ES2515290T3 - Proteínas de la seda del ácaro araña - Google Patents

Abstract

Una proteína de la seda del ácaro araña, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº 1 - SEQ ID Nº 19, o un homólogo de la misma con al menos una identidad del 80% a lo largo de la longitud completa de dichas secuencias.

Description

Proteínas de la seda del ácaro araña

La presente invención se refiere a proteínas de la seda derivadas del ácaro araña, más específicamente derivadas de Tetranychus urticae. Más específicamente, la invención se refiere al uso de estas proteínas para hacer fibras, o material compuesto de fibras.

La seda es un material fibroso secretado que es depositado o tejido por un organismo. Desde un punto de vista bioquímico, la seda consiste en hilos de proteínas compuestos de disposiciones repetitivas de polipéptidos que contienen dominios tanto cristalinos como no cristalinos discretos que están orientados alrededor de un eje de la fibra. Varios artrópodos tales como arañas, orugas, ácaros, mantis, polillas y escarabajos producen seda, o fibras similares a la seda. Insectos, como un grupo, así como las arañas producen muchos tipos diferentes de sedas y proteínas fibrosas tales como fibroínas y espidroínas. Una sola araña puede producir tanto como nueve diferentes tipos de sedas y proteínas fibrosas, cada una de las cuales puede estar compuesta por más de un tipo de proteína (Kovoor 1987, Haupt & Kovoor 1993). Las diferentes sedas difieren en número, así como en la secuencia de las proteínas constituyentes: a pesar de que todas las proteínas de fibroína y espidroína comprenden varias repeticiones, las estructuras repetitivas dependen de la especie y de la composición de aminoácidos, así como las características mecánicas pueden variar fuertemente de una seda a otra (Zurovec y Sehnal, 2002; Fedic et al, 2003).

Aunque el gusano de seda Bombyx mori domesticado es el pilar de la industria de la seda, hay un comercio considerable en algunos países de la seda producida por los gusanos de la seda que viven "de forma salvaje". La más importante de estas sedas salvajes son las que se conocen como Tussah. Tussah es el producto de varias especies del gusano de la seda del género Antheraea, particularmente Antheraea mylitta, autóctona de la India y Antheraea pernyi que es originaria de China (Huber 1947, Cook 1984). Aunque la seda Tusa es la seda salvaje más importante en el uso comercial, todavía hay otras variedades de orugas que producen seda. Estas sedas se denominan salvajes, debido a que estos gusanos no son capaces de ser domesticados y criados artificialmente. Algunos ejemplos son: Antheraea yamamai, Attacus ricini, Attacus Atlas. En los últimos años, la seda de arañas estaba recibiendo cada vez más interés, principalmente debido a las excelentes características mecánicas de esta seda. Para las arañas, una especie puede hacer diferentes fibras de seda para diferentes fines, como la seda dragalina o seda ampulácea mayor, seda-espiral de captura, seda tubuliforme, seda aciniforme y seda ampulácea menor. El tipo más investigado de la seda de araña es la seda dragalina o ampulácea mayor (MA – siglas en inglés) que es secretada por las glándulas ampuláceas mayores de la araña. La dragalina se utiliza para soportar a la araña cuando construye una tela y para evitar que se caiga. Esta función da como resultado propiedades mecánicas que combinan un elevado módulo de Young con una alta resistencia. Debido a su tamaño y la accesibilidad, la glándula ampulácea mayor ha sido el foco de la mayoría de los estudios. Un segundo tipo importante de la seda de araña es la seda flageliforme, espiral o de captura. Este tipo de seda se compone de una glicoproteína de carácter ácido, secretada por la glándula flageliforme, y está recubierto con un adhesivo de la glándula agregada lo que la hace pegajosa. El adhesivo no se considera una seda, ya que se compone de glicoproteínas y otros aminoácidos. La seda flageliforme se utiliza exclusivamente para la construcción de los componentes en espiral de la tela. Esta función resulta en una fibra que es muy extensible y es capaz de absorber la energía de la presa de vuelo sin fracasar. Se cree que el papel funcional del adhesivo es permitir una captura más eficaz de la presa. La seda ampulácea menor (MI – siglas en inglés) es la seda de la araña que es secretada por las glándulas ampuláceas menores y es una seda fuerte, no elástica estirable con deformación utilizada en la formación de la tela (Colgin & Lewis 1998). Otra seda de araña que se comenta en este texto es la seda de saco de huevos que se utiliza para envolver los huevos. Vollrath (1992, 2000) mencionó en su representación de las glándulas de hilatura asociadas a su función, que la seda interior suave del saco de huevos es producida por las glándulas aciniformes (seda aciniforme), mientras que la seda externa resistente del saco de huevos es secretada por las glándulas de hilatura cilíndricas o tubuliformes (seda tubuliforme). Viney et al. (2000) pretende lo contrario. Las glándulas tubuliformes sólo se encuentran en las arañas hembra, lo que hace que sea más probable que la seda interior sea de hecho secretada por las glándulas tubuliformes. Debido a sus propiedades atractivas (alta resistencia, flexible con buen poder de adsorción de agua, suave, buen comportamiento de recuperación elástica, brillo, etc.), la seda tiene una amplia diversidad de usos en la ropa, cortinas, tapicería y en el sector militar. La seda natural tiene una larga historia de uso como una fibra textil, y se ha utilizado en los últimos años para suturas médicas, vasos sanguíneos, piel artificial, tendones y para la unión de enzimas (Bunning et al. 1994, Kuzuhara et al. 1987). El interés en la seda de Antheraea pernyi para aplicaciones biomédicas ha crecido recientemente debido a la SF de A. pernyi contiene la secuencia de

tripéptidos arg-gly-asp (RGD), conocida como sitio adhesivo de la célula para el cultivo de células de mamíferos (Minoura et al. 1995, Pierschbacher y Ruoslahti 1984a, 1984b, Li et al., 2003). Por lo tanto, se ha investigado como un biomaterial potencial tal como una matriz para la inmovilización de la enzima y el cultivo celular de fibroblastos de mamífero (Kweon et al. 2001 a, Kweon et al. 2001 b). La seda de la araña Nephila clavipes se ha utilizado para ayudar a la regeneración neuronal de mamíferos (Allmeling et al., 2006). Dado que cada una de las sedas tiene su propia composición y características, hay un gran interés en la identificación de nuevas proteínas de la seda, que abran la posibilidad de nuevas aplicaciones. Sorprendentemente, los autores de la invención encontraron que los ácaros araña y, en particular, Tetranychus urticae, producen proteínas de la seda de las que la composición de aminoácidos difiere bastante intensamente de las de fibroínas y espidroínas clásicas, especialmente en el contenido en alanina, glicina y serina. Esas diferencias se encuentran en la composición global de la proteína, así como en la composición de las repeticiones. Un primer aspecto de la invención es una proteína de la seda del ácaro araña que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nº 1 -SEQ ID Nº 19, o un homólogo del mismo. Homólogos, tal como se utilizan en esta memoria, quieren dar a entender una proteína con al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, incluso más preferiblemente al menos 90% de identidades, según se mide utilizando BLASTp (Altschul et al., 1997). Preferiblemente, dicho ácaro araña es Tetranychus urticae. Preferiblemente, dichas proteínas tienen una composición que comprende al menos 40%, preferiblemente al menos 45%, incluso más preferiblemente al menos 50% de serina y glicina (considerados juntos ambos aminoácidos), con lo que la composición individual de serina y glicina para cada uno es al menos 15%, preferiblemente al menos 18%, incluso más preferiblemente al menos 20%, calculado como porcentaje del número del aminoácido específico sobre el número total de aminoácidos. Incluso más preferiblemente, independiente del porcentaje de glicina, la serina está presente en al menos 21%, preferiblemente al menos 26%, incluso más preferiblemente al menos 30%. Incluso más preferiblemente, dichas proteínas comprenden, además del contenido de serina y glicina, también al menos 15%, preferiblemente al menos 17%, incluso más preferiblemente al menos 20% de alanina. Una realización preferida es una proteína de la seda del ácaro araña, con lo que la proteína se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID Nº 1, SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 4, SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 11, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 13, SEQ ID Nº 14, SEQ ID Nº 15, SEQ ID Nº 16 y SEQ ID Nº 17. Una realización incluso más preferida es una proteína de la seda del ácaro araña, con lo que la proteína se selecciona del grupo constituido por SEQ ID Nº 8, SEQ ID Nº 13 y SEQ ID Nº 15. La realización más preferida es una proteína de la seda del ácaro araña seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12, SEQ ID Nº 14 y SEQ ID Nº 17. Otro aspecto de la invención es una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención, o el complemento de la misma, o un fragmento funcional de la misma. Molécula de ácido nucleico, tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Esta expresión se refiere sólo a la estructura primaria de la molécula. Por lo tanto, esta expresión incluye ADN de doble cadena y de cadena sencilla, y ARN en las formas conocidas por la persona experta en la técnica tales como, pero sin limitarse a ADN genómico, ADNc, ARNm, ARN antisentido y ARNi. También incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo metilación, sustitución de “remates” de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo. Una realización preferida de un fragmento funcional es un fragmento que puede ser utilizado como ARNi.

Todavía otro aspecto de la invención es una célula huésped recombinante, que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención. Una célula huésped recombinante, tal como se utiliza en esta memoria, es una célula que ha sido modificada genéticamente, preferiblemente mediante la introducción de un ácido nucleico de acuerdo con la invención. La célula huésped recombinante de la invención puede ser cualquier célula procariota o eucariota, que incluye, pero no se limita a células bacterianas tales como Escherichia coli, células de levaduras tales como Saccharomyces spp, Pichia spp o Kluyveromyces spp, células de insectos células vegetales o células de mamíferos. Dichas células huéspedes recombinantes pueden utilizarse para producir grandes cantidades de la proteína de la seda del ácaro araña de acuerdo con la invención. Métodos para la producción de proteínas de la seda recombinantes son conocidos por la persona experta en la técnica, y se han descrito, como un ejemplo no limitativo, en los documentos WO9116351 y WO9947661. Otro aspecto de la invención es el uso de una proteína de la seda del ácaro araña, de acuerdo con la invención para producir una fibra. Métodos para producir fibras de seda artificial utilizando proteínas de la seda son conocidos por la persona experta en la técnica, y se han descrito, como un ejemplo no limitativo, en el documento WO0153333 y en Teulé et al. (2009).

Todavía otro aspecto de la invención es una fibra producida artificialmente, que comprende una o más proteínas de la invención. Producida artificialmente, tal como se utiliza en esta memoria, significa que la fibra y/o las proteínas constituyentes no son producidas por un Tetranychus urticae que se presenta de forma natural.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Secuenciación del genoma de Tetranychus urticae.

La población London de T. urticae se desarrolló a partir de la línea isofemale en London Ontario, después de 8 retrocruzamientos (para generar la población máxima homocigótica) fue producida en masa en las plantas de habas en cámaras de crecimiento a 27ºC y un fotoperiodo 16: 8. Las plantas se lavaron en disolución detergente TRITON X al 0,1% en vasos de precipitados de 2 I para liberar todas las fases vitales del ácaro araña. Ácaros araña adultos, ninfas, larvas y huevos se filtraron a través de una serie de tamices finos para aislar la fracción de huevo pura. Los huevos se recogieron en el tubo de Eppendorf, se trataron con disolución de blanqueo (para separar el tejido vegetal y posibles contaminantes microbianos) y se prepararon para la extracción de ADN. Los embriones fueron molidos en el triturador de tejidos de vidrio y la extracción de ADN se realizó utilizando el kit de ADN de la sangre y cultivos celulares de QIAGEN (columna Midi nº 13433) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ADN para el proyecto de secuenciación del genoma completo fue secuenciado utilizando el protocolo de secuenciación de Sanger en el Joint Genome Institute (Departamento de Energía de EE.UU.), Walnut Creek, California.

Ejemplo 2: Identificación de los genes.

A partir de fragmentos de genes fibroina disponibles en la base de datos, blastp y tblastn se extendieron sobre el proteoma y el genoma de Tetranychus urticae. Los resultados obtenidos fueron todos ellos controlados manualmente, ya que debido a la naturaleza altamente repetida de la secuencia se produjeron problemas con la predicción e incluso el montaje de la secuencia genómica inicial. Aproximadamente la mitad de los modelos de genes fueron originalmente predichos erróneamente, lo que implica marcos de lectura incorrectamente predichos. Las correcciones fueron evaluadas de forma iterativa y fueron alineadas utilizando MUSCLE, incluyendo los genes fibroina existentes de las bases de datos públicas y los genes ya encontrados (y corregidos) que se encuentran en Tetranychus urticae. Las proteínas que originalmente encontradas tenían todas en común un alto % de G, A y P organizados en modelos repetitivos. Este aspecto particular se utilizó, además, para identificar proteínas más divergentes que tienen modelos similares. Para encontrarlos, tblastn se ejecutó de nuevo con los filtros de baja complejidad desconectados. De los múltiples resultados devueltos, quedaron retenidos 6 genes más, basándose en la similitud de los modelos y la cobertura por lecturas del transcrito lllumina. Todos fueron anotados manualmente y se añadieron a los genes ya encontrados, como potencialmente implicados en las fibras. En total se encontraron 12 genes que tenían un dominio repetitivo similar.

Ejemplo 3: Análisis de la seda del ácaro araña

Se investigan características mecánicas y antimicrobianas de la seda del ácaro araña. El grosor y la resistencia del hilo se miden utilizando las técnicas estándares.

El FAVIMAT-ROBOT (Textechno) se utiliza para analizar las propiedades de tracción. Es un dispositivo de ensayo de la resistencia sencilla semiautomática, trabajando de acuerdo con el principio de la velocidad constante de extensión (normas DIN 51221, DIN 53816, ISO 5079). El instrumento está equipado con una balanza que permite que la masa se pueda medir a una alta resolución de 0,1 mg. El instrumento incluye un ROBOT, que es un almacén de fibras, equipado con una abrazadera de transferencia controlado por ordenador para el transporte de la fibra individual a la posición de ensayo del FAVIMAT. Además de ello, este instrumento está equipado con una unidad de medición integrada de la densidad lineal (en dtex = 0,1 g / km). Esto tiene la ventaja considerable, ciertamente para fibras naturales, que la finura se determina simultáneamente con las propiedades de tracción. La densidad lineal se mide de acuerdo con el método vibroscópico (norma ASTM D 1577 -BISFA 1985/1989 capítulo F). La fibra es precargada a una velocidad predefinida. Además, la fibra se somete a una vibración sinusoidal electro-acústica y la frecuencia de resonancia se detecta con un sensor opto-electrónico. La densidad lineal de la fibra se calcula a partir de la condición de resonancia, es decir, longitud, precarga y frecuencia de resonancia de la fibra. Sugiriendo una distribución de masa uniforme y una sección transversal redonda, la densidad lineal se puede calcular como sigue:

En esta ecuación, Tt es la densidad lineal en dtex, Fv es la precarga en cN, f es la frecuencia de resonancia y L es la longitud de la prueba en mm. Dado que la seda del ácaro araña es muy resistente a la degradación, se mide la posible actividad antimicrobiana de la seda, midiendo el círculo de inhibición alrededor de la seda, en medio sólido

Ejemplo 4: Confirmación de la presencia de las proteínas en la seda del ácaro araña mediante análisis por espectrometría de masas (MS)

Diez T. urticae adultos se colocaron en placas de Petri de 35 mm tapadas y selladas con Parafilm durante 24 horas a la temperatura ambiente. La tapa de la placa de Petri se retiró y se examinó en cuanto a signos de los ácaros, huevos y desechos que fueron retirados según fuese necesario. Después de esto una tapa se lavó con 1 mL de etanol al 95% y los hilos de seda suspendidos en etanol se recogieron en tubos Eppendorf. El contenido de 10-15 tubos se agrupó y los hilos de seda se transfirieron a un recipiente de vidrio para un lavado con ácido acético. Los hilos de seda fueron transferidos de nuevo a etanol al 95%, se separaron y se transfieren a tubos Eppendorf con etanol al 95% para su almacenamiento y posterior análisis. Suspensiones de hilos de seda se evaporaron inicialmente utilizando un sistema SpeedVac. Las muestras secadas se volvieron a suspender en TFA (ácido trifluoroacético) al 75% en viales de vidrio. Los viales fueron calentados luego en microondas durante 45 minutos a plena potencia en un vaso de precipitados lleno de agua. Los contenidos de los viales se secaron después utilizando un sistema SpeedVac y después de esto se reconstituyó en ácido fórmico al 10%. Las muestras se inyectaron luego en un sistema Q-TOF MS utilizando un gradiente de 0 -40% de ACN durante 150 minutos, adquiriendo datos de una manera dependiente de los datos. El análisis de los datos se realizó utilizando el software Peaks Studio 5.2. Los péptidos se compararon frente a la base de datos del proteoma de T. urticae. El análisis se realizó tanto teniendo en cuenta como no teniendo en cuenta posibles modificaciones post-traduccionales variables tales como la desamidación y la oxidación.

Se consideraron y también de predijeron coincidencias de ID de proteínas de la base de datos del proteoma de

T. urticae que aparecieron en los dos tipos de análisis utilizando un enfoque computacional para su subsiguiente amplificación y clonación mediante PCR. La SEQ ID Nº 3, SEQ ID Nº 14 y SEQ ID Nº 17 han sido confirmadas mediante MS como parte de la seda.

Ejemplo 5: Uso de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para confirmar la expresión de genes

Se extrajo ARN de T. urticae utilizando reactivo Trizol (Invitrogen). Las muestras para la PCR se prepararon mediante la transcripción inversa de 3 µg de ARN total utilizando la transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen). Partes alícuotas de esta reacción se utilizaron luego en reacciones PCR. Los cebadores para PCR fueron diseñados para amplificar fragmentos cortos (100-200 pb) de las regiones 5' y 3' de la secuencia de ARNm predicha de genes candidatos. La PCR se realizó con Taq ADN polimerasa (Fermentas) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante y los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pGEM-T Easy (Promega) para la secuenciación. La SEQ ID Nº 9, SEQ ID Nº 12 y SEQ ID Nº 17 fueron confirmadas como expresadas como ARNm mediante PCR.

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

5

<110> VIB VZW UNIVERSITEIT GENT THE UNIVERSITY OF WESTERN ONTARIO

<120>

PROTEÍNAS DE LA SEDA DEL ÁCARO ARAÑA

10

<130> <150> <151> PH/SILK/V320 EP 09172104.3

15

<160> <170> 19 PatentIn version 3.5

20

<210> <211> <212> <213> 1 1172 PRT Tetranychus urticae

<400>

1

<220>

<221> característica miscelánea

<222> (311)….. (311)

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se presenta de forma natural

<220>

<221>

característica miscelánea

<222>

(972)….. (1005)

5

<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido que se presenta de forma natural

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una proteína de la seda del ácaro araña, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que

   consiste en SEQ ID Nº 1 – SEQ ID Nº 19, o un homólogo de la misma con al menos una identidad del 80% a 5 lo largo de la longitud completa de dichas secuencias.
2. 2. Una proteína de la seda del ácaro araña de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende al menos 40% de serina y glicina, en donde el contenido individual de serina y glicina para cada una es de al menos 15%.

   10 3. Una composición de proteína de la seda del ácaro araña de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el contenido de serina es de al menos 21%.
3. 4. Una proteína de la seda del ácaro araña de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde

   dicho ácaro araña es Tetranychus urticae. 15
4. 5. Un ácido nucleico, que codifica una proteína de la seda del ácaro araña de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
5. 6. Una célula huésped recombinante, que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 5. 20
6. 7. El uso de una proteína de la seda de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para producir una fibra.