serotipo (cápside): ½. El ADNc de prepro-NPY se subclonó en un casete de expresión que consiste en el promotor de NSE de rata, elemento regulador postraduccional de marmota (WPRE), y una señal de poli(A) de la hormona de crecimiento bovina (título: 1,2 x 1012 partículas genómicas/ml) (Richichi et al. (2004) J. Neurosci. 24:3051-9); 2) rAAV-galanina, serotipo 2. El ADNc de galanina de rata se subclonó en un casete de expresión que también contenía la secuencia señal secretora de fibronectina; la expresión del gen se dirigió mediante un promotor de citomegalovirus, (título: 1 x 1012 partículas genómicas/ml) (Haberman et al. (2003) Nature Med. 9:1076-80); 3) combinación de rAAV-NPY + rAAV-galanina como antes; 4) combinación de rAAV-NPY + rAAV-Y2. El vector del receptor Y2 era idéntico a 1) excepto que se subclonó el ADNc para el receptor de NPY Y2 en el casete de expresión en lugar del NPY (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda). 5) Vector de control: vector como en 1), pero sin transgén ("vacío"). Se inyectó un volumen de 2 µl de suspensión de vector vírico en cada posición en 10 min (0,1 µl/30 s) usando una pipeta de vidrio fino, y la pipeta se dejó en el sitio durante 3 min adicionales después de inyección para permitir la extensión del virus y prevenir su reflujo a través del surco de inyección tras la retirada de la pipeta. Las coordenadas para la inyección del vector vírico (desde el bregma, línea media, duramadre) eran: Hipocampo dorsal: AP -3,3, ML ±1,8, DV -2,6 mm; Hipocampo ventral: AP -4,8, ML ±5,2, DV -6,4 y -3,8 mm.

Dos semanas después de la inyección de vector vírico, los animales se anestesiaron como durante la inyección de virus y se implantó un electrodo bipolar de estimulación/registro de acero inoxidable (Plastics One, Roanoke, VA, EE.UU.) de forma estereotáctica en el hipocampo ventral (AP -4,8 mm, ML ±5,2 mm, DV -6,5 mm) y se fijó con cemento dental como se ha descrito previamente (Schlifke et al. (2007) Molecular Therapy). Después de recuperación durante al menos 1 semana, los animales se estimularon eléctricamente (pulsos de ondas cuadradas de 1 ms de duración de 100 Hz suministradas durante 1 segundo) para determinar el umbral para producir postdescargas epileptiformes en el hipocampo. Empezando con 10 µA, la intensidad de la corriente se aumentó en etapas de 10 µA cada 5 min, hasta que se detectó una postdescarga epileptiforme focal de al menos 5 s de duración por registro electroencefalográfico (EEG). Se determinaron las duraciones de las postdescargas primaria y secundaria. El experimentador no conocía la identidad del grupo de los animales individuales cuando producía y evaluaba las postdescargas.

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Posteriormente, los animales se sometieron a un protocolo de activación propagada rápida tradicional que produce una afección epiléptica crónica (Kopp et al. (1999) Mol. Brain Res. 72:17-29; Schlifke et al. (2007) Molecular Therapy). Cuatro semanas después (= 7 semanas después de inyección de vectores víricos), se determinaron el umbral de postdescarga y las duraciones de postdescarga en los animales epilépticos usando los mismos parámetros de estimulación que para la determinación del umbral inicial.

Resultados III

Primero se analizaron las diferencias en el umbral de inducción de postdescarga entre los vectores de AAV-NPY, AAV-galanina y AAV-vacío en animales sin tratamiento anterior de convulsiones. Este análisis mostró que no había diferencia en el umbral de postdescarga entre cualquiera de estos grupos (fig. 69, prueba t). Por lo tanto, estos tres grupos se agruparon en un solo grupo de control y se analizaron frente a los grupos de vectores de combinación: AAV-NPY + AAV-galanina y AAV-NPY + AAV-Y2. Ambos grupos de vectores de combinación mostraron umbrales de postdescarga significativamente mayores comparado con el grupo de control (fig. 70). Estos datos sugerían que en los animales sin tratamiento anterior de convulsiones, una combinación de transgén de NPY con transgén de galanina o transgén del receptor Y2 tenía un efecto de prevención de las convulsiones y disminuía la probabilidad de que se produjeran convulsiones aumentando el umbral para las convulsiones. Se podría argumentar que incluso efectos pequeños en el umbral de inducción de convulsiones tendrá consecuencias notables para amortiguar síndromes epilépticos y episodios de convulsiones.

Los autores de la invención se preguntaron además si dicho efecto de la terapia de combinación de genes tendría un efecto beneficioso incluso en los animales ya hechos epilépticos por activación propagada. Una vez que se llevó a cabo la activación propagada completa de los animales usando el protocolo de activación propagada rápido, se analizó de nuevo el umbral de inducción de convulsiones en estos grupos. De forma similar a lo que se observó en los animales sin tratamiento anterior de convulsiones, el AAV-NPY solo o AAV-galanina solo no diferían significativamente de los vectores vacíos de control en estos animales epilépticos, y por consiguiente, estos grupos se agruparon (fig. 71). En cambio, como en las ratas sin tratamiento anterior de convulsiones, se encontró que en ratas epilépticas, la combinación del transgén de NPY con galanina (AAV-NPY + AAV-galanina) aumentaba significativamente el umbral de postdescarga comparado con el grupo de control (fig. 72). La combinación de NPY+Y2 no se ensayó en animales epilépticos.

Análisis adicionales pusieron de manifiesto que en los animales sin tratamiento anterior de convulsiones, el AAVgalanina no difería significativamente del vector vacío, y, por consiguiente, se agruparon los grupos para el análisis adicional (fig. 73A). Sin embargo, la inyección del vector de AAV-NPY disminuyó significativamente la duración de las postdescargas del hipocampo comparado con el grupo de control (fig. 73B). La combinación del transgén de NPY con el transgén de galanina (grupo de AAV-NPY + AAV-galanina) tenía un efecto inhibidor similar en la duración de la postdescarga al transgén de NPY solo (grupo de AAV-NPY; fig. 73B) y la combinación del transgén de NPY con el transgén de Y2 (grupo de AAV-NPY + AAV-Y2) parecía que tenía el mismo efecto pero no alcanzaba significancia estadística (fig. 73B). Se observó lo mismo en ratas epilépticas (fig. 74) con la combinación de vector vírico de galanina + NPY que mostraba un efecto inhibidor similar en la duración de postdescarga que el vector de NPY solo. Estos datos indicaban que el procedimiento de combinación no tenía ningún efecto beneficioso adicional, comparado con el transgén de NPY solo.

Considerados juntos los resultados de este ejemplo indican que la combinación del transgén de NPY con el transgén de galanina o del receptor de Y2 previene la inducción de convulsiones aumentando el umbral, pero una vez inducidas las convulsiones, el transgén de NPY solo acorta eficazmente la duración de la postdescarga, y la adición además del transgén de galanina o de Y2 no tiene efecto adicional. Sin embargo, puesto que la prevención de la aparición de convulsiones es claramente un objetivo importante en el tratamiento de la epilepsia, la combinación es claramente preferible al procedimiento del transgén de NPY solo, que se había patentado previamente (PCT WO 2005/037211 A2). Estos resultados son bastante inesperados basándose en todo el conocimiento previo en la acción de neuropéptidos en la actividad de convulsiones, y proporciona un buen ejemplo de los efectos beneficiosos del procedimiento de terapia de genes combinada en modelos de epilepsia.

Ejemplo IV: Convulsiones por kainato en ratas

Ratas macho adultas Wistar (B&K, Sweden), que pesan 250 g al principio del experimento, se alojaron en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con acceso libre a alimento y agua. Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Agencia Sueca del bienestar animal y fueron aprobadas por el Comité ético local de experimentación animal. Después de ser anestesiadas como en el ejemplo III y fijadas en un marco estereotáxico, se inyectaron bilateralmente los siguientes vectores víricos en el hipocampo dorsal y ventral: 1) rAAV-NPY como en el ejemplo III; 2) rAAV-Y2 como en el ejemplo III, 3) combinación de rAAV-NPY + rAAV-Y2 como en el ejemplo III, y 4) vector de rAAV vacío como en el ejemplo III. El procedimiento y las coordenadas de inyección eran las mismas que en el ejemplo III.

Después de recuperación durante al menos 3 semanas, se inyectó a las ratas por vía subcutánea en la región del cuello kainato convulsionante que induce estado epiléptico (nº K-0250, Sigma; 10 mg/kg diluido en solución salina isotónica al 0,9%; pH 7,4) (Woldbye et al. (1997), Nature Med. 3:761-4) y los animales se observaron durante 150

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min. El experimentador no conocía la identidad del grupo de los animales individuales cuando inyectaba y evaluaba a las ratas.

Resultados IV

Para evaluar más los efectos de la combinación del transgén de NPY con el transgén del receptor de Y2 en convulsiones, se usó el modelo de inyección subcutánea de kainato. En este modelo, las convulsiones inducidas por kainato llevaron a una mortalidad alta de los animales de control de vector vacío debido a la gravedad de las convulsiones (5 de las 7 ratas). Esto se previno casi completamente en animales con inyecciones intrahipocampo de AAV-NPY + AAV-Y2 (solo 1 de 7). Sin embargo, el transgén de NPY o Y2 solo tenía efecto preventivo similar en la mortalidad de los animales tratados con kainato (0 de 7 o 0 de 6 animales, respectivamente). Como se muestra en la figura 75, las estadísticas de supervivencia (análisis de log-rank) mostraron que la combinación de NPY+Y2 así como el vector de NPY solo y de Y2 solo, tenían un efecto inhibidor significativo en el periodo de latencia a la muerte. Estos datos apoyan los descubrimientos de los autores de la invención del ejemplo III, e indican que una vez que se producen las convulsiones, no parece que el procedimiento de combinación tenga ningún efecto beneficioso adicional comparado con la terapia de un solo gen. Por otra parte, estos datos también sugieren que la combinación del transgén de NPY e Y2 no tiene efecto perjudicial en la supervivencia de los animales después del tratamiento con kainato, y cuando todavía se producen las convulsiones, esta combinación es tan segura como el tratamiento con un solo transgén de NPY.

Ejemplo V

Usando los mismos protocolos que en los ejemplos III y IV, se infundieron bilateralmente las siguientes combinaciones de genes en vectores víricos de AAV, en el hipocampo, corteza piriforme y/o amígdala de roedores: NPY+Y2+Y5+Y1, NPY+Y1+Y5, NPY+Y1, NPY+somatostatina, galanina+somatostatina, NPY+galanina+somatostatina, NPY+Y2+galanina, NPY+Y1+Y2+Y5+galanina, NPY+Y1+Y5+galanina, NPY+Y2+Y5+galanina, NPY+Y2+galanina+somatostatina, NPY+Y2+Y5+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST1+SST2, NPY+Y2+galanina+GALR2+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y1+galanina+GALR2+somatostatina+SST2, somatostatina+SSTR1+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR2+somatostatina+SSTR2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST2+SST4, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST1+SST2+SST4. La infusión del vector vacío y de vectores con un solo gen sirve como grupos de control. Además, también se ensayan combinaciones que implican receptores y6. Aunque se cree que el receptor y6 no es funcional en seres humanos, este receptor podría ser expresado funcionalmente en combinación con otros receptores de NPY. También se ensayan combinaciones que implican otros genes de receptores neuropeptídicos descritos en esta patente antes.

Resultados esperados V

Como se muestra en los ejemplos III y IV con las combinaciones de NPY+galanina y NPY+Y2, se espera que las combinaciones del ejemplo 5 den como resultado un aumento a largo plazo del umbral de postdescarga de mayor magnitud que el logrado con un solo vector, p. ej., NPY AAV. También se espera una reducción de la gravedad de las convulsiones y duraciones de la postdescarga.

Ejemplo VI: Prueba de nado forzado, campo abierto y laberinto elevado en cruz en ratas

Ratas macho adultas Wistar (B&K, Sweden), que pesan 250 g al principio del experimento, se alojan en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, con acceso libre a alimento y agua. Los experimentos se llevan a cabo de acuerdo con las directrices de la Agencia Sueca del bienestar animal y fueron aprobadas por el Comité ético local de experimentación animal. Después de ser anestesiadas como en el ejemplo III y fijadas en un marco estereotáxico, se inyectaron bilateralmente los siguientes vectores víricos en el hipocampo dorsal y central y/o la amígdala: 1) rAAV-NPY como en el ejemplo III; 2) rAAV-Y1 (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda), serotipo (cápside): ½. El ADNc del receptor Y1 se subclona en un casete de expresión que consiste en el promotor de NSE de rata, elemento regulador postraduccional de marmota (WPRE), y una señal de poli(A) de la hormona de crecimiento bovina (título: 1012 partículas genómicas/ml); 3) combinación de rAAV-NPY + rAAV-Y1; 4) rAAV-galanina (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda), serotipo (cápside): ½. El ADNc de la galanina se subclona en un casete de expresión que consiste en el promotor de NSE de rata, elemento regulador postraduccional de marmota (WPRE), y una señal de poli(A) de la hormona de crecimiento bovina (título: 1012 partículas genómicas/ml); 5) combinación de rAAV-NPY + rAAVgalanina; 6) Combinación de rAAV-NPY + rAAV-Y1 + rAAV-galanina; 7) rAAV-somatostatina (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda), serotipo (cápside): ½. El ADNc de la somatostatina se subclona en un casete de expresión que consiste en el promotor de NSE de rata, elemento regulador postraduccional de marmota (WPRE), y una señal de poli(A) de la hormona de crecimiento bovina (título: 1012 partículas genómicas/ml); 8) combinación de rAAV-NPY + rAAV-galanina + rAAV-somatostatina; 9) combinación de rAAV-NPY + rAAV-Y1 + rAAV-galanina + rAAVsomatostatina; 10) rAAV-Y5 (GeneDetect, Auckland, Nueva Zelanda), serotipo (cápside): ½. El ADNc del receptor

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13-03-2015

somatostatina+SST1+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR2+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST2, NPY+Y2+Y5+Y1+galanina+GALR1+GALR2+somatostatina+SST2+SST4. La infusión del vector vacío y de vectores con un solo gen sirve como grupos de control. Además, también se ensayan combinaciones que implican receptores y6. También se ensayan combinaciones que implican otros genes de receptores neuropeptídicos descritos en esta patente antes.

Resultados esperados VII

Se espera que las combinaciones del ejemplo VII den como resultado un efecto de tipo ansiolítico y un efecto de tipo antidepresivo de mayor magnitud que el logrado con un vector solo, p. ej., AAV de NPY.

Además de estos ejemplos, se analiza el exceso de expresión de los correspondientes genes en animales transfectados usando inmunocitoquímica, hibridación in situ para el ARNm, PCR cuantitativa, así como la unión al receptor de NPY tradicional y la unión funcional de [35S]GTPgammaS estimulada por NPY para todos los ligandos y receptores en los cerebros de diferentes grupos de ratones y ratas. Este análisis proporcionará el conocimiento del patrón del exceso de expresión y extensión de diferentes genes y sus productos en el hipocampo de ratón y rata, así como otras regiones. Además, se ensayará cuánto dura la expresión de diferentes genes tomando animales en diferentes puntos de medición después de transfección. Tendrá un interés particular comparar la regulación por disminución de los receptores de NPY en animales transfectados solo con NPY comparado con los animales transfectados con NPY y su receptor.

Estos datos proporcionarán el estudio demostrativo preliminar de la hipótesis de los autores de la invención, de que el uso de vectores víricos para inducir el exceso de expresión de una combinación de genes de ligandos neuropeptídicos y genes de sus correspondientes receptores conduce a una supresión más pronunciada de convulsiones epilépticas comparado con solo un ligando. Puesto que las convulsiones epilépticas representan el máximo de la actividad excitatoria que puede experimentar un cerebro, los resultados de los experimentos de epilepsia deberían ser transferibles a otros trastornos neuropsiquiátricos donde se desea una reducción a largo plazo de la excitación en regiones del cerebro seleccionadas, es decir, trastornos de ansiedad, depresión y TOC.

En las reivindicaciones y en la descripción las secuencias de determinadas Seq Id No corresponden a las secuencias de la lista de secuencias. Con el fin de demostrar esto claramente, la siguiente tabla I muestra la correspondencia.

Tabla I

Secuencia en la descripción y reivindicaciones

Lista de secuencias de Patent In

Seq Id No. 1a Secuencia de ácido nucleico del NPY humano

SEQ ID NO: 1

Seq Id No. 1b Secuencia de ácido nucleico del NPY humano (CDS)

SEQ ID NO: 2

Seq Id No. 2 Secuencia de aminoácidos del NPY humano

SEQ ID NO: 3

Seq. Id. No. 3a Secuencia de ácido nucleico del NPY del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 4

Seq. Id. No. 3b Secuencia de ácido nucleico del NPY del macaco Rhesus (Macaca mulatta) (CDS)

SEQ ID NO: 5

Seq. Id. No. 4 Secuencia de aminoácidos del NPY del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 6

Seq. Id. No. 5a Secuencia de ácido nucleico del NPY del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 7

Seq. Id. No. 5b Secuencia de ácido nucleico del NPY del ratón doméstico (Mus musculus) (CDS)

SEQ ID NO: 8

Seq. Id. No. 6 Secuencia de aminoácidos del NPY del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 9

Seq. Id. No. 7a Secuencia de ácido nucleico del NPY de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 10

Seq. Id. No. 7b Secuencia de ácido nucleico del NPY de la rata parda (Rattus norvegicus) (CDS)

SEQ ID NO: 11

Seq. Id. No. 8 Secuencia de aminoácidos del NPY de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 12

Seq. Id. No. 17a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 humano

SEQ ID NO: 24

Seq. Id. No. 17b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 humano (CDS)

SEQ ID NO: 25

Seq. Id. No. 18 Secuencia de aminoácidos del receptor Y2 humano

SEQ ID NO: 26

Seq. Id. No. 19 Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 27

Seq. Id. No. 20 Secuencia de aminoácidos del receptor Y2 del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 28

Seq. Id. No. 21a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 29

Seq. Id. No. 21b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 del ratón doméstico (Mus musculus) (CDS)

SEQ ID NO: 30

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13-03-2015

Secuencia en la descripción y reivindicaciones

Lista de secuencias de Patent In

Seq. Id. No. 22 Secuencia de aminoácidos del receptor Y2 del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 31

Seq. Id. No. 23a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 32

Seq. Id. No. 23b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y2 de la rata parda (Rattus norvegicus) (CDS)

SEQ ID NO: 33

Seq. Id. No. 24 Secuencia de aminoácidos del receptor Y2 de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 34

Seq. Id. No. 33a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 humano

SEQ ID NO: 46

Seq. Id. No. 33b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 humano (CDS)

SEQ ID NO: 47

Seq. Id. No. 34 Secuencia de aminoácidos del receptor Y5 humano

SEQ ID NO: 48

Seq. Id. No. 35 Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 49

Seq. Id. No. 36 Secuencia de aminoácidos del receptor Y5 del macaco Rhesus (Macaca mulatta)

SEQ ID NO: 50

Seq. Id. No. 37a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 51

Seq. Id. No. 37b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 del ratón doméstico (Mus musculus) (CDS)

SEQ ID NO: 52

Seq. Id. No. 38 Secuencia de aminoácidos del receptor Y5 del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 53

Seq. Id. No. 39a Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 54

Seq. Id. No. 39b Secuencia de ácido nucleico del receptor Y5 de la rata parda (Rattus norvegicus) (CDS)

SEQ ID NO: 55

Seq. Id. No. 40 Secuencia de aminoácidos del receptor Y5 de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 56

Seq. Id. No. 47a Secuencia de ácido nucleico de la galanina humana

SEQ ID NO: 66

Seq. Id. No. 47b Secuencia de ácido nucleico de la galanina humana (CDS)

SEQ ID NO: 67

Seq. Id. No. 48 Secuencia de aminoácidos de la prepro-galanina humana

SEQ ID NO: 68

Seq. Id. No. 49 Secuencia de ácido nucleico de la galanina de macaco (Macaca nemestrina)

SEQ ID NO: 69

Seq. Id. No. 50 Secuencia de aminoácidos de la galanina de macaco (Macaca nemestrina)

SEQ ID NO: 70

Seq. Id. No. 51a Secuencia de ácido nucleico de la galanina del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 71

Seq. Id. No. 51b Secuencia de ácido nucleico de la galanina del ratón doméstico (Mus musculus) (CDS)

SEQ ID NO: 72

Seq. Id. No. 52 Secuencia de aminoácidos de la galanina del ratón doméstico (Mus musculus)

SEQ ID NO: 73

Seq. Id. No. 53a Secuencia de ácido nucleico de la galanina de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 74

Seq. Id. No. 53b Secuencia de ácido nucleico de la galanina de la rata parda (Rattus norvegicus) (CDS)

SEQ ID NO: 75

Seq. Id. No. 54 Secuencia de aminoácidos de la galanina de la rata parda (Rattus norvegicus)

SEQ ID NO: 76

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2

   imagen3