ES2524050T3 - Detection of human papillomavirus (HPV) using nucleic acid probes, microbeads and fluorescence activated cell sorters (FACS) - Google Patents
Detection of human papillomavirus (HPV) using nucleic acid probes, microbeads and fluorescence activated cell sorters (FACS) Download PDFInfo
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- ES2524050T3 ES2524050T3 ES05815710.8T ES05815710T ES2524050T3 ES 2524050 T3 ES2524050 T3 ES 2524050T3 ES 05815710 T ES05815710 T ES 05815710T ES 2524050 T3 ES2524050 T3 ES 2524050T3
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Abstract
Un conjunto de perlas para detectar una cepa del VPH y/o para diferenciar entre dos o más cepas del VPH, en el que el conjunto de perlas comprende una pluralidad de subconjuntos de perlas específicos de una cepa del VPH en el que: (a) las perlas de cada subconjunto son homogéneas con respecto al tamaño; (b) las perlas dentro de cada subconjunto específico de una cepa del VPH se enlazan químicamente a una sonda de captura de ácido nucleico que es capaz de unirse a una región específica de una cepa del VPH de un genoma del VPH; (c) cada subconjunto de perlas es distinguible en virtud de diferencias mensurables en el tamaño de la perla, la presencia o ausencia de una marca ópticamente detectable, y la intensidad de marca ópticamente detectable, en el que la marca ópticamente detectable está provista en la sonda de captura en cada perla; y (d) se mezclan entre sí al menos dos subconjuntos de perlas, con una sonda de captura de ácido nucleico seleccionada de la lista constituida por los SEQ ID NO: 5 a 20, para producir un conjunto de perlas, en el que la identidad del subconjunto y, por lo tanto, la cepa del VPH es identificable por citometría de flujo basándose en el tamaño, la intensidad de marca y la discriminación de secuencias.A set of beads for detecting a strain of HPV and/or for differentiating between two or more strains of HPV, wherein the set of beads comprises a plurality of subsets of beads specific to an HPV strain, wherein: (a) the beads in each subset are homogeneous with respect to size; (b) the beads within each HPV strain-specific subset are chemically linked to a nucleic acid capture probe that is capable of binding to an HPV strain-specific region of an HPV genome; (c) each subset of beads is distinguishable by virtue of measurable differences in bead size, the presence or absence of an optically detectable label, and the intensity of optically detectable label, wherein the optically detectable label is provided on the capture probe on each bead; and (d) at least two bead subsets are mixed with each other, with a nucleic acid capture probe selected from the list consisting of SEQ ID NOs: 5 to 20, to produce a bead set, wherein the identity of the subset and therefore the HPV strain is identifiable by flow cytometry based on size, label intensity and sequence discrimination.
Description
E05815710 E05815710
17-11-2014 11-17-2014
VPH 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 y 68. Las sondas de captura adecuadas son las enumeradas en la figura 9 y representadas en los SEQ ID NO: 5 a 20. HPV 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 and 68. Suitable capture probes are those listed in Figure 9 and represented in the SEQ ID NO: 5 to 20.
La determinación de si se ha producido unión entre un analito y un reactante presente en una perla puede realizarse The determination of whether binding has occurred between an analyte and a reactant present in a bead can be made
5 usando cualquier metodología que permita la diferenciación entre diferentes perlas dentro de un conjunto de perlas. En una realización particularmente preferida, el método de diferenciar entre diferentes perlas dentro de los conjuntos de perlas es la citometría de flujo. 5 using any methodology that allows differentiation between different pearls within a set of pearls. In a particularly preferred embodiment, the method of differentiating between different beads within the sets of beads is flow cytometry.
La presente invención además contempla kits de diagnóstico para su uso de acuerdo con los reactivos y métodos de The present invention further contemplates diagnostic kits for use in accordance with reagents and methods of
10 la presente invención. En particular, la presente invención se extiende a biochips y la miniaturización de los componentes de fase sólida del ensayo para generar reactivos de nanoensayo. En una realización el conjunto de perlas o parte del mismo u otros reactivos se inmovilizan en una fase sólida tal como un biochip. El biochip también puede considerarse como un “biolaboratorio” en el que se realiza al menos parte del ensayo y/o se registran los resultados. 10 the present invention. In particular, the present invention extends to biochips and miniaturization of the solid phase components of the assay to generate nanoassay reagents. In one embodiment the set of beads or part thereof or other reagents are immobilized in a solid phase such as a biochip. The biochip can also be considered as a "biolaboratory" in which at least part of the test is carried out and / or the results are recorded.
15 En la tabla 1 se proporciona una lista de abreviaturas usadas en este documento. 15 Table 1 provides a list of abbreviations used in this document.
Tabla 1 -Abreviaturas Table 1 - Abbreviations
- Abreviatura Abbreviation
- Descripción Description
- FITC FITC
- Fluoresceína Fluorescein
- HEX HEX
- Hexaclorofluoresceína Hexachlorofluorescein
- VIH HIV
- Virus de inmunodeficiencia humana Human immunodeficiency virus
- VPH HPV
- Virus del papiloma humano Human papilloma virus
- JOE JOE
- 7’-dimetoxifluoresceína 7’-dimethoxyfluorescein
- PCR PCR
- Reacción en cadena de la polimerasa Polymerase chain reaction
- PE PE
- Ficoeritrina Phycoerythrin
- PMT PMT
- Tubo fotomultiplicador Photomultiplier tube
- QD QD
- Punto cuántico Quantum dot
- TAMRA TAMRA
- Carboxitetrametilrodamina Carboxitetramethylrodamina
- TET TET
- Tetraclorofluoresceína Tetrachlorofluorescein
- TMR TMR
- Tetrametilrodamina Tetramethyl rhodamine
- VRE VRE
- Enterococos resistentes a la vancomicina Vancomycin Resistant Enterococci
20 En la tabla 2 se muestra un resumen de los identificadores de secuencia usados en este documento. Tabla 2 -Identificadores de secuencia 20 Table 2 shows a summary of the sequence identifiers used in this document. Table 2 - Sequence Identifiers
- Identificador de secuencia Sequence identifier
- Secuencia Sequence
- SEQ ID NO:1 SEQ ID NO: 1
- GP5+ secuencia de nucleótido cebador GP5 + nucleotide sequence primer
- SEQ ID NO:2 SEQ ID NO: 2
- GP6+ secuencia de nucleótido cebador GP6 + primer nucleotide sequence
- SEQ ID NO:3 SEQ ID NO: 3
- secuencia de nucleótido cebador LC1_F primer nucleotide sequence LC1_F
- SEQ ID NO:4 SEQ ID NO: 4
- secuencia de nucleótido cebador LC1_R primer nucleotide sequence LC1_R
- SEQ ID NO:5 SEQ ID NO: 5
- Sonda de captura o cepa 6 del VPH HPV 6 capture or strain probe
- SEQ ID NO:6 SEQ ID NO: 6
- Sonda de captura o cepa 11 del VPH HPV capture or strain probe 11
- SEQ ID NO:7 SEQ ID NO: 7
- Sonda de captura o VPH 31 Capture probe or HPV 31
- SEQ ID NO:8 SEQ ID NO: 8
- Sonda de captura o VPH 33 Capture probe or HPV 33
- SEQ ID NO:9 SEQ ID NO: 9
- Sonda de captura o VPH 35 Capture probe or HPV 35
- SEQ ID NO:10 SEQ ID NO: 10
- Sonda de captura o VPH 39 Capture probe or HPV 39
- SEQ ID NO:11 SEQ ID NO: 11
- Sonda de captura o VPH 45 Capture probe or HPV 45
- SEQ ID NO:12 SEQ ID NO: 12
- Sonda de captura o VPH 51 Capture probe or HPV 51
5 5
E05815710 E05815710
17-11-2014 11-17-2014
- SEQ ID NO:13 SEQ ID NO: 13
- Sonda de captura o VPH 52 Capture probe or HPV 52
- SEQ ID NO:14 SEQ ID NO: 14
- Sonda de captura o VPH 56 Capture probe or HPV 56
- SEQ ID NO:15 SEQ ID NO: 15
- Sonda de captura o VPH 58 Capture probe or HPV 58
- SEQ ID NO:16 SEQ ID NO: 16
- Sonda de captura o VPH 59 Capture probe or HPV 59
- SEQ ID NO:17 SEQ ID NO: 17
- Cebador de sonda 68 VPH sintético 68 HPV synthetic probe primer
- SEQ ID NO:18 SEQ ID NO: 18
- Sonda de captura o VPH 31 Capture probe or HPV 31
- SEQ ID NO:19 SEQ ID NO: 19
- Sonda de captura o VPH 31 Capture probe or HPV 31
- SEQ ID NO:20 SEQ ID NO: 20
- Sonda de captura o VPH 31 Capture probe or HPV 31
- SEQ ID NO:21 SEQ ID NO: 21
- Cebador MLC1_Ac VPH sintético MLC1_Ac synthetic HP primer
- SEQ ID NO:22 SEQ ID NO: 22
- Cebador GP5+ For_Ac VPH sintético GP5 + For_Ac synthetic HP primer
- SEQ ID NO:23 SEQ ID NO: 23
- Cebador MLC1_reg_FP VPH sintético MLC1_reg_FP synthetic HPV primer
- SEQ ID NO:24 SEQ ID NO: 24
- Cebador MLC1_reg_R VPH sintético MLC1_reg_R synthetic HPV primer
- SEQ ID NO:25 SEQ ID NO: 25
- Cebador GP5d+ VPH sintético GP5d + HPV synthetic primer
- SEQ ID NO:26 SEQ ID NO: 26
- Cebador GP6d+ VPH sintético GP6d + HPV synthetic primer
La figura 1 es una representación gráfica que representa un citómetro de flujo típico. Figure 1 is a graphical representation depicting a typical flow cytometer.
5 La figura 2 es una representación gráfica que muestra un esquema del protocolo de extracción de ADN usado en el método de diagnóstico del VPH. 5 Figure 2 is a graphical representation showing a scheme of the DNA extraction protocol used in the HPV diagnostic method.
La figura 3 es una representación gráfica que muestra el protocolo de PCR usado para amplificar el VPH y el ADN Figure 3 is a graphical representation showing the PCR protocol used to amplify HPV and DNA.
10 humano a partir de una muestra de ADN. GP5+ y GP6+ se refieren a cebadores de VPH universales que se unen a secuencias conservadas (Y) en el VPH y generan un amplicón que comprende una región que es variable entre cepas del VPH (X1-16). Los cebadores LC1_F y LC1_R amplifican una región del ADN genómico humano (Z) que sirve como control en las etapas de hibridación posteriores. Los cebadores GP6+ y LCR_R comprenden una marca fluorescente que se incorpora dentro del amplicón generado. 10 human from a DNA sample. GP5 + and GP6 + refer to universal HPV primers that bind to conserved sequences (Y) in HPV and generate an amplicon comprising a region that is variable between strains of HPV (X1-16). Primers LC1_F and LC1_R amplify a region of human genomic DNA (Z) that serves as a control in the subsequent hybridization steps. Primers GP6 + and LCR_R comprise a fluorescent label that is incorporated into the generated amplicon.
15 La figura 4 es una representación gráfica que muestra la diferenciación de microesferas basándose en el tamaño. Se muestran seis grupos que corresponden a microesferas que comprenden diámetros de 3,0 µm, 3,5 µm, 4,1 µm, 5,0 µm, 5,6 µm y 6,8 µm. 15 Figure 4 is a graphical representation showing the differentiation of microspheres based on size. Six groups are shown that correspond to microspheres comprising diameters of 3.0 µm, 3.5 µm, 4.1 µm, 5.0 µm, 5.6 µm and 6.8 µm.
20 La figura 5 es una representación gráfica que muestra la diferenciación de microesferas del mismo tamaño basándose en la intensidad de marca fluorescente. Se pudieron distinguir claramente intensidades relativas de TMR del 0%, 4%,20 % y 100 %. 20 Figure 5 is a graphical representation showing the differentiation of microspheres of the same size based on the intensity of fluorescent label. Relative intensities of TMR of 0%, 4%, 20% and 100% could be clearly distinguished.
La figura 6 es un diagrama esquemático que muestra cada uno de los agentes de unión usados en la matriz. La Figure 6 is a schematic diagram showing each of the bonding agents used in the matrix. The
25 matriz comprende microesferas que comprenden diámetros de 3,0 µm, 3,5 µm, 4,1 µm, 5,0 µm, 5,6 µm y 6,8 µme intensidades de señal de marca fluorescente del 0 %, 4 %, 20 % y 100 %. En el caso de los tamaños de perlas más pequeños, es decir, 3,0 µm, 3,5 µm y 4,1 µm, se usaron intensidades de TMR del 0 % y 100 %; para las microesferas de 5,0 µm se usaron intensidades de TMR del 0 %, 20 % y 100 %; y para las microesferas más grandes, de 5,6 µm y 6,8 µm de diámetro, se usaron todas las intensidades de señal. The matrix comprises microspheres comprising diameters of 3.0 µm, 3.5 µm, 4.1 µm, 5.0 µm, 5.6 µm and 6.8 µm and fluorescent signal intensities of 0%, 4%, 20% and 100%. In the case of smaller pearl sizes, that is, 3.0 µm, 3.5 µm and 4.1 µm, TMR intensities of 0% and 100% were used; TMR intensities of 0%, 20% and 100% were used for the microspheres of 5.0 µm; and for the larger microspheres, 5.6 µm and 6.8 µm in diameter, all signal intensities were used.
30 La figura 7 es una representación gráfica que muestra cómo se distinguieron 17 agentes de unión usando citometría de flujo basándose en el tamaño de partícula y la intensidad de marca fluorescente. Los grupos 1 a 4 corresponden a partículas de 6,8 µm con intensidades de marca del 0 %, 4 %, 20 % y 100 % respectivamente; los grupos 5 a 8 corresponden a partículas de 5,6 µm con intensidades de marca del 0 %, 4 %, 20 % y 100 % respectivamente; los Figure 7 is a graphical representation showing how 17 binding agents were distinguished using flow cytometry based on particle size and fluorescent label intensity. Groups 1 to 4 correspond to 6.8 µm particles with brand intensities of 0%, 4%, 20% and 100% respectively; Groups 5 to 8 correspond to 5.6 µm particles with brand intensities of 0%, 4%, 20% and 100% respectively; the
35 grupos 9 a 11 corresponden a partículas de 5,0 µm con intensidades de marca del 100 %, 20 % y 0 % respectivamente; los grupos 12 y 13 corresponden a partículas de 4,1 µm con intensidades de marca del 100 % y 0 % respectivamente; los grupos 14 y 15 corresponden a partículas de 3,5 µm con intensidades de marca del 100 % y 0 % respectivamente; los grupos 16 y 17 corresponden a partículas de 3,0 µm con intensidades de marca del 0 % y 100 % respectivamente. 35 groups 9 to 11 correspond to particles of 5.0 µm with brand intensities of 100%, 20% and 0% respectively; groups 12 and 13 correspond to particles of 4.1 µm with brand intensities of 100% and 0% respectively; Groups 14 and 15 correspond to particles of 3.5 µm with brand intensities of 100% and 0% respectively; Groups 16 and 17 correspond to 3.0 µm particles with brand intensities of 0% and 100% respectively.
40 La figura 8 es una representación gráfica que muestra a qué matriz de agentes de unión se ha unido un amplicón. Los resultados muestran la unión a la secuencia conservada vírica, Y, la secuencia de control humano Z y la secuencia específica de una cepa vírica X16. Figure 8 is a graphic representation showing to which matrix of binding agents an amplicon has been attached. The results show the binding to the conserved viral sequence, Y, the human control sequence Z and the specific sequence of a viral strain X16.
6 6
E05815710 E05815710
17-11-2014 11-17-2014
epidermodisplasia verruciforme (EV). En internet se dispone de una base de datos de secuencias genómicas del VPH y un árbol filogénico en la Base de datos de secuencias del VPH. verruciform epidermodisplasia (EV). An HPV genomic sequence database and a phylogenic tree are available on the HPV Sequence Database.
Las infecciones por VPH mucoso se clasifican además como latentes (asintomáticas), subclínicas o clínicas. Las Mucosal HPV infections are also classified as latent (asymptomatic), subclinical or clinical. The
5 lesiones clínicas son manifiestamente evidentes, mientras que las infecciones latentes sólo se detectan por pruebas de ADN vírico. Las lesiones subclínicas se identifican por la aplicación de ácido acético al 5 % y la inspección bajo aumento. La mayoría de las infecciones por VPH son latentes; las infecciones clínicamente evidentes normalmente tienen como resultado verrugas en lugar de tumores malignos. 5 clinical lesions are manifestly evident, while latent infections are only detected by viral DNA tests. Subclinical lesions are identified by the application of 5% acetic acid and inspection under increase. Most HPV infections are latent; Clinically evident infections usually result in warts instead of malignant tumors.
10 Los tipos 6 y 11 del VPH se marcan típicamente como de bajo riesgo porque la infección con estos tipos tiene bajo potencial oncogénico y normalmente tiene como resultado la formación de condilomas y lesiones precancerosas de bajo grado. Los tipos 16 y 18 del VPH han resultado ser los tipos de alto riesgo del VPH porque son responsables de la mayoría de las lesiones intraepiteliales de alto grado que pueden evolucionar a carcinomas, en particular las de la categoría anogenital y/o mucosa. 10 Types 6 and 11 of HPV are typically marked as low risk because infection with these types has low oncogenic potential and usually results in the formation of condylomas and precancerous lesions of low grade. Types 16 and 18 of HPV have been found to be the high-risk types of HPV because they are responsible for the majority of high-grade intraepithelial lesions that can develop into carcinomas, particularly those of the anogenital and / or mucosal category.
15 La infección por VPH sola no causa transformación maligna del tejido infectado. En este proceso han estado implicados cofactores tales como el uso de tabaco, la radiación ultravioleta, el embarazo, la deficiencia de folato, y la supresión inmunitaria. La tabla 3 enumera una diversidad de enfermedades y los tipos del VPH asociados. 15 HPV infection alone does not cause malignant transformation of infected tissue. In this process, cofactors such as tobacco use, ultraviolet radiation, pregnancy, folate deficiency, and immune suppression have been implicated. Table 3 lists a variety of diseases and the associated types of HPV.
20 Tabla 3 -Enfermedades y subtipos del VPH asociados 20 Table 3 - Associated HPV diseases and subtypes
- Enfermedad cutánea no genital Non-genital skin disease
- Tipo de VPH HPV type
- Verrugas comunes (verrucae vulgaris) Common warts (verrucae vulgaris)
- 1, 2, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65 1, 2, 4, 26, 27, 29, 41, 57, 65
- Verrugas plantares (myrmecias) Plantar warts (myrmecias)
- 1, 2, 4, 63 1, 2, 4, 63
- Verrugas planas (verrucae plana) Flat warts (flat verrucae)
- 3, 10, 27, 28, 38, 41, 49 3, 10, 27, 28, 38, 41, 49
- Verrugas de carnicero (verrugas comunes de gente que manipula carne, carne de ave y pescado) Butcher's warts (common warts of people handling meat, poultry and fish)
- 1, 2, 3, 4, 7, 10, 28 1, 2, 3, 4, 7, 10, 28
- Verrugas en mosaico Mosaic warts
- 2, 27, 57 2, 27, 57
- Carcinoma de células escamosas ungueal Nail squamous cell carcinoma
- 16 16
- Epidermodisplasia verruciforme (benigna) Verruciform epidermodisplasia (benign)
- 2, 3, 10, 12, 15, 19, 36, 46, 47, 50 2, 3, 10, 12, 15, 19, 36, 46, 47, 50
- Epidermodisplasia verruciforme (maligna o benigna) Verruciform epidermodisplasia (malignant or benign)
- 5, 8, 9, 10, 14, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 37, 38 5, 8, 9, 10, 14, 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 37, 38
- Lesiones cutáneas no verrugosas Non-warty skin lesions
- 37, 38 37, 38
- Enfermedad mucosa no genital Non-genital mucous disease
- Tipo de VPH HPV type
- Papilomatosis respiratoria Respiratory papillomatosis
- 6, 11 6, 11
- Carcinoma de células escamosas del pulmón Squamous cell carcinoma of the lung
- 6, 11, 16, 18 6, 11, 16, 18
- Papiloma laríngeo Laryngeal papilloma
- 6, 11, 30 6, 11, 30
- Carcinoma laríngeo Laryngeal carcinoma
- 16, 18 16, 18
- Papiloma del seno maxilar Maxillary Sinus Papilloma
- 57 57
- Carcinoma de células escamosas de los senos Squamous cell carcinoma of the breast
- 16, 18 16, 18
- Papilomas conjuntivos Connective papillomas
- 6, 11 6, 11
- Carcinoma conjuntivo Conjunctive carcinoma
- 16 16
- Hiperplasia epitelial focal oral (enfermedad de Heck) Oral focal epithelial hyperplasia (Heck's disease)
- 13, 32 13, 32
- Carcinoma oral Oral carcinoma
- 16, 18 16, 18
- Leucoplaquia oral Oral leukoplakia
- 16, 18 16, 18
- Carcinoma de células escamosas del esófago Squamous cell carcinoma of the esophagus
- 16, 18 16, 18
- Enfermedad anogenital Anogenital disease
- Tipo de VPH HPV type
- Condilomas acuminados Illuminated condylomas
- 6, 11, 30, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 54 6, 11, 30, 42, 43, 44, 45, 51, 52, 54
- Papulosis bowenoide Bowenoid Papulosis
- 16, 18, 34, 39, 42, 45 16, 18, 34, 39, 42, 45
- Enfermedad de Bowen Bowen's disease
- 16, 18, 31, 34 16, 18, 31, 34
- Condilomas gigantes (tumores de Buschke-Löwenstein) Giant condylomas (Buschke-Löwenstein tumors)
- 6, 11 6, 11
9 9
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