ES2472724A1 - Método para la cuantificación absoluta de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem, y sus usos - Google Patents

Abstract

Método para la cuantificación absoluta de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem, y sus usos utilizando péptidos enriquecidos isotópicamente en isótopos estables que presenten solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural, monitorización de reacciones múltiples a baja resolución en el primer analizador de un espectrómetro de masas en tándem y regresión lineal múltiple. El método es también aplicable para la determinación indirecta de proteínas tras la hidrólisis de las proteínas con enzimas, la selección de uno o varios péptidos característicos de éstas y la determinación absoluta de estos péptidos. La invención resulta de aplicación en aquellos sectores en los que sea necesaria la cuantificación de proteínas y/o péptidos en una muestra, como puede ser en fluidos biológicos o en cultivos celulares, como por ejemplo en los sectores de la agricultura, la química, la farmacia, la biomedicina o la seguridad alimentaria.

Description

MÉTODO PARA LA CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA DE PÉPTIDOS MEDIANTE ESPECTROMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM. Y SUS USOS

La presente invención se refiere a un método para la cuantificación absoluta de péptidos mediante espectrometría de masas en tándem utilizando péptidos enriquecidos isotópicamente con isótopos estables que presenten solapamiento espectral con el péptido de abundancia natural, monitorización de reacciones múltiples a baja resolución en el primer analizador y regresión lineal múltiple. El método es también aplicable para la determinación indirecta de proteínas tras su hidrólisis la selección de uno o varios péptidos característicos de éstas y la determinación absoluta de estos péptidos. La presente invención también se refiere a los usos del método para la cuantificación absoluta de péptidos.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores en los que sea necesaria la cuantificación de proteínas y/o péptidos en una muestra, como puede ser en fluidos biológicos o en cultivos celulares, como por ejemplo en los sectores de la agrícultura, la química, la fannacia, la biomedicina o la seguridad alimentaria.

ESTADO DE LA TÉCNICA

La expresión de los genes tiene Como resultado final la síntesis de péptidos y proteínas. Se considera que una cadena de aminoácidos es un péptido cuando contiene menos de 50 aminoácidos y que es una proteína cuando la cadena es más larga. En muestras biológicas se pueden encontrar tanto péptidos como proteínas. Estas biomoléculas son la llave para descifrar y entender la información contenida en el genoma de cualquier organismo vivo. El proteoma humano comprende más de

100.000 proteínas y péptidos con diferentes propiedades químicas que cubren concentraciones de hasta nueve órdenes de magnitud. Para llegar a entender moleculannente los procesos de las enfermedades es vital comparar sistemas celulares nonnales y en estado patológico para identificar y cuantificar los cambios que se efectúan en el proteoma. Esta tecnología se conoce con el nombre de proteómica cuantitativa y se basa en el análisis de proteínas y péptidos mediante distintas técnicas

--

~---------~~--

incluyendo su marcaje metabólico, químico o enzimático. Los métodos analíticos desarrollados hasta la fecha en este campo están lejos de lograr la cuantificación de todas las proteínas y péptidos contenidos en un organismo. Sin embargo, la cromatografia líquida acoplada a la espectrometría de masas es una de las herramientas actuales más eficientes y prometedoras.

El uso de isótopos estables eruiquecidos juega un papel muy importante en el desarrollo de nuevas técnicas basadas en la cromatografia líquida acoplada a espectrometría de masas para la cuantificación de proteínas y péptidos ya que pennite el desarrollo de métodos de cuantifi<:ación mediante análisis por dilución isotópica (IDMS). El análisis por dilución isotópica está considerado como un método absoluto de análisis que proporciona resultados directamente trazables al Sistema Internacional de unidades. Además, el uso de isótopos estables enriquecidos ha dado lugar al desarrollo de nuevas metodologías para explorar la dinámica de proteomas enteros y así proporcionar comparaciones relativas de las abundancias de las proteínas entre muestras (cuantificación relativa), IDMS ha sido también empleado en el desarrollo de métodos capaces de proporcionar un alto nivel en la precisión y exactitud de la detenninación de proteínas (cuantificnción absoluta).

La cuantificación relativa tü~ne como objetivo caracterizar cualitativa y cuantitativamente los cambios en la composición de un proteoma en función del genotipo, estado del ciclo celular, estado de la enfennedad y metabolismo de un fánnaco (Mosclcy A, "Current trends in differential expression proteomics: isolopically coded lags" Trends in Biotechnology 19 (2001) SIO) en lo que se ha venido llamando "expresión diferencial". Hay una gran cantidad de proteínas y péptidos que están involucrados en la respuesta a un estímulo, produciendo cambios en la señalización, transcripción, transducción y en las interacciones metabólicas de las modificaciones post-transduccionales. El reto reside en conocer los patrones de respuesta que se encuentran ocultos en ese cambio. El empleo de isótopos estables enriquecidos en combinación con la e:spectrometrfa de masas en tándem es una de las herramientas más eficaces para llevar a cabo el estudio de la expresión diferencial de las proteínas. Este tipo de cuantificación, conocida como cuantificación relativa, se basa en generar dos mezclas de proteoma: una

isotópicamente emiquecida y otra con abundancia natural. La combinación de ambas mezclas durante la preparación de la muestra disminuye al mínimo las diferencias en la pérdida de proteínas o péptidos. Por tanto, la comparación de las intensidades de las señales correspondientes a cada mezcla de proteoma separadas por una diferencia de masa definida, proporcionará una medida en el nivel de la expresión relativa de los péptidos o proteínas en la muestra que se estudia (Bantscheff M, Schirle M, Sweetman G, Rick J, Kuster B "Quantitative mass spectrometry in proteomics: a critical review" Anal.Bioanal. Chem. 389 (2007) 1017). Es muy importante resaltar qut: este modo de cuantificación en ningún caso permite determinar la cantidad absoluta de proteína o péptido presente en una muestra. Los primeros procedimientos que se desarrollaron dentro de la cuantificación relativa con isótopos estables eruiquecidos fueron el marcaje metabólico (Y, Huang K, Cross F.R, Cowbum D, Chait B.T "Aecurate quantitation 01 protein expression and site-specijic phosphorylation" Proc. Nattl. Acad. Sci. USA, 96 (1999) 6591; "Method lor the eomparative quantitative analysis 01 proteins and other biologieal material by isotopie labelling and mass spectrometry" Pat. No. US 6,391 ,649 Bl) y el marcaje estable de células en cultivo con aminoácidos enriquecidos isotópicamente, SILAC (Stable isotope labelling by aminoaeids in eell culture) (Ong S, Blagoev B, Kratchmarova 1, Kristensen D.B, Steen H, Pandey A, Mann M "Stable ¡sotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approaeh to expression proteomics" Mol. CelL Proteomics 1(2002) 376). Posteriormente se desarrollaron métodos basados en el marcaje proteo lítico, como la introducción de la marca isotópica de forma simultánea con la digestión de la proteína ("Enzyme Catalyzed Isotope Labeling" Pat. No. US 2005/0032149; Fenselau C, Yao X ""O,-Labeling in Quantitative Proteomic Strategies: A Status Report" J. Proteome Res 8 (2009) 2140). Sin embargo, los métodos más utilizados actualmente son los basados en el marcaje químico. Dependiendo del reactivo utilizado, se pueden encontrar numerosos métodos en la bibliografia (Julka S, Regnier F "Quantifieation in Proteomies through Stable ¡sotope Coding: A Review" J. Proteome Res 3 (2004) 350; I1iuk A, Galan J, Tao W.A "Playing tag with q:uantitative proteomics" Anal. Bioanal. Chem. 393 (2009) 503). Por ejemplo, Goodl,," y colaboradores (Goodlett D. R, Keller A,

Watts J.D, Newitt R, Yi E.C, Purvine S, Eng J.K, von Haller P, Aebersold R,

Kolker E "Diflerenttal stable isolope labeling ojpeptides for quanlitation and de

novosequence derivation" Rapid Commun. Mass Spectrom. 15 (2001) 1214)

propusieron en 2001 introducir pequeñas marcas después de la digestión triptica.

S

Estas marcas consistían en utilizar akoholes deuterados para esterificar los grupos

carboxílicos de los péptidos (carboxilo tenninal y cadena lateral del ácido

glutámico y ácido aspártico). Otro marcaje químico es conocido como "dimethyl

labelling" y consiste en utilizar fonnaldehído enriquecido con deuterio después de

la digestión (Hsu J, Huang S, Chow N, Chen S "Stable-tsotope dimethyl labeling

10

for quantilalive proteomics" Anal. Chem.75 (2003) 6843; "Reagen/ Kit ojGlobal

Analysis for Protein Expression and Melhod for Qualilalive and Quantitalive

Proteomic Analysis using the same" Patent No.: US 7,338,806 S2). Gygi y

colaboradores (Gygi S. P, RiS! B, Gerber S.A, Turecek F, Gelb M.H, Aebersold R

"Quantitalive analysis of complex protein mixlures using isolope-coded affinity

15

lags" Nat. Siotechnol. 17 (1999) 994; "Rapid Quantitalive Analysis 01 Proleins or

Pro/ein Function in Complex Mixtures " Patent No.: US 6,670,194 SI)

desarrollaron otra estrategia de marcaje químico con isótopos estables y una

etiqueta de afinidad para la cuantificación relativa de proteínas en mezclas

complejas. En ella se procede a la dc:~rivatización química de los péptidos con un

20

reactivo conocido como ICAT. Este compuesto posee un extremo que reacciona

con los residuos de cisteína libres, un linker que puede contener ocho hidrógenos

(ligero) ti ocho deuterios (pesado), :y otro extremo con biolina como ancla de

afinidad. Los péptidos (que contienen cisteína) se aíslan selectivamente por

cromatografia de afinidad con avidina. Li y colaboradores (Li J, Steen H, Gygi S.P

25

"Prolein Profiling wilh Cleavable ¡solope-coded Affinity Tag (cJCAT) Reagenls"

Mol. Cell. Proteomics 2 (2003) 1198) desarrollaron una nueva versión de ICAT

denominada "cleavage ICAT (cICAT)" mediante la sustitución del reactivo (linker)

que contenía 8 átomos de deuterio por otro que contenía nueve átomos de DC.

Otros métodos que se basaron en el procedimiento ICAT consistieron en marcar

30

sitios específicos de péptidos con t:isteína (Zhou H, Ranish J.A, Watts J.D,

Aebersold R "Quantitative proteome analysis By solid-phase ¡solope lagging and

mass spectrometry" Nat. Siotechnol. 19 (2002) 512). Otro tipo de estrategia de

marcaje químico es el que hace uso de marcas isobáricas. Este método fue publicado por Thompson y colaboradores (fhompson A, Schafer J.U, Kuhn K, Kienle S, Schwarz J, Schmidt G. Neurnan T, Hamon C "Tandem mass tags: a nove/ quantification strategy for comparative ana/ysis of complex protein mixtures by MSIMS' AnaL Chem.75 (2003) 1895; "Mass Labels " Patent Application No.: US 2005/0048489 Al) Y recibió el nombre de etiqueta de masa en tándem (tandem mass tags, TMT). Es similar a otrd,S estrdtegias para marcar péptidos pero la diferencia es que los péptidos de abundancia isotópica natural y sus análogos enriquecidos isotópicamente contienen la misma masa global. En este caso, el grupo amino terminal y el grupo épsilon amino de la lisina es marcado utilizando N-hidroxysuccinimida. Solamente, después de la colisión en la celda, los péptidos naturales y enriquecidos se distinguen en el espectro de masas. Actualmente, la estrategia que más se utiliza se conoc(~ con el nombre de iTRAQ (isobaric tags for re/ative and abso/ute quantification) (Ross P.L. Huang Y.N, Marchese J.N, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin D

"Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using aminereactive isobaric tagging reagents" Mol.Cell. Proteomics 3 (2004) 1154; "lsobarically Labelled Ana/y tes and Fragment lons derived therefrom " Patent Application No.: US 2010/0129842 Al). i1RAQ se basa en el empleo de un reactivo que reacciona con el grupo amino terminal y el grupo amino de la cadena lateral de la lisina. La molécula que se utiliza para el marcaje químico es la Nmetilpiperazina. El reactivo iTRAQ consta de un equilibrador con masa 28 a 31 Da y un grupo reporter con masa 114 a 117 Da. Tras la fragmentación, el gruIX> reporter se pierde generando fragmentos entre 114 a 117 Da. La intensidad o la relación de la abundancia de los fragmentos se utilizan para la cuantificación de los péptidos. La principal ventaja es que se pueden marcar 4 muestras diferentes en el mismo experimento.

Cabe resaltar que nmguno de estos procedimientos permite determinar la cantidad absoluta de proteína presente en una muestra ya que la cuantificación relativa tiene como objetivo determinar la expresión diferencial de las proteínas entre dos estados, como por ejemplo ausencia o presencia de un fármaco. Sin embargo, la cuantificación absoluta pretende conocer cuál es la concentración de las proteinas y los péptidos en una muestra concreta. Esto tiene una relevancia importante en campos como la biomedicina, la industria frumacéutica, la seguridad alimentaria o la salud pública. Solamente las concentraciones de proteínas o péptidos obtenidas mediante el empleo de cuantificaciones absolutas puede relacionarse con una referencia establecida a través de una cadena ininterrumpida de comparaciones, en donde todas ellas tienen asociada una incertidumbre (trazabilidad). Ésta es la única fonna de asegurar que la detenninación de la concentración de proteína en una muestra es directamente trazable al Sistema Internacional de unidades. La cuantificación de una proteína mediante IOMS requiere la adición de un compuesto enriquecido isotópicamente (trazador isotópico) a la muestra. La exactitud y precisión en la determinación de la concentración de la proteína dependerá del trazador que se seleccione y de la metodología analítica que se vaya a utilizar. Dependiendo de la forma en que se encuentre el análogo enriquecido se pueden encontrar proteínas, péptidos o aminoácidos enriquecidos isotópicamente en alguno de sus átomos. Por tanto, existen tres estrategias actuales de cuantificación absoluta.

La primera de las estrategias se basa en la cuantificación de proteínas y péptidos utilizando aminoácidos eDlriquecidos isotópicamente. Esta estrategia es directamente trazable al SI (Burkitt W. 1, Pritchard C, Arsene C, Henrion A, Bunk O, O'CoIUlor G '7oward Sysleme Inlernalional d'Unité-Iraceable prolein quantification: From amino acids lo proteins" AnaL Biochem. 376 (2008) 242), ya que los aminoácidos se pueden adquirir comercialmente en diferentes empresas con certificados de pureza que incluso pueden ser proporcionados por Institutos Nacionales de Metrología. La cuantificación de una proteína a través de esta estrategia se hace con una hidrólisis química ten condiciones ácidas, pero también han sido descritas hidrólisis básicas y enzimáticas. Estas reacciones requieren tiempos largos (24 h), que pueden acortarse mediante el empleo de microondas (Fountoulakis M, Lahm H. "Hydrolysis and amino acid composition ana/ysis 01 proteins" J. Chrom. A. 826 (1998) 109). El paso limitante en este procedimiento es conseguir una hidrólisis completa de las proteínas, lo cual es detenninante para la exactitud final de la medida. La principal desventaja de este método es que no se puede aplicar directamente a muestras reales debido a la presencia de otras proteínas o péptidos que también contienen los aminoácidos a detenninar. Por tanto, este método está limitado al análisis de una proteína o péptido en patrones o en muestras que contengan única y exclusivamente la proteína a detenninar. La determinación de proteínas como la albúmina (Kato M, Kato H, Eyama S, Takatsu A "Application oJ amino acid analysis using hydrophilic interaction liquid chromatography coupled with isotope di/uNon mass spectrometry Jor peptide and protein quantification" 1. Chromatogr. B 877 (2009) 3059) de suero bovina, péptidos como la angiotensina o la hormona de crecimiento humana (Jeong J, Lim H, Kim S, Ku H, Oh K, Park S "Quantification oJ human growth hormone by amino acid composition analysis using isotope dilution liquid-chromotography tandem mass .spectrometry " J. Chrom. A 1218 (2011) 6596) son algunos ejemplos recientes.

La segunda estrategia se basa en la utilización de péptidos enriquecidos isotópicamente. La cuantificación de proteínas a través péptidos enriquecidos se realiza a través de la determinación de uno o varios de los péptidos característicos de la proteína liberados tras una hidrólisis enzimática (comúnmente utilizando tripsina). Para llevar a cabo esta estrategia es imprescindible que el péptido a determinar sea único de la proteína que se va a estudiar. Además, se debe asegurar que la hidrólisis enzimática sea completa para que el péptido de interés de abundancia isotópica natural se libere cuantitativamente de la proteína. Esta estrategia, por tanto, está basada en la adición de un péptido enriquecido isotópicamente al inicio del análisis, es decir, antes de la digestión triptica. El péptido enriquecido isotópicamente debe ser estable a lo largo de todo el proceso de digestión y no debe sufrir ningún tipo de degradación

hasta que el péptido característico de abundancia isotópica natural sea liberado completamente y se mezcle homogéneamente con el péptido enriquecido isotópicamente. La primera aplicación donde se utilizaron péptidos enriquecidos isotópicamente fue publicada por Desiderio y Kai (Desiderio D.M, Kai M

"Preparation oJ stable isotope-incorporated peptide internal standards Jor field desorption mass spectrometry quantiji.cation oJ peptides in biologic tissue" Biol. Mass Spectrom. lO (1983) 471) en 1983 para determinar una serie de aminoácidos presentes en el tejido del tálamo. A continuación, Barr y colaboradores (Barr 1. R, Maggio V.L, Patterson D. G, Cooper G.R, Henderson L.O, Turner W.E, Smith S.J, Hannon W.H, Needham L.L, Sampson E. J "Isolope di/ution-mass spectrometric quantification oJ specific proteins: model application with apolipoprOlein A-r Clin. Chem. 42 (I996) 1676) sintetizaron péptidos de abW1dancia natural y enriquecidos isotópicamente para llevar a cabo la cuantificación de la apoproteina Al . Posterionnente se desarrollaron y patentaron otras metodologías como AQUA y QCONCA T. El acrónimo AQUA (Absolute QUAantification) se refiere al uso de péptidos enriquecidos isotópicamente sintetizados químicamente para la cuantificación de las proteínas (Gygi S.P, Gerber

S.A "Absolule Quantificalion 01 Proteins and modified lorms thereol by multistage mass Spectrometry". Pat. no. US 7,501 ,286 82; Gerber S.A, Rush J, Sternman 0, Kirschner M.W, S.P. Gygi "Absolute quantification 01 proteins and phosphoproteins from eeU Iysates by tandem MS' PNAS lOO (2003) 6940). Antes de optar por esta estrategia de trabajo la selección del tipo de péptido enriquecido isotópicamente es crucial y se deben realizar estudios previos para la selección del péptido más adecuado. El péptido seleccionado debe ser específico de la proteína y debe ser detectado mediante el espectrómetro de masas sin interferencias isobáricas incluso cuando se trabaje en modo tándem. Para la determinación directa de péptidos el método es análogo sin necesidad de realizar la hidrólisis de la proteína. Actualmente, existen empresas que ofrecen W1a amplia variedad de péptidos enriquecidos isotópicamente para aplicar métodos basados en la estrategia AQUA. Por otra parte, QconCAT es W1a estrategia más refinada capaz de realizar cuantificación múltiple de proteínas ("Artificial protein, methodjor absolute quantification olproteins and uses thereof' Pat. no. WO 2006/128492 Al; Rivers J, Simpson D.M, Robertson D.H.L, Gaskell SJ, Beynon R.J "Absolute Mulliplexed Quanlitative Analysis 01 Protein Expression during Musc1e Development Using QconCAT' Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 1416). Este método se basa en crear genes artificiales (Síntesis de novo) que al expresarse producen proteínas sintéticas fonnadas por péptidos trípticos. En otras palabras, los genes sintéticos se expresan generando péptidos estándar concatenados, los cuales a través de una digestión triptica producen múltiples péptidos enriquecidos isotópicamente. De esta manera se pueden utilizar hasta 50 péptidos trípticos incluidos en QcollCAT, pennitielldo una cuantificación múltiple y absoluta de una o varias proteínas en un solo experimento. Las limitaciones de esta estrategia se deben principalmente a la trazabilidad del estándar de QconCAT. La calibración requiere la hidrólisis de aminoácidos descrita en la sección anterior. Además, al igual que en

AQUA, se necesita una hidrólisis completa de la proteína y una buena estabilidad de

los péptidos a lo largo de la digestión. Las metodologías AQUA y QconCAT utilizan

marcaje isotópico múltiple para evitar el solapamiento espectral entre los péptidos

enriquecidos isotópicamente y los de abundancia isotópica natural ya que el cálculo

S

final se realiza mediante relación de intensidades entre el pico más abundante del

péptido de abundancia isotópica natural y el más abundante del péptido enriquecido

isotópicamente. Además, para una cuantificación correcta estas metodologías

requieren la preparación de un calibrado metodológico que se suele realizar en

ausencia de matriz, lo que puede provocar errores significativos en la cuantificación.

10

La tercera estrategia para la cuantificación absoluta de proteínas se basa en la

utilización de proteínas enriquecidas isotópicamente. Este procedimiento recibe el

nombre de PSAQ (Protein Standardfi':Jr Absolu/e Quantification) (Brun V, Dupuis A,

Garin J "Me/hod for absolute quan/ification of polypeptides". Pat. no. US

2010/0173786 Al) Y se aplicó por primera vez en la determinación de toxinas de

1S

estafilococos (Brun V, Dupuis A, Adrait A, Marcellin M, Thomas D, Court M,

Vandenesch F, Garin J "Isotope-labeled Pro/ein S/andards Toward Absolu/e

Quantita/ive Proteomics" Mol. Cell. Proteomics 6 (2007) 2139). La principal ventaja

es la adición de la proteína marcada al comienzo del análisis. De esta forma se pueden

corregir los errores a lo largo de todo el procedimiento, incluida una digestión no

20

cuantitativa o la inestabilidad de los péptidos durante la misma. Otra ventaja es que al

tener las mismas propiedades químicas hace que esta estrategia sea compatible con

cualquier tipo de fraccionamiento de la muestra como es el SDS-PAGE o la

inmunocaptura de proteínas. Otra ventaja de este método es que ofrece la posibilidad

de que la cuantificación de la proteína se pueda realizar con cualquiera de los péptidos

2S

generados en la hidrólisis de la proteína. Por tanto, interferencias generadas durante la

ionización de la muestra o la supresión de la ionización se pueden corregir con una

adecuada selección del péptido que se va a medir (Brun V, Masselon C, Garin J,

Dupuis A, "Isotope dilution slrategies for absolu/e quantita/ive proteomics" 1.

Proteomics 72 (2009) 740). Sin embargo, esta estrategia tiene dos inconvenientes

30

fundamentales. El primero de ellos es que la certificación de los estándares de

proteínas debe realizarse mediante hidrólisis de aminoácidos para obtener una

concentración trazable al SI. Como consecuencia, los estándares de la proteína deben

estar purificados y no contener ningún péptido o aminoácido que no pertenezca a la cadena proteica. El segundo es el alto coste de esta estrategia debido a la enonne dificultad de la síntesis y purificación de las proteínas enriquecidas isotópicamente.

Los métodos descritos hasta la fecha para la cuantificación absoluta de proteínas mediante el uso de péptidos enriquecidos isotópicamente, en concreto el método AQUA, utilizan análogos enriquecidos isotópicamente en un número suficiente de átomos de deuterio, l3e ó 15N, que pennita evitar el solapamiento espectral en el espectrómetro de masas entre la distribución isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido isotópicamente. Esto peInlite obtener una relación isotópica utilizando las intensidades observadas a dos masas (o dos transiciones) libres de solapamiento espectral. Estas intensidades se utilizan junto con la cantidad de péptido enriquecido isotópicamente añadida para realizar la cuantificación absoluta de la proteína. Este tipo de procedimientos pueden conducir a errores significativos en la detenninación de proteínas por dos razones:

a) El uso de péptidos análogos enriquecidos isotópicamente en varios átomos de la molécula aumenta la probabilidad de efectos isotópicos no solo durante la preparación de la muestra sino también durante la separación cromatográfica y la ionización en la fuente de electroespray (ESI).

b) Utilizar relaciones isotópicas calculadas a partir de intensidades de dos masas conduce a errores en la deteInlinación final del péptido de abundancia isotópica natural. La relación isotópica no es igual a la relación de moles ya que las intensidades absolutas no tienen en cuenta el enriquecimiento isotópico del péptido enriquecido isotópicamente ni la abundancia isotópica relativa de cada uno de los isotopólogos constituyentes de los péptidos. Para una conversión correcta de la relación de intensidades a relación de número de moles es necesario realizar un calibrado metodológico que pennita establecer una función de correlación entre ambos. Dicho calibrado se suele realizar en ausencia de matriz, lo cual puede provocar errores significativos en las detetminaciones utilizando una fuente ESI.

Los inventores también han desarrollado un modo alternativo de cuantificación en dilución isotópica que hace uso de análogos del compuesto a detenninar

_.. _-------------

mínimamente enriquecidos en 13C y regresión lineal múltiple (González-Antuña A, Rodríguez-Oonzález P, Centineo G, Oarcía Alonso JI. "Evaluation 01 minimal /abellin¡;lor stab/e isotope di/ulion in organie ana/ysis". Analyst 2010;135:953--64; Oonzález-Antufia A, Rodríguez-Oonzález P, Lavandera 1, Centineo O, Ootor V, García Alonso JI. "Deve/opment 01 a routine method lor the simu/taneous conjirmation and determination 01 clenbutero/ in urine by minima/ labelling isotope pattern deconvolution and GC-EI-MS'. Anal. Bioana!. Chem. 2012; 402: 1879-88). La utilización de compuestos mínimamente enriquecidos isotópicamente pennite evitar efectos isotópicos durante las detenninaciones, y la regresión lineal múltiple pennite la obtención de la relación de moles entre el compuesto enriquecido isotópicamente y el compuesto de abundancia isotópica natural mediante la medida de las abundancias isotópicas con espcctromctría de masas. Sin embargo, cuando se han de utilizar espectrómetros de masas en tándem, como por ejemplo en la detenninación de péptidos, el empleo de compuestos mínimamente enriquecidos isotópicamente requiere un cálculo complejo de los perfiles de fragmentación tanto del compuesto de abundancia isotópica natural como del compuesto enriquecido isotópicamente (Ramaley L. , Cubero Herrera L. "Sojiware lor the ca/culalion 01 isotope patterns in tándem mass spectrometry" Rapid C:ornmun. Mass Spectrom. 2008; 22: 2707-14; Castillo A., Gracia-Lor E., Roig-Navarro A.F., Sancho J.V., Rodríguez-González P., Garcia Alonso 1.1.: Isotope pattern deconvolution-tandem mass speetrometry lor the determination and conjirmation 01 diclolenac in wastewaters". Anal. Chim. Acta. 765(2013)77-85).

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

A efectos de la presente invención y su descripción, se definen a continuación algunos conceptos utilizados que pueden ser desconocidos para un experto en la materia o utilizados de una fonna poco conocida o diferente de la habitual:

•

Isotopólogo: entidad molecular que difiere solamente en su composición isotópica (numero de sustituciones isotópicas).

•

Perjil isotópico: se defme como el conjunto de abundancias isotópicas relativas de todos los isolopólogos de una molécula. La suma de lodas las abundancias

•

Resolución de un analizador de masas. La resolución de un analizador de masas se puede definir de distintas formas. En el texto de la presente invención se define como "anchura de un pico de masa a mitad de su altura" (Fu/l Width al Ha/fMaximum, FWHM). Al aumentar el valor del FWHM de un analizador

isotópicas relativas de cualquier perfil isotópico es l. El perfil isotópico de una

molécula puede medirse experimentalmente mediante Espectrometría de

Masas.

•

Perfil isotópico natural: es el perfil isotópico de una molécula que se encuentra

en la naturaleza. Para la mayoría de los elementos de la Tabla Periódica que

constituyen las moléculas, el perfil isotópico natural es constante e invariable

en toda la Tierra. Las abundancias isotópicas naturales de los elementos están

tabuladas incluyendo sus incertidumbres debidas a la variabilidad natural.

•

Perfil isotópico enriquecido: es el perfil isotópico de una molécula donde la

abundancia relativa de uno o varios isótopos estables de uno o varios

elementos constituyentes de la molécula es claramente distinta de la natural.

En estos perfiles isotópicos enriquecidos, normalmente un isótopo se encuentra

en una abundancia isotópica relativa más elevada que en el elemento natural,

isótopo enriquecido, mientras que el resto de isótopos tienen una abundancia

menor. Esto hace que la abundancia relativa de los isotopólogos de la molécula

marcada isotópicamente difiera de la abundancia relativa de los isotopólogos

en la molécula natural.

•

Solapamiento espectral: cuando se mezclan en la misma disolución dos

perfiles isotópicos distintos del mi smo péptido, natural y enriquecido, existirá

solapamiento espectral si las abundancias isotópicas en algunas de las masas

del perfil isotópico son distintas de cero para los dos perfiles. Cuando se marca

un compuesto con un número pequefto de isótopos enriquecidos (n<4) hay una

alta probabilidad de solapamiento espectral mientras que cuando se utiliza un

número elevado de isótopos en el marcaje (n>4) la probabilidad de

solapamiento espectral disminuye.

•

Fracci6n molar del péptido natural: se define como la cantidad de moles

correspondientes al péptido de abundancia isotópica natural dividida por la

cantidad de moles totales del péptido (natural y enriquecido) en la muestra

analizada. La fracción molar se obtiene a partir de un perfil isotópico de una

mezcla del péptido natural y enriquecido obtenido experimentalmente

mediante Espectrometría de Masas.

•

Fracción molar del péptido enriquecido: se define como la cantidad de moles

correspondientes al péptido enriquecido de abundancia isotópica alterada

dividida por la cantidad de moles totales del péptido (natural y enriquecido) en

la muestra analizada. La fral;::ción molar se obtiene a partir de un perfil

isotópico de una mezcla del péptido natural y enriquecido obtenido

experimentalmente mediante Espectrometría de Masas.

•

Regresión lineal múltiple: es un procedimiento matemático que aquí permite

calcular la contribución de los perfiles isotópicos del péptido natural y del

péptido enriquecido en el espectro de masas experimental de una mezcla de

ambos. El resultado de este proceso matemático es la fracción molar de cada

uno de los dos perfiles isotópicos en la muestra. La relación de fracciones

molares equivale a la relación de moles entre el péptido natural y el péptido

enriquecido.

•

Espectrómetro de masas en tándem: es un tipo de espectrómetro de masas que

combina dos analizadores de masa y una celda de colisión entre ellos. El

primer analizador selecciona un ión característico del analito y lo envía a la

celda de colisión donde este ión sufre reacciones de fragmentación por colisión

con distintos gases. Los fragmentos cargados son analizados por el segundo

analizador de masas.

•

Monitorización de reacciones múltiples (MRM): es un modo de medida en

Espectrometría de Masas que se puede aplicar con espectrómetros en tándem

del tipo triple cuadrupolo (QqQ). En el primer cuadrupolo (primer analizador

de masas) se transmite solam(:nte los iones con la relación masa/carga (miz)

del analito (iones precursores). En la celda de colisión se rompen los iones

precursores en iones producto mediante disociación inducida por colisión con

moléculas neutras de un gas (nonnalmente nitrógeno). En el tercer cuadrupolo

(segundo analizador de masas) se transmite solamente la relación masa/carga

(miz) de uno o varios iones producto del analito. Este modo de medida

proporciona una mejor relación señal-ruido y una cuantificación más selectiva

y libre de interferencias espectrales. Por tanto, es el modo más adecuado para

la medida de péptidos por Espe:ctrometría de Masas.

5 aumenta el intervalo de masas que es transmitido por el analizador. Un analizador de masas de tipo cuadrupolo trabaja normalmente con valores de FWHM entre 0.5 y 1. Sin embargo, modificando los parámetros eléctricos del cuadrupolo se pueden aumentar los valores de FWHM lo que permite una transmisión de un intervalo de masas amplio en el cuadr:upolo.

10 • Digestión proteolítica: es la degradación de proteínas mediante enzunas específicas, llamadas proteasas, que tiene como resultado su rotma en varios péptidos constituyentes. En la mayoría de los casos se suele utilizar como enzima la tripsina (digestión tríptica), que hidroliza los enlaces peptídicos de la proteína específicamente en el lado carboxilo de Arginina (R) y Lisina (K)

15 generando péptidos de un tamaño adecuado para su análisis por Espectrometria de Masas (1000-2000 Da). La digestión triptica se realiza normalmente a 37°C durante tiempos no inferiores a 24 horas.

• Péptido: cadena lineal de aminoácidos con un número inferior a 50 unidades.

• Péptido característico de una proteína: es un péptido que procede de la

20 digestión de una proteina y que es exclusivo de la misma de modo que la presencia de dicho péptido en una muestra confirma la presencia de la proteína en dicha muestra y puede utilizarse para su cuantificación.

• Péptido isotópicamente diluido: es un péptido de abundancia isotópica alterada

que resulta de la mezcla del péptido de abundancia isotópica natural y del 2S mismo péptido enriquecido isotópicamente.

El objetivo de la presente invención es la cuantificación absoluta, exacta, precisa y directamente trazable al Sistema Internacional de unidades de péptidos, entendidos como cadenas de aminoácidos con menos de 50 unidades. El método de la

30 presente invención puede utilizarse también para la determinación de una o varias proteínas presentes en muestras biológicos mediante la cuantificación de sus péptidos característicos tras una hidrólisis de la proteína.

S

El método está basado en la determinación de péptidos de abundancia isotópica natural mediante: i) la adición de una cantidad conocida de análogos de estos péptidos, enriquecidos isotópicamente: que presenten solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural (en inglés "Mass Overlapping Pepades"), ii) monitorización de reacciones múltipl<es a valores de FWHM de entre 2 y 20 en el primer cuadrupolo de un espectrómc:tro de masas en tándem para la mezcla del péptido de abundancia isotópica natu.ral y del enriquecido isotópicamente, y ¡ii) la detenninación de las fracciones molares de cada perfil isotópico utilizando regresión lineal múltiple.

10

Por lo tanto, un aspecto de la presente invención es un método para la cuantificación absoluta de péptidos en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem que comprende los siguientes pasos:

lS

a) Selección de un péptido enriquecido isotópicamente, análogo químicamente al péptido a cuantificar, que presente solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en 1m espectro de masas.

b) Selección de uno o varios iones precursores y de uno o varios iones producto que permita la detección tanto dd péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente en un espectrómetro de masas en tándem.

20 2S

c) Medida experimental de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente utilizando un espectrómetro de masas en tándem con una modificación de la resolución en el primer cuadrupolo de modo que el valor del FWHM esté entre 2 y 20 Y la distribución isotópica medida ~:n los iones producto seleccionados en b) se corresponda con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia. isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente.

d) Adición a la muestra de Wla cantidad conocida del péptido enriquecido isotópicamente seleccionado en a).

e) Separación del péptido isotópicamente diluido de otros componentes de la muestra mediante cualquier técn.ica de separación fisica, química o bioquímica que separe el péptido isotópicamente diluido de sus interferentes.

f) Medida de la distribución isotópica en iones fragmento del péptido isotópicamente diluido aislado en el paso e) utilizando el modo de medida optimizado en el paso e) en lUl espectrómetro de masas en tándem.

g) Cálculo de las fracciones moJares tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal múltiple expresando la distribución isotópica obtenida experimentalmente en el paso f) como lUla combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente medidas en el paso c).

h) Cálculo del número de moles de péptido de abundancia isotópica natural a partir de la relación de las fracciones molares determinadas en el paso g) y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente añadidos a la muestra en el paso d).

En una realización preferida, la muestra es un fluido biológico, un cultivo celular o cualquier otra muestra biológica que contenga péptidos o proteínas, como por ejemplo tejidos de órganos, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico o esperma. En una realización más preferida, el método además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, previo o posterior del paso d) ya que el péptido enriquecido isotópicamente se puede degradar durante el proceso de hidrólisis de la muestra. En otra realización más preferida, el método además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior del paso e) ya que el péptido enriquecido isotópicamente se puede degradar durante el proceso de separación lisiea, química o bioquímica. En una realización aún más preferida, In hidrólisis es enzimática y el péptido constituyente a cuantificar es característico de la proteína.

En otra realización preferida, I!I péptido enriquecido isotópicamente contiene entre 1 y 4 átomos de alguno de los isótopos enriquecidos De ó ISN en cualquier combinación.

En otra realización preferida, el péptido enriquecido isotópicamente se sinteti7.a químicamente utilizando distintas combinaciones de aminoácidos enriquecidos isotópicamente en Ile ó I SN.

En otra realización preferida, el ¡ón precursor seleccionado en el paso b) posee carga +2 ó +3 y el ión producto seleccionado posee carga +1.

En una realización especifica, el espectrómetro de masas en tándem es de tipo triple cuadrupolo. En una realización más específica, el espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo es con trampa lineal en el tercer cuadrupolo.

En otra realización especifica. el espectrómetro de masas en tándem es un equipo de tipo cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF).

En otra realización especifica del método, en el paso c) además se aumenta la resolución en el tercer cuadrupolo reduciendo el FWHM a un valor entre 0.7 y 0.4, hasta que la distribución isotópica me:dida en los iones producto se corresponde con las distribuciones isotópicas teóricas. Estas distribuciones isotópicas teóricas se pueden calcular mediante métodos matemáticos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el pépfido enriquecido isotópicamente.

En otra realización especifica, el método fisico para la separación en la etapa e) del pépfido a cuantificar del resto de la muestra es la centrifugación.

En otra realización especifica, el método químico para la separación en la etapa e) del péptido a cuantificar del resto de la muestra es la cromatografia de intercambio iónico, reparto O afinidad..

En una realización preferida, la separación del péptido O cuantificar del resto de la muestra se realiza por cromatografia líquida acoplada al espectrómetro de masas en tándem.

En una realización más preferida, la medida de las abundancias isotópicas en el espectrómetro de masas en tándem de los pasos c) y f) se realiza a partir de las áreas de pico obtenidas para el péptido de interés tras la separación cromatográfica.

En otra realización preferida, el método bioquímico para la separación en la etapa e) del péptido a cuantificar del rt::sto de la muestra es la inmunoprecipitación.

En otra realización preferida, en el paso f) se mide un mínimo de 2 y un máximo de 6 transiciones para cada combinación ión precursor -ión producto seleccionado.

En otra realización preferida, las abundancias isotópicas para el péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente medidas en el paso c) y utilizadas en la regresión lineal múltiple del paso g) se detenninan matemáticamente mediante un programa de ordenador.

Otro aspecto de la presente: invención es el uso del método descrito anteriormente para la cuantificación de un péptido en una muestra como herramienta de diagnóstico clínico.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras de alimentos y la certificación de su seguridad alimentaria.

Otro aspecto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras farmacéuticas.

Otro objeto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras en biomedicina.

Otro objeto de la presente invención es el uso del método descrito anteriormente para el análisis de muestras en metrología química.

Este método permite obtener directamente la relación de moles entre el péptido a detenninar y su análogo enriquecido isotópicamente a partir de la determinación de la composición isotópica de la mezcla. La composición isotópica de la mezcla se mide mediante monitorización de reacciont:s múltiples en las que se emplea una FWHM entre 2 Y 20 en el primer cuadrupolo del espectrómetro de masas. Bajo estas condiciones, el primer cuadrupolo trasmite todo el clúster isotópico de la mezcla de los péptidos (de abundancia natural y su análogo enriquecido isotópicamente) con el objetivo de poder recoger en el segundo analizador todos los fragmentos generados tras la fragmentación del ión precursor en una celda de colisión y realizar una medida exacta de la composición isotópica del péptido isotópicamente diluido midiendo iones producto. La composición isotópica del péptido isotópicamente diluido se expresa como una combinación lineal de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido eruiquecido isotópicamente, de modo que la fracción molar de ambos en la mezcla se calcula mediante regresión lineal múltiple. A partir de la relación de las fracciones molares, se obtiene la concentración del péptido de interés ya que la cantidad de moles del péptido enriquecido añadida al inicio del proceso es conocida. En el caso del uso de la determinación de un péptido para inferir la concentración de una proteína en la muestra se asume que la concentración molar del péptido es igual a la de la proteína de la que proviene.

En una realización de la presente invención, se hace uso de la cromatografia líquida acoplada a Espectrometria de Masas en tándem como algunos de los métodos descritos en el estado de la técnica pero, a diferencia de estos métodos, utiliza análogos de los péptidos a determinar enriquecidos isotópicamente en De ó ISN con un número pequeño de isótopos enriquecidos (entre 1 y 4) que permita obtener un solapamiento espectral entre el perfil isotópico del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente. Este hecho, en combinación con la monitorización de reacciones múltiples (MRM) empleando valores de FWHM entre 2 y 20 en la medida del primer analizador de masas permite la obtención precisa y exacta de perfiles de abundancia isotópica en el péptido de abundancia isotópica natural, en el péptido enriquecido isotópicamente y en el péptido isotópicamente diluido. El uso de la regresión lineal múltiple permite, finalmente, a partir de las abundancias isotópicas del péptido isotópicamente diluido, la obtención de la fracción molar del péptido de abundancia isotópica natural y la fracción molar del péptido enriquecido isotópicamente en la muestra. Además, la presente invención puede ser aplicable a la detenninación de proteínas cuando se usa la digestión triptica para obtener los péptidos característicos de la proteína de interés.

La utilización de péptidos enriquecidos isotópicamente con solapamiento espectral tiene dos ventajas: i) se minimizan los efectos isotópicos entre el péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido isotópicamente, y ii) se favorece la transmisión de todo el clúster de iones precursores del péptido isotópicamente

5 diluido a través del primer analizador de masas cuando se aumenta la FWHM hasta valores entre 2 y 20. Este concepto es totalmente nuevo y contrario a los métodos descritos en el estado de la técnic,a donde se requiere evitar a toda costa el solapamiento espectral entre el compuesto de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente. Para ello se utilizan péptidos enriquecidos isotópicamente

10 con un número alto de isótopos enriquecidos (por ejemplo, 6 átomos de l3e en el método AQUA) que pueden producir efectos isotópicos durante la preparación de la muestra o la separación cromatográfica. Por tanto, la presente invención supone una mejora cuantitativa respecto a los métodos actuales.

Por otro lado, la utilización de regresión lineal múltiple permite obtener

15 directamente las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente a partir del espectro de masas de iones producto. Esto proporciona dos ventajas fundamentales respecto a los métodos descritos en el estado de la técnica: i) la relación de moles se obtiene a partir de la relación de fracciones molares en lugar de la relación de áreas de pico (método AQUA)

20 proporcionando una mejor exactitud y precisión en las determinaciones, y ii) se evita la realización de un calibrado metodológico para evaluar la dependencia entre relación de intensidades y relación de moles, lo cual disminuye considerablemente el tiempo de análisis.

La invención resulta de aplicación en aquellos sectores en los que sea necesaria

25 la cuantificación de péptidos en una muestra, como puede ser en fluidos biológicos o en cultivos celulares, como por ejemplo en los sectores de la agricultura, la química, la farmacia, la biomedicina o la seguridad alimentaria.

DESCRJPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Ilustración del conC4~pto de solapamiento espectral para un péptido

de secuencia ALDF A VGEYNK medido por espectrometria de masas en el ión

(M+2H)'+. El eje de ordenadas se corresponde a la abundaocia (Al y el eje de abscisas

S

se corresponde a la relación masa/carga (miz). Las barras negras corresponden con el

perfil isotópico de abundancia isotópica natural mientras que las barras blancas

corresponden con el perfil isotópico dl~l mismo péptido enriquecido en dos átomos de

De enriquecidos al 99%. Se observa que existe solapamiento espectral desde la

relación m/z 614.0 hasta la relación miz 616.0. Las barras grises corresponden con el

10

perfil isotópico del mismo péptido enriquecido en 6 átomos de lJe enriquecidos al

99%. Como se puede observar no existe prácticamente solapamiento espectral con el

perfil isotópico natural (barras negras). Para evitar efectos isotópicos a lo largo del

proceso, el marcaje con dos átomos de \3e es preferible al marcaje con 6 átomos de

"c (método AQUA yQconCAT).

15

Figura 2. Monitorización de reacciones múltiples a resolución convencional

(FWHM=O.7) utilizando un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo para la

medida de un péptido de secuencia. ALDF A VGEYNK y abundancias isotópicas

naturales con un ión precursor doblemente cargado a miz 613.5 (Fig.2A), Y su análogo

enriquecido en dos átomos de De con un ión precursor doblemente cargado a miz

20

614.5 (Fig.2B). Ql se refiere al primer cuadrupolo donde se selecciona la relación miz

613.5 para el péptido natural y la relación miz 614.5 para el péptido enriquecido

isotópicamente. Q2 se refiere a la celda de colisión donde el péptido seleccionado en

Ql da lugar a fragmentos de distintas relaciones miz. Q3 se refiere al tercer

cuadrupolo donde se analizan los fragmentos obtenidos en la celda de colisión Q2. Se

2S

observa que el perfil isotópico medido en el tercer cuadrupolo da lugar a un solo pico

a masas 709 y 1042 para el péptido natural y a masas 7 Il Y 1044 para el péptido

enriquecido isotópicamente.

Figura 3. Monitorización de reacciones múltiples en un espectrómetro de

masas de triple cuadrupolo a un valor de FWHM de aproximadamente 13 en el primer

30

cuadrupolo. para la medida de un péptido de secuencia ALDF A VGEYNK y

abundancia isotópica natural con un ión precursor doblemente cargado a miz 613 .5

(Fig.3A), Y su análogo enriquecido en dos átomos de De con un ión precursor

doblemente cargado a miz 614.5 (Fig.3B). Ql se refiere a! primer cuadrupolo donde

se selecciona la relación mJz 613 tanto para el péptido de abundancia isotópica natural

como para el péptido enriquecido isotópicamente. Q2 se refiere a la celda de colisión

S

donde las distintas relaciones mJz seleccionadas en Ql dan lugar a fragmentos de

distintas relaciones mJz. Q3 se refiere al tercer cuadrupolo donde se analizan los

fragmentos obtenidos en Q2. Se observa que el perfil isotópico medido en el tercer

cuadrupolo da lugar a cuatro picos para cada fragmento (a relaciones mJz 709-714 y

1042-1047, respectivamente) cuyas abundancias isotópicas se corresponden con las

10

calculadas teóricamente.

Figura 4. Espectro de masas obtenido con espectrómetro de masas de tipo

triple cuadrupolo en el modo barrido de iones precursores seleccionando un rango de

relaciones mJz de 600 a 630 mJz en el ,primer cuadrupolo (Q 1) Y además, en la Fig.4A,

seleccionando en el tercer cuadrupolo (Q3) los iones producto con relaciones miz 709,

15

710,71 I Y 712 para el péptido de abundancia natura! yen la Fig.4B, seleccionando en

el tercer cuadrupolo (Q3) los iones producto con relaciones mJz 711, 712, 713 Y 714

para el péptido enriquecido isotópicamente en dos átomos de l3e. El eje de ordenadas

indica la abundancia relativa (A) de las señales obtenidas y el eje de abscisas indica la

relación masa/carga (mJz). Se observa que los valores de FWHM son de

20

aproximadamente 13, tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para

el péptido enriquecido isotópicamente. Este hecho permite la selección de una única

masa en el primer cuadrupolo para la transmisión simultánea de todo el perfil

isotópico tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido

enriquecido isotópicamente. La zona marcada con un rectángulo de trazos indica el

2S

intervalo de relaciones mJz que se puede seleccionar en Ql para asegurar una

transmisión cuantitativa de todas las re:laciones mJz seleccionadas.

Figura S. El gráfico de la Fig.5A muestra el espectro de masas obtenido con

un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo en el modo barrido de iones

precursores seleccionando un intervalo de relaciones mJz de 600 a 625 mJz en el

30

primer cuadrupolo (Ql) para una mezcla de un péptido de abundancia isotópica

natural y su análogo enriquecido isotópicamente en dos átomos de Be seleccionando las relaciones miz 709, 710, 711 Y 712 como iones producto en el tercer cuadrupolo (Q3). El eje de ordenadas indica la intensidad medida (1) y el eje de abscisas indica la relación miz. La flecha indica el intervalo donde se calcularía el valor de FWHM=13 para la relación miz 709. Se observa que se puede seleccionar una relación miz detenninada en Ql (por ejemplo la masa 610, centro de ventana) que pennite la detección de las relaciones miz 709, 710, 711 Y 712 en Q3 en la zona constante del espectro de masas. El gráfico de la Fig.5B muestra las detenninación de la concentración (e) del péptido enriquecido isotópicamente mediante el método propuesto utilizando distintos centros de ventana en QI (desde 605 hasta 616 miz) y dos fragmentos moleculares (709-712 y 1042-1044) en Q3. Se observa que desde masa 608 hasta 615 aproximadamente todos los centros de ventana dan lugar a la misma concentración para los dos fragmentos considerados.

EXPLICACIÓN DE UNA FORMA DE REALIZACIÓN PREFERENTE

Para una mejor comprensión de la presente invención, se exponen los siguientes ejemplos de realización preferente, descritos en detalle, que deben entenderse sin carácter limitativo del alcance de la invención.

EJEMPLO J

Se explica paso por paso la forma de poder cuantificar el péptido de secuencia ALDFA VGEYNK que corresponde a un péptido característico de la proteína cistatina e (biomarcador renal) utilizando tComo trazador isotópico el mismo péptido enriquecido en dos átomos de l3e en un espectrómetro de masas de tipo triple cuadrupolo. De la descripción realizada en este ejemplo se puede deducir la fonna general de cuantificación de cualquier otro péptido, con las modificaciones adecuadas en caso de ser necesarias. En el caso de la detenninación de una proteína el procedimiento es totalmente análogo pero incluiría un paso de digestión proteolítica, tal como el que se muestra en el ejemplo 2.

Cabe destacar que los puntos 1 a 6 de la explicación de una forma de realización preferente incluyen una serie de actividades encaminadas a la puesta a punto de la metodología y sirven para: establecer una mejor comprensión de! proceso seguido y su validación. El ejemplo de aplicación de la invención propiamente dicha se deduce de todos los pasos anteriores y se recoge en el punto 7.

1. Selección del marcaje isotópico delpéptido.

1.1. Para la determinación del péptido de secuenCia ALDFAVGEYNK y fórmula química CS6HS3N1301S se calcularon las abundancias isotópicas teóricas del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente, suponiendo que se puede obtener el péptido enriquecido isotópicamente en un número cualquiera de isótopos enriquecidos. Para este cálculo se hizo uso de un programa de ordenador desarrollado en el grupo de investigación al que pertenecen los inventores. Por ejemplo, la Fig. 1 muestra e! perfil isotópico teórico calculado para el péptido de abundancia natural y para el enriquecido en 2 y 6 átomos de D C, respectivamente. Con e! objeto de que existiera solapamiento espectral entre el péptido natural y el enriquecido isotópicamente se seleccionó el péptido enriquecido en 2 átomos de D C. El péptido enriquecido en 6 átomos dI;: De, preferido en otros métodos descritos en el estado de la técnica, no fue adecuado en e! contexto de la presente invención ya que no presentaba solapamiento espectral con el péptido de abundancia natural.

1.2 Se adquirió comercialmente el péptido seleccionado en el paso anterior tanto de abundancia isotópica natural como enriquecido en dos átomos de De donde la glicina (G) se sustituyó por glicina marcada universalmente en DC. Se prepararon sendas disoluciones patrón del péptido de abundancia natural y del enriquecido isotópicamente.

2. Optimización de la medida de la composición isotópica del péptido mediante monitorización de reacciones múltiples (MRM).

2.1 Se midieron en modo "barrido de iones precursores" (precursor ion scan) los patrones del péptido de interés, tanto de abundancia isotópica natural como enriquecido isotópicamente para la selección, en el primer cuadrupolo (Ql), del ión precursor más adecuado. Se seleccionó un ión precursor doblemente cargado cuyo ión principal aparecía a relación miz de 613.5 para el péptido de abundancia natural y a miz 614.5 para el péptido enriquecido en dos átomos de \3e.

2.2 Se realizó un análisis en modo "barrido de iones producto" (product ion sean) del ión precursor seleccionado c~n el paso anterior para la selección tanto de la energía de colisión a utilizar en la celda de colisión (Q2) como de los iones producto que se generasen. En el caso del péptido enriquecido isotópicamente los iones producto debían mantener la marca isotópica. Se seleccionaron dos iones producto con una sola carga positiva a relaciones miz de 709 y 1042 para evaluar el procedimiento. En estos iones producto, el compuesto enriquecido isotópicamente presentaba su pico principal a relaciones rn/z 711 y 1044, lo que confirmó la presencia de la marca isotópica en los iones producto.

2.3 Se seleccionaron distintas tmnsiciones para trabajar en el modo MRM. Estas transiciones se correspondían con los iones producto más abundantes del péptido natural y del enriquecido isotópicamente. En primer lugar se trabajó en el modo convencional de trabajo de un triple cuadrupolo a FWHM de 0.7. La Fig. 2A muestra el esquema del modo MRM convencional para el péptido seleccionado de abundancia isotópica natural con un ión precursor doblemente cargado a rn/z 613.5 y para el mismo péptido enriquecido en dos átomos de \3e. El primer y tercer cuadrupolo (Ql y Q3, respectivamente) operaban con la resolución típica para este tipo de espectrómetros de masas con tm valor de anchura total a la mitad del máximo del pico (FWHM) de 0.7 unidades de masa. En el cuadrupolo QI se seleccionó una relación miz (ión precursor natural, 613.5) que fue filtrada para pasar a la celda de colisión (Q2) donde el ión precursor se fragmentaba produciendo diferentes iones producto (709, 1042 Y otros) entre los que se seleccionaron los más sensibles para ser analizados en el tercer cuadrupolo (miz 709 y 1042). La Fig. 2B muestra el mismo proceso para el péptido enriquecido en dos átomos de \3e, donde los iones producto aparecían a miz 711 y 1044 respectivamente. Este modo de trabajo convencional en los cquipos de triple cuadrupolo es el que se aplica en los métodos de determinación de péptidos y proteínas descritos en el estado de la técnica (por ejemplo en el método AQUA). Estos métodos precisan que no exista solapamiento espectral entre el péptido de abundancia natural y el enriquecido isotópicamente para obtener resultados satisfactorios en la medida de las intensidades pero tienen el problema de los efectos isotópicos, tal como se ha indicado anterionnente.

3. Disminución de la resolución del primer cuadrupolo.

La presente invención evita. los efectos isotópicos utilizando péptidos enriquecidos isotópicamente que presenten solapamiento espectral con el péptido natural. Para utilizar esta ventaja de modo adecuado, se requería la disminución de la resolución espectral del primer cuadru.polo aumentando la FWHM a valores entre 2 y 20 unidades de masa de fonna que, al seleccionar una determinada relación miz en el primer cuadrupolo, éste fuera capaz de transmitir completamente todo el perfil isotópico del Ión precursor seleccionado a la celda de colisión. Se seleccionó un ión precursor con dos cargas positivas para que el intervalo de relaciones miz de todo el perfil isotópico fuera menor (a más carga, menor intervalo de miz) y se facilitase su transmisión cuantitativa. El intervalo de valores de FWHM con el que decidió trabajar fue de 2~20 unidades de miz. En la Fig. 3 se muestra un esquema del análisis de los mismos péptidos de la Fig. 2 cuando Sj~ disminuyó la resolución del primer cuadrupolo hasta un valor de FWHM= 13 y donde se seleccionó un valor de miz nominal (ión precursor) de 6 I3 tanto para el péptido natural (Fig. 3A) como para el péptido enriquecido isotópicamente (Fig. 38). Esta selección del valor de miz nominal del ión precursor pennitió que, junto con la resolución modificada del primer cuadrupolo, se transmitiera el clúster molecular completo del péptido (desde miz 613.5 hasta miz

615.0 para el péptido de abundancia isotópica natural o desde 614.5 a 616.0 para su análogo enriquecido isotópicamente) hacia la celda de colisión donde se fragmentaba. Los iones fragmento generados se transmitieron a través del tercer cuadrupolo para obtener su distribución isotópica. En este caso, los fragmentos más sensibles seleccionados correspondían a valore:s de miz 709 -712 Y miz 1042-1045 para el péptido de abundancia natural y miz 711 -714 con miz 1044-1047 para el péptido enriquecido isotópicamente.

Dependiendo del rango de ma.sas en el que se trabaje, se podría requerir un aumento de la resolución del tercer cuadrupolo para disminuir la contribución de masas adyacentes y aumentar la exactitud y precisión de la medida de la distribución isotópica del péptido. Por ejemplo, en el caso del péptido de la Fig. 38, un aumento de la resolución en el tercer cuadrupolo desde el valor convencional de FWHM= 0.7 hasta un valor de 0.6 proporcionaba una mejor exactitud en la medida de la distribución isotópica de los iones fragmento del péptido a miz 1042-1047.

4. Cálculo de las distribuciones isotópicas teóricas de los fragmentos moleculares del 5 pépttdo natural y enriquecido isotópicamente.

El cálculo de la distribución isotópica de los fragmentos moleculares de los péptidos de abundancia isotópica natural y enriquecido isotópicamente se realizó utilizando el mismo programa de ordenador que el señalado en el apartado 1.1 pero no para el péptido completo sino para sus fragmentos. Estas distribuciones isotópicas así

10 calculadas se utilizaron posteriormente en los cálculos de regresión lineal múltiple. Las abundancias isotópicas calculadas matemáticamente para los fragmentos analizados se recogen en la Tabla l.

Tabla 1. Abundancias isotópicas te6ricas de los iones producto (1042-1045 y 709712) de un péptido de secuencia ALDFAVGEYNK de abundancias isotópicas

15 naturales y de su análogo enriquecido en dos átomos de l3c.

Péptido B CZ

Iones producto 709-712

F'éptido natural

0.6687

0.0004

0.2511

0.0094

0.0622

0.6808

0.0114

0.2400

Péptido B CZ

Iones producto 1042-1045

P'éptido natural

0.5438

0.0010

0.0141

0.3098

0.1019

0.5567

0.0257

0.3010

5. Comparación de las distribuciones isotópicas teóricas de los fragmemos moleculares del péptido de abundancia isotópica natural y del enriquecido isotópicamente con sus distribuciones isotópicas medidas experimentalmente .

. . _-----_._._--------------

Las distribuciones isotópicas del péptido de abundancia natural y de su análogo enriquecido se midieron experimentalmente según las condiciones seleccionadas en el punto 3. Las distribuciones isotópicas experimentales obtenidas se compararon con las teóricas que aparecen en la Tabla l. Se observó que los valores de FWHM=13 en el primer cuadrupolo y FWHM=0.6 en el tercer cuadrupolo proporcionaban resultados satisfactorios.

6. Selecci6n de la masa nominal en el primer cuadurpolo (Ql) para el péptido de abundancia isotópica natural, el enriquecido isotópicamente y sus mezclas.

6.1 Se realizó la medida de una disolución patrón del péptido de interés en modo "barrido de iones precursores" (precursor ion sean). Este modo de adquisición pennitió la selección de la masa nominal en el primer cuadrupolo (QI). Tomando como ejemplo el péptido natural de la Fig. 3, se escogió un rango de masas de 600 a 630 en QI ya que la relación mJz del ión precursor del péptido natural era 613.5 mientras que en el tercer cuadrupolo (Q3) se seleccionaron los iones fragmento de m/z 709,710,711 y 712. En la Fig. 4A se puede observar el resultado de la adquisición del péptido natural en el modo barrido de iones precursores con las resoluciones de Q 1 Y Q3 previamente optimizadas. Se pued(~ ver cómo desde un centro con un miz de 604 a miz 617 se transmitía todo el rango de masas 709-712 correspondiente a la distribución isotópica del fragmento molecular de interés. De manera análoga, cuando se analizó el péptido enriquecido en dos átomos de He se puede observar en la Fig. 4B que estableciendo un centro de ventana en el intervalo desde 608 a 616, se transmitía completamente el rango de masas desde 711 a 714 correspondiente a la distribución isotópica del fragmento molecular de interés.

El centro óptimo de Ql debía situarse en un valor de miz que pennitiese transmitir completamente y de fonna simultánea las distribuciones isotópicas de los fragmentos moleculares del péptido de abundancia isotópica natural y de su análogo enriquecido isotópicamente. Según los espectros de masa de la Fig. 4, el centro de ventana del Ql debería situarse aproximadamente entre 608 y 614 (en la FigA se muestra esta zona, marcada con un rectángulo de trazos).

6.2. Finalmente, y para confinnar la correcta selección del centro de masa en Ql, se mezcló una cantidad conocida de péptido de abundancia isotópica natural con una cantidad conocida de la disolución de péptido enriquecido en De. En la Fig. 5A se muestra el espectro de masas obtenido en el modo barrido de iones precursores de la mezcla de péptidos. Las rnJz a 709 y 710 proceden mayoritariamente del péptido de abundancia isotópica natural, mientras que las rnJz a 711 y 712 proceden mayoritariamente del péptido enriquecido isotópicamente. Como se puede observar, existe un amplio intervalo de relaciones rnJz en Ql (entre 608 y 614 aproximadamente) que pennitían la transmisión completa de todas las masas seleccionadas. Finalmente, se detenninó la relación de fracciones molares entre el péptido de abundancia isotópica natural y el péptido enriquecido en lJC mediante regresión lineal múltiple seleccionando distintos centros de ventana en Ql. En la Fig. 58 se muestran los valores obtenidos en la concentración del péptido enriquecido isotópicamente con los diferentes centros de masa seleccionados. En este experimento se utilizaron los dos fragmentos moleculares (709-712 y 1042-1045) para conftnnar los resultados. Se puede observar cómo, desde un centro de rnJz en Ql de 608 a 614 UJÚdades de masa, el valor de la conCl~ntración obtenida era constante e idéntico para los dos fragmentos seleccionados. Se confinnó que, en ese intervalo, el centro de masas seleccionado en Ql pennitía la transmisión cuantitativa tanto del ión precursor del péptido de abundancia isotópica natural como de su análogo enriquecido isotópicamente de fonna simultánea, para obtener los correspondientes fragmentos en Q3. Se validó de esta manera el procedimiento y se procedió a su aplicación a muestras reales fortificadas.

7. Cuantificación del péptido de interés en una muestra real.

Se describe a continuación e:l método para la cuantificación absoluta del péptido en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem tanto en agua (ausencia de matriz) como en un suero humano (presencia de matriz).

7.1 Se seleccionó un péptido enriquecido isotópicamente análogo al péptido a cuantificar y que presentaba solapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en un espectro de masas. En el caso de este ejemplo, se escogió el péptido ALDF A VGEYNK enriquecido en dos átomos de l3e.

7.2 Posteriormente se seleccionaron uno o varios iones precursores y uno o varios iones producto que permitían la detección del péptido de abundancia isotópica natural y de su análogo enriquecido isotópicamente. En el caso de este ejemplo, para la determinación del péptido ALDFA VGEYNK se seleccionó como ion precursor

5 para todas las transiciones el ion a miz 614, y como iones producto los iones 709, 710, 711,712,1042,1043,1044 Y 1045.

7.3 Se determinó experimentalmente la composición isotópica del péptido de abundancia natural y del péptido enriquecido isotópicamente mediante espectrometría de masas en un espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo con un

10 aumento de la FWHM de entre 2 y 20 en el primer analizador, de modo que la distribución isotópica medida en los iones producto seleccionados en 7.2 se correspondía con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente.

7.4 Posteriormente se realizó la adición de una cantidad conocida del péptido

15 enriquecido isotópicamente seleccionado en 7.1 a la muestra. Para llevar a cabo el procedimiento se pesaron aproximadamente 0.5 g de agua o de un suero libre del péptido y a continuación se añadieron aproximadamente 0.10 g de una disolución de péptido de abundancia isotópica natural de 1.91 }lg gol Y 0.10 g de una disolución de péptido enriquecido isotópicamente de 1.97 J.1g g-l. En la Tabla 2 se muestran las

20 cantidades exactas tomadas de muestra y las cantidades añadidas de péptido de abundancia isotópica natural y enriquecido isotópicamente, respectivamente.

Tabla 2. Cantidades de muestra, péptido de abundancia isotópica natural y análogo enriquecido isotópicamente utilizadas para el desarrollo del procedimiento.

Tipo de Muestra

Muestra (g) l'éptido N aturol (g) Péptido eoriquecido (g)

Agua

0.4980 0.0995 0.0990

Suero

0.5065 0.1385 0.0936

2S 7.5. Posteriormente, se separó el péptido isotópicamente diluido (mezcla de péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente) de otros componentes de la muestra mediantl! una técnica de separación fisica, química O bioquímica apropiada. Dependiendo del péptido elegido, su concentración y la complejidad de la muestra, podría ser necesario realizar uno o varios pasos de separación incluyendo separaciones cromatográficas para eliminar interferencias. En este ejemplo, se utilizó una separación por cromatografia líquida. Las muestras disueltas en 0.1 % de ácido trifluoroa(!ético (TF A) se sometieron a dos purificaciones mediante HPLC preparativa (fase :reversa e intercambio catiónico). En ambas cromatografias se seleccionaron las fracciones de interés. Tras el intercambio catiónico se eliminaron las sales con columnas de extracción en fase sólida con un recubrimiento C18. Finalmente, las muestras se disolvieron en 0.05 mL de agua con

0.1 % de ácido fónnico y se inyectaron en el cromatógrafo de líquidos acoplado al espectcómetro de masas para medir su distribución isotópica.

7.6. Se midió la distribución isotópica del péptido isotópicamente diluido (mezcla de péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente) mediante espectrometría de masas en tándem. El pico cromatográfico correspondiente al péptido de interés se midió en las condiciones seleccionadas de resolución y para las transiciones escogidas en 7.3. No se observaron cambios en los tiempos de retención para el marcaje isotópico seleccionado, lo que indicó que no existían efectos isotópicos. En este caso, la FWHM dd primer cuadrupolo se ajustó a 13, la del tercer cuadrupolo a 0.6 y se seleccionaron 4 transiciones para el fragmento de masa 709 (709,710,711 Y 712) Y otras cuatro transiciones para el fragmento 1042 (1042,1043, 1044 Y 1045). La distribución isotópica se calculó dividiendo el área de pico detenninada para cada transición por la suma de áreas de pico obtenidas para las cuatro transiciones de catla fragmenlo correspondiente.

7.7. Se calcularon las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal múltiple expresando la distribución isotópica del péptido isotópicamente diluido (Amix) obtenida experimentalmente en el p.aso 7.6 como una combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural (Anat) y del péptido enriquecido isotópicamente (Acnr) respectivamente obtenidas en el paso 7.3. Para este propósito se aplicó la ecuación (1) para la medida de n miz, donde A se

refiere a la abundancia relativa de cada uno de los isotopólogos constituyentes de la

molécula.

A'mu A'mu

A'.

mu

A":-1

mu

A;u

~

A!,,/

A~r

A' ~

A;lIr

A!,/

A~r

A,,-I =,

A,,-I '"'

A:/

A;lIr

e'

e'

e'

[x~, ]

(1)

. x +

ellr

e,,-I

e"

5

Las soluciones a la ecuación (1) fueron las fracciones molares del péptido de abundancia isotópica natural (xnat) y el péptido enriquecido isotópicamente (xenr).

10

7.8. Se calcularon el número de moles de péptido de abundancia isotópica natural (Nnat) a partir de la relación de las fracciones molares detenninadas en el paso 7.7 y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente (Nenr) añadidos a la muestra en el paso 7.4. A partir de la relación de estas fracciones molares se obtuvo directamente el número de moles de péptido natural según la ecuación (2).

N""/ Nenr

= X"OI Xellr (2)

1S 20

Utilizando este procedimiento no se necesitó recurrir a un calibrado metodológico para el cálculo de la relación de moles entre el péptido de abundancia isotópica natural y su análogo enriquecido isotópicamente, ya que la relación de fracciones molares era igual a la relación de moles. Los resultados finales obtenidos se muestran en la Tabla 3, donde se pueden observar las fracciones molares obtenidas así como el número de moles de péptido determinado y las recuperaciones obtenidas respecto a la cantidad añ.adida inicialmente. Los datos de la Tabla 3 muestran que se recuperaba aproximadamente el 100% de la cantidad de péptido de abundancia isotópica natural añadida utilizando tanto los iones fragmento del clúster a 709 como los correspondientes al clúster a masa 1042.

Tabla 3. Resultados obtenidos en el cálculo del número de moles de un péplido de secuencia ALDFAVGEYNK añadido en una muestra de agua y suero humano.

Muestra

Xt nr Xn1t Ntnr (omol) aiiiadidos Nnat (omol) añadidos Nnat (omol) obtenidos Recuperación (%)

Agua (Cluster 709)

0.5169 0.5217 0.147 0.144 0.148 103

Agua (Cluster 1042)

0.5393 0.5407 0.147 0.144 0.148 103

Suero (Cluster 709)

0.5 129 0.5276 0.\39 0.145 0.143 99

Suero Cluster 1042)

0.5248 0.5419 0.\39 0.145 0.143 99

EJEMPLO 2

s

En este ejemplo se describe el método para la cuantificación absoluta de un

péptido característico de una proteína que está presente en una muestra. La proteína

seleccionada en este ejemplo es la cistatina e y el péptido proteotípico a cuantificar es

el de secuencia ALDF A VGEYNK que corresponde a un péptido característico de la

proteína cistatina e (biomarcador renal). Se utilizó como trazador isotópico el mismo

10

péptido enriquecido en dos átomos de 13e en un espectrómetro de masas de tipo triple

cuadrupolo. Para esta realización se empleó el mismo método que el descrito en el

ejemplo 1, aunque con un paso de hidrólisis para la romper las proteínas y liberar sus

péptidos antes o después de la adición del péptido enriquecido isotópicamente a la

muestra.

lS

Para ello se realizó una digestión proteo lítica con tripsina para simular la

fragmentación de proteínas en sus péptidos constituyentes. El proceso de digestión

empleado aquí tenía como objetivo la comprobación de la exactitud del procedimiento

en condiciones donde debía realizarse una digestión enzimática de proteínas y así

asegurar

una ausencia de degradación tanto del péptido de abundancia isotópica

20

natural como del péptido eruiquecido isotópicamente (si se añade antes de la

digestión). El procedimiento seguido fue el siguiente: se llevó a cabo la digestión tríptica durante 24 horas. A continuación, se añadió ditioeritritol (agente reductor) y se incubó a 37 oC durante 1 hora. Tras este tiempo, se centrifugó y los sobrenadantes se evaporaron a sequedad. Posteriormente, se reconstituyó en agua (0.7 mL) y se volvió a centrifugar. Se añadió iodoacetamida (agente alquilante) a los sobrenadantes y se agitó en oscuridad durante 1 h. Se eliminó el exceso de iodoacetamida añadiendo ditioeritritol y finalmente se añadió 0. 1. mL TF A al 15 %.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   l. Método para la cuantificación absoluta de péptidos en una muestra mediante espectrometría de masas en tándem que comprende los siguientes pasos:

   a) selección de un péptido enriquecido isotópicamente, análogo químicamente al péptido a cuantificar, que presl~nte ~olapamiento espectral con el péptido de abundancia isotópica natural en UD espectro de masas;

   b) selección de uno o varios iones precursores y de uno o varios iones producto que pennita la detección tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente en un espectrómetro de masas en tándem;

   e) medida experimental de la composición isotópica del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente utilizando un espectrómetro de masas en tándem, ajustando la resolución en el primer analizador de masas de modo que el valor del FWHM esté entre 2 y 20 Y que la distribución isotópica medida (!n los iones producto seleccionados en b) se corresponda con las distribuciones isotópicas teóricas para los fragmentos tanto para el péptido de abundancia isotópica natural como para el enriquecido isotópicamente;

   d) adición a la muestra de Wla cantidad conocida del péptido enriquecido isotópicamente seleccionado en a);

   e) separación del péptido isotópicamente diluido de otros componentes de la muestra mediante cualquier técnica de separación fisica, química O bioquímica que separe el péptido isotópicamente diluido de sus interferentes;

   f) medida de la distribución isotópica en iones fragmento del péptido

   isotópicamente diluido aislado en el paso e) utilizando el modo de medida

   optimizado en el paso e) en un espectrómetro de masas en tándem;

   g) cálculo de las fracciones molares tanto del péptido de abundancia isotópica natural como del péptido enriquecido isotópicamente mediante regresión lineal

   múltiple expresando la distribución isotópica obtenida experimentalmente en el paso f) como una combinación lineal de las composiciones isotópicas del péptido de abundancia isotópica natural y del péptido enriquecido isotópicamente medidas en el paso c);

   s

   h) cálculo del número de moles del péptido de abundancia isotópica natural a partir de la relación de las fracciones molares detenninadas en el paso g) y del número de moles conocido del péptido enriquecido isotópicamente añadidos a la muestra en el paso d).

   10

   2. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que la muestra es un fluido biológico, un cultivo celular o cualquier otra muestra biológica que contenga péptidos o proteínas.

2. 3. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestm para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, previo al paso d).

   15

   4. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestra para romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior al paso d).

   20

   5. Método según la reivindicación 2 caracterizado por que además comprende un paso de hidrólisis de la muestra p::tra romper las proteínas y liberar sus péptidos constituyentes, posterior al paso e).

3. 6. Método según las reivindicaciones 3, 4 ó 5 caracterizado por que la hidrólisis es enzimática y el péptido constituyente a cuantificar es característico de la proteína.

   25

   7. Método según la reivindicación I caracterizado por que el péptido enriquecido isotópicamente contiene entre 1 y 4-átomos de alguno de los isótopos enriquecidos I3C ' ¡SN l' b'"o en cua qUler com maClOn.

4. 8. Método según la reivindicación l caracterizado por que el péptido enriquecido isotópicamente se sintetiza químic:amente utilizando distintas combinaciones de , "d ' 'd IJC ' ¡SN amInOaCl os ennquecl os en o .

5. 9.

   Método según la reivindicación l caracterizado por que el ión precursor seleccionado en el paso b) posee carga +2 ó +3 y el ión producto seleccionado posee carga +l.

6. 10.

   Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem es de tipo triple cuadrupolo.

7. 11.

   Método según la reivindicación 10 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem de tipo triple cuadrupolo es con trampa lineal en el tercer cuadrupolo.

8. 12.

   Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el espectrómetro de masas en tándem es un equipo de ti:po cuadrupolo-tiempo de vuelo (Q-TOF).

9. 13.

   Método según la reivindicación 1 caracterizado por que en el paso c) además se reduce el FWHM en el tercer cuadrupolo a un valor entre 0.7 y OA, hasta comprobar que la distribución :isotópica medida en los iones producto se corresponde con las distribuciones isotópicas teóricas calculadas para los fmgmentos tanto para el péptido natural como para el enriquecido isotópicamente.

10. 14.

    Método según la reivindicación 1 caracterizado por que el método fisico para la separación en la etapa e) del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la centrifugación.

11. 15.

    Método según la reivindicación I caracterizado por que el método químico para la separación en la etapa e) del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la cromatografia de intercambio jónico, reparto o afinidad.

12. 16.

    Método según la reivindicación I caracterizado por que la separación del péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra se realiza por cromatografia liquida acoplada al espectrómetro de masas en tándem.

13. 17.

    Método según la reivindicación 16 caracterizado por que la medida de las abundancias isotópicas en el espectrómetro de masas en tándem de los pasos c) y f) se realiza a partir de las áreas de pico obtenidas para el péptido isotópicamente diluido tras la separación cromatográfica.

14. 18.

    Método según la reivindicación I caracterizado por que el método bioquímico para la separación en la etapa e) de:l péptido isotópicamente diluido del resto de la muestra es la irununoprecipitación.

15. 19.

    Método según la reivindicación l caracterizado por que en el paso f) se mide un

    5 mínimo de 2 y un máximo de 6 transiciones para cada combinación ión precursor ión producto seleccionado.
16. 20. Método según la reivindicación 1 caracterizado por que las abundancias isotópicas para el péptido de abundancia isotópica natural y el enriquecido isotópicamente medidas en el paso c) y utilizadas en la regresión lineal múltiple del

    10 paso g) se determinan matemáticarnente mediante un programa de ordenador.

17. 21.

    Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 como herramienta de diagnóstico clínico.

18. 22.

    Uso del método según las reivi.ndicaciones 1 a 20 para el análisis de muestras de alimentos y la certificación de su seguridad alimentaria.

    1S 23. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 como herramienta para el análisis de muestras fannacéuticas.
19. 24. Uso del método según las reivindicaciones l a 20 para el análisis de muestras en biomedicina.
20. 25. Uso del método según las reivindicaciones 1 a 20 para el análisis de muestras 20 en metrología química.