ES2497465A1 - Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1 - Google Patents
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Abstract
Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1. La presente invención se refiere a una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1, cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1, presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón, así como de progenies y líneas celulares derivadas. La presente invención también se refiere a la utilización de las mismas.
Description
Ratones cisgénicos sobreproductores de MCP-1
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de animales cisgénicos y uso de los mismos. En particular, la presente invención se refiere a ratones cisgénicos que sobreproducen MCP-1 útiles en el estudio de enfermedades como por ejemplo, la obesidad, la esteatosis hepática
o la aterosclerosis.
Antecedentes de la invención
La obesidad, y por tanto, las enfermedades asociadas , especialmente aterosclerosis, esteatosis hepática , resistencia a la insulina, o diabetes, constituye el principal problema al que se enfrenta la medicina moderna. Para comprender su patobiología, los conocimientos actuales obligan a que cualquier hipótesis debe considerar los mecanismos de regulación del sistema inmune y debe, en consecuencia, dirigirse al estudio del complejo entramado de las citoquinas. De este modo, los procesos inflamatorios se hacen patentes mediante la acción concertada de numerosas citoquinas, quimiocinas, hormonas y factores de transcripción que actúan en red, de forma que la respuesta de un elemento interfiere o activa otro.
Una de las citoquinas más importantes es la quimiocina MCP-1 (del inglés monocyte chemolaclic prolein-1) que se sabe que está relacionada con la presencia concomitante de hiperlipidemia, uno de los aspectos más frecuentes en la obesidad y la arteriosclerosis. La ausencia o deficiencia de MCP-1 tiene efectos relevantes en el reclutamiento de macrófagos y en la secreción de otras citoquinas. El papel relevante de MCP-1 en la génesis de la arteriosclerosis ha sido descrita y justificada por el hecho de que la deficiencia de MCP-1 disminuye de forma significativa la presencia de aterosclerosis en ratones genéticamente modificados (MCP-1 '¡) Recientemente se han descrito trastornos en el metabolismo de la glucosa y de las lipoproteínas derivados de la ausencia de MCP-1 , es decir, parece haber una relación directa entre MCP-1 y la homeostasis energética. Datos recientes (véase, Rull A el al. Hepatic monocyte chemoattractant protein-1 is upregulated by dietary cholesterol and contributes to liver steatosis. Cytokine 2009, 48:273-9) confirman que la ausencia de MCP-1 enlentece la progresión de la arteriosclerosis, previene la inducción de la obesidad,
evita la formación de esteatosis hepática y afecta notablemente a la resistencia a la insulina y el metabolismo hepático del colesterol.
Así pues, con el objetivo de estudiar más profundamente las bases moleculares y
5 fisiopatologías del proceso inflamatorio en relación con enfermedades, tales como la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis, los presentes inventores han desarrollado un ratón cisgénico con un background genético C57BL6/J sobreproductor de MCP-1 en todos los tejidos del organismo.
10 Hasta la fecha los estudios planteados solamente buscaban respuestas desde la deficiencia de MCP-1 , por lo que el objetivo del desarrollo de dicho ratón es estudiar el problema desde la posición contraria.
El documento US5817911 describe un animal no transgénico que sobreexpresa un gen
15 responsable de la acumulación de monocitos y leucocitos. En particular, se indica que el transgen que se inserta expresa MCP-1 y más preferiblemente sobreexpresa MCP-1 en células epiteliales pulmonares de tipo 11. Este animal se utiliza como modelo para ensayar fármacos para el tratamiento de enfermedades que dan lugar a una acumulación elevada de monocitos y/o linfocitos.
20 El documento W09746664 describe un animal no humano (ratón) transgénico que expresa un transgen que codifica perlecan. Se menciona que este animal transgénico se puede aparear con otro animal transgénico que sobre produce, entre muchas otras, la proteína MCP-1.
25 Ninguno de los modelos planteados hasta la fecha, presenta una sobreproducción de MCP1 en todos los tejidos del organismo.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Genotipado de la cepa sobreproductora de MCP-1 (homocigoto (tgMCP-1 +1+); heterocigoto (tgMCP-1 +1-» y de un ratón salvaje (WT). WM: marcador de peso molecular. Figura 2A. Concentración de MCP-1 en diferentes tejidos del modelo animal tgMCP-1 +1-, obtenidos mediante ELlSA. (TABe: Tejido adiposo blanco epididimal, TABi: Tejido adiposo
35 blanco inguinal, TAM: Tejido adiposo marrón). Figura 2B. Concentración de MCP-1 en suero y plasma del modelo animal tgMCP-1 +1-.
Figura 3. Control del aumento de peso y de la ingesta de alimento en un estudio de intervención dietética llevado a cabo en la cepa sobreproductora de MCP-1 de 32 semanas de edad. Figura 4. Concentraciones séricas de colesterol y triglicéridos en las distintas cepas estudiadas y con distinto tratamiento dietético a las 16 semanas de edad. Figura 5. Test de tolerancia a la glucosa en las distintas cepas y diferentes intervenciones dietéticas. Figura 6. Peso relativo de los órganos metabólicos más importantes. eWAT: tejido adiposo blanco epididimal. iWAT: tejido adiposo blanco inguinal. BAT: Tejido adiposo marrón. Figura 7. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x). Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 16 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 8. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x). Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 24 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 9. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (20x). Se observan las imágenes según los diferentes tratamientos dietéticos y las diferentes cepas (homocigoto +/+ y heterocigoto +/-) en ratones tratados durante 32 semanas. CD =dieta Chow; HF = Dieta rica en grasas Figura 10. Cortes histológicos hepáticos observados en microscopio óptico (4x, 20x y 40x). Se observan imágenes de ratones tgMCP-1 +'+ alimentados con dieta rica en grasa durante 32 semanas. Figura 11 . Cortes histológicos hepáticos en microscopía electrónica de ratones sobre productores de MCP-1 de los distintos grupos dietéticos a las 24 semanas de edad. Las flechas muestran distintas mitocondrias. A. Cepa heterocigota alimentada con una dieta normal. B. Cepa homocigota alimentada con una dieta normal. C. Cepa heterocigota alimentada con una dieta rica en grasa. D. Cepa homocigota alimentada con una dieta rica en grasa. Figura 12. Esquema del vector insertado en el Locus ROSA26. La secuencia de STOP, flanqueada por sitios se restricción 10xP, se encuentra entre el promotor (UbiC) y el gen de MCP-1 (representado por sus tres exones: 1, 2 Y 3). Los elementos PGK, Neo y SDIS, solamente son necesarios para la selección de clones.
Descripción de la invención
La presente invención se refiere a una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ), cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1 , presente tanto en células 5 somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.
La presente invención también se refiere a una línea celular derivada de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ), cisgénica y homocigota,
10 sobre productores de MCP-1 , presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.
La presente invención también se refiere a una progenie de una cepa de ratones con doble
15 dotación génica de MCP-1 (tgMCP-1 ), cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1 , presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón introducido mediante transgénesis o intragénesis.
Por "animal cisgénico" o ~ratón cisgénico" se entiende en la presente invención, un 20 organismo (animal, preferiblemente ratón) que contiene en su gen ama fragmentos de AON de su misma especie pero que ha sido obtenido mediante ingeniería genética.
El ratón desarrollado en la presente invención es un ratón que además de conservar la proteína natural (wild type, cromosoma 11 ), posee otra copia en otro locus genético
25 (ROSA26, cromosoma 6) regulada por un potente promotor (promotor de la ubiquitina) en un background genético que es C57BU6J.
El desarrollo de la cepa de ratones de la presente invención se basa en la tecnología Cre/Lox, ampliamente utilizada en el diseño de ratones transgénicos inducibles. Los ratones 30 transgénicos inducibles son ratones en los que se puede activar la expresión de un gen de forma ubicua o en tejidos concretos, como en hígado, páncreas o linfocitos T.
Para producir una cepa de ratones Cre-Lox, normalmente se cruza un ratón ere con un ratón loxP. El ratón ere contiene el transgen de recombinasaCre bajo el control de un promotor 35 específico de tejido, el ratón loxP contiene dos sitios loxP flanqueando el segmento genómico de interés (floxed locus).
Cre (cyclization recombinase) es una recombinasa que es capaz de recombinar específicamente entre pares de dianas loxP. Así pues, se puede utilizar para eliminar secuencias comprendidas ente sitios loxP, invertirlas, o producir translocaciones.
Dependiendo de los promotores y otros controles regulatorios, los ratones ere pueden ser
diseñados para expresar la recombinasa Cre solo bajo algunas condiciones como: en algunos tejidos cuando la dieta del ratón se suplementa con ciertas sustancias como doxiciclina,
10 tetraciclina, tamoxifeno, etc ...
En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigoto, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que
15 contiene en su genoma un gen mep-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, que comprende las etapas de:
a) introducir la secuencia del gen de mcp-1 de ratón C57BL6/J en un plásmido para su clonación;
20 b) transferir el fragmento de ADN clonado de forma homocigota a ovocitos fertilizados de ratones C57BL6/J para producir descendientes; e) analizar dichos descendientes para evaluar la existencia del gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis.
25 La estrategia a seguir ha sido la de colocar una secuencia STOP flanqueada por sitios loxP entre el promotor y el transgen, para poder eliminarla específicamente activando la transcripción del transgen de MCP-1 , de forma general o en tejidos específicos. La estructura básica del inserto se muestra en la figura 12.
30 El promotor de la Ubiquitina produce una alta expresión en ratones transgénicos.
El fragmento del gen se clona mediante PCR del DNA genómico de C57BU6. El gen de MCP-1 se encuentra en el cromosoma 11. Consta de tres exones repartidos en aproximadamente 3kb. Normalmente, se inserta el cDNA, pero en este caso se ha copiado
35 el DNA genómico.
Una secuencia STOP flanqueada por dianas 10xP contiene las señales que impiden la transcripción del transgen inducida por el promotor UbiC. Esta secuencia STOP es la que puede eliminarse mediante la recombinasa ere, dando lugar a la expresión del transgen.
5 El lugar donde se clonará este vector en el genoma del ratón será en el locus ROSA26 que se encuentra en el cromosoma 6.
Es conocido que el locus de ROSA26 es un sitio de integración adecuado ya que permite una fuerte y predecible expresión de transgenes que lleven promotores exógenos.
Por ejemplo, si se tiene un ratón transgénico heterocigoto, y se cruza con un ratón homocigoto para Cre, la descendencia será siempre Cre'¡-'· (heterocigoto), así que, los individuos que hereden el alelo transgénico sobreexpresarán MCP-1 (en este caso).
15 Además del modelo Cre general, existen los modelos Cre específicos de tejido.
Una vez diseñado y generado el vector, se introduce en células madre embrionarias previamente aisladas mediante electroporación.
20 El inserto, una vez dentro del núcleo de la célula, se integra en el cromosoma mediante recombinación homóloga.
Las células madre embrionarias (ES) transformadas se cultivan y seleccionan.
25 Una vez seleccionados los clones mediante southern blot, estas células madre embrionarias se transfieren al interior de un blastocisto y éste se implanta en el útero de una madre receptora.
De esta, nacerán las quimeras que podrán dar lugar a la descendencia transgénica (si 30 alguna de estas células portadoras del transgen ha ido a desarrollar las gónadas).
La primera generación que se obtiene son animales quimeras, ya que tienen dos tipos de células con material genético diferente. Difieren en que unas células son portadoras del vector y otras no.
Estas quimeras (normalmente todas del mismo sexo), son cruzadas con animales del mismo background genético (C57BU6) y la descendencia (offspring) que de ellos derive, serán los primeros animales transgénicos heterocigotos.
5 En otro aspecto, la presente invención también se refiere a la utilización de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
La presente invención también se refiere a la utilización de una o más líneas celulares derivadas de la cepa de ratones según la presente invención con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su gen ama un gen mcp-1 introducido
15 mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
La presente invención también se refiere a la utilización de una progenie de una cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobre productores de
20 MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
En otro aspecto, la presente invención también se refiere a la utilización de una cepa de
25 ratones con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la
30 esteatosis hepática o la ateroscierosis.
La presente invención también se refiere a la utilización de una o más líneas celulares derivadas de la cepa de ratones según la presente invención con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células 35 somáticas como germinales, que contiene en su gen ama un gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la
esteatosis hepática o la aterosclerosis, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
5 La presente invención también se refiere a la utilización de una progenie de cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1 , cisgénica y homocigota, sobreproductores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su gen ama un gen mcp-1 introducido mediante transgénesis o intragénesis, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis, en la identificación de compuestos
10 eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
Ejemplos
Caracterización
15 Genotipado de la cepa
Las técnicas de genotipado se realizan para establecer la cepa y, además, durante los diferentes estudios para llevar un control de la pureza genética de los ratones (control de calidad). El método de genotipado que se ha utilizado en el laboratorio para el desarrollo de
20 la presente invención no causa ningún tipo de dolor al animal.
En primer lugar, se selecciona el ratón en cuestión para su identificación. Para ello, se le realiza un pequeño agujero en el borde exterior de una de las orejas, obteniendo el tejido taladrado. Se realiza la extracción del ADN del animal a partir del tejido y se lleva a cabo
25 posteriormente una PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Este método silVe para amplificar una región determinada del ADN y poder usar estas regiones para identificar o caracterizar cada cepa.
Para este fin, son necesario unos cebadores (primers) concretos, es decir un conjunto de
30 nucleótidos que se añaden a la reacción y que realizan la amplificación de una región determinada del ADN . Estos cebadores se seleccionan cuidadosamente para que la reacción sea lo más específica posible.
Cabe destacar que los animales tienen una reproducción y cría normal, obteniéndose fetos 35 viables y fértiles.
Tabla 1 Cebadores utilizados para el genotipado de la cepa sobreproductora de MCP-1
- F_WTTG
- 5'-GCACTTGCTCTCCCAAAGTC -3' S' HOlllology arlll primer
- R_WT
- 5'-AGACTCCCGCCCATCTTC -3' 3' HOlllology arlll primer -plu'a detectar wt, dará una banda con elS' homoloj;lV arm primer de 235 bp
- R_Cre
- S'-AGGCAAATITTGGTGT ACGG·3' Secuencia Cre-para detectar el alelo Cre, dará una b:mda con el S' homology arm primer de 773 bp
- R_TG
- 5'-TCCGCTCTCTGGAAAGAAAA -3' Promoter primer -para detectar el transgenico, dará \ma banda con el S' HOllloloRV arm primer de 478 bp
En el genotipado se demuestra que las cepas son homocigotas de MCP-1 y que además no tienen ningún tipo de problema en la reproducción, ya que los fetos se desarrollan 10 correctamente y son fértiles.
ELlSA de MCP-l
La técnica de ELlSA (del inglés Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) es una técnica de
15 inmuensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo unido a una enzima capaz de generar un producto detectable mediante colorimetría, fluorescencia o luminiscencia.
Para la realización de este ensayo, se requiere una preparación previa de la placa con el 20 anticuerpo de captura. Una vez superado el tiempo de incubación, se procede a un lavado de la placa y se añade la solución de tampón de bloqueo.
Una vez realizado el segundo lavado, se añaden las diferentes muestras según un previo diseño en plantilla. Pasadas unas 2 horas, se procede a un siguiente lavado y
25 posteriormente se añade el anticuerpo de detección en cada pocillo. Dos horas después se lava de nuevo la placa y se añade un conjugado de avidina-peroxidasa.
Por último, se lava de nuevo la placa, se añade el sustrato líquido ABTS, se deja actuar unos 20 minutos y se procede a la lectura de la placa.
30 Cabe indicar que en el ELlSA de tejidos, éstos deben ser previamente homogenados y a partir de ahí se procede a la cuantificación de proteína de cada homogenado obtenido mediante el método de cuantificación Bradford. De esta manera, se consigue que la muestra que se añade a cada pocillo de la placa sea similar en concentración proteica y, por tanto,
35 se puedan comparar los resultados.
Las figuras 2A y 28 muestran la sobreexpresión de MCP-1 en la cepa sobreproductora de dicha quimiocina en comparación con una cepa de control. Se observa la presencia de una mayor concentración de MCP-1 en suero, plasma y tejidos.
Evolución de peso e ingesta
Cuando los modelos homocigoto y heterocigoto de la cepa sobreproductora de MCP-1 son alimentados con una dieta normal no existen diferencias de peso significativas. No obstante, si la dieta administrada es una dieta rica en grasa la variante homocigota aumenta su peso significativamente respecto a la otra variante (figura 3). Este hecho podría deberse a una ingesta de alimentos superior, pero como se puede observar ambas variantes obtienen la misma energía a partir de los alimentos ingeridos.
Ademas del significativo aumento de peso, destaca un aumento en el tejido adiposo, un aumento en el peso hepatico y la disminución del peso relativo del pancreas.
Análisis bioquímicos
El suero de cada animal fue analizado con el analizador automático Cobas para determinar las concentraciones séricas de colesterol y triglicéridos.
En la figura 4 se recogen los datos de ratones control (cepa wiJd-type) y ratones sobre productores de MCP-1 (tanto de la cepa homocigota como heterocigota) a las 16 semanas de edad.
Los resultados muestran que entre los distintos grupos estudiados no existen diferencias en las concentraciones de colesterol. Únicamente se observa un efecto de la dieta ya que la ingesta de una dieta rica en grasa aumenta los niveles de colesterol en suero en todos los grupos.
Por otro lado, las concentraciones séricas de triglicéridos muestran una ligera tendencia a ser inferiores en las cepas sobreproductoras de MCP-1 , aunque las diferencias no son estadísticamente significativas. Además, el efecto de la dieta es opuesto al de concentraciones de colesterol. En este caso, la ingesta de una dieta rica en grasa disminuye los niveles de triglicéridos en suero y se puede entrever la misma tendencia que en el caso de la dieta normal.
Test de tolerancia a la glucosa
Para evaluar la capacidad de los animales para meta balizar la glucosa, se realiza el test de tolerancia a la glucosa.
La prueba consiste en, primeramente, medir la glucosa basal del ratón. A continuación, se le inyecta una dilución de glucosa en agua (cantidad estipulada según el peso de cada ratón). Seguidamente, se debe medir la concentración de glucosa en sangre a distintos intervalos de tiempo llegando a alcanzar las dos horas. Esto se hace a partir de una pequeña incisión en la cola del animal, extrayendo una gota de sangre y analizándola con el medidor automático de glucosa Accu-check.
El tratamiento con una dieta rica en grasa aumenta el área bajo la curva en todas las cepas, es decir, una ingesta de nutrientes excesiva conlleva resistencia a la insulina. Si comparamos cepas con el mismo tratamiento dietético, esta resistencia es mayor en el modelo sobre productor de MCP-1 que en ratones deficientes para el receptor de las lipoproteínas de baja densidad (modelo de hiperlipidemia, figura 5).
Órganos metabólicos
Al realizarse el sacrificio del animal, se extraen los órganos y se pesan. En la figura 6 se recogen los pesos de los órganos metabólicos de las cepas en estudio corregidos según el peso del animal.
En el caso del hígado y del músculo no se observan diferencias entre las distintas cepas estudiadas ni un efecto de la dieta rica en grasa en ninguno de los grupos estudiados. Aun así, el volumen del hígado es mucho mayor en las cepas sobre productoras.
A excepción del tejido adiposo marrón, el peso relativo de los distintos tejidos adiposos aumenta significativamente cuando los animales son alimentados con una dieta rica en grasa destacando la cepa sobre productora de MCP-1 homocigota (tgMCP-1 +/+) en la que este aumento de peso es significativamente distinto a las otras cepas.
Los resultados obtenidos en el caso del páncreas son peculiares ya que cuando los animales son alimentados con una dieta normal el peso relativo de este órgano es menor en
las cepas sobre productoras de MCP-1. Con una dieta rica en grasa su peso aumenta en la cepa control y la cepa heterocigota siendo en ésta menor que en la primera, pero disminuye en la cepa homocigota.
Histología hepática
La obtención de muestras se realizó a las 16, 24 Y 32 semanas de estudio de diferentes grupos de ratones. Los tejidos hepáticos destinados a histología se conservaron en tubos con formol. Posteriormente, se procesaron estos tejidos y se incluyeron en parafina para poder realizar cortes de 2 Jlm de grosor en el micrótomo.
Una vez obtenidos los cortes, se realizó un protocolo determinado para teñir los cortes con hematoxilina (colorante básico que tiñe, por ejemplo, los núcleos) y eosina (colorante ácido).
En las figuras 7, 8 Y 9 se observan los cortes histológicos de los diferentes grupos de ratones según el tratamiento dietético administrado (CD: dieta chow, HF: dieta elevada en grasas), la cepa se ratones tgMCP-1 '" (homocigoto) o tgMCP-1 '" (heterocigoto) y las semanas de estudio.
Se observan grandes diferencias en la evaluación de la esteatosis (presencia de grasa en el hígado) en los diferentes grupos estudiados. Se aprecia una mayor presencia de vesículas lipídicas en los grupos alimentados con una dieta rica en gasa y esta presencia se hace más evidente en los grupos tgMCP-1 +'+.
Además, el porcentaje de grasa aumenta según se alargan las semanas de estudio, siendo 16 semanas el grupo con menos presencia de grasa y 32 semanas el grupo con más presencia de grasa (véase la figura 10).
La histología hepática depende del tiempo y también de la dieta, es decir, cuanto mayor tiempo se alimenta el ratón con dieta rica en grasa, más grasa hepática acumula.
Cortes histológicos de corazón
Se realizaron cortes histológicos de los corazones de los ratones. Se efectuó una fijación con sacarosa y Del para mantener la integridad de las membranas y estructuras internas del corazón para posteriormente cortarlos con el criostato. Una vez cortado y depositado en los portaobjetos, se realizó la tinción con Sudan IV (específica para lípidos) para observar la posible placa de ate roma. En las imágenes obtenidas se observó que en animales sometidos a dieta rica en grasa, no se observa en coronarias miocárdicas de mediano calibre, placa de ateroma con tindón Sudán para lípidos.
Observación de mitocondrias mediante microscopía electrónica
Se ha llevado a cabo la observación de tejido hepático de los distintos grupos dietéticos de las dos cepas sobreproductoras de MCP-1 con el fin de realizar una evaluación cualitativa 10 (morfología) y cuantitativa de las mitocondrias.
La obesidad es el resultado de un exceso de almacenamiento de energía y/o un defecto de gasto de energía que conduce a la mayor incidencia de factores de riesgo cardiovascular que favorecen el desarrollo de complicaciones vasculares. La mitocondria es el orgánulo
15 celular cuya función es la gestión de la energía celular. De ahí que la disfunción de este orgánulo sea importante en la fisiopatología de la obesidad y todas sus consecuencias metabólicas.
En la figura 11 se observa que los animales homocigotos tienen una morfometría anormal 20 de las mitocondrias, así como menor cantidad de éstas en la dieta rica en grasa.
Claims (9)
- REIVINDICACIONES1.-Cepa de ratones con doble dotación génica de MCP-1, cisgénica y homocigota, sobre productores de MCP-1 presente tanto en células somáticas como germinales, que contiene en su genoma un gen mcp-1 de ratón.
- 2.-Línea celular derivada de una cepa de ratones según la reivindicación 1.
- 3.-Progenie de una cepa de ratones según la reivindicación 1.
- 4.-Utilización de una cepa de ratones según la reivindicación 1> como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
- 5.-Utilización de una o más líneas celulares según la reivindicación 2, como modelo para el estudio de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
- 6.-Utilización de una progenie según la reivindicación 3, como modelo para el estudio de la obesidad , la esteatosis hepática o la aterosclerosis
- 7.-Utilización de una cepa de ratones según la reivindicación 1 en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
- 8.-Utilización de una o más líneas celulares según la reivindicación 2, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
- 9.-Utilización de una progenie según la reivindicación 3, en la identificación de compuestos eficaces como antagonistas de CCR2 para el tratamiento de la obesidad, la esteatosis hepática o la aterosclerosis.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN112602673A (zh) * | 2020-12-31 | 2021-04-06 | 东北农业大学 | 一种评估音乐刺激对断奶仔猪影响的方法 |
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