ES2431242B1 - Procedimiento de identificación de animales gestantes - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de identificación de animales gestantes, que comprende (a) obtener los valores de absorción en el espectro visible-infrarrojo cercano, en cualquier rango comprendido entre 400 y 2498 nm, de una muestra de plasma sanguíneo obtenida de dicho animal e (b) identificar un animal gestante comparando los valores de absorción obtenidos en la etapa (a) con los valores de absorción estándar de animales gestantes y no gestantes obtenidos en las mismas condiciones que los valores de la etapa (a), donde dicha identificación es positiva cuando los valores de absorción de la etapa (a) son más próximos a los valores de absorción estándar de animales gestantes que a los valores de absorción estándar de animales no gestantes. Dicho animal es un mamífero seleccionado del grupo compuesto por las especies ovina, caprina, bovina, porcina, equina y humana.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento de identificación de animales gestantes.
CAMPO DE LA INVENCIÓN 5
La presente invención pertenece al campo de la reproducción animal. Específicamente, la presente invención describe un procedimiento para el diagnóstico precoz de animales gestantes basado en el análisis de espectros de absorción en la región del visible e infrarrojo cercano de muestras de plasma sanguíneo obtenidas en un periodo cercano y/o posterior al comienzo de la implantación del embrión en el útero. 10
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La técnica de la espectroscopia de reflectancia en el infrarrojo cercano (Near-infrared reflectance spectroscopy, NIRS) se basa en que el espectro de absorción de energía en la región del infrarrojo cercano del espectro electromagnético 15 por parte de una muestra es único. Esta absorción de energía depende esencialmente de la composición de la muestra. El espectro infrarrojo cercano (Near-infrared, NIR) es el resultado de los valores de absorbancia a las diferentes longitudes de onda al exponer una muestra a una fuente de radiación que emite en este rango. La obtención de espectros se realiza mediante la utilización de un espectrómetro que mide la absorbancia en el infrarrojo cercano (espectrómetro NIRS). 20
Actualmente es una técnica habitualmente usada en análisis de control de calidad de un gran número de sustancias, al tratarse de una técnica rápida, no-destructiva y adecuada para las mediciones en línea o en la cadena productiva.
Los métodos que se utilizan en la actualidad para la detección de hembras gestantes son la ecografía (en todas las 25 especies de mamíferos), el método de cuantificación en plasma sanguíneo de la progesterona (en casi todas las especies de mamíferos) o de Glicoproteína asociada a la gestación (Pregnancy-Associated Glycoprotein; PAG) en algunos rumiantes (ovino, bovino y caprino), o de la gonadotropina coriónica humana (hCG) en la especie humana, medidas mediante kits de radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis (EIA).
30
La presente invención propone un método alternativo de diagnóstico precoz de gestación por espectrometría visible-infrarrojo cercano (VIS-NIR) de plasma sanguíneo obtenido en un momento cercano y/o posterior al comienzo de la implantación. Las ventajas del método de la invención frente a los métodos anteriores se describen a continuación. La presente invención permite el diagnóstico de gestación antes que la ecografía. La duración de la gestación en la oveja es de 150 días y se diagnostica de forma rutinaria por ecografía a partir del día 30. Sobre el método de diagnóstico por 35 progesterona tiene la ventaja de que no es preciso conocer la fecha de cubrición. Es tan precoz como el diagnóstico de la PAG cuantificada por RIA, pero tiene la ventaja de que no usa radioactividad. Es más precoz que el diagnóstico por PAG cuantificada por EIA, y además no usa reactivos. Es una técnica que solo requiere un aparataje rutinario en cualquier laboratorio. Al no requerir adiciones de múltiples reactivos, es una técnica muy robusta, es decir, el resultado depende en menor medida de la persona que la realiza, comparado con los métodos anteriores. 40
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Una realización preferida de la presente invención es un procedimiento de identificación de animales gestantes, que comprende 45
(a) obtener los valores de absorción en el espectro visible-infrarrojo cercano, en cualquier rango comprendido entre 400 y 2498 nm, de una muestra de plasma sanguíneo obtenida de dicho animal e
(b) identificar un animal gestante comparando los valores de absorción obtenidos en la etapa (a) con los valores de absorción estándar de animales gestantes y no gestantes obtenidos en las mismas condiciones que los valores de la etapa (a), donde dicha identificación es positiva cuando los valores de absorción de la etapa (a) son más próximos a los 50 valores de absorción estándar de animales gestantes que a los valores de absorción estándar de animales no gestantes,
en adelante procedimiento de la invención.
Otra realización es el procedimiento de la invención, donde dicho animal es un mamífero. De forma particular, dicho 55 mamífero se selecciona del grupo compuesto por las especies ovina, caprina, bovina, porcina, equina y humana.
El método de la invención permite diagnosticar la gestación en un estado temprano de la misma. Esto ha sido probado en un número importante de ovejas, de dos razas distintas y mantenidas con un manejo alimenticio muy diferente. Tiene muchas ventajas cuando se la compara con otros métodos. 60
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Espectros brutos de muestras de plasma sanguíneo obtenidas 18 días tras la inseminación artificial (a) y 25 días tras la inseminación artificial (b) en ovejas gestantes (línea contínua) y no gestantes (línea discontínua). 65
MODOS DE REALIZACIÓN PREFERENTE
Ejemplo 1. Obtención de muestras de una población de ovejas. Obtención de espectros VIS-NIR y de la concentración de PAG por EIA
5
En este ejemplo se obtuvieron espectros VIS-NIR del plasma sanguíneo de distintas ovejas en la misma etapa de la gestación, en un momento cercano (día 18) y/o posterior (día 25) al comienzo la implantación del embrión en el útero. En la oveja, el comienzo de la implantación tiene lugar en los días 15-16 tras la cubrición.
En la presente invención se estudiaron 188 ovejas adultas, de dos razas distintas y mantenidas en condiciones de 10 alimentación y manejo completamente diferentes. 142 ovejas eran de raza Rasa Aragonesa mantenidas en pradera sembrada en zona irrigada y 46 eran de raza Ansotana, mantenidas en pradera natural de una zona semiárida. Las ovejas estaban identificadas electrónicamente.
A estas ovejas se les indujo el celo y la ovulación con tratamientos hormonales comerciales y se inseminaron con 15 semen de machos de fertilidad probada. A los 18 y 25 días después de la inseminación, se tomaron muestras de sangre de la yugular del animal mediante tubos de 5 ml al vacío heparinizados. Las muestras se centrifugaron y se extrajo el plasma sanguíneo, el cual se congeló a -20 ºC hasta su posterior análisis por NIRS y cuantificación de la PAG por EIA. 42 días después de la inseminación, se realizó un diagnóstico de gestación por ecografía transabdominal. En el momento del parto, las ovejas se colocaron en jaulas individuales de parición con el fin de evitar errores de identificación 20 en el nacimiento de los corderos.
El plasma sanguíneo se dividió en dos muestras. La primera muestra se analizó por NIRS. En la segunda muestra se determinó la concentración plasmática de Glicoproteína asociada a la gestación (PAG). La PAG está segregada por el trofoblasto y se detecta en la sangre alrededor del día en que se produce la implantación definitiva del embrión en el 25 útero. Esta glicoproteína es un buen indicador de la gestación en ovejas.
En la presente invención, la PAG se determinó utilizando un kit comercial EIA con una sensibilidad y especificidad del 100% a partir del día 25 de gestación.
30
Las muestras de plasma se analizaron por NIRS siguiendo la metodología descrita por Coppa, M. y col. para análisis de otro tipo de compuestos (Coppa, M. y col. Prediction of milk fatty acid composition by near infrared spectroscopy. Int Dairy J 2010; 20:182-9).
Después de su descongelación a temperatura ambiente, se tomaron 0.5 ml de las muestras de plasma que se colocaron 35 en filtros de microfibra de vidrio (Whatman GF/A, 55 mm, Cat. No. 1820 055; Whatman International, Ltd., Maidstone, UK), los cuales se colocaron en estufa a 30 °C durante 24 h para que se deshidrataran. A continuación, las muestras se colocaron en cápsulas redondas de 50 mm de diámetro y se escanearon en el modo de reflectancia (R) entre 400 y 2498 nm cada 2 nm de intervalo usando un espectrómetro Foss NIRSystems 6500 (Foss NIRSystems, Silver Spring, MD, USA) equipado con un módulo de transporte y controlado vía WinISI software versión 1.02 (Infrasoft International 40 LLC, State College, PA, USA). Cada espectro de reflectancia era la media de 32 medidas que a su vez se compararon con la media de 32 medidas realizadas sobre una referencia de cerámica. Los valores de reflectancia (R) se convirtieron en valores de Absorbancia (A) usando la formula A = log (1/R).
Ejemplo 2. Identificación de hembras gestantes y no gestantes 45
En este ejemplo se analizaron las diferencias espectrales del plasma de hembras y se clasificaron dichas ovejas entre gestantes y no gestantes en una etapa precoz.
A partir de los espectros de muestras conocidas de ovejas gestantes y no gestantes, se construyó un modelo estadístico 50 con el programa específico WinISI. Este modelo sirve para predecir si el espectro de una oveja desconocida corresponde a una oveja gestante o no gestante a partir de si sus valores de absorbancia a las diferentes longitudes de onda se sitúan más próximos a un grupo u otro.
El espectro bruto obtenido del espectrómetro se transformó mediante la aplicación del tratamiento de corrección de la 55 dispersión standard normal variate and de-trending y de la primera derivada. Sobre los espectros transformados de las muestras de cada tratamiento (gestantes y no gestantes) se realizó un análisis discriminante utilizando el método de mínimos cuadrados parciales modificados (PLS-DA). El análisis discriminante mediante el método de mínimos cuadrados parciales consiste en una regresión donde la variable dependiente es una variable categórica que describe las diferentes clases de observaciones (“1” para las ovejas gestantes, “2” para las ovejas no gestantes), usando el punto 60 de corte de 2 para la clasificación de las muestras según este criterio. Como variables independientes se utilizan los valores de absorbancia a las diferentes longitudes de onda que están más relacionadas con las diferencias espectrales de plasma sanguíneo entre ovejas gestantes y no gestantes.
El modelo obtenido se validó mediante la utilización del procedimiento de validación cruzada, para el cual, una cuarta parte de las muestras de la población inicial, elegidas al azar se separaron temporalmente de la base de datos inicial para ser utilizadas como validación del modelo. El modelo PLS-DA se desarrolló utilizando el resto de las muestras (muestras de calibración) y utilizando para clasificar las muestras del colectivo de validación.
5
El procedimiento se repitió 4 veces, de manera que la totalidad de las muestras fueron utilizadas para validar el modelo. Se calculó el error de clasificación de validación cruzada, expresado como el porcentaje de muestras bien clasificadas por el modelo en relación al verdadero valor. Estos procedimientos se realizaron mediante el programa WinISI II versión 1.02 (Infrasoft International LLC, State College, PA, USA) que controla al espectrómetro. El modelo obtenido sirve para predecir si el espectro de una oveja desconocida, obtenido en las mismas condiciones que los utilizados para desarrollar 10 el modelo, corresponde a una oveja gestante o no gestante a partir de si sus valores de absorbancia a las diferentes longitudes de onda se sitúan más o menos próximos a un grupo u otro.
A continuación se proporciona una definición de los términos que se utilizan más abajo en el presente ejemplo:
15
Sensibilidad: Número de ovejas correctamente diagnosticadas como gestantes en relación al número total de ovejas gestantes.
Especificidad: Número de ovejas correctamente diagnosticadas como no-gestantes en relación al número total de ovejas no-gestantes
Valor predictivo positivo (VPP): Número de ovejas correctamente diagnosticadas como gestantes en relación a las 20 diagnosticadas como gestantes.
Valor predictivo negativo (VPN): Número de ovejas correctamente diagnosticadas como no- gestantes en relación a las diagnosticadas como no-gestantes.
Exactitud total: Número de ovejas correctamente diagnosticadas (gestantes y no-gestantes) en relación al número total de ovejas. 25
Todos los espectros obtenidos mostraron picos, cuyos máximos locales correspondían a 418, 1502, 1728, 1930, 2056, 2176, 2302 y 2472 nm, y una banda extensa entre 460 y 490 nm. En la Figura 1 se muestran espectros de muestras de plasma sanguíneo obtenidas 18 y 25 días tras la inseminación artificial, en ovejas gestantes y vacías.
30
En el día 18 de gestación, la sensibilidad fue del 98,9% (89/90) y la especificidad fue 100% (98/98). En el día 25 de gestación, tanto la sensibilidad como la especificidad fueron del 100%, (90/90 y 29/29, respectivamente).
Tabla 1. Sensibilidad, especificidad, valor predictivo del resultado positivo (VPP), valor predictivo del resultado negativo (VPN) y exactitud total utilizando los métodos de espectrometría de reflectancia en el visible-infrarrojo cercano (VIS-35 NIRS) comparado con el método de la Glicoproteína plasmática asociada a la gestación (PAG) en los días 18 y 25 después de la inseminación artificial. Los valores entre paréntesis corresponden al número de ovejas diagnosticadas correctamente / total de ovejas en cada categoría.
- Sensibilidad Especificidad VPP VPN Exactitud total
- Día 18
- VIS-NIRS
- 98,9 (89/90)a 100 (98/98) 100 (89/89) 99,0 (98/99)a 99,5 (187/188)a
- PAG
- 32,2 (29/90)b 100 (98/98) 100 (29/29) 61,6 (98/159)b 67,6 (127/188)b
- Día 25
- NIRS
- 100 (90/90) 100 (29/29) 100 (90/90) 100 (29/29) 100 (119/119)
- PAG
- 100 (90/90) 100 (29/29) 100 (90/90) 100 (29/29) 100 (119/119)
Dentro de cada columna: a,b: P < 0,001.
Claims (3)
- REIVINDICACIONES1. Procedimiento de identificación de animales gestantes, que comprende(a) obtener los valores de absorción en el espectro visible-infrarrojo cercano, en cualquier rango comprendido entre 400 y 2498 nm, de una muestra de plasma sanguíneo obtenida de dicho animal e(b) identificar un animal gestante comparando los valores de absorción obtenidos en la etapa (a) con los valores de absorción estándar de animales gestantes y no gestantes obtenidos en las mismas condiciones que los valores de 5 la etapa (a), donde dicha identificación es positiva cuando los valores de absorción de la etapa (a) son más próximos a los valores de absorción estándar de animales gestantes que a los valores de absorción estándar de animales no gestantes.
- 2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que dicho animal es un mamífero.
- 3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado por que dicho mamífero se selecciona del grupo compuesto 10 por las especies ovina, caprina, bovina, porcina, equina y humana.
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| ES2431242A1 (es) | 2013-11-25 |
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