ES2408509B1 - Extractos enzim�ticos de hongos de la vid que degradan aminas bi�genas en vinos. - Google Patents

Abstract

En la presente invención se proponen nuevas fuentes de materias primas para el aislamiento de los hongos con actividad enzim�tica amino oxidasa. En concreto los hongos que se describen en la presente invención proceden de viñedos y otros nichos ecológicos naturales e íntimamente relacionados con el que se persigue en la aplicación, y no explotados usualmente para tales fines. Se trata por tanto de nuevas materias primas de bajo coste y procesos de producción sencillos y rentables. La presente invención también tiene como objetivo obtener extractos enzim�ticos procedentes de hongos previamente aislados y que contienen enzimas con capacidad de degradar aminas bi�genas (i.e. histamina, tiramina y putrescina) sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio. Por tanto, los extractos enzim�ticos de origen f�ngico descritos en esta invención se podrían aplicar tras el proceso de elaboración de productos fermentados que de forma natural presentan elevadas concentraciones de aminas bi�genas, con la intención de reducir la concentración de las mismas antes de salir al mercado.

Description

Extractos enzim�ticos de hongos de la vid que degradan aminas bi�genas en vinos.

La presente invención concierne a extractos enzim�ticos de origen f�ngico que eliminan aminas bi�genas (histamina, tiramina y putrescina) para su aplicación en la industria de la alimentación, en la agricultura y en la biotecnolog�a.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Las aminas bi�genas son compuestos nitrogenados de bajo peso molecular que est�n presentes de forma natural en alimentos y bebidas fermentadas, especialmente queso, algunos productos cárnicos, cerveza y vino, entre otros. De forma general se admite que, la presencia de aminas bi�genas en estos alimentos, est� relacionada con los procesos de fermentación, y fundamentalmente se debe a la acción de bacterias l�cticas con actividad amino�cido descarboxilasa. El contenido total de aminas bi�genas en el vino varía desde trazas a valores de hasta 130 mg/L (Soufleros et al., 1998). Las aminas bi�genas mayoritarias en vinos son la histamina, tiramina y putrescina (Bauza et al, 1995; Silla Santos, 1996; Marcobal et al, 2006), que se producen principalmente a partir de la descarboxilaci�n microbiana de los correspondientes amino�cidos precursores, histidina, tirosina y ornitina, respectivamente.

El consumo de alimentos y bebidas con cantidades elevadas de aminas bi�genas, como histamina y tiramina, se considera un riesgo potencial por sus efectos tóxicos para la salud, que pueden ser más graves en los consumidores sensibles, ya que éstos presentan una reducción de las enzimas mono (MAO) y diamino (DAO) oxidasas que, de forma natural, se encuentran en el intestino humano y constituyen la principal vía de detoxificaci�n de las aminas bi�genas que ingerimos en la dieta (Anc�n-Azpilicueta et al., 2008; Moreno-Arribas et al., 2009). El etanol y la presencia de otras aminas en el alimento (como putrescina) pueden potenciar los efectos adversos de las aminas en el organismo humano. Por otro lado, la presencia de histamina supone una amenaza potencial para el sector enol�gico en las transacciones comerciales a determinados países, que imponen límites máximos de la concentración de histamina que admiten en los vinos.

Por todo lo expuesto, existe un gran interés en controlar la producción de aminas bi�genas en los vinos y otros productos alimentarios. Sin embargo, en la actualidad, los únicos procedimientos disponibles para evitar la presencia en vinos de elevadas concentraciones de aminas, se basan en estrategias de prevención que ponen el énfasis en controlar los principales factores que intervienen en la génesis de estos compuestos durante la vinificación (es decir, cepas de bacterias l�cticas con actividad descarboxilasa, concentración de amino�cidos precursores, pH del vino y otros factores con incidencia directa en los anteriores), con el objetivo final de evitar su formación. Sin embargo, en la práctica estos procedimientos suponen inconvenientes en bodega, y en algunos casos el llevarlos a cabo puede comprometer la composición química y calidad organol�ptica del producto final, por lo que los elaboradores no siempre est�n dispuestos a asumirlos. Por tanto, en la práctica el problema de la formación de aminas bi�genas en los vinos no est� resuelto. De ahí, el interés en desarrollar nuevos procedimientos eficaces para eliminar las aminas bi�genas de los alimentos ya fermentados, incluido el vino.

En la actualidad, en el mercado no existen productos de origen f�ngico a utilizar en el control de aminas bi�genas en el vino. EP0132674A2 describe un procedimiento para reducir la presencia de aminas bi�genas en productos alimentarios basado en la puesta en contacto del alimento en cuestión con enzimas amino oxidasas de origen f�ngico (Aspergillus niger) en presencia de oxígeno molecular.

El procedimiento desarrollado en EP0132674A2 fue aplicado con éxito para reducir la concentración de aminas bi�genas de extractos de levaduras autolisadas. Sin embargo su aplicación a la producción de alimentos, específicamente durante la elaboración y maduración del queso, y en bebidas fermentadas como vino y cerveza, est� restringida por la presencia de oxígeno en el medio, es decir, que para el caso concreto de los vinos, el procedimiento descrito en EP0132674A2 únicamente podría ser útil en las fases previas a los procesos de fermentación, momento en el cual todavía no es relevante la presencia o no de aminas bi�genas. De hecho, el vino como producto no figura entre los ejemplos que se incluyen en EP0132674A2. La alta capacidad de secreción enzim�tica y de productos de alto valor añadido de hongos filamentosos ha sido ampliamente explotada comercialmente. Un ejemplo claro son una gran parte de los antibióticos disponibles en el comercio. La eliminación enzim�tica de aminas bi�genas puede ser una forma segura y económica para eliminar estos compuestos problem�ticos en los vinos y otros alimentos fermentados.

Se han descrito varios tipos de hongos filamentosos que producen actividades enzim�ticas amino oxidasa utilizando las aminas como única fuente de carbono para su crecimiento (Yamada et al, 1965; Yamada et al, 1966; Adachi et al, 1970; Yamada et al, 1972; Isobe et al, 1982). El procedimiento de obtención de las enzimas amino oxidasas a partir de hongos filamentosos se ha descrito previamente (Yamada et al, 1965). En hongos filamentosos, se han purificado y caracterizado dos tipos de enzimas amino oxidasas (Fr�bort et al, 1996; Fr�bort et al, 1997). Además, el genoma de Aspergillus niger contiene seis genes que codifican para enzimas amino oxidasas. La expresión heter�loga de uno de esos genes en la levadura Saccharomyces cerevisiae se ha abordado recientemente

(Kolař�kov� et al., 2009)

Las enzimas amino oxidasas presentes en distintos microorganismos como hongos y algunas bacterias l�cticas, permiten, mediante una reacción oxidativa, degradar aminas bi�genas para generar un aldeh�do, peróxido de hidrógeno y amonio. Esta reacción enzim�tica se favorece en presencia de oxígeno y humedad. Dependiendo del sustrato de partida, es decir de la amina bi�gena, se clasifican en diamino oxidasas (si se trata de histamina y putrescina) y monoamino oxidas (si el sustrato de partida es la tiramina).

Hasta el momento, no existe información sobre la distribución de estas enzimas en especies de hongos procedentes de la vid, ni tampoco sobre el potencial de los hongos de la vid para degradar las aminas bi�genas en vinos y otros alimentos.

En los hongos, la mayoría de las enzimas amino oxidasas han sido estudiados en los extractos crudos cuando son inducidas por diferentes aminas, principalmente n-butilamina, espermina, metilamina y agmatina (Isobe et al., 1982; Fr�bort et al., 1997a).

Por tanto, actualmente existe la necesidad de identificar nuevas fuentes de materias primas para el aislamiento de los hongos con esta capacidad enzim�tica amino oxidasa, con el objetivo de desarrollar un procedimiento de obtención de extractos enzim�ticos de origen f�ngico que aplicados a productos fermentados sean capaces de reducir la concentración de las aminas bi�genas sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, mostrando su utilidad como agentes detoxificantes al final del proceso de elaboración de dichos productos y antes de salir al mercado.

DESCRIPCI�N BREVE DE LA INVENCIÓN

En la presente invención se proponen nuevas fuentes de materias primas para el aislamiento de los hongos con actividad enzim�tica amino oxidasa. En concreto los hongos que se describen en la presente invención proceden de viñedos y otros nichos ecológicos naturales e íntimamente relacionados con el que se persigue en la aplicación, y no explotados usualmente para tales fines. Se trata por tanto de nuevas materias primas de bajo coste y procesos de producción sencillos y rentables.

La presente invención también tiene como objetivo obtener extractos enzim�ticos procedentes de hongos previamente aislados y que contienen enzimas con capacidad de degradar aminas bi�genas (es decir, la histamina, la tiramina y la putrescina) sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio. Por tanto, los extractos enzim�ticos de origen f�ngico descritos en esta invención se podrían aplicar tras el proceso de elaboración de productos fermentados que de forma natural presentan elevadas concentraciones de aminas bi�genas, con la intención de reducir la concentración de las mismas antes de salir al mercado.

Otros objetos de la presente invención son el uso del citado extracto f�ngico como agente detoxificante de aminas bi�genas en la industria alimentaria, as� como para el control de la concentración aminas bi�genas en el vino.

Cepa Penicillium sp. CIAL-274,760 (CECT 20782)

La siguientes cepa ha sido depositada el 14 de septiembre de 2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) en el Edificio 3 CUE del parque científico de la Universidad de Valencia, Catedrático Agustín Escardino n�9,46980 Paterna, Valencia (España), por M. Victoria Moreno-Arribas, INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN (CIAL), (CSIC-UAM) Calle Nicolás Cabrera n� 9, Campus de Cantoblanco, 28049, Madrid (España).

El depósito de la cepa depositada cuya referencia es Penicillium sp. CIAL-274,760, fue recibido por la CECT con el número de acceso CECT 20782 una vez dicha Autoridad Internacional para el Depósito declar� que dicha cepa en cuestión era viable.

DESCRIPCI�N DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención hace referencia a un método o proceso para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado, que comprende poner en contacto dicho producto fermentado con un extracto enzim�tico de origen f�ngico sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio.

En una realización particular, el producto fermentado es un alimento o bebida en cuya fermentación intervienen bacterias l�cticas con actividad amino�cido descarboxilasa, las cuales son responsables de la presencia natural de aminas bi�genas en estos productos. De manera representativa y no limitante, dichos productos fermentados se pueden seleccionar de entre el siguiente grupo: queso, algunos productos cárnicos y encurtidos, cerveza, mosto, sidra y vino. En una realización preferente, el producto fermentado es el vino.

En una realización particular, el extracto enzim�tico de origen f�ngico tal y como se entiende en la presente invención, contiene enzimas amino oxidasas con capacidad de degradar al menos una amina bi�gena.

En la presente invención el término: “amina bi�gena” se refiere a un compuesto nitrogenado de bajo peso molecular que est� presente de forma natural en algunos productos fermentados. De manera representativa y no limitante, dichas aminas bi�genas se pueden seleccionar de entre el siguiente grupo: histamina, tiramina y putrescina y una combinación de las mismas.

En otra realización particular de la presente invención, el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado de un nicho ecológico natural e íntimamente relacionado con el que se persigue en la aplicación, y no explotados usualmente para tal fin. Preferentemente, el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado de un ecosistema vínico.

En la presente invención el término “ecosistema vínico” o “ecosistema de la vid”, se refiere al entorno de los viñedos, de donde se aíslan hongos procedentes de plantas de vid y del suelo.

En una realización más particular, el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado perteneciente a un género de hongo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternaria spp., Epicoccum nigrum, Penicillium spp., Phoma spp., y Ulocladium chartarum. Preferentemente, el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado perteneciente al género Penicillium spp. Aún más preferentemente, el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de la cepa Penicillium sp. CIAL-274,760, depositada el 14 de septiembre de 2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y cuya referencia es CECT 20782.

En otra realización particular de la presente invención, el método o proceso para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado anteriormente descrito, se caracteriza porque el porcentaje de reducción de la concentración de al menos una amina bi�gena puede ser superior al 60%.

En otra realización particular de la presente invención, el método o proceso para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado anteriormente descrito, se caracteriza porque incluye estabilizantes o conservantes conocidos por un experto en la materia para mejorar la eficiencia de la reacción.

La presente invención también hace referencia a un método para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado, caracterizado por poner en contacto dicho producto fermentado con un extracto enzim�tico de origen f�ngico, sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, tal y como se ha definido anteriormente, donde la capacidad del extracto enzim�tico de eliminar las aminas bi�genas presentes en los productos fermentados determinan su uso como agentes detoxificantes en la industria alimentaria.

La presente invención también hace referencia a un método para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado, caracterizado por poner en contacto dicho producto fermentado con un extracto enzim�tico de origen f�ngico, sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, tal y como se ha definido anteriormente, donde la capacidad del extracto enzim�tico de eliminar las aminas bi�genas presentes en los productos fermentados determinan su uso para mejorar la calidad organol�ptica del vino ya fermentado.

Otro objeto de la presente invención, es el procedimiento o método de obtención de un extracto enzim�tico de origen f�ngico para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, caracterizado porque dicho método comprende las siguientes etapas:

i. aislar al menos un hongo, preferentemente de un ecosistema vínico,

ii. incubar el hongo aislado en i) en un medio de cultivo que contiene al menos una amina bi�gena como principal fuente de nitrógeno,

iii. inducir la actividad enzim�tica del hongo implicada en la degradación de la amina bi�gena citada en ii),

iv.

separar el micelio del hongo, preferentemente mediante filtración, y

v.

extraer del micelio el citado extracto enzim�tico.

En una realización más particular, el procedimiento o método de obtención definido anteriormente se caracteriza porque el paso i) es aislar al menos un hongo perteneciente a un género de hongo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternaria spp., Epicoccum nigrum, Penicillium spp., Phoma spp., y Ulocladium chartarum. Más preferentemente, el hongo pertenece al género Penicillium spp. Aún más preferentemente, el paso i) es aislar al menos la cepa Penicillium sp. CIAL-274,760, depositada el 14 de septiembre de 2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y cuya referencia es CECT 20782.

En otra realización particular de la presente invención se hace referencia al método para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado definido anteriormente, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico es obtenido mediante el método de obtención definido anteriormente por las etapas i-v.

En otra realización particular de la presente invención se hace referencia a un extracto enzim�tico de origen f�ngico para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, caracterizado porque se obtiene mediante el método de obtención definido anteriormente por las etapas i-v.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCI�N DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. Análisis ‘neighbour-joining’ de los hongos aislados de ecosistemas de la vid procedentes de cuatro regiones geográficas (Villamanrique del Tajo, Escuela de la Vid, Tortuero y Membrilla) de España. Las cepas de referencia seleccionadas se alinearon con los hongos aislados de viñedos. Los valores estadísticos se indican en las ramas. Las distancias horizontales son proporcionales a las distancias de las secuencias.

FIGURA 2. Degradación de histamina, tiramina y putrescina en un vino tinto (2 a), blanco (2 b) y sintético (2 c) tras 18 h de incubaci�n con los extractos enzim�ticos f�ngicos A, B y C. Las determinaciones se hicieron mediante RP-HPLC.

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EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1. Aislamiento e identificación molecular de hongos de la vid con capacidad de degradar aminas bi�genas

1.1. Obtención de las materias primas y aislamiento de los hongos

Uno de los objetivos de esta invención fue aislar una colección amplia de hongos representativos de los hongos del ecosistema de la vid. En total, se aislaron 224 cepas de hongos procedentes de plantas de vid y 66 de muestras procedentes del suelo (Tabla 1).

Tabla 1. Distribución de los hongos aislados de cuatro ecosistemas de viñedos españoles

Localizaci�n

Número Número de aislados Hongos aislados por Número de géneros Hongos sin identificar

Plantas

Suelos Plantas Suelos Plantas Suelo Plantas Suelos Plantas Suelos

Villamanrique del Tajo (Madrid)

4 - 30 - 7,5 - 12 - 3 -

Escuela de la Vid (Madrid)

5 - 97 - 19,4 - 17 - 17 -

Membrilla (Ciudad Real)

9 2 70 31 7,77 15,5 11 13 14 6

Tortuero (Guadalajara)

6 1 27 35 4,5 35 4 12 11 13

Total

24 3 224 66 - - 44 25 45 19

El muestreo de plantas de viñedos se llev� a cabo durante la primavera del 2008 en cuatro zonas de España, dos en la provincia de Madrid (Villamanrique del Tajo y Escuela de la Vid), uno en la provincia de Guadalajara (Tortuero) y por último, uno en la provincia de Ciudad Real (Membrilla). Para aislar los hongos de la parte aérea de la vid, se cortaron, con la ayuda de un bistur�, pequeñas virutas de la corteza, xilema y yemas de las plantas recogidas. Las virutas se desinfectaron mediante lavados consecutivos, durante 30 s en etanol 70%, hipoclorito sádico (5%), etanol 70% y agua estéril en el caso de la corteza, mientras que para las yemas se utilizó etanol 70% y agua estéril. Las virutas de xilema no requieren desinfecci�n al tratarse de una muestra limpia. Tras el lavado, las virutas se transfirieron con unas pinzas a placas de 48 pocillos que contenían medio YMC (10 g de extracto de malta, 2 g extracto de levadura, 20 g de agar bacteriol�gico, 4 mg de ciclosporina A, 50 mg de sulfato de estreptomicina, 50 mg de terramicina, y 1 litro de agua destilada. Se prepararon 6 placas por cada muestra. Las placas se incubaron a 22�C y 70% de humedad relativa durante 2 semanas.

Para aislar los hongos del suelo, las muestras se tamizaron, lavaron y filtraron utilizando un sistema de filtración de partículas acoplado a una bomba de vacío, descrito anteriormente por Bills y col. (2004). Las partículas que quedaron retenidas en el filtro con menor tamaño de poro se transfirieron a un tubo falcon donde se lavaron 7-8 veces con agua destilada. Tras el lavado las partículas de suelo se transfirieron a una placa Petri que contenía carboximetilcelulosa sádica (CMC) al 0.05%, y que se emple� para hacer 3 diluciones de las partículas de suelo lavadas. Después, alícuotas de 10 él de cada dilución se pipetearon en placas de 48 pocillos con medio YMC. Se prepararon 9 placas por cada muestra (3 placas/dilución). Las placas se incubaron a 22�C y 70% de humedad relativa durante 2 semanas.

1.2. Obtención de los cultivos puros de hongos

Para la obtención de cultivos puros, los hongos que crecieron en las placas de YMC se reaislaron, con la ayuda de una lupa Leica MZ APO, en placas de Agar Extracto de Levadura Malta (10 g de extracto de malta, 2 g de extracto

ES 2 408 509 Bl

de levadura, 20 g de agar bacteriol�gico y 1 litro de agua destilada), que se incubaron a 22�C y 70% de humedad relativa durante 2 semanas.

Una vez obtenidos los cultivos puros de hongos, se procedió a la preparación de in�culos. Para ello, a partir de las

5 placas con cultivos puros, con un transfer estéril se cortaron de 3 a 4 discos de micelio, los cuales se introdujeron en tubos con 8 ml de medio SMYA (10 g de neopeptona, 40 g de maltosa, 10 g de extracto de levadura, 4 g de agar bacteriol�gico y 1 litro de agua destilada) y 2 cubreobjetos. Los tubos se incubaron con una inclinación de 75� en cabinas K�hner a 22�C durante 4 días, en agitaci�n (200 rpm). Los in�culos obtenidos se utilizaron para la caracterización molecular de los hongos, experimentos de degradación

10 de aminas bi�genas y ensayos de actividad antimicrobiana.

1.3. Identificación molecular de hongos

Para la extracción del ADN gen�mico se utilizó un kit de purificación de ADN para bacterias Gram positivas (Master

15 Pure TM Gram Positive DNA Purification Kit Epicentre Biotechnologies), siguiendo el protocolo indicado por el fabricante con algunas modificaciones: (a) se disminuyó el volumen añadido de isopropanol a 300 él, (b) se lav� el pellet de ADN con 200 él de etanol 70% seguido de un proceso de desecaci�n a 45�C durante 15 minutos (Speed Vac ADN 120), y (c) se resuspendi� el ADN en 100 él de agua milli-Q.

20 El ADN extraído se utilizó para amplificar la región espaciadora interg�nica ribosomal ITS (fragmento ITS1-5.8S-ITS2), empleando los cebadores universales ITS1 e ITS4 (White et al., 1990). Los productos de PCR se purificaron usando el protocolo de purificación Ilustra GFX 96 PCR y se secuenciaron en el secuenciador automático ABI Prism Dye terminator cycle sequencing kit. Las secuencias se alinearon usando la aplicación Clustal W (Thompson y col., 1994). De manera paralela, las secuencias obtenidas fueron comparadas con secuencias depositadas en el banco

25 de datos GenBank usando la aplicación BLAST.

Se gener� un árbol filogen�tico por método del “neighbourd joining”(NJ) a partir de la matriz de distancias genéticas

(Figura 1), al que se incorpor� la secuencia de cepas de hongos de referencia. El árbol se dividió en dos ramas principales (Figura 1, las ramas A y B). Sobre la primera, con un fuerte agrupamiento (98%) se sitúan secuencias de

30 referencia pertenecientes a los órdenes Xylariales y Sordariales (Clase Sordariomycetes) (Tabla 2).

La otra rama principal (Figura 1, b) que incluye a la mayoría de los aislados (81% del muestreo), se dividió en dos sub-ramas (Figura 1, c ramas y d) con un apoyo razonable. La rama c incluye los aislamientos de hongos pertenecientes a los órdenes Hypocreales, Microascales, Clalosphaeriales y Phyllachoreales (Clase

35 Sordariomycetes) (Tabla 2); mientras que la rama d parece corresponder con los órdenes Capnodiales, Botryosphaeriales, Dothideales y Pleosporales (Clase Dothideomycetes), Eurotiales Onygenales (Clase Eurotiomycetes), Xylariales (Clase Sordariomycetes), y, por último, Agaricales (Clase Agaromycetes) (Tabla 2).

Tabla 2. Distribución de los hongos aislados en función de su grupo taxonómico 40

Filo Clase Orden Familia Especies

Ascomycota Dothideomycetes Botryosphaeriales Botryosphaeriaceae Botryosphaeria spp, Dothiorella spp, Microdiplodia spp Capnodiales Davidiellaceae Cladosporium spp, Davidiella spp Sin asignar Rachicladosporium spp Dothideales Dothideaceae Coniozyma spp Dothioraceae Aureobasidium spp Pleosporales Didymellaceae Didymella spp Leptosphaeriaceae Epicoccum spp, Leptosphaeria spp Massarinaceae Saccharicola spp Montagnulaceae Paraconiothyrium spp Phaeosphaeriaceae Phaeosphaeria spp, Stagonospora spp

Pleosporaceae Alternaria spp, Ulocladium spp, Embellisia spp, Pleospora spp, Lewia spp, Pyrenochaeta spp, Didymella spp, Dendryphion spp

Sporormiaceae Sporormia spp Sin asignar Phoma spp, Camarosporium spp, Coniothyrum spp

Eurotiomycetes Chaetothyriales Herpotrichiellaceae Exophiala spp Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus spp, Penicillium spp Onygenales Sin asignar Geomyces spp

Sordariomycetes

Calosphaeriales Calosphaeriaceae Phaeoacremonium spp, Togninia spp

Hypocreales

Clavicipitaceae Paecilomyces spp, Metarrhizium spp

Hypocreaceae

Acremonium spp, Hypocrea spp,

Trichoderma spp

Hypocreomycetidae

Myrothecium spp

Nectriaceae

Fusarium spp, Nectria spp, Gibberella

spp

Sin asignar

Acremonium spp, Acrostalagmus

spp,Stachybotrys spp

Microascales

Microascaceae Wardomycopsis spp, Scedosporium spp

Sin asignar

Microdochium spp

Phyllachorales

Sin asignar Verticillium spp

Sordariales

Chaetomiaceae Chaetomium spp, Thielavia spp

Xylariales

Amphisphaeriaceae Discostroma spp, Pestalotiopsis spp, Truncatella spp

Sin asignar

Sin asignar

Sin asignar

Tetracladium spp, Scolecobasidium spp,

Helminthosporium spp

Basidiomycota

Coelomycetes Especies de Coelomycete

Agaricomycetes

Agaricales Psathyrellaceae Coprinellus spp

Hongos sin identificar

Los análisis filogen�ticos se confirmaron empleando el modelo de sustitución nucleot�dica de máxima parsimonia, implementado en el programa PAUP, a partir del alineamiento múltiple, y realizando una búsqueda heurística con

5 1000 réplicas mediante el algoritmo TBR (tree bisection recollection). El soporte de los nodos se evalu� mediante “bootstrap” como una medida de confianza estadística. Una agrupación del 95% de las réplicas fue considerada estadísticamente significativa.

Las comparaciones de las secuencias de nucleótidos de los hongos aislados con las secuencias disponibles en

10 GenBank permitieron identificar la mayoría de los hongos aislados, al menos a nivel de género. La mayoría de los hongos aislados pertenecieron a los géneros Phoma spp, Alternaria spp y Fusarium spp. Estos géneros representaron el 22,8% de todos los aislamientos.

1.4. Screening de hongos capaces de degradar aminas bi�genas y obtención de extractos f�ngicos

15 Para profundizar en el estudio de las actividades enzim�ticas de interés, implicadas en la eliminación de aminas bi�genas, en la presente invención, se seleccionaron 44 cepas representativas de los principales géneros de hongos de los ecosistemas de la vid, previamente aislados de la planta y suelo de la vid. Las cepas de hongos fueron estudiadas para comprobar su capacidad de degradar aminas bi�genas después de haber sido inducida la actividad

20 enzim�tica amino oxidasa por las aminas bi�genas que se detectan más frecuentemente en los vinos (histamina, tiramina y putrescina). Para ello, los hongos seleccionados se inocularon en un medio de cultivo que contenía estas aminas como única fuente de nitrógeno (Tabla 3). Se utilizó un medio de cultivo básico, el Yeast Carbon Base (YCB, Sigma), al que se a�adi� 0,05 g/L de histamina, tiramina o putrescina como única fuente de nitrógeno. El medio de cultivo se esterilizó por filtración (Millipore ExpressTM Plus, 0.22 n) y después se distribuyó, con la ayuda de un

25 Termo Multidrop Combi (Termo Scientific), en placas de 24 pocillos a razón de 4 ml/pocillo. A continuación se transfirió aproximadamente 0,5 cm de de cada in�culo de hongo a su pocillo correspondiente, a excepción de los pocillos utilizados como control. Las placas se incubaron en agitaci�n a 22�C en cabinas K�nhner durante 10 días. Los ensayos se hicieron por duplicado. Transcurrido el tiempo de incubaci�n, se separ� el micelio del hongo del medio de cultivo mediante filtración (Syringe Filters with Luer tip; Agilent Technologies). Para comprobar si los

30 hongos habían degradado las aminas se tom� 1 ml del medio filtrado y se analizó mediante RP-HPLC.

Tabla 3. Screening de los hongos aislados de ecosistemas de la vid con capacidad de de degradar aminas bi�genas

N�mero de Identificación Degradación de Degradación de Degradación de aislado histamina (%) tiramina (%) putrescina (%)

F-274,861 Acremonium spp 42,05 96,9 98,94 F-274,707 Alternaria spp 99,66 100 100 F-274,722 Alternaria spp 99,83 100 100 F-274,736 Alternaria spp 99,88 100 100 F-274,737 Alternaria spp 99,89 100 100 F-274,767 Alternaria spp 100 100 100 F-274,720 Ascochyta spp 99,67 100 100 F-274,787 Cladosporium spp 80,6 100 99,61 F-274,684 Coelomycete 99,42 100 100 F-274,776 Coelomycete 75,94 100 100 F-274,726 Dendryphion penicillatum 0 99,91 22,8 F-274,659 Discostroma spp 88,86 99,98 100 F-274,735 Discostroma spp 73,12 100 100 F-274,673 Embellisia spp 99,52 100 100 F-274,906 Embellisia spp 100 20,08 99,68 F-274,672 Epicoccum nigrum 99,69 100 100 F-274,667 Fusarium spp 2,07 100 100 F-274,763 Fusarium spp 19,62 100 100 F-274,683 Leptosphaeria spp 35,5 100 100 F-274,696 Leptosphaeria spp 99,55 100 100 F-274,897 Metarhizium anisopliae 0 100 100 F-274,760 Penicillium spp 100 99,91 99,69 F-274,895 Pestalotiopsis spp 100 100 99,84 F-274,692 Phoma spp 99,64 99,91 99,95 F-274,733 Phoma spp 52,14 99,99 100 F-274,741 Phoma spp 99,46 100 99,5 F-274,757 Phoma spp 100 99,86 99,84 F-274,885 Phoma spp 93,79 100 99,82 F-274,896 Phoma spp 100 100 100 F-274,903 Phoma spp 68,06 100 100 F-274,904 Scolecobasidium spp 99,74 64,84 100 F-274,893 Ulocladium chartarum 99,84 100 100 F-274,899 Ulocladium chartarum 100 100 100 F-274,670 Ascomycete sin identificar 79,12 100 100 F-274,674 Hongo sin identificar 99,65 100 100 F-274,731 Hongo sin identificar 0 99,98 48,97 F-274,755 Hongo sin identificar 92,6 0 100 F-274,888 Hongo sin identificar 100 100 99,77 F-274,901 Hongo sin identificar 100 100 100 F-274,687 Hongo sin identificar (n.s) 5,61 100 88,96 F-274,724 Hongo sin identificar (n.s) 37,3 37,93 100 F-274,743 Pleosporales sin identificar 99,72 100 99,55 F-274,881 Pleosporales sin identificar 51,12 100 99,73 F-274,900 Pleosporales sin identificar 100 100 100

n.s: Secuencia no disponible

5 De las 44 cepas estudiadas, 31 cepas mostraron capacidad de degradar las 3 aminas, 8 cepas degradaron 2 aminas y 5 cepas degradaron sólo una amina. En esta encuesta, se fij� arbitrariamente el valor del 60% de degradación como el nivel mínimo para considerar que los hongos eran capaces de degradar aminas bi�genas. Es decir, las actividades enzim�ticas de degradación de aminas bi�genas fueron significativas para muchos de los hongos estudiados, independiente de la amina incorporada al medio de cultivo (Tabla 4), lo que sugiere que las especies de 10 hongos de la vid tienen capacidad para degradar las aminas de manera similar.

EJEMPLO 2. Degradación de aminas bi�genas

2.1 Degradación de aminas bi�genas por hongos seleccionados

Los hongos que mostraron mayor capacidad de degradación de las aminas bi�genas, histamina, tiramina y putrescina (Alternaria spp., Epicoccum nigrum, Penicillium spp., Phoma spp., y Ulocladium chartarum) (Tabla 3) se seleccionaron para llevar a cabo un nuevo ensayo, en el que además se incluyeron dos microorganismos GRAS (Generally Regarded As Safe), Aspergillus oryzae CECT 2094 y Penicillium roqueforti CECT 2905, procedentes de la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) (Tabla 4).. La metodología y análisis empleados fueron los descritos en anteriormente, pero además, se incluyó la medición del pH a tiempo inicial y tras la incubaci�n.

Tabla 4. Degradación de histamina, tiramina y putrescina (valores expresados como un porcentaje con respecto a los valores iniciales) en el medio YCB con 0,05 g/L histamina, tiramina o putrescina, después de 10 días de incubaci�n a 22�C con los hongos aislados de la vid.

N�mero

Origen Nombre Degradación pH Degradación pH Degradación pH

de aislado

de histamina final de tiramina final de final

(%)

(%)

putrescina

(%)

F-274,707

Corteza de vid Alternaria spp 100 4.5 100 4.5 100 4.5

F-274,672

Xilema de vid Epicoccum nigrum 36.45 4.5 100 4.5 100 4.5

F-274,760

Corteza de vid Penicillium spp 100 4 100 4 100 4

F-274,692

Xilema de vid Phoma spp 100 4.5 100 4.5 100 4.5

F-274,893

Suelo de vid Ulocladium chartarum 100 5 100 5 ND 5

CECT 2094

Aspergillus oryzae 3.77 4 100 4 100 4

CECT 2905

Penicillium roqueforti 100 4.5 100 4.5 100 4.5

ND: No determinado

Cuando el ensayo se repitió con una nueva incubaci�n empleando mayores volúmenes de muestra, todas los hongos mantuvieron su capacidad para degradar las aminas bi�genas, con excepción de E. nigrum, para el cual el porcentaje de degradación de la histamina se redujo de 99.69% (Tabla 4) a 36.45% (Tabla 4), y Ulocladium chartarum, para el que no se detect� la degradación de putrescina (Tabla 4).

Respecto a los dos hongos GRAS, ambos fueron capaces de degradar la tiramina y putrescina, sin embargo, la histamina sólo fue degradada por P. roqueforti (Tabla 4). Los valores medios de pH en los medios de cultivo se mantuvieron estables para cada cepa. Estos son los primeros datos sobre la degradación de aminas bi�genas, y en particular histamina, por hongos GRAS, lo que les convierte en fuentes muy atractivas para su aplicación en productos de consumo humano.

2.2. Degradación de aminas bi�genas en vinos

Para este ensayo se emplearon dos vinos comerciales, uno tinto y otro blanco, y un vino sintético. El vino tinto presentaba una concentración total de aminas bi�genas de 43,97 mg/L (19,33 mg/L de histamina, 2,08 mg/L de tiramina y 22,56 mg/L de putrescina). El vino blanco fue dopado con 0,05 g/L de cada una de las aminas (histamina, tiramina y putrescina). El vino sintético se prepar� mezclando etanol al 12% (v/v) (VWR, Leuven, Bélgica) y 4 g/L de ácido tartárico (Panreac, Barcelona, España); tras ajustar el pH a 4 con NaOH (Panreac, Barcelona, España) se añadieron las aminas bi�genas (histamina, tiramina y putrescina, 0,05 g/l).

El hongo seleccionado para este ensayo fue Penicillium spp (F-274,760, aislado de la vid) debido a su elevado potencial para degradar aminas bi�genas (en torno al 100% de degradación) en los dos experimentos de incubaci�n en medios de cultivo (Tablas 3 y 4).

Para obtener los extractos crudos del hongo se procedió de la siguiente manera: a matraces con 25 ml de medio YCB y 0,05 g/l de histamina (extracto A), tiramina (extracto B) o putrescina (extracto C) como única fuente de nitrógeno, se a�adi� 0,5 cm de in�culo de Penicillium spp. Para cada amina se utilizó un matraz como control que contenía sólo el medio de cultivo con la amina. Tras la inoculación, los matraces se incubaron en agitaci�n (200 rpm), a 22�C y 80% de humedad relativa durante una semana. Transcurrido el tiempo de incubaci�n los caldos de cultivo se filtraron usando filtros de 0.22 �m (Millipore ExpressTM Plus), obteniéndose as� lo que denominamos extractos crudos del hongo. El experimento se realizó por duplicado.

Para confirmar que el extracto enzim�tico mantenía su capacidad de degradación de aminas, se tom� una alícuota (1ml) de cada extracto para su análisis por RP-HPLC mediante el método propuesto por una Marcobal et al., (2005), basado en una derivatizaci�n precolumna de las aminas con ortoftaldialdehido (OPA) en presencia de mercaptoetanol, para formar un complejo detectable por fluorescencia.

Posteriormente, los extractos A, B y C fueron utilizados para los ensayos enzim�ticos en vino (Figura 2). Se a�adi� 0,5 ml de extracto f�ngico (o agua estéril en el caso del control) a 1 ml de vino tinto, blanco o sintético, y se incub� a 35�C durante 18 h; transcurrido este tiempo, la reacción se par� mediante la adición de 1,5 ml de HCl 1M. Las muestras se filtraron antes de su análisis por RP-HPLC. La degradación de aminas presentes en los vinos se expres� como porcentaje con respecto de la concentración del vino control (Figura 2).

Cuando se añadieron a los vinos, los tres extractos disminuyeron el contenido de aminas bi�genas. Los extractos enzim�ticos procedentes de los medios de cultivo inducidos por el crecimiento del hongo en presencia de histamina (extracto A) mostraron la mayor capacidad para promover la degradación de aminas bi�genas en los dos vinos comerciales, blanco y tinto, y en el vino sintético. En conjunto, la histamina fue significativamente degradada en el vino tinto tratado con los extractos A, B y C (hasta 20, 40 y 38% de degradación de histamina, respectivamente), aunque se obtuvieron mejores resultados en el vino blanco (hasta un 80-90% de degradación, Figura 2).

EP0132674A2 propone el uso de extracto enzim�tico procedente de A. niger en los alimentos fermentados como quesos, cervezas, mostos y extractos de levadura, pero no se presentan los datos concretos de su utilidad en condiciones reales de producción de alimentos.

En base a los resultados obtenidos tanto en medios de cultivo como en vinos, la presente invención se refiere a extractos enzim�ticos procedentes de Penicillium spp., previamente aislado de la vid, cuyas actividades enzim�ticas mantienen su capacidad de degradación de aminas bi�genas (i.e. histamina, tiramina y putrescina) a valores de pH de entre 3,5 hasta 5,0, es decir a valores de pH más bajos (y más cercanos a los de cualquier producto fermentado) que los pH óptimos de las amino oxidasas de A. niger descritos en EP0132674A2.

Claims (20)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado, caracterizado por poner en contacto dicho producto fermentado con un extracto enzim�tico de origen f�ngico, sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio.

2. 2.

   El método según la reivindicación 1, caracterizado porque el producto fermentado es un alimento o bebida en cuya fermentación intervienen bacterias l�cticas con actividad amino�cido descarboxilasa.

3. 3.

   El método según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el producto fermentado se selecciona de entre el siguiente grupo: queso, productos cárnicos y encurtidos, cerveza, mosto, sidra y vino.

4. 4.

   El método según las reivindicaciones 1 - 3, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico es capaz de degradar al menos una amina bi�gena.

5. 5.

   El método según las reivindicaciones 1 - 4, caracterizado porque la amina bi�gena se selecciona de entre el siguiente grupo: histamina, tiramina, putrescina y una combinación de las mismas.

6. 6.

   El método según las reivindicaciones 1 - 5, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado de un ecosistema vínico.

7. 7.

   El método según las reivindicaciones 1 - 6, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado perteneciente a un género del siguiente grupo: Alternaria spp., Epicoccum nigrum, Penicillium spp., Phoma spp., y Ulocladium chartarum.

8. 8.

   El método según las reivindicaciones 1 - 7, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de al menos un hongo aislado perteneciente al género Penicillium spp.

9. 9.

   El método según las reivindicaciones 1 - 8, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico procede de la cepa Penicillium sp. CIAL-274,760, depositada el 14 de septiembre de 2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y cuya referencia es CECT 20782.

10. 10.

    El método según las reivindicaciones 1 - 9, caracterizado porque el porcentaje de reducción de la concentración de al menos una amina bi�gena es superior al 60%.

11. 11.

    El método según las reivindicaciones 1 - 10, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico se usa como agente detoxificante en la industria alimentaria.

12. 12.

    El método según las reivindicaciones 1 - 11, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico se usa para mejorar la calidad organol�ptica del vino.

13. 13.

    Un método de obtención de un extracto enzim�tico de origen f�ngico para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, caracterizado porque dicho método comprende las siguientes etapas:

    i. aislar al menos un hongo,

    ii. incubar el hongo aislado en i) en un medio de cultivo que contiene al menos una amina bi�gena como principal fuente de nitrógeno,

    iii. inducir la actividad enzim�tica del hongo implicada en la degradación de la amina bi�gena citada en ii),

    iv.

    separar el micelio del hongo, y

    v.

    extraer del micelio el citado extracto enzim�tico.

14. 14.

    El método de obtención según la reivindicación 13, caracterizado porque el paso i) es aislar al menos un hongo de un ecosistema vínico.

15. 15.

    El método de obtención según las reivindicaciones 13 y 14, caracterizado porque el paso i) es aislar al menos un hongo perteneciente a un género seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternaria spp., Epicoccum nigrum, Penicillium spp., Phoma spp., y Ulocladium chartarum.

16. 16.

    El método de obtención según las reivindicaciones 13 - 15, caracterizado porque el paso i) es aislar al menos un hongo perteneciente al género Penicillium spp.

17. 17.

    El método de obtención según las reivindicaciones 13 - 16, caracterizado porque el paso i) es aislar al menos la cepa Penicillium sp. CIAL-274,760, depositada el 14 de septiembre de 2011, en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) y cuya referencia es CECT 20782.

18. 18.

    El método según las reivindicaciones 1 -12, caracterizado porque el extracto enzim�tico de origen f�ngico es obtenido mediante el método de obtención definido en las reivindicaciones 13 - 17.

19. 19.

    Un extracto enzim�tico de origen f�ngico para reducir la concentración de al menos una amina bi�gena en un producto fermentado sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular en el medio, caracterizado porque se obtiene mediante el método de obtención definido en las reivindicaciones 13 - 17.

    FIGURA. 1

    FIGURA. 2

    OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

    N.� solicitud: 201131620

    ESPA�A

    Fecha de presentación de la solicitud: 07.10.2011

    Fecha de prioridad:

    INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

    51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

    DOCUMENTOS RELEVANTES

    Categor�a

    56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

    X

    PUNAKIVI K. et al. Enzymatic determination of biogenic amines with transglutaminase. Talanta.15.01.2006. Vol. 68, N�. 3, páginas 1040-1045. ISSN 0039-9140. 19

    Y

    1-6,10-12

    Y

    EP 0170880 A1 (UNDERBERG EMIL) 12.02.1986, todo el documento. 1-6,10-12

    A

    EP 0132674 A2 (BOVRIL LTD) 13.02.1985, todo el documento. 1-19

    A

    ES 483819 A1 (UNDERBERG EMIL) 01.09.1980, todo el documento. 1-19

    Categor�a de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

    El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones n�:

    Fecha de realización del informe 13.02.2013

    Examinador J. Manso Tomico Página 1/4

    INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

    N� de solicitud: 201131620

    CLASIFICACI�N OBJETO DE LA SOLICITUD A23L1/015 (2006.01)

    A23L2/84 (2006.01) C12H1/00 (2006.01) Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

    A23L, C12H

    Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, wpi, embase, biosis

    Informe del Estado de la Técnica Página 2/4

    OPINI�N ESCRITA

    N� de solicitud: 201131620

    Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 13.02.2013

    Declaraci�n

    Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 1-18 19 SI NO

    Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

    Reivindicaciones Reivindicaciones 7-9, 13-18 1-6, 10-12, 19 SI NO

    Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

    Base de la Opinión.-

    La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

    Informe del Estado de la Técnica Página 3/4

    OPINI�N ESCRITA

    N� de solicitud: 201131620

    1. Documentos considerados.-

    A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

    Documento

    Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

    D01

    PUNAKIVI K. et al. Enzymatic determination of biogenic amines with transglutaminase. Talanta. 15.01.2006. Vol. 68, N�. 3, páginas 1040-1045. ISSN 0039-9140

    D02

    EP 0170880 A1 (UNDERBERG EMIL) 12.02.1986

    D03

    EP 0132674 A2 (BOVRIL LTD) 13.02.1985

    D04

    ES 483819 A1 (UNDERBERG EMIL) 01.09.1980

20. 2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

    La reivindicación 19 hace referencia a un extracto enzim�tico caracterizado por el procedimiento de obtención del mismo. Sin embargo, la novedad del extracto se debe valorar en base a las características técnicas de estructura o actividad de dicho extracto enzim�tico. D01 divulga un enzima, la transglutaminasa, que puede ser utilizada para reducir la cantidad de aminas biog�nicas de un producto fermentado sin la necesidad de la presencia de oxígeno molecular, por lo que el objeto de la reivindicación 19 carece de novedad tal y como se menciona en el art. 6 de la ley 11/986. El documento D02 y D03 pueden ser considerados como los documentos más cercanos del estado de la técnica. Ambos documentos divulgan el uso de la enzima amino-oxidasa para la degradación de histamina en alimentos y bebidas, en concreto la amino-oxidasa que aparece en D02 es de origen f�ngico. Por tanto, D02 y D03 plantean el mismo problema técnico que el del objeto de la presente invención. La presente solicitud difiere de lo divulgado en D02 en que el extracto enzim�tico, cuya enzima exacta no aparece reivindicada, no requiere la presencia de oxígeno molecular en el medio. El documento D01 divulga el uso de la enzima transglutaminasa que descompone algunas aminas biog�nicas sin necesidad de la existencia de oxígeno en el medio. Por tanto, partiendo de D02 el experto en la materia consultaría lo divulgado en D01 para buscar un enzima, como la transglutaminasa, como alternativa a la amino-oxidasa utilizada usualmente para la degradación de aminas biog�nicas en alimentos y bebidas. Por tanto, la solución propuesta en las reivindicaciones 1-6, 10-12 carece de actividad inventiva tal y como se menciona en el art. 8 de la ley 11-1986. Sin embargo, el hecho de que ese extracto enzim�tico sea obtenido a partir de los hongos aislados y divulgados en las reivindicaciones 7-9 no se puede deducir de los documentos anteriormente citados tomados solos o en combinación, por lo que el objeto de la invención contenido en las reivindicaciones 7-9, 13-18, siempre que se refiera a los hongos mencionados en las reivindicaciones 7-9, cumpliría con el requisito de actividad inventiva tal y como se menciona en el art. 8 de la ley 11/986.

    Informe del Estado de la Técnica Página 4/4