ES2416836A1 - Método para la obtención del perfil genético de un individuo - Google Patents

Abstract

Método para la obtención del perfil genético de un individuo. La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis de 4 ó más loci hasta un total 21, en un extracto de ADN de dicho individuo mediante una reacción de amplificación PCR multiplex, en donde a) al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317, y b) al menos dos de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248. La presente invención también contempla el kit que comprende las parejas de cebadores para la puesta en práctica de dicho método, siendo ambos útiles en la identificación de individuos en el área de la genética forense y de poblaciones, antropología y biomedicina.

Description

MÉTODO PARA LA OBTENCiÓN DEL PERFIL GENÉTICO DE UN INDIVIDUO

CAMPO DE LA INVENCIÓN

5 \O

La invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo o resto biológico que comprende el análisis de 4 ó más loci STRs, hasta un total de 20 loci STRs más ellocus amelogenina determinante del sexo (en total 21 loci), en un extracto de ADN de dicho individuo o resto mediante una reacción de amplificación PCR multiplexo Asimismo, la presente invención también se dirige a la producción de un kit que comprende las parejas de cebadores para la puesta en práctica del método de la invención. Tanto el método como el kit aquí descritos son de aplicación en la identificación de individuos en el área de la genética forense, así como en genética de poblaciones, antropología y biomedicina.

15

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

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El análisis de marcadores microsatélites denominados STRs (del inglés, Short Tandem Repeats) es hoy en día la técnica de referencia para la obtención de pertiles genéticos destinados a identificación de individuos, restos biológicos, determinación de parentesco o criminalística.

25

Del mismo modo, a partir del análisis de dichos marcadores STRs se han ido creando bases de datos de perfiles genéticos en diferentes países del mundo. Dichas bases de datos permiten la utilización de los perfiles genéticos en investigación criminal así como la utilización del conocimiento acumulado sobre los distintos loci STRs en diferentes grupos poblacionales, a la hora de cotejar los datos disponibles y estimar el poder de discriminación en cada caso cotejado.

30

Existe un amplio número de bases de datos de perfiles genéticos, entre ellas las más relevantes son Combined Index system (CODIS) creada por el FBI, Interpol Standard Se! oI Loei (ISSL), ElIropean eore loei (ECL), UK National Criminal Intelligenee DNA Database (NDNAD), Extended European Standard Set (ESS) y German Core loei (GCL). Todas las bases de datos incluyen un núcleo común de STRs (D18S51, D21S11, D3S1358,

08S1179, FGA, THOI, vWA) aunque difieren en el número total yen al¡,'Unos de los loci STRs incluidos en cada una de ellas (Tabla 1).

Tabla l. Loci STRs incluidos en las principales bases de datos.

CODIS ECLINDNAD ESS GCL ISSL FEI European & UK European E'Ctended Gemwn Core Loci Interpol

DI8S51

DI8S51

DI8S51

DI8S51

DI8S51

021SI1

D21SI1 D2ISI1 D2ISI1 D2ISI1

O3S1358

D3S135H D3S1358

O3S1358

O3S1358

08S1I79

OHSI179 mSI179 D8S1179 D8S1179

FGA

FGA

FGA

FGA

FGA

THOI

THOI

THOI

THOI

THOI

vWA

v\VA v\VA

vWA

vWA

DI6S539

0I6S539

DI3S317

CSFIPO

TPOX

D7S820

D5S818

DI9S433

D2S1338

DIOSI248

DI2S391

DI SI656

D22SI045

D2S44 I

SE}3

CODIS es la base de datos que más loci STRs incluye, un total de 13, además del locus amelogenina para la determinación del sexo. ECL y la base de datos del Reino Unido incluyen 10 loci STRs y amelogenina, el núcleo de 7 loci STRs junto con el 016S539 10 compartido con el CODIS y dos loci STRs adicionales 019S433 y 02S1338, además de recomendar el análisis de TPOX, incluido en el CODlS. ISSL incluye el núcleo universal de 7 loci STRs y considera opcional el análisis de amelogenina. Por último, GCL incluye el núcleo universal de 7 loci STRs, amelogenina y el locus SE33. Recientemente se ha recomendado el uso de 5 nuevos loci STRs (OIS1656, 02S441, 0I0S1248, 012S391,

D22S1045) además del núcleo de 7 loci STRs por la Extended European Standard Set (ESS).

En la actualidad existen numerosas empresas que comercializan kits para la elaboración de perfiles genéticos. Applied Biosystems'~ comercializa AmpFlSTR1\l Identifiler'" PCR amplification kit (2004, Applied Biosystems''', Foster City, CA). Promega fabrica

TM ·w

PowerPlex 16 (2004, Promega Corporation, USA). Mediante estos kits puede alcanzarse una probabilidad de coincidencia entre los perfiles genéticos de dos individuos de alrededor de uno entre un trillón, tras el análisis de 15 regiones STRs. Ambos kits incluyen los 13 loci del CODIS; en el caso de Identifiler'" incluye además los loei autosómicos D2S1338 y D19433, Y Powerplex™ 16 incluye los loci autosomicos Penta E y Penta D.

Recientemente se han desarrollado otros nuevos kits comerciales AmpFISTR® NGM ™ Amplification Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), PowerPlex® ES X Y PowerPlex® ES Y (Promega® Corporation, USA), Investigator ESSplex Kit (Qiagen, (Valencia, California, U.S.A.) dirigidos especialmente a analizar los 5 nuevos loci recomendados por la EDNAP (European DN4 Projiling Group) and ENFSI (EL¡ropean

Network o(Forensic Science lnstitutes).

Uno de los principales inconvenientes de éstos y otros kits actualmente disponibles en el mercado es su falta de capacidad para amplificar la totalidad de los loci STRs que se incluyen en el conjunto de las principales bases de datos. Este problema dificulta la comparación de los perfiles obtenidos mediante estos kits comerciales y los registrados en las diferentes bases de datos haciendo en muchos casos ineficaz dicha comparación al no obtenerse una probabilidad de coincidencia suficiente (ver Tabla 9 de los Ejemplos).

En este contexto han surgido numerosas solicitudes de patentes relacionadas con la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis simultáneo de varios loci STRs, que describen nuevos métodos de obtención de perfiles genéticos cada vez más discriminati vos basados en el análisis de nuevos STRs además de incluir algunos de los loci STRs utilizados hoy día.

La solicitud de patente US6090558 describe el uso de la espectrometría de masas para detectar la variación de longitud en repeticiones de secuencias de nucleótidos, tales como microsatélites y repeticiones cortas en tándem, y cebadores de ADN para el análisis de polimorfismos en repeticiones de nucleótidos en tándem en loci específicos.

Tanto la solicitud de patente US6479235 como la patente ES2273367 describen la detección de loci genéticos, más específicamente, la amplificación simultánea de múltiples loci genéticos polimórficos diferentes utilizando la reacción en cadena de la polimerasa u otros sistemas de amplificación para determinar los alelos de cada locus. Los loci genéticos amplificados comprenden HUMvWFA31, HUMLIPOL, HUMBFXIII, HUMF13A01, HUMFESFPS, HUMTH01, HUMTPOX, HUMCSF1PO, D22S683, D20S481, D19S253, D17S1299, D17S1298, D16S753, D16S539, D16S490, D14S562, D14S548, D14S118, D13S317, D10S1239, D9S930, D7S820, D5S818, D4S2368, D3S1539. Aunque integra un alto número de loci STRs, incluye únicamente 8 de los 13 loci objeto del CODIS, y 3 de los 10 loci incluidos en la base de datos europea, lo que disminuye su rendimiento en cuanto a comparación de los resultados obtenidos con los millones de perfiles genéticos disponibles en las bases de datos existentes.

La solicitud de patente US6479235 describe métodos y materiales para la amplificación simultánea de, al menos, 13 STRs del CODIS en una reacción multiplex cuyos tamaños de amplificado exceden las 360 pb.

La solicitud de patente US2003/0186272 describe un método rápido para determinar la longitud de los fragmentos de los alelos presentes en una pluralidad de loci en una muestra que contiene ADN que comprende: (a) obtener una muestra que contiene ADN, b) amplificar mediante PCR multiplex los loci FGA, vWA, TH01, TPOX, CSF1PO, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, D13S317, D16S539, D18S51 y D21S11 (la reacción PCR multiplex se lleva a cabo empleando una pluralidad de parejas de cebadores, donde al menos un cebador de cada pareja de cebadores está marcado con una etiqueta detectable, y la amplificación produce una mezcla de amplicones marcados), y (c) analizar por electroforesis dicha mezcla de amplicones, para determinar la longitud de los fragmentos de los alelos en dicha pluralidad de loci de la muestra que contiene ADN.

Actualmente la obtención de perfiles genéticos mediante el análisis de loci STRs autosómicos plantea el problema técnico del escaso éxito de la mayoría de las reacciones para resolver casos de parentesco complejo en los que por falta de un progenitor, o por ser un parentesco lejano, el reducido número de STRs analizados en los diferentes kits hace que la probabilidad de parentesco obtenida resulte insuficiente para determinar con seguridad el grado de parentesco. En estos casos se hace necesario un nuevo análisis de los individuos con otros kits de STRs autosómicos y STRs sexuales (STRs del cromosoma X y del cromosoma Y) con el fin de aumentar el número de STRs analizados para alcanzar una probabilidad suficiente o para descartar el parentesco.

Por lo tanto, el estado de la técnica revela la necesidad de desarrollar un nuevo método para obtener perfiles genéticos de loci STRs, que supere los inconvenientes de los actualmente existentes.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

El establecimiento de bases de datos de perfiles genéticos basados en loci STRs proporciona una herramienta de gran relevancia para la resolución de casos forenses en el ámbito criminal o la determinación del parentesco entre individuos.

En la actualidad existen numerosas empresas que comercializan kits para la elaboración de perfiles genéticos, pero ninguno de ellos permite analizar la totalidad de los loci STRs incluidos en las principales bases de datos usadas en la identificación de individuos como son CODlS, NDNAD, ECL, ISSL, ESS y GCL. Para solventar este problema los inventores han diseñado nuevas parejas de cebadores dirigidas a amplificar cada uno de los loci incluidos en las mencionadas bases de datos, como son CSF 1 PO, D5S818, D7S820, D2ISI1, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TROl, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, FGA, D22S1045 y D10S1248, con la caracteristica técnica adicional de que, si se desea, pueden emplearse simultáneamente en combinaciones de 4 o más parejas de cebadores en una reacción de amplificación multiplex para obtener un perfil genético compuesto de hasta 20 loci STRs más el locus amelogenina de determinación del sexo (lo que hacen un total de 21 loei), incluyendo entre ellos la totalidad de los loci de las bases de datos más comúnmente empleadas en la

identificación de individuos. Esta característica de las parejas de cebadores de la invención permite su empleo en casos de determinación de parentesco complejo y evita el análisis de los individuos con varios kits comerciales con el fin de analizar todos los STRs incluidos en las bases de datos de identificación de individuos, lo que disminuye el coste de la identificación genética.

Tal como se muestra en el Ejemplo 1, el diseño de las parejas de cebadores de la presente invención se realizó mediante una búsqueda de las secuencias flanqueantes a cada locus STR y posteriormente se diseñaron los cebadores empleando el programa Perlprimer. Una vez obtenidas las parejas de cebadores, se procedió a realizar una reacción de amplificación de la polimerasa sobre un extracto de ADN empleando dichas parejas de cebadores tras lo cual, se obtuvo el perfil genético del individuo al que pertenecía el extracto de ADN con fiabilidad, precisión y con un poder de discriminación superior a los perfiles genéticos obtenidos por otros métodos.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis, en un extracto de ADN procedente de dicho individuo mediante una reacción de amplificación multiplex, de al menos 4 loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde

a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs

CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317, y

b) Al menos dos de los 4 loci se seleccionan del grupo formado por los loci STRs

D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un método según la presente invención para identificar un individuo, determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende parejas de cebadores específicas para amplificar al menos 4 loci seleccionados del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179,

D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317; y b) Al menos dos de los 4 loci se seleccionan del grupo formado por los loci STRs D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit según la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para identificar un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores que comprende, al menos, 4 parejas de cebadores dirigidas a amplificar 4 loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde

a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs

CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317; y

b) Al menos dos de los 4 loci se seleccionan del grupo formado por los loci STRs

D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

El uso del conjunto de cebadores de la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos, para identificar restos humanos, constituye un aspecto adicional de la presente invención.

Finalmente, en otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de cebadores

seleccionada del grupo que consiste en las siguientes parejas de oligonucleótidos

-

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el locus CSF1PO,

-

SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para el locus D5S818,

-

SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el locus D7S820,

-

SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para el locus D21S11,

-

SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para el locus D2S441,

-

SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para el locus D1S1656,

SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para ellocus TPOX,

SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para e1locus VW A,

SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para ellocus 08S1179,

SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para ellocus 019S433,

SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para ellocus 012S391,

SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para ellocus THOI,

SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para ellocus Dl6S539,

SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para ellocus O3S1358,

SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para ellocus O 18S51,

SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para ellocus 02S 1338,

SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para ellocus 013S317,

SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para e1locus Amelogenina,

SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para ellocus FGA,

SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para ellocus 022S1045, y

SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para ellocus 01OS1248.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 corresponde a un gráfico llamado electroferograma que muestra el perfil genético de un individuo obtenido de los loci analizados mediante el conjunto de cebadores de la invención empleando un analizador automático de secuencias AB3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems'~). En la Figura se pueden observar 4 paneles, cada uno correspondiente a aquellas parejas de cebadores marcadas con el mismo locus fluorescente. En cada panel se muestra la intensidad de la señal detectada en Relative Fluorescence Units (RFU, unidad relativa de tluorescencia.) en el eje y; el eje X corresponde al tamaño en pares de bases. Así, el primer panel corresponde a los resultados obtenidos para los productos de STRs amplificados con cebadores marcados con 6-F AM™ (dirigidos a los loci CSFIPO, 05S818, 07S820, 021S11. 02S441 y 0ISI656), el segundo panel a los marcados con VIC™ (loci TH01, 016S539, 03S1358, 018S51, 02S1338), el tercero a NEO™ (loci TPOX, VWA, 08S1179, 019S433 y 012S391) yen el cuarto panel se muestran los resultados para los loci marcados con el fluorocromo PET'" (013S317, amelogenina, FGA, 022S1045 Y O 1 OS 1248). Las barras situadas en la parte superior de

cada panel corresponden al nombre de los loci. Los rectángulos situados bajos los picos del electroferograma muestran el nombre del alelo, indicado por un número.

La Figura 2 es una representación gráfica que muestra el diseño del conjunto de parejas de cebadores (denominado I-DNAE21). Las cajas representan los tamaños de amplificado para cada locus. Los loci marcados con diferente color se presentan en diferentes escalas de grises. Los respectivos marcajes se señalan en la parte derecha de la figura.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

En la actualidad existen varias empresas que comercializan kits para la elaboración de perfiles genéticos, pero ninguno de ellos permite el análisis de la totalidad de los loci STRs incluídos en las bases de datos internacionales más importantes como son CODIS, NDNAD, ECL, ISSL, ESS y GCL. Para solventar esta carencia los inventores han diseñado unas parejas de cebadores dirigidas a amplificar cada uno de los loci STRs incluidos en las mencionadas bases de datos, como son CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, FGA, D22S1045 y D10S1248, con la característica técnica adicional de que, si se desea, las parejas de cebadores pueden emplearse simultáneamente en una reacción de amplificación multiplex en combinaciones de 4 o más parejas de cebadores para obtener un perfil genético compuesto de hasta 20 loci STRs más el locus amelogenina de determinación del sexo (lo que hacen un total de 21 loci analizados), estando todos los loci amplificados incluidos en las bases de datos más comúnmente empleadas en la identificación de individuos. Esta característica de las parejas de cebadores de la invención permite su empleo en casos de determinación de identificación y parentesco complejo, evitando además el análisis de los individuos con varios kits comerciales con el fin de analizar todos los STRs incluidos en las bases de datos de identificación de individuos, lo que disminuye el coste analítico. Dicha característica permite a esta invención tener un poder de discriminación y por consiguiente una probabilidad de coincidencia al azar netamente superior a cualquier kit existente actualmente en el mercado, posibilitando el cotejo de los perfiles genéticos obtenidos mediante su análisis, con los contenidos en las principales bases de datos y la aplicación de la invención a casos de parentesco complejos.

Así, mediante las parejas de cebadores diseñadas por los inventores de la presente invención, se han desarrollado los distintos aspectos inventivos que forman parte de la presente invención y que serán descritos en detalle a continuación. Previamente a la descripción de dichos aspectos inventivos, se incluye un listado de definiciones donde se explica el significado de los ténninos empleados en el contexto de la presente invención para ayudar en la comprensión de la misma.

Definiciones

"un "j"una"

El uso de la palabra "un" o "una" cuando se usa junto con el término "comprender"o "comprende" en las reivindicaciones y/o en la descripción puede significar "uno", pero también es consistente con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

Perfil Genético

En el contexto de la presente invención, los términos "perfil genético" y "huella genética" tienen el mismo significado por lo que pueden emplearse indistintamente a lo largo de la descripción. El "perfil genético" es un conjunto de secuencias de bases en posiciones caracteristicas del material genético que permiten diferenciar a un individuo de otro.

Loei STRs

En la presente invención, el perfil genético se obtiene a partir del análisis de loci caracterizados por la repetición en tándem de una corta secuencia de bases STRs (del inglés Short Tandem Repeats) cuyo número de repeticiones es altamente variable entre individuos. Asi, en la presente invención se entiende por "secuencias STRs" o "loci STRs" aquellas secuencias del ADN, también llamadas microsatélites, que contienen repeticiones de 4 pb (Butler JM, Biotechniques. 2007).

El análisis de los loci STRs en el genoma presenta múltiples aplicaciones que incluyen, aunque no se limitan a, obtención de perfiles genéticos. diagnósticos de parentesco, determinación del origen de una muestra o tejido, identitlcación de cadáveres, estudios de genética de poblaciones, pruebas de cigosidad en mellizos, seguimiento de transplantes de médula ósea, evaluación de la trazabilidad de muestras biológicas de origen humano, identificación de mezclas presentes en una muestra y determinación del número de contribuyentes de origen humano a una mezcla y su aportación relativa a la mezcla.

PCR

PCR corresponde a las siglas de reacción en cadena de la polimerasa mediante la cual se pueden obtener millones de copias de las regiones de ADN deseadas. Se caracteriza por el empleo de parejas de cebadores que acotan la región de la que se realizarán millones de copias, lo que también se conoce como "amplificar ADN" durante la PCR. La PCR está compuesta por un número determinado de ciclos, compuestos a su vez por tres fases en las que las hebras de ADN se separan, se unen los cebadores y se elongan las nuevas hebras de ADN. En cada ciclo, si la eficiencia de la reacción es del 100% se produce un crecimiento exponencial 2n del número de fragmentos de ADN objeto de la amplificación.

Reacción de amplificación multiplex

En la presente invención se entiende por "Reacción de amplificación multiplex" a la reacción PCR en la cual se amplifica más de una secuencia de ADN en una misma reacción, mediante el empleo de dos o más parejas de cebadores junto con el resto de los reactivos de la reacción con el fin de amplificar simultáneamente múltiples secuencias de ADN.

Oligol1ucleótido

El término "oligonucleótido" hace referencia a la secuenCia de bases de nucleótidos unidos por enlaces tosfo-diéster, habitualmente no mayor de 50 nuc!eótidos.

Cebador En la presente invención se entiende por "cebador" o "primer" u "oligonucleótido" ("oligo") a la secuencia de nucleótidos a partir de la cual la ADN polimerasa inicia la síntesis de una molécula nueva de ADN. Los cebadores son secuencias nucleotídicas cortas, aproximadamente de 15-24 nucJeótidos de longitud que se pueden alinear con una hebra de ADN diana gracias a la complementariedad de bases para formar un híbrido entre el cebador y la hebra diana de ADN. Después, el enzima ADN polimerasa puede extender el cebador a lo largo de la hebra diana de ADN. Los métodos para preparar y usar

cebadores se describen, por ejemplo en Sambrook el al. (2001) y Ausubel el al. (1999).

Pareja de cebadores En el contexto de la presente invención se entiende por "pareja de cebadores" o "primer pair", al conjunto de dos cebadores que, empleados en una misma reacción de amplificación o PCR, permiten obtener múltiples copias de una secuencia diana de ADN. Cada uno de los cebadores hibrida con la secuencia diana en el extremo 3' de cada hebra, de manera que se amplifica la secuencia de nucleótidos acotada mediante cada pareja de cebadores. La extensión de los cebadores durante los ciclos de PCR determina la multiplicación exponencial 2n de la secuencia de nuc!eótidos acotada por los cebadores, siendo "n" el número de ciclos de la reacción PCR.

Muestra biológica

En el contexto de la presente inveneión, se entiende por "muestra biológica" cualquier materia que contenga ácido nucleico, por ejemplo, ADN. En la presente invención se entiende por "ADN" o "ADN genómico" al material genético de los organismos vivos que controla la herencia y se localiza en el núcleo de las células.

Extracto de ADN

En el contexto de la presente invención se entiende "extracto de ADN", cuando tras someter la muestra biológica a un procedimiento de extracción, separación, purificación o clonación de ADN, entre otros, se obtiene como resultado ya sea en seco, en solución, unido o no a otras moléculas, adherido o no a diversas sustancias o lechos, materia en la que el ADN se encuentra en mayor proporción relativa respecto al resto de moléculas presentes, en comparación con la muestra biológica de partida.

Así "extracto de ADN" se refiere al ADN extraído de cualquier muestra biológica que contenga ADN humano, ya sea procedente de un individuo vivo o muerto, feto, órganos,

JO tejidos ó células.

individuo

El término “individuo” se refiere a ser humano de cualquier edad o raza, que en el contexto de la presente invención puede estar vivo o muerto.

Cebadores de la invención

5 Los inventores han diseñado unas parejas de cebadores, de aquí en adelante, “parejas de cebadores de la invención” o “I-DNAE21”, que permiten obtener el perfil genético de un individuo con un alto poder de discriminación y son aplicables incluso al análisis de parentesco complejo.

10 Las parejas de cebadores han sido diseñadas de manera que su uso en una reacción de amplificación multiplex permite obtener el perfil genético de un individuo que comprende la combinación de 4 hasta 20 loci STRs de la totalidad de los STRs (a excepción del marcador SE33) que forman parte de las principales bases de datos empleadas en la

15 identificación de individuos como son CODIS, NDNAD, ECL, ISSL, ESS y GCL, más el locus amelogenina de determinación del sexo (en total 21 loci)..

Los loci analizados en la presente invención así como las parejas de cebadores diseñadas para su identificación se muestran en la Tabla 2. En el Ejemplo 1 se detalla el 20 procedimiento seguido en el diseño del conjunto de parejas de cebadores de la invención.

Tabla 2. Resumen de las secuencias de los cebadores en dirección 5´a 3´ diseñados para la amplificación de cada loci en la combinación denominada como I-DNAE21 (columna: secuencia 5´-3´). En esta misma tabla se detalla del alelo menor al

25 mayor de los STRs que serán considerados mediante este análisis (columna: alelos) así como el tamaño máximo y mínimo posible para cada STR.

LOCUS

ALELOS Tamaño de los amplificados (pb) SEQ ID NO: SECUENCIA (5-3´)

CSF1PO

6 -15 75 -111 1 ACTGCCTTCATAGATAGAAGAT

2

GCCCTGTTCTAAGTACTTCCT

D5S818

7 -17 127 -167 3 TTAATAGCAAGTATGTGACAAGG

4

GACATTTGTATCTTTATCTGTATCCTT

D7S820

6 -15 183 -219 5 GAATTATAACGATTCCACATTTATCC

6

ATAAAGGGTATGATAGAACACTTG

D21S11

24-38 240-296 7 CCCTGATTCTTCAGCTTGTA

8

GCAGAGACAGACTAATAGGAGG

D2S441

9 -16 305 -333 9 CTCTGAAGAGATTCTTAAGACCC

10

GTTCACTCTCCTTCCCAAATG

D1S1656

9 -21 341 -389 11 ATCCCCATATAAGTTCAAGCC

12

GCTTTCAGGCATTTCAGAGATTATG

TPOX

6 -16 61-101 13 CTTAGGGAACCCTCACTG

14

GCAGCGTTTATTTGCCCAA

VWA

11 -24 121-173 15 TCAGTATGTGACTTGGATTGA

16

GTAGGTTAGATAGAGATAGGACAGA

D8S1179

8 -20 181-229 17 TTGTATTTCATGTGTACATTCGT

18

GTTGTGTTCATGAGTATAGTTTCAC

D19S433

5.2-18.2 245-297 19 CATGTTGGCACATTCCTG

20

AGTTCTTTAGCAGTGATTTCTG

D12S391

14 -27 305 -357 21 CAAATTGTGATAGTAGTTTCTTCTGG

22

GTTAGACCTGGACTGAGCC

TH01

5 -14 57-93 23 AACACAGACTCCATGGTG

24

GTTCCTCCCTTATTTCCCT

D16S539

5 -16 105-149 25 CCTCTTCCCTAGATCAATACA

26

ATCTGTAAGCATGTATCTATCATC

D3S1358

9 -20 161-205 27 TGTAGTGAGCTATGATTCCC

28

GTATTCCCTGTGCCTTTG

D18S51

7 -27 213-293 29 GTCTCAGCTACTTGCAGG

30

GGAGATGTCTTACAATAACAGTTG

D2S1338

15 -28 313 -365 31 GGAGGTGCCTAAAGACTTC

32

GCCTACCAGAATGCCAGTC

D13S317

5 -17 72-120 33 CGCCTATCTGTATTTACAAATACAT

34

GGACAGAAAGATAGATAGATGATTGAT

Amelogenina

X,Y 121-127 35 CCCTGGGCTCTGTAAAGA

36

GGGCTTGAGGCCAACCAT

FGA

16-51.2 151-293 37 CTCACAGATTAAACTGTAACCA

38

TTGTCTGTAATTGCCAGC

D22S1045

8 -19 294 -327 39 TCTGCATAAGACCCACTATG

40

ATAGTGACAGTGCCTGTG

D10S1248

8 -18 339 -379 41 AGCTATTATTACCAAAGCATGAAC

42

GTTCCAGTCCAACTAGATCCT

Así, en un aspecto, la invención se relaciona con un conjunto de parejas de cebadores, de aquí en adelante “conjunto de parejas de cebadores de la invención”, que comprende, al menos, 4 parejas de cebadores dirigidas a amplificar 4 loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179,

D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317; y b) Al menos dos de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

En una realización particular, el conjunto de parejas de cebadores de la invención comprende, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 parejas de cebadores específicas para los loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.

En otro aspecto, la invención se relaciona con una pareja de cebadores seleccionada del

grupo que consiste en las siguientes parejas de oligonucleótidos -SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el locus CSF1PO, -SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para el locus D5S818, -SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el locus D7S820, -SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para el locus D21S11, -SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para el locus D2S441, -SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para el locus D1S1656, -SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para el locus TPOX, -SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para el locus VWA, -SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para el locus D8S1179, -SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para el locus D19S433, -SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para el locus D12S391, -SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para el locus TH01, -SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para el locus D16S539, -SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para el locus D3S1358, -SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para el locus D18S51, -SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para el locus D2S1338, -SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para el locus D13S317, -SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para el locus Amelogenina, -SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para el locus FGA, -SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para el locus D22S1045, y -SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para el locus D10S1248.

Uso de los cebadores de la invención

Los diferentes usos que tienen los cebadores de la invención, constituyen aspectos adicionales de la presente invención.

Así, los usos del conjunto de parejas de cebadores de la invención incluyen, sin limitarse a, la obtención de perfiles genéticos, diagnósticos de parentesco, determinación del origen de una muestra o tejido, identificación de cadáveres, estudios de genética de poblaciones, pruebas de cigosidad en gemelos o mellizos, seguimiento de transplantes de médula ósea, evaluación de la trazabilidad de muestras biológicas de origen humano, identificación de mezclas presentes en una muestra, determinación del número de contribuyentes de origen humano a una mezcla y su aportación relativa a la mezcla, la realización de estudios poblacionales mediante la elaboración de bases de datos de frecuencias alélicas, y la estimación de las tasas de pérdida alélica o tasas de mutación .

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del conjunto de parejas de cebadores de la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

Método de la invención

Tal como se ha explicado anteriormente, la presente invención está basada en el diseño de parejas de cebadores que permiten obtener el perfil genético de un individuo basado en una combinación de 4 o más loci que forman parte de las principales bases de datos usadas en la identificación de individuos como son CODIS, NDNAD, ECL, ISSL, ESS y GCL.

Así, en un primer aspecto, la invención se relaciona con un método, de aquí en adelante “método de la invención”, para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis, en un extracto de ADN procedente de dicho individuo mediante una reacción de amplificación multiplex, de al menos 4 loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde

a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs

CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317, y

b) Al menos dos de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los STRs

loci D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

Tal como se ha indicado anteriormente, las parejas de cebadores de la presente invención dirigidas a amplificar los STRs de las principales bases de datos empleadas en la identificación de un individuo, han sido diseñadas de tal manera que es posible emplearlas en el análisis de 4 o más, hasta un total de 20 loci STRs de los STR incluidos en dichas bases de datos, más el locus Amelogenina de determinación del sexo (dando lugar a un total de 21 loci analizados). Así, mediante el empleo de las parejas de cebadores de la invención, es posible obtener el perfil genético de un individuo formado por 5, 6, 7, 8, 9, 10 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 loci de los loci STRs incluidos en las bases de datos antes mencionadas más el locus amelogenina de determinación del sexo.

Por lo tanto, en una realización particular del método de la invención, el conjunto de parejas de cebadores dirigido a obtener el perfil genético de un individuo está dirigido al análisis de al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.

En otra realización todavía más particular, la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los loci analizados es la pareja de oligonucleótidos mostrada en las secuencias

-

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el locus CSF1PO, -SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para el locus D5S818, -SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el locus D7S820, -SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para el locus D21S11, -SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para el locus D2S441, -SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para el locus D1S1656, -SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para el locus TPOX, -SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para el locus VWA, -SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para el locus D8S1179, -SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para el locus D19S433, -SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para el locus D12S391, -SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para el locus TH01, -SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para el locus D16S539, -SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para el locus D3S1358, -SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para el locus D18S51, -SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para el locus D2S1338, -SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para el locus D13S317, -SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para el locus Amelogenina, -SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para el locus FGA, -SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para el locus D22S1045, y -SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para el locus D10S1248.

La puesta en práctica del método de la invención requiere la obtención de un extracto de ADN que procederá, en última instancia, de una muestra biológica que será tratada de forma adecuada para obtener dicho extracto de ADN.

Como entiende el experto en la materia, si el método de la invención está dirigido a obtener el perfil genético de un individuo o la relación de parentesco entre individuos, el extracto de ADN procederá del individuo cuyo perfil genético quiere obtenerse, o de los individuos cuya relación de parentesco quiere determinarse. Sin embargo, si el método de la invención está dirigido a la identificación de restos humanos, el extracto de ADN procederá de los restos humanos que se quieren identificar. En la presente invención, el término “restos humanos” incluye cualquier muestra biológica procedente de un ser

humano VIVO o muerto, pudiendo estar dicho resto humano conservado en formol, congelado, desecado, fijado en parafina, en estado de descomposición, degradación y/o putrefacción, entre otros.

Ejemplos de muestras de las que se puede obtener AON son, sm limitar a, t1uidos biológicos (sangre, saliva, orina, esperma, etc); epidermis, células epiteliales, pelo, heces, una muestra vaginal, una muestra de tejido, tejidos quemados, etc. Las muestras más adecuadas para la obtención de extractos de AON útiles en la identificación de un individuo o de restos humanos incluyen, entre otros, pelos con raíz, hueso compacto, diente, tejidos blandos y sangre.

En una realización particular, el extracto de AON procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, células epiteliales, una muestra vaginal y una muestra de tejido,

La obtención de la muestra biológica debe realizarse en las condiciones y con el material adecuado, tales como torundas, pinzas, etc. y cada muestra debe almacenarse independientemente en frascos o bolsas plásticas separadas y estériles, sin ningún tipo de conservante, en congelación y debidamente rotulados, evitando la contaminación por material biológico foráneo.

Una vez que se ha obtenido la muestra del individuo/s o del resto humano, ésta debe ser procesada para obtener el extracto de AON. La fracción de AON adecuada para la puesta en práctica de la invención es el AON nuclear. La extracción del AON puede ser llevado a cabo usando cualquier método conocido por los expertos en la materia (Sambrock el al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", yd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3) que incluyen sin limitación, centrifugaciones en gradientes de densidad, extracción en dos fases usando fenol acuoso o cloroformo con etanol, cromatogratla en columna, métodos basados en la capacidad del AON para unirse en superficies de cristal y/o silicatos, como preparaciones de tierra de diatomeas o lechos de cristal, empleando kits comerciales, por ejemplo, los kits "Q-Biogene fast ONA kit" o el "QIAamp(R) ONA Blood Mini Kit" (Qiagen, Hilden, Alemania) el "G-Spin !Ip" (Intron Biotechnology, Corea) o el "Fast Prep System Bio 101" (Qbiogene, Madrid, España) o los

métodos descritos en las solicitudes de patente US5.057.426, US4.923.978 y la solicitud de patente europea EP0512767A1.

El extracto de ADN es cuantificado y normalizado para obtener cantidades iguales de

5 ADN en cada muestra en el caso de que la cantidad de ADN sea suficiente para ello. En el caso de muestras altamente degradadas con ADN escaso y/o degradado es habitual añadir la mayor cantidad de ADN posible en la subsiguiente reacción de PCR multiplex.

Tras obtener el extracto de ADN de la muestra biológica, éste es sometido a una reacción

10 de amplificación multiplex empleando el conjunto de parejas de cebadores de la invención. La amplificación de los diferentes loci STRs requiere condiciones y procedimientos de reacción específicos para cada una de las parejas de cebadores empleadas, las cuales pueden conseguirse mediante variación sistemática de cada parámetro. El número de ciclos y la temperatura de alineamiento empleada en la reacción de PCR deben de ser

15 adecuados para la obtención de resultados mediante cada una de las parejas de cebadores de la invención. Parámetros como la concentración de cebadores son específicos para cada cebador y se han ajustado en la validación del conjunto de cebadores. Los cebadores ofrecen resultados en un amplio rango de concentraciones, aunque las concentraciones óptimas para cada pareja de cebadores se recogen en la Tabla 3.

Tabla 3. Resumen de las concentraciones a las que se emplea cada uno de los cebadores y el fluorocromo con el que se ha marcado el extremo 5´del cebador directo o forward (en negrita) de cada pareja de cebadores en el conjunto denominado IDNAE21.

LOCUS

SEQ ID NO Intervalo Concentración de cebadores (µM) Concentración de cebadores (µM) Marcaje fluorescente

CSF1PO

1 0,03 – 0,45 0,10 6-FAM

2

D5S818

3 0,06 – 0,3 0,11

4

D7S820

5 0,07-0,3 0,14

6

D21S11

7 0,07-0,24 0,14

Como entiende el experto en la materia, una reacción de amplificación multiplex requiere una serie de reactivos. entre los que se incluyen, sin limitar a, el ADN molde, la enzima ADN polimerasa, al menos, dos parejas de cebadores (siendo cada cehador de cada pareja complementario a una de las dos hebras del ADN), desoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs), cloruro de magnesio (MgCI2), tampón de reacción y aditivos opcionales, que pueden

añadirse por separado mezclándose en el laboratorio o adquirir previamente mezclados, como es el caso de Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) o Kapa2GTMFast Multiplex PCR kit (Kapa Biosystems, Inc., USA), al que se le añaden las parejas de cebadores en las concentraciones adecuadas y el ADN molde.

La PCR se lleva a cabo en un termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta, tales como la temperatura de hibridación o la temperatura de fusión.

En una realización particular del método de la invención, la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 42 (Tabla 1) es desde 57 a 63ºC según lo calculado mediante el programa informático Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.net/).

La amplificación multiplex del conjunto de parejas de cebadores (Tabla 2) ofrece resultados satisfactorios en un amplio rango de temperaturas de fusión, entre 57-63ºC, aunque los mejores resultados se obtienen a 60,5ºC. De igual manera, los cebadores ofrecen resultados en un amplio rango de concentraciones, aunque las concentraciones óptimas para cada pareja de cebadores se recogen en la Tabla 2. Respecto al número de ciclos empleado en la reacción de PCR se obtienen resultados satisfactorios entre 28-32 ciclos, aunque el número de ciclos óptimo es de 30 ciclos.

Previamente a la reacción de amplificación multiplex, puede llevarse a cabo el marcaje de los cebadores que participan en dicha reacción de amplificación multiplex con el fin de poder detectar posteriormente los fragmentos amplificados. El marcaje de los productos de amplificación puede realizarse por métodos convencionales. Dicho marcaje puede ser directo, para lo cual pueden utilizarse fluoróforos, por ejemplo, Cy3, Cy5, fluoresceína, alexa, etc., enzimas, por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa, etc., isótopos radiactivos, por ejemplo, 33P, 125I, etc., o cualquier otro marcador conocido por el experto en la materia. Alternativamente, dicho marcaje puede ser indirecto mediante el empleo de métodos químicos, enzimáticos, etc.; a modo ilustrativo, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, avidina o estreptavidina conjugada con un fluorocromo (locus), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, biotina (indicador), efectuándose la lectura mediante fluorimetría, etc., o bien, el producto de amplificación puede incorporar un miembro de un par de unión específica, por ejemplo, un anticuerpo anti-digoxigenina conjugado con una enzima (locus), y la sonda se une al otro miembro del par de unión específica, por ejemplo, digoxigenina (indicador), etc., transformándose el sustrato de la enzima en un producto luminiscente o fluorescente, efectuándose la lectura mediante quimio-luminiscencia, fluorimetría, etc.

Así, en una realización particular, el marcaje del producto de amplificación se lleva a cabo mediante el marcaje, en uno de sus extremos, de uno de los oligonucleótidos de cada pareja de cebadores que, en otra realización todavía más particular, el marcaje de los oligonucleótidos se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina. Ejemplos de materiales fluorescentes que se pueden emplear en el marcaje de oligonucleótidos incluyen, sin limitar a, 5-carboxifluoresceína (5FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi4’, 5’-dicloro-2’, 7’-dimetoxifluoresceína (JOE), NED, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).

Tras finalizar la reacción de amplificación multiplex, si se desea, se puede proceder a separar los productos de amplificación o amplicones. Prácticamente cualquier método convencional puede ser utilizado dentro del marco de la invención para separar los productos de amplificación. Las técnicas para separar los productos de amplificación están ampliamente descritas en el estado de la técnica, como por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 (citado ad supra). Técnicas para separar los productos de amplificación son, por ejemplo, electroforesis sumergida con geles de Methafor, electroforesis en geles de poliacrilamida, electroforesis capilar, etc.

Seguidamente a la separación de los productos de amplificación, se procede a identificar el tamaño de los fragmentos separados, para lo cual puede emplearse cualquiera de los procedimientos de identificación de fragmentos de amplificación conocidos del estado de la técnica, tales como hibridación con sondas marcadas (por ejemplo con un fluoróforo) que serán detectadas por un detector y procesadas mediante un sistema informático, tinción, por ejemplo, con bromuro de etidio, tinción de plata, etc. Tal como entiende el experto en la materia, si todo este proceso es integrado en un sistema informático, se puede generar una gráfica denominada electroferograma donde puede identificarse el tamaño de los fragmentos amplificados.

En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del método de la invención para identificar un individuo, determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

Kit de la invención

Por otro lado, la invención se relaciona con un kit útil para la puesta en práctica del método de la invención, que comprende el conjunto de parejas de cebadores de la invención que comprende 4 o más parejas de cebadores dirigidas a amplificar los loci contenidos en las principales bases de datos empleadas en la identificación de individuos.

Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con un kit, de aquí en adelante kit de la invención, que comprende parejas de cebadores específicas para amplificar al menos 4 loci seleccionados del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248, en donde

a) Al menos uno de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs

CSF1PO, D5S818, D7S820, TPOX y D13S317; y

b) Al menos dos de los 4 loci se selecciona del grupo formado por los loci STRs

D2S441, D1S1656, D12S391, D22S1045 y D10S1248.

En una realización particular, el kit de la invención comprende al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ó 21 parejas de cebadores específicas para los loci del grupo formado por los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.

En otra realización todavía más particular del kit de la invención, la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los loci analizados es la pareja de oligonuc1eótidos mostrada en las secuencias

SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para ellocus CSP1PO, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para e1locus D5S818, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para ellocus D7S820, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para ellocus D21 S11, SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para e110cus D2S441, SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para ellocus D1S1656, SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para ellocus IPOX, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para el10cus VW A, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para ellocus D8S 1179, SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para ellocus D19S433, SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para ellocus D12S39l, SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para ellocus IH01, SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para ellocus D16S539, SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para e1locus D3S 1358, SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para ellocus D18S5l, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para ellocus D2S1338, SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para ellocus D13S317, SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para ellocus Amelogenina, SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para ellocus FGA, SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para ellocus D22Sl045, y SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para ellocus D10S1248.

Como entiende el experto en la materia, el kit de la invención además de comprender el conjunto de parejas de cebadores de la invención, puede incluir, opcionalmente, los reactivos necesarios para llevar a cabo la reacción de ampliticación multiplex, entre los que se incluyen, sin limitar a, desoxinucleótidos trifosfato (dNIPs), iones divalentes y/o monovalentes, una solución tampón (bl![fer) que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa, ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas, etc. No obstante, si el kit de la invención no comprende los reactivos necesarios para poner en práctica el método de la invención, éstos están disponibles comercialmente y pueden encontrarse formando parte de un kit. Cualquier kit de los disponibles comercialmente que contenga los reactivos necesarios para llevar a cabo una reacción de amplificación, puede emplearse con éxito en la puesta en práctica del método de la invención. Tal como se muestra en los ejemplos, en el caso de la presente invención estos reactivos se encuentran previamente mezclados en el reactivo Qiagen Multiplex PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).

Tal como se ha descrito en párrafos anteriores, previamente a la reacción de amplificación multiplex del método de la invención, si se desea puede llevarse a cabo el marcaje de los cebadores con el fin de poder detectar posteriormente los fragmentos amplificados. De forma análoga, como entiende el experto en la materia, el kit de la invención puede comprender el primer conjunto de parejas de cebadores de la invención en donde uno de los oligonuc1éotidos dc cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos o, alternativamente, puede comprender los reactivos necesarios para llevar a cabo el marcaje de los cebadores. Los distintos métodos que existen en el estado de la técnica para realizar el marcaje de los cebadores, así como los tipos de marcadores que se puede emplear han sido explicados previamente en la presente memoria.

Así, en una realización particular, el kit de la invención comprende, además, los reactivos necesarios para marcar las parejas de nucleótidos o, en otra realización particular, uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.

En una realización todavía más particular del kit de la invención, los marcadores empleados en el marcaje de los oligonuc1cótidos seleccionan del grupo que consiste en un radio isótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina. En otra realización aún más particular, el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexac1orinado de 6-FAM (HEX), 6-carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-Xrodamina (ROX), 6-carboxi-4'. S'-dicloro-2', T-dimetoxifluoresceína (JOE), NED (ABI), Cy-3, Cy-S, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).

Tal como se ha mencionado previamente, el kit de la invención es útil en la puesta en práctica del método de invención. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención para obtener el perfil genético de un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos de la invención y no pretenden ser limitativos de la misma.

EJEMPLOS

En los ejemplos siguientes se realiza la validación de I-DNAE21, para su uso en identificación humana y casos de parentesco y se demuestra a su vez sus ventajas frente a las técnicas actuales.

Ejemplo 1. En el primer ejemplo se detalla la optimización de los conjuntos de cebadores y de los parámetros de las reacciones de PCR, estudios de concordancia con otras STRs multiplex,

Ejemplo 2. En el segundo ejemplo, se realiza un caso práctico de de identificación, con el objetivo de demostrar que la invención es adecuada para su uso en identificación humana.

Ejemplo 3. En el tercer ejemplo, se realiza un caso práctico de parentesco en ausencia de un progenitor, con el fin de demostrar la alta capacidad discriminativa de la invención y determinar la probabilidad de parentesco en casos de parentesco humano complejos.

EJEMPLO 1 Validación del método de la invención que comprende una reacción de amplificación multiplex empleando los conjuntos de parejas de cebadores I-DNAE21 para su uso en identificación humana

A continuación se describe la validación de I-DNAE21 para su uso en identificación humana. Dicha validación ha consistido en ensayos de optimización de los conjuntos de

cebadores, optimización de los parámetros de la PCR y estudios de concordancia con otras STRs multiplex. Los resultados obtenidos mostraron que I-ONAE21 es una herramienta adecuada para la obtención de perfiles genéticos humanos.

MATERIALES y MÉTODOS

Afuestras control de ADN humano

Se utilizaron los AON controles 9947 A del kit AmpF1STR'" YFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA), Control ONA 007 (Applied Biosystems, Foster City, CA), K562 (Promega® Corporation, USA) y Control ONA 2800M (Promega Corporation, USA) para poner a punto las condiciones de PCR y realizar ensayos de sensibilidad. Estas tres muestras se cuantificaron mediante Quantifiler® Human ONA Quantitication Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) en un ABI PRISM® 7000 Sequence Oetection System (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante y fueron diluidas a I ngl~L

Muestras de la población

Se tomaron muestras de sangre periférica de 600 individuos sanos: 318 caucasoides europeos (País Vasco, España) y 282 individuos de Colombia (133 negroides y 149 hispanos).

Extracción de ADNy cuantificación

Los extractos de AON de los individuos de origen caucasoide se obtuvieron mediante lisis proteolítica con proteinasa K y extracción orgánica. Los extractos de AON procedentes de las muestras biológicas de los individuos de origen negroide e hispano se obtuvieron mediante extracción por QiAamp ONA Micro Kit (Qiagen, CA). Todos los extractos de AON se cuantificaron con PicoGreenE (Invitrogen).

Optimización del conjunto de cebadores

Se utilizó el programa Perlprimer (http://perlprimer.sourceforge.netl) para diseñar nuevos cebadores que amplifican 20 loci STRs (03S1358, 05S818, 07S820, 08S1179, 013S317, 016S539, 018S51, 019S433, 021SII, CSFIPO, FGA, THOI, TPOX, vWA, 02S1338, D2S441, DlS1656, D12S391, D22SI045 y DIOSI248) más amelogenina, en base a las secuencias de referencia cuyos números de acceso a Genbank se recogen en la Tabla 4.

Las regiones t1anqueantes a los loei analizados se estudiaron mediante SNPblast

5

(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snpblastByChr.html) con el fin de evitar posiciones variables

en la región de unión de todos los cebadores diseñados. Los amplificados se extienden

desde 49 hasta 389 pb, para abarcar un amplio número de los alelos contenidos en

STRBase website [Ruitberg, C.M., DJ. Reeder, y J .M. Butler,200 1. Nucleic Acids Res,

29(1): 320-2]

lO

La intensidad de los amplicones y la ausencia de inespecíficos de cada locus se evaluó

mediante el análisis de los productos de PCR por DHPLC con un DNAsep Cartridge

(Transgenomic" WAVEJiJ System 4500, Glasgow, UK). 10 fll de amplificado fueron

migrados a 40°C en un gradiente lineal desde 38,6 a 61,1 % de tampón B (25 % de

15

acetonitrilo y TEAA 0,1 M) durante \O minutos.

Para evitar la adenilación incompleta se utilizó la adición de una guanina al extremo 5' del

cebador inverso, (Brownstein, M.J., J.D. Carpten, and J.R. Smith, 1996. Biotechniques,

20(6): 1004-6, 1008-10; Hill CR, B.1., Valone PM, 2009. J Forensic Sci, 54(5): 7; Butler,

20

J.M., Y. Shen, and B.R. McCord, 2003. J Forensic Sci, 48(5): 1054-64).

Amplificación de peRo electroforesis y análisis de datos

Se emplearon 12,s,.tl de Multiplex PCR Kit Plus de Qiagen1ll (Qiagen, Valencia, CA), 5 fll

25

de la mezcla de cebadores, 6,5 fll de H,O mQ esteril y 1 fll de ADN molde (Ing / fll). Las

concentraciones de cada pareja de cebadores se detallan en la Tabla 3. Se analizó el

rendimiento de la ampliticación en diferentes termocicladores: Biorad™ ICycler, CIOOO™

y Mycycler™ (BioRad, Hercules, CA) y GeneAmpij) 9700 PCR System (Applied

Biosystems, Foster City, CA), así como en diferentes condiciones de temperaturas de

30

hibridación ("annealing temperature"): 57 oC, 58,9 oC, 60,5 oC, 61,8 oC y 63 oC, a distintos

números de ciclos: 28, 29, 30,31 Y32 ciclos y a tiempos de extensión tinal de 30, 45, 60 Y

90 minutos. Se analizaron 2 J.lI de cada producto de ampliticado mezclados con 9 J.lI de Hi

Di™ Formamide (Applied Biosystems~, Foster City, CA) y 0,5 fll de GeneScan™ 500

LIZ® Size Standard (Applied Biosystems@, Foster City, CA). Tras la desnaturalización de los amplificados (6 minutos a 95 oC) se enfriaron (4 minutos a 4 "C) y se separaron en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystemsi~, Foster City, CA). Los resultados de la electroforesis fueron analizados mediante el software Genmapper versión

5 4.0 (Applied Biosystems®, Foster City, CA).

Estudios de concordancia con otras STRs multip/ex

Se compararon perfiles genéticos analizados con I-DNAE21, Identifiler·1!l y NGM'1!l (Applied Biosystems, Foster Cíty, CA). Para su análisis mediante I-DNAE21 se empleó I

10 ng de ADN molde de cada individuo. El análisis mediante Identitiler'" y NGM1!l (Applied Biosystems, Foster City, CA) se realizó según las condiciones óptimas sugeridas por el fabricante. RESULTADOS

15 Optimización de los conjuntos de cebadores

La Tabla 4 recoge un amplio rango de alelos para cada locus incluido en I-DNAE21. Se han considerado los alelo s descritos en los principales grupos poblacionales según la información recogida en STRbase [Ruitberg, C.M., D.J. Reeder, y J.M. Butler,2001. Nucleic Acids Res, 29(1): 320-2].

Tabla 4

Locus

N° acceso Genbank Intervalo alelos Fragmento de PCR (pb) Concentración de cebadores (~M) Marcador fluorescente

C5F1PO

X14720 6-15 75-111 0.10 6·FAM™

055818

AC008512 7-17 127 -167 0.11

075820

AC004848 6-15 183 -219 0.14

021511

M84567 24 -38 240 -296 0.14

025441

AC079112 9-16 305-333 0,41

0151656

G07820 9-21 341-389 0.31

TPOX

M68651 6-16 61-101 0.08 NED™

vWA

M25858 11-24 121-173 0.12

0851179

AF216671 8-20 181 -229 0.17

0195433

G08036 5.2-18.2 245 -297 0.14

0125391

G08921 14-27 305-357 0.11

TH01

000269 5-14 57 -93 0,08 VIC™

0165539

AC024591 5-16 105-149 0,10

0351358

NT_005997 9-20 161-205 0,11

018551

AP001534 7-27 213 -293 0,34

0251338

AC010136 15-28 313-365 0,07

0135317

AL353628 5-17 72-120 0,10 PE""

Amelogenlna

Sullivan et al.* X, Y 121,127 0,14

FGA

M64982 16-51,2 151 -293 0,30

02251045

AL022314 8-19 294-327 0,19

01051248

AL391869 8-18 339-379 0,22

• Sulhvan 1C\1, et.al. 1993. BlOtechnzques,15(4):636-8,640.1.

Se diseñaron 132 cebadores de entre los que se eligieron aquellos capaces de producir amplificados del menor tamaño posible, que en ningún caso excedieran de 400 pb, cuyas 5 temperaturas de fusión ("melting temperature") estuvieran comprendidas entre 57,8"C y 62,4"C y que hibridaran en regiones carentes de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e lNDELS (Inserciones/deleciones) descrito hasta la fecha en NCBI (http://www.ncbi,nlm.nih.gov/snp/). En la primera tase de optimización se efectuaron amplificaciones PCR singleplex de cada locus. Los productos PCR fueron analizados 10 mediante DHPLC para evaluar la especiticidad de los cebadores y la intensidad de amplificación. En la segunda fase de optimización, se ensayaron diversos conjuntos de cebadores en multiplexo Se espaciaron los rangos de alelos de los loci adyacentes en tamaño con el fin de evitar solapamientos entre alelos correspondientes a loci diferentes para asegurar así un correcto genotipado. El análisis mediante DHPLC permitió evaluar la

15 ausencia de inespecíficos y la eficacia de la amplificación para cada uno de los loei ensayados en formato multiplex.

Finalmente, se seleccionó una reacción de PCR sextaplex (sextaplex A: CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441 y DlS1656) y 3 reacciones de PCR quintuplex (quintuplex B:

20 THOl, D16S539, D3S1358, Dl8S51 y D2S1338; quintuplex C: TPOX, vWA, D8S1179, Dl9S433 y D12S391 y quintuplex D: D13S317, amelogenina, FGA, D22SlO45 y O 1 OS 1248).

Los cebadores directos de la reacción sextaplex A se marcaron con el marcador 25 fluorescente 6-F AMnt, y los cebadores directos de las reacciones quintuplex B, C y D,

fueron marcados con VICTM, NEDTM y PET® respectivamente (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Tabla 4). Por último, se agruparon los distintos conjuntos de cebadores en una única reacción de PCR multiplex que permite la amplificación de 20 loci STRs y amelogenina. En la Figura 2 se representa el resultado final de la estrategia en el diseño de cebadores para I-DNAE21.

En conclusión, para posibilitar la obtención del perfil genético completo se diseñaron los cebadores de tal modo que pudiesen ser analizados en una única reacción multiplex un total de 21 loci: 20 loci STR (CSF1PO, D10S1248, D1S1656, D12S391, D13S317, D16S539, D18S51, D19S433, D21S11, D22S1045, D2S1338, D2S441, D3S1358, D5S818, D7S820, D8S1179, FGA, TH01, TPOX y vWA) más el locus amelogenina.

Optimización de los parámetros de PCR

La optimización de los parámetros de amplificación tales como la concentración óptima de cebadores, temperatura de hibridación, número de ciclos y tiempo de extensión, se realizó mediante el estudio de los electroferogramas en los que se evaluó la altura de los picos, el balance en heterocigosis de los mismos y la adenilación incompleta.

En primer lugar, la concentración de cada pareja de cebadores fue testada entre 0,0375 µM y 1,5 µM, de tal forma que en cada caso, por debajo de la concentración óptima se observó un aumento en la altura de los picos a medida que se aumentaba la concentración de cebadores. Mientras que a su vez, en concentraciones superiores a la considerada óptima se detectó un aumento tanto del desbalance en heterocigosis y de la adenilación incompleta, como de la intensidad de los artefactos en I-DNAE21 (FAM71, FAM92, FAM165, VIC85, VIC92, VIC108, NED107, NED128, NED171, PET103 y PET154).

En este sentido, las intensidades de los loci analizados mediante I-DNAE21 se equilibró alrededor de 1000 RFUs en el análisis de 1 ng de ADN, para alcanzar un equilibrio entre la intensidad de la señal y la ausencia de solapamiento entre las señales correspondientes a diferentes fluorocromos. (Figura 1)

A continuación se procedió a la optimización de la temperatura de hibridación de la reacción PCR multiplex. El aumento de temperatura de hibridación produjo una disminución gradual tanto de la adenilación incompleta, como de la altura de los picos. Los mejores resultados se obtuvieron a la temperatura de hibridación de 60,5 ºC.

Por otro lado, el aumento en el número de ciclos incrementó de forma generalizada la altura de los picos y la adenilación incompleta. En este sentido, los resultados más equilibrados correspondieron a 30 ciclos. Así mismo la adición de una guanina al extremo 5´ del primer reverse eliminó el efecto de la adenilación incompleta, incluso mejor que la adición de pig-tailing. La adición de dicha guanina se representa como una G en la Tabla

2.

Cabe destacar también que, el empleo de los termocicladores BioradTM ICycler, C1000TM y MycyclerTM (BioRad, Hercules, CA) y GeneAmp® 9700 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA) no reveló variaciones significativas en cuanto a la calidad de los resultados obtenidos.

Tras la evaluación de todos los parámetros anteriormente mencionados, se llegó a determinar la concentración óptima de cebadores, de tal forma que se obtuvieron las siguientes intensidades medias para cada color en el análisis de 1 ng de ADN de I-DNA1 [6-FAMTM (702 ± 118 RFUs), VICTM (725 ± 194 RFUs), NEDTM (895 ± 140 RFUs) y PET® (842 ± 95 RFUs)].

De esta manera, I-DNAE21 ha demostrado ser una reacción multiplex balanceada y específica, capaz de amplificar 20 loci STRs, además del locus amelogenina, a partir de 1 ng de ADN molde (Figura 1), mediante la siguientes condiciones de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial durante 5 minutos a 95 ºC, 30 ciclos de 30 s a 95 ºC, 90 s a 60,5 ºC y 30 s a 72 ºC, seguidos de 1 ciclo de extensión final de 30 minutos a 60 ºC.

Estudios de concordancia con otras STRs multiplex Los estudios de concordancia se llevaron a cabo mediante la comparación de 2430 allele calls obtenidos por I-DNAE21 e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y la comparación de 665 allele calls obtenidos mediante I-DNAE21 y NGM® (Applied Biosystems, Foster City, CA). Se eligieron Identifiler® y NGM® (Applied Biosystems, Foster City, CA) por ser estos sistemas ampliamente utilizados [Hill, C.R., et al., 2007. J

Forensic Sci, 52(4): 870-3] y validados [Collins, P.J., et al., 2004. J Forensic Sci, 49(6): 1265-77]. Entre los resultados obtenidos por I-DNAE2l e Identifiler® se encontró una única discordancia lo que supone una concordancia del 99,9% entre estos sistemas. Dicha discordancia correspondió a un individuo genotipado como homocigoto (15/15) para 03S1358 mediante Identifiler® y como heterocigoto (12115) mediante I-DNAE21. La muestra fue analizada por triplicado por ambos sistemas con idénticos resultados. En la comparación de I-DNAE21 y NGM® (Applied Biosystems, Foster City, CA) no se encontraron discordancias, lo que supone una concordancia del 100% entre ambos sistemas.

DISCUSIÓN

A continuación se discuten los resultados relativos a la validación de I-ONAE21 en los ensayos de optimización del conjunto de cebadores, optimización de parámetros de PCR, y estudios de concordancia.

I-DNAE21 ha demostrado ser una reacción multiplex balanceada y específica, capaz de amplificar 20 loci STRs además del ]ocus amelogenina.

De este modo I-ONAE21 es la única reacción capaz de analizar de manera simultánea la totalidad de los loci STRs del CODIS, ECL, NDNAD y ESS, incluyendo además los 5 STRs recomendados por la EDNAP (European DNA Projiling Group) and ENFSI (European Network ofForensic Science Institutes). Además, al ser la única reacción que permite el análisis de 20 loei STRs aporta una probabilidad de discriminación superior a todas las reacciones multiplex existentes hasta la fecha.

La fiabilidad de I-ONAE21 ha sido comprobada mediante estudios de concordancia entre los perfiles genéticos determinados por este sistema y los obtenidos mediante sistemas preexistentes ampliamente utilizados como son Identitiler@ y NGM®(Applied Biosystems, Foster City, CA). En este sentido en primer lugar se constató una concordancia del 99,9 % entre I-ONAE2l e Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA), donde la única excepción se detectó en un individuo, genotipado como homocigoto

por Identifiler® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y como heterocigoto por IDNAE21. Así mismo, se constató la concordancia del 100 % de I-DNAE21 respecto a NGM® (Applied Biosystems, Foster City, CA)

La discordancia hallada es similar a las habitualmente encontradas tras el análisis de idénticos STRs con sistemas que emplean diferentes parejas de cebadores (Hill, C.R. et al., 2007. J Forensic Sci, 2007. 52(4): 870-3). Discordancias similares reportadas en otros estudios se debieron a la presencia de mutaciones que probablemente coincidían con la región de unión del extremo 3´ de uno de los cebadores mientras que las variaciones en el tamaño de alelos probablemente se debieron a la presencia de inserciones y/o deleciones en la región flanqueante a la repetición STR [Budowle, B., et al., 2008. Int J Legal Med, 122(5): 421-7; Zhai, X.D., et al., 2009., Int J Legal Med, 124(5):457-8]. Dichas mutaciones impiden la amplificación de uno de los alelos y en consecuencia originan pérdidas alélicas. En este sentido, los perfiles genéticos obtenidos mediante I-DNAE21 mostraron una alta fiabilidad.

En conclusión, la presente validación ha puesto de manifiesto que I-DNAE21 constituye un sistema de elevada robustez y fiabilidad en la obtención de perfiles genéticos, lo que lo convierte en una herramienta útil para su utilización en identificación humana. Así mismo, el reducido tamaño de sus amplificados menores en su totalidad a 389 pb, sugiere que la presente invención posee una elevada capacidad de análisis de loci incluidos en las principales bases de datos nacionales como son CODIS, NDNAD, ECL y ESS incluso en muestras cuyo ADN pueda estar degradado

EJEMPLO 2 Aplicación del conjunto de cebadores de I-DNAE21 en un caso práctico de identificación humana

A continuación se describe la validación de I-DNAE21 para su uso en identificación humana. Dicha validación ha consistido en el análisis de una muestra mediante el conjunto de cebadores de I-DNAE21 con la finalidad de obtener su perfil de identificación genético.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras control de ADN humano

Se utilizó el ADN control 9947 A del kit AmpFISTR'lll YFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA) como control positivo de amplificación.

Como control negativo de amplificación se utilizó H¡Ü mQ estéril (Millipore Corporation, Billerica,. MA, EE. UU).

lvfuestras de análisis

Se tomaron muestras de saliva mediante el frotis de la mucosa bucal con un hisopo estéril a un individuo sano de origen caucasoide.

Extracción de ADNy cuantificación

La extracción de ADN de los hisopos de saliva se realizó mediante el sistema de extracción QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen lnc., Valencia, CA, USA). Todos los extractos de ADN se cuantificaron con Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit (lnvitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Amplificación de peR, electroforesis y análisis de datos

La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp® 9700 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para ello se emplearon 12.5¡.Jl de Multiplex PCR Kit Plus de Qiagen® (Qiagcn, Valencia, CA), 5 fll de la mezcla de cebadores de I-DNAE21, 6.5 fll de H20 mQ estéril y 1 fll de ADN molde (1 ng / fll) mediante la siguientes condiciones de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial durante 5 minutos a 95 oC, 30 ciclos de 30 s a 95 oC, 90 s a 60,5 OC Y30 s a 72 oC, seguidos de 1 ciclo de extensión final de 30 minutos a 60 oC.

Se analizaron 2 fll de cada producto de amplificado mezclados con 9 fll de Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystems@, Foster City, CA) y 0,5 fll de GeneScarirM 500 LIZID Size Standard (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Tras la desnaturalización de los ampliticados (6 minutos a 95 oC) se enfriaron (4 minutos a 4 OC) Yse separaron en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems®, Foster City, CA). Los resultados de la electroforesis fueron analizados mediante el software Genmapper versión 4.0 (Applied Biosystems®, Foster City, CA).

Cálculos de probabilidad

Se realizó el cálculo de la probabilidad de coincidencia por azar, según la base de datos del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses ofrecidas en el ejercicio de intercomparación del 2011 del Grupo de Habla Española y Portuguesa de la International

10 Societyfor Forensic Genetics (GHEP-ISFG).

RESULTADOS

15 La Tabla 5 recoge el pertil genético de un individuo obtenido mediante la amplificación con I-DNAE21, electroforesis y el análisis de datos del individuo analizado.

TablaS

Muestra

Loci

~--~-----_.~. _.~

Alelo 1 Alelo 2 Amelogenina X X C5FlPO 11 12 01051248 12 18 0125391 16 20 0135317 11 14 0165539 10 11 018559 16 16 0195433 14 14 0151656 16 17.3 021511 29 30 02251045 11 12 02513338 16 17 025441 10 14

D3S1358

15 15

D5S818

11 13

D7S820

9 11

D8S1179

14 15

FGA

18 22

TH01

6 6

TPOX

8 8

VWA

17 17

El perfil genético de la muestra analizada mediante I-DNAE21 ha mostrado una probabilidad de coincidencia por azar, según los cálculos realizados con la base de datos del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses ofrecidas en el ejercicio de

5 intercomparación del 2011 del GHEP-ISFG de 2,8188 E-30. Este valor de coincidencia por azar indica que de ser hallado este perfil es 354753 cuatrillones de veces más probable que pertenezca al individuo analizado que a otro individuo tomado al azar en la población.

DISCUSIÓN

10 A continuación se discute los resultados obtenidos para la validación de I-DNAE21 en su uso en identificación humana.

Mediante el uso de I-DNAE21 se ha obtenido un valor de probabilidad de coincidencia de 2,8188 E-30, dicho valor resulta sobradamente discriminativo y demuestra por tanto la

15 aplicabilidad de I-DNAE21 para la identificación humana. La probabilidad de coincidencia se define como la probabilidad de que dos personas elegidas al azar en una población determinada tengan el mismo perfil genético.

La probabilidad complementaria es la probabilidad de discriminación, que a su vez se

20 define como la probabilidad de que dos personas elegidas al azar en una población determinada tengan distinto perfil genético. La suma de la probabilidad de coincidencia y de la probabilidad de discriminación, al ser sucesos complementarios, es 1. Por tanto a menor probabilidad de coincidencia mayor poder de discriminación.

En este sentido cuanto mayor número de marcadores STR altamente polimórficos se analicen menor es la probabilidad de coincidencia y por tanto mayor su probabilidad de discriminación.

5 En la actualidad, y como se puede observar en la Tabla 9, I-oNAE2l es el kit que permite la amplificación simultánea de un mayor número de STR. Por ello I-oNAE2l es el kit que ofrece una menor probabilidad de coincidencia y por tanto un mayor poder de discriminación (Tabla 6).

10 Tabla 6

Probabilidad de Coincidencia

Kits STR Multiplex

Afro-americanos Caucásicos Hispanos

I-ONAE21

5,54E-25 5,02E-24 3,89E-24

ESSplex SE kit

8,17E-22 2,35E-2l 3,15E-2l

NGM Select

8,17E-22 2,35E-2l 3,15E-2l

Powerplex ESI-17

8,17E-22 2,35E-2l 3,15E-2l

Powerplex ESX-17

8,l7E-22 2,35E-2l 3,15E-2l

Powerplex 16

7,04E-19 5,46E-18 3,40E-18

rdentifiler

l,08E-18 7,94E-18 2,57E-l8

Inves! Idplex

1,08E-18 7,94E-18 2,57E-l8

rnvest Nonaplex ESS

l,27E-17 8,38E-l8 2,54E-17

I-ONAI

4,77E-17 2,51E-l6 8,09E-17

Invest Oecaplex SE

l,59E-15 3,72E-15 2,08E-l5

I-ONA2

5,03E-14 1,88E-13 1,02E-13

Bioplex-II

5,34E-13 1,OlE-12 1,35E-12

Q8

2,48E-ll 1,32E-ll l,68E-ll

Minifiler

6,70E-ll 1,36E-lO 5,74E-ll

Estos datos reflejan objetivamente la aplicabilidad y superioridad de I-ONAE21 frente a los kits STR multiplex actualmente existentes en el mercado. en su utilización para la 15 identificación humana.

EJEMPLO 3

Aplicación del conjunto de cebadores de I-DNAE21 en un caso práctico de parentesco en ausencia de un progenitor

A continuación se describe la validación de I-DNAE2l para su uso en la determinación de relaciones de parentesco entre individuos. Dicha validación ha consistido en el análisis de dos muestras mediante el conjunto de cebadores de l-DNAE21 con la finalidad de determinar la supuesta relación de maternidad biológica entre los individuos analizados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestras control de ADN humano

Se utilizó el ADN control 9947 A del kit AmpFlSTRwYFiler (Applied Biosystems, Foster City, CA) como control positivo de amplificación.

Como control negativo de amplificación se utilizó H20 mQ esteril (Millipore Corporation, Billerica,. MA, EE.UU).

Muestras de análisis

Se tomaron muestras de saliva mediante el frotis de la mucosa bucal con hisopos estériles a dos individuos sanos (supuesta madre e hija) de origen caucasoide.

Extracción de ADNy cuant(ficación

La extracción de ADN de los hisopos de saliva se realizó mediante el sistema de extracción QiAamp DNA Micro Kit (Qiagen lnc., Valencia, CA, USA).

Todos los extractos de ADN se cuantificaron con Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit (lnvitrogen, Carlsbad, CA, USA).

Amplificación de peRo e/ectrojoresis y análisis de datos

5

La amplificación se realizó en un termociclador GeneAmp@ 9700 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Para ello se emplearon 12,5!.tl de Multiplex PCR Kit Plus de Qiagen@ (Qiagen, Valencia, CA), 5 ¡.tl de la mezcla de cebadores de l-DNAE21, 6,5 ¡.tI de H20 mQ esteril y 1 ¡.tI de ADN molde (1 ng ! ¡.tI) mediante la siguientes condiciones de amplificación: un ciclo de desnaturalización inicial durante 5 minutos a 95 "C, 30 ciclos de 30 s a 95 oC, 90 s a 60,5 oC y 30 s a 72 oC, seguidos de 1 ciclo de extensión final de 30 minutos a 60 oC.

lO 15

Se analizaron 2 ¡.tI de cada producto de amplificado mezclados con 9 ¡.tI de Hi-Di™ Formamide (Applied Biosystemsro , Foster City, CA) y 0,5 ¡.tI de GeneScan™ 500 LIZ® Size Standard (Applied Biosystems@, Foster City, CA). Tras la desnaturalización de los amplificados (6 minutos a 95 oC) se enfriaron (4 minutos a 4 oC) y se separaron en un ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems'''', Foster City, CA). Los resultados de la electroforesis fueron analizados mediante el software Genmapper versión 4.0 (Applied Biosystems®, Foster City, CA).

Cálculos de probabilidad

20 25

Se realizó el cálculo de la probabilidad de maternidad mediante ei soílware de cálculo de probabilidad Familias (J. Drábek, 2008. For Science Intcrnational: Genetics, Volumen 3, Número 2, Páginas 112-118) según la base de datos del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses ofrecidas en el ejercicio de intercomparación del 2011 del Grupo de Habla Española y Portuguesa de la International Society jar Forensic Genetics (GHEPISFG).

RESULTADOS

30

La Tabla 7 recoge los perfiles genéticos de dos individuos obtenidos mediante la amplificación con I-DNAE21, electroforesis y el análisis de datos de los individuos analizados.

El análisis estadístico, teniendo en cuenta la estructura genotípica del supuesto padre y las distribuciones alélicas de los marcadores analizados, ha proporcionado una Probabilidad de Maternidad de 99,99947%.

Tabla 7

Loei

Supuesta Madre Hija

Alelo 1

Alelo 2 Alelo 1 Alelo 2

Amelogenina

X X X X

C5FIPO

10 11 11 11

01051248

13 16 13 13

0125391

19 25 19 22

0135317

11 11 8 11

0165539

11 12 10 12

018559

14 17 17 17

0195433

13 14 13 14

0151656

12 17 12 14

021511

30 30 28 30

02251045

15 16 15 16

02513338

19 25 20 25

025441

10 14 14 15

0351358

15 18 15 17

055818

11 13 12 13

075820

9 10 9 11

0851179

12 14 12 13

FGA

21 21 21 27

THOl

6 9.3 6 9.3

TPOX

8 9 8 8

VWA

17 18 17 18

DISCUSIÓN

A continuación se discute los resultados obtenidos para la validación de I-DNAE21 en su uso en la determinación de relaciones de parentesco entre individuos.

Mediante el uso de I-DNAE21 se ha obtenido una Probabilidad de Maternidad de 5 99,99947%. El Índice de Maternidad obtenido indica que la maternidad biológica es 192294 veces más probable que la de otra mujer tomada al azar en la población.

Dentro del árca de la investigación biológica de parentesco se establece que un valor de probabilidad de parentesco superior al 99,99% es considerado como que el parentesco 10 biológico queda demostrado "más allá de cualquier duda razonable".

En este sentido, existen ocasiones en las que resulta de gran dificultad obtener un valor de probabilidad de parentesco superior a dicho umbral mediante la aplicación de un único kit SIR multiplexo Este problema es habitual cuando se quiere determinar una paternidad o

15 maternidad en ausencia de algún progenitor, en determinaciones de hermanidad o parenteseos más complejos como medio-hermanos, abuelo-nieto, tío-sobrino etc. En estos casos, con el fin de alcanzar una probabilidad de parentesco que permita demostrar el parentesco, es necesario aumentar el número de STRs analizados e incluso analizar STRs ligados a cromosomas sexuales (cromosoma X e Y).

20 La probabilidad de exclusión a priori determina el potencial teórico de un kit, se define como la probabilidad de demostrar la exclusión del parentesco de un individuo falsamente implicado mediante el estudio de diversos marcadores genéticos. En cste sentido, 1DNAE21 incluye un número de STRs mayor que cualquier kit STR multiplex

25 comercializado hasta la fecha, por ello alcanza una probabilidad de exclusión a priori mayor a los kits ampliamente utilizados en los laboratorios en los que se analizan relaciones de parentesco. (Tabla 8) Tabla 8

Probabilidad de exclusión a priori

Kits STR Multiplex

Hispanos Caucásicos Atro-americanos

I-DNAE21

99,9999984 99,99999932 99,99999981

ESSplex SE kit

99,9999918 99,9999985 99,99999905

NGM select

99,9999918 99,9999985 99.99999905

PP ESI-17

99,9999918 99,9999985 99,99999905

PP ESX-17

99,9999918 99,9999985 99,99999905

PP 16'

99,99983 99,999940 99,999960

Identifiler

99,999902 99,99985 99,999941

Invest Idplex

99,999902 99,99985 99,999941

InvestNonaplex ESS

99,99980 99,999971 99,999971

l-DNAl

99,99962 99,99939 99,99971

Invest Decaplex SE

99,99947 99,99967 99,99970

I-DNA2

99,9972 99,9960 99,9983

Bioplex-ll

99,9911 99,9944 99,9962

Q8

99,987 99,9937 99,9909

Minifiler

99,975 99,975 99,984

En este ejemplo I-DNAE21, sin necesidad de análisis adicionales, ha resultado óptimo para

resol ver un caso de maternidad biológica en ausencia de padre obteniendo un Índice de

maternidad superior al 99,99% y por tanto demostrando "más allá de cualquier duda

razonable" la maternidad.

Se ha demostrado por tanto la gran aplicabilidad y fiabilidad de I-DNAE2l para su uso en

parentesco biológico, incluso en casos de parentesco complejo.

Tabla 9: Prin~ipales kits multiplex de loei STRs autosómicos comparando el número de STRs de cada kit con los incluidos en las difewntcs bases de datos.

TRADUCCIÓN AL ESPAÑOL DEL TEXTO DE LA LISTA DE SECUENCIAS

-

“SEQUENCE LISTING” – Lista de secuencias

-

“METHOD FOR OBTAINING THE GENE PROFILE OF AN INDIVIDUAL”: Método para obtener el perfil genético de un individuo.

-

“ARTIFICIAL SEQUENCE”: Secuencia Artificial

-

“DNA”: ADN

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY CSF1PO LOCUS” – Cebador directo diseñado para amplificar el locus CSF1PO

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY CSF1PO LOCUS” – Cebador inverso diseñado para amplificar el locus CSF1PO

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D5S818 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D5S818

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D5S818 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D5S818

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D7S820 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D7S820

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D7S820 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D7S820

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D21S11 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D21S11

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D21S11 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D21S11

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D2S441 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D2S441

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D2S441 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D2S441

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D1S1656 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D1S1656

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D1S1656 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D1S1656

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY TPOX LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus TPOX

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY TPOX LOCUS” -Cebador

inverso diseñado para amplificar el locus TPOX

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY VWA LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus VWA

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY VWA LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus VWA

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D8S1179 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D8S1179

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D8S1179 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D8S1179

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D19S433 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D19S433

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D19S433 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D19S433

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D12S391 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D12S391

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D12S391 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D12S391

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY TH01 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus TH01

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY TH01 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus TH01

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D16S539 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D16S539

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D16S539 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D16S539

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D3S1358 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D3S1358

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D3S1358 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D3S1358

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D18S51 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D18S51

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D18S51 LOCUS” -Cebador

inverso diseñado para amplificar el locus D18S51

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D2S1338 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D2S1338

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D2S1338 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D2S1338

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D13S317 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D13S317

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D13S317 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D13S317

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY AMELOGENINA LOCUS” Cebador directo diseñado para amplificar el locus Amelogenina

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY AMELOGENINA LOCUS” Cebador inverso diseñado para amplificar el locus Amelogenina

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY FGA LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus FGA

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY FGA LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus FGA

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D22S1045 LOCUS” -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D22S1045

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D22S1045 LOCUS” -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D22S1045

-

“FORWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D10S1248 LOCUS -Cebador directo diseñado para amplificar el locus D10S1248

-

“REWARD PRIMER DESIGNED TO AMPLIFY D10S1248 LOCUS -Cebador inverso diseñado para amplificar el locus D10S1248

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para obtener el perfil genético de un individuo que comprende el análisis, en un extracto de ADN procedente de dicho individuo mediante una reacción de amplificación multiplex, de los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1, en donde la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los loci analizados es la pareja de oligonucleótidos mostrada en las secuencias

   -SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el locus CSF1PO, -SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para el locus D5S818, -SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el locus D7S820, -SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para el locus D21S11, -SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para el locus D2S441, -SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para el locus D1S1656, -SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para el locus TPOX, -SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para el locus VWA, -SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para el locus D8S1179, -SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para el locus D19S433, -SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para el locus D12S391, -SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para el locus TH01, -SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para el locus D16S539, -SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para el locus D3S1358, -SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para el locus D18S51, -SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para el locus D2S1338, -SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para el locus D13S317, -SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para el locus Amelogenina, -SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para el locus FGA, -SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para el locus D22S1045, y -SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para el locus D10S1248.

3. 3.

   Método según la reivindicación 2, en donde la temperatura de fusión de la reacción de amplificación multiplex que comprende los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 42 está comprendida entre 57 y 63ºC.

4. 4.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde uno de los oligonucléotidos de cada pareja de cebadores está marcado en uno de sus extremos.

5. 5.

   Método según la reivindicación 4, en donde los compuestos empleados en el marcaje de los oligonucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

6. 6.

   Método según la reivindicación 5, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4’, 5’-dicloro-2’, 7’-dimetoxifluoresceína (JOE), NED, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5, fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).

7. 7.

   Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el extracto de ADN procede de una muestra de sangre, pelo, saliva, epidermis, esperma, cenizas, tejidos o fluidos vaginales.

8. 8.

   Uso de un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para identificar un individuo, determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

9. 9.

   Un kit que comprende parejas de cebadores específicas para amplificar los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.

10. 10.

    Kit según la reivindicación 9, en donde la pareja de cebadores empleada en la reacción de amplificación multiplex específica para cada uno de los loci analizados es la pareja de oligonucleótidos mostrada en las secuencias

    -SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 para el locus CSF1PO, -SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para el locus D5S818, -SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para el locus D7S820, -SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 para el locus D21S11, -SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10 para el locus D2S441, -SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 12 para el locus D1S1656, -SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 14 para el locus TPOX, -SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16 para el locus VWA, -SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 para el locus D8S1179, -SEQ ID NO: 19 y SEQ ID NO: 20 para el locus D19S433, -SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22 para el locus D12S391, -SEQ ID NO: 23 y SEQ ID NO: 24 para el locus TH01, -SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26 para el locus D16S539, -SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 para el locus D3S1358, -SEQ ID NO: 29 y SEQ ID NO: 30 para el locus D18S51, -SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32 para el locus D2S1338, -SEQ ID NO: 33 y SEQ ID NO: 34 para el locus D13S317, -SEQ ID NO: 35 y SEQ ID NO: 36 para el locus Amelogenina, -SEQ ID NO: 37 y SEQ ID NO: 38 para el locus FGA, -SEQ ID NO: 39 y SEQ ID NO: 40 para el locus D22S1045, y -SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 42 para el locus D10S1248.

11. 11.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 o 10, en el que la pareja de cebadores comprende un oligonucleótido marcado en uno de sus extremos.

12. 12.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que además, comprende, los reactivos necesarios para marcar las parejas de cebadores.

13. 13.

    Kit según la reivindicación 12, en donde los reactivos empleados para marcar las parejas de cebadores se seleccionan del grupo que consiste en un radioisótopo, un material fluorescente, digoxigenina y biotina.

    5 14. Kit según la reivindicación 13, en donde el material fluorescente se selecciona del grupo que consiste en 5-carboxifluoresceína (5-FAM), 6-FAM, análogo tetraclorinado de t-FAM (TET), análogo hexaclorinado de 6-FAM (HEX), 6carboxitetrametilrodamina (TAMRA), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4’, 5’-dicloro-2’, 7’-dimetoxifluoresceína (JOE), NED, Cy-3, Cy-5, Cy-5.5,

    10 fluorescein-6-isotiocinato (FITC) y tetrametilrodamina-5-isotiocinato (TRITC).
14. 15. Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 para obtener el perfil genético de un individuo, para identificar un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos, para identificar restos humanos.
15. 16. Un conjunto de parejas de cebadores que comprende parejas de cebadores dirigidas a amplificar los loci CSF1PO, D5S818, D7S820, D21S11, D2S441, D1S1656, TPOX, VWA, D8S1179, D19S433, D12S391, TH01, D16S539, D3S1358, D18S51, D2S1338, D13S317, Amelogenina, FGA, D22S1045 y D10S1248.
16. 17. Uso de un conjunto de parejas de cebadores según la reivindicación 16 para obtener el perfil genético de un individuo, para identificar un individuo, para determinar relaciones de parentesco entre individuos o para identificar restos humanos.

    Figura 2

    FLUDRESC:ENT []VE

    50 100 1$0 200 250 300 350 390

    0151856 6_FAr\llTFl

    CSF1PO 05S818 075820 021511

    D135317 D2251045 11 D10S1248 PET'

    ~I

    FGA

    SEQUENCE LISTING

    <110>

    UNIVERSIDAD DEL PAÍS VASCO

    <120>

    METHOD FOR OBTAINING THE GENE PROFILE OF AN INDIVIDUAL

    <130>

    P7636ESOO

    <160>

    42

    <170>

    PatentIn version 3.5

    <21 O> <211> <212> <213>

    1 22 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify CSF1PO locus

    <400> 1 actgccttca tagatagaag

    at 22

    <210> <211> <212> <213>

    2 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify CSF1PO locus

    <400> 2 gccctgttct aagtacttcc

    t 21

    <210> <211> <212> <213>

    3 23 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D5S818 locus

    <400> 3 ttaatagcaa gtatgtgaca agg

    23

    <21 O> <211> <212> <213>

    4 27 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D5S818 locus

    <400> 4 gacatttgta tctttatctg tatcctt

    27

    <210> 5

    <211> 26

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> Forward primer designed to amp1ify D7S820 locus

    <400> 5 gaattataac gattccacat ttatcc 26

    <210> 6

    <211> 24

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> Reward primer designed to amp1ify D7S820 locus

    <400> 6 ataaagggta tgatagaaca cttg 24

    <21 O> 7

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> Forward primer designed to amp1ify D21S11 locus

    <400> 7 ccctgattct tcagcttgta 20

    <21 O> 8

    <211> 22

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> Reward primer designed to amp1ify D21S11 locus

    <400> 8 gcagagacag actaatagga gg 22

    <21 O> 9

    <211> 23

    <212> DNA

    <213> Artificial Sequence

    <220>

    <223> Forward primer designed to amp1ify D2S441 locus

    <400> 9 ctctgaagag attcttaaga ccc 23

    <210> <211> <212> <213>

    10 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify D2S44l locus

    <400> 10 gttcactctc cttcccaaat g

    21

    <210> <211> <212> <213>

    11 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify DlS1656 locus

    <400> 11 atccccatat

    aagttcaagc c 21

    <210> <211> <212> <213>

    12 25 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify DlS1656 locus

    <400> 12 gctttcaggc atttcagaga ttatg

    25

    <210> <211> <212> <213>

    13 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify TPOX locus

    <400> 13 cttagggaac cctcactg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    14 19 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify TPOX locus

    <400> 14

    gcagcgttta tttgcccaa

    <210> <211> <212> <213>

    15 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify VWA locus

    <400> 15 tcagtatgtg acttggattg

    a 21

    <210> <211> <212> <213>

    16 25 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify VWA locus

    <400> 16 gtaggttaga tagagatagg acaga

    25

    <210> <211> <212> <213>

    17 23 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D8S1179 locus

    <400> 17 ttgtatttca tgtgtacatt cgt

    23

    <210> <211> <212> <213>

    18 25 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D8S1179 locus

    <400> 18 gttgtgttca tgagtatagt

    ttcac 25

    <210> <211> <212> <213>

    19 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D19S433 locus

    <400> 19 catgttggca cattcctg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    20 22 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D19S433 locus

    <400> 20 agttctttag cagtgatttc tg

    22

    <210> <211> <212> <213>

    21 26 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D12S391 locus

    <400> 21 caaattgtga tagtagtttc ttctgg

    26

    <210> <211> <212> <213>

    22 19 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D12S391 locus

    <400> 22 gttagacctg gactgagcc

    19

    <210> <211> <212> <213>

    23 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify TH01 locus

    <400> 23 aacacagact ccatggtg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    24 19 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify TH01 locus

    <400> 24 gttcctccct

    tatttccct 19

    <210> <211> <212> <213>

    25 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D16S539 locus

    <400> 25 cctcttccct

    agatcaatac a 21

    <210> <211> <212> <213>

    26 24 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D16S539 locus

    <400> 26 atctgtaagc atgtatctat

    catc 24

    <210> <211> <212> <213>

    27 20 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amp1ify D3S1358 locus

    <400> 27 tgtagtgagc tatgattccc

    20

    <210> <211> <212> <213>

    28 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amp1ify D3S1358 locus

    <400> 28 gtattccctg tgcctttg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    29 18 DNA Artificial Sequence

    <220>

    <223>

    Forward primer designed to amplify D18S51 locus

    <400> 29 gtctcagcta cttgcagg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    30 24 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify D18S51 locus

    <400> 30 ggagatgtct

    tacaataaca gttg 24

    <210> <211> <212> <213>

    31 19 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify D2S1338 locus

    <400> 31 ggaggtgcct aaagacttc

    19

    <210> <211> <212> <213>

    32 19 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify D2S1338 locus

    <400> 32 gcctaccaga atgccagtc

    19

    <210> <211> <212> <213>

    33 25 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify D13S317 locus

    <400> 33 cgcctatctg

    tatttacaaa tacat 25

    <210> <211> <212> <213>

    34 27 DNA Artificial Sequence

    <220>

    <223> Reward primer designed to amplify D13S317 locus

    <400>

    34 ggacagaaag atagatagat gattgat

    <210> <211> <212> <213>

    35 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify Amelogenina locus

    <400> 35 ccctgggctc tgtaaaga

    18

    <210> <211> <212> <213>

    36 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify Amelogenina locus

    <400> 36 gggcttgagg

    ccaaccat 18

    <210> <211> <212> <213>

    37 22 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify FGA locus

    <400> 37 ctcacagatt aaactgtaac

    ca 22

    <210> <211> <212> <213>

    38 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify FGA locus

    <400> 38 ttgtctgtaa ttgccagc

    18

    <210> <211> <212> <213>

    39 20 DNA Artificial Sequence

    <220>

    <223> Forward primer designed to amplify D22S1045 locus

    <400>

    39 tctgcataag acccactatg

    <210> <211> <212> <213>

    40 18 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify D22S1045 locus

    <400> 40 atagtgacag tgcctgtg

    18

    <210> <211> <212> <213>

    41 24 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Forward primer designed to amplify D10S1248 locus

    <400> 41 agctattatt accaaagcat gaac

    24

    <210> <211> <212> <213>

    42 21 DNA Artificial Sequence

    <220> <223>

    Reward primer designed to amplify D10S1248 locus

    <400> 42 gttccagtcc aactagatcc

    t 21