5 SISTEMA DE CONTEO DE PARTICULAS ADAPTABLE A UN INSTRUMENTO ÓPTICO Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al campo de conteo celular y de partículas. En particular, se refiere a los sistemas de conteo de células y partículas con microscopio o lupa. 10 Más concretamente, se refiere a los sistemas de conteo con microscopio o lupa basados en análisis de imagen que realizan un conteo automático, semi-automático o semi-asistido. 15 20 25 30 Estado de la Técnica Se conocen diversas técnicas antiguas de conteo celular como puede ser la divulgada por la patente US-5135302 (Citómetro de flujo) o por la patente US-1918351 (hemacitómetro/Cámara de Neubauer). Estas técnicas presentan diversas desventajas y problemas. Entre los que destacan los siguientes: El conteo en cámara de Neubauer presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) errores humanos de conteo; (b) errores estadísticos; (c) errores en el cálculo de concentración, al aplicar la fórmula matemática correspo ndiente; (d) baja reproductibilidad / alta varianza en las mediciones realizadas; (e) proceso muy tedioso y monótono para los técnicos de laboratorio; (f) proceso difícil de realizar para personas con deficiencias visuales; (g) proceso fatigante para la vista del técnico de laboratorio. El conteo en citómetro de flujo presenta las siguientes desventajas y problemas: (a) destrucción de la muestra al realizarse el conteo;
5 (b) sistema con un alto coste de mantenimiento; (c) sistema requiere calibraciones periódicas; (d) si el sistema no se usa a menudo, se estropea; (e) el sistema no permite la observación visual de las muestras por los técnicos. Las cámaras de recuento del tipo de las descritas por US 1918351 (cámara de Neubauer) son unas cámaras adaptadas al microscopio de campo claro o al de 10 contraste de fases. Consisten, en general, en un portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula con unas dimensiones dadas, con una separación entre dos líneas consecutivas conocida. Para contar las células se observa el retículo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las células. 15 Con base en la cantidad de células contadas, conociendo el volumen de líquido que admite el campo del retículo, se calcula la concentración de células por unidad de volumen de la muestra líquida inicial. 20 Uno de los problemas de esta técnica reside en la inexactitud que se produce cuando se realiza el conteo, ya que, se utiliza una fórmula estadística que introduce cierto error, y además también está presente el error humano. Esta inexactitud se traduce en una menor fiabilidad y reproductibilidad (fiabilidad = ausencia de error en la medida, reproductibilidad = precisión = coherencia en las mediciones de una misma 25 concentración). US 5135302 describe un Citó metro de flujo. La citometría de flujo es una técnica de análisis celular que implica medir las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las células conforme se las hace pasar a través de un rayo 30 de luz. Para su análisis por citometría de flujo, las células deben encontrarse individualmente en suspensión en un fluido. Al atravesar el rayo de luz, las células interaccionan con éste causando dispersión de la luz. Basándose en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complejidad de 35 estas. Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se coloca a las células en presencia de anticuerpos monoclonales marcados con moléculas
fluorescentes, se pueden evaluar que células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales usados. Un problema importante de esta técnica reside en la destrucción de la muestra que se 5 va a utilizar para realizar el conteo, ya que al exponer las células al rayo de luz y a la fluorescencia estamos destruyendo la muestra extraída. También se conocen diversas técnicas basadas en otros principios para recuento de células. Ejemplos de ello son patentes y solicitudes de patente como US 10 2007/0143033 que divulga sistemas y métodos para contar partículas por Beckam Coulter, US 2007/0012784 trata sobre la autentificación de producto por Thomas J. Mercolino, US 2008/0050619 "Fuel celllife counter and method of managing remaining life" por Life Technologies, US 3973194 de 1976 por Daniel W. McMorris y William J. Skidmore, US 5159642 de 1992 por Tokihiro Kosaka o US 5741648 de 1998 por 15 George P. Hemstreet que describe un método de análisis celular usando análisis de imagen cuantitativo fluorescente. 20 Breve descripción de la invención La presente invención propone un sistema adaptable a cualquier microscopio o lupa. Actualmente, los sistemas de conteo automáticos celulares son máquinas cerradas que únicamente permiten realizar conteos celulares. El sistema reivindicado aprovecha los microscopios existentes y los convierte en máquinas de contar células permitiendo 25 realizar conteos y medidas en un rango más amplio. El montaje sobre el microscopio, permite además ahorrar espacio en el banco de trabajo. 30 Ventajosamente, la invención permite además el conteo automático en cualquier recipiente de profundidad conocida que pueda ser observado en el microscopio. Para conseguir estos objetivos, se han tenido que resolver varias dificultades: Problemas con la iluminación de algunos microscopios. Según el microscopio, puede ser necesario incorporar un detector de luminosidad, e incluir un parámetro de luminosidad asociado a cada perfil celular. Si cuando se intenta contar se ha
cambiado la luminosidad con la que se configuró el sistema obliga a volver a definir el perfil. Problemas de desenfoque. Hay microscopios que se desenfocan en cuestión de segundos o moviendo la pletina. Se ha paliado este problema mostrando 5 instantáneamente el análisis en pantalla (si el análisis es incorrecto, normalmente es un problema de desenfoque y el usuario se da cuenta inmediatamente y lo corrige). Problemas de artefactos, suciedad del microscopio y aberraciones de las lentes en microscopios de baja calidad, usados, etc. Se pueden definir áreas de exclusión 10 para eliminar áreas de la pantalla especialmente problemáticas y evitar que se utilicen en el conteo. Sistema de conteo de partículas adaptable a un instrumento óptico que incluye unos medios de captación de imágenes para adquirir imágenes de un recipiente con una 15 muestra a través del instrumento óptico, unos medios de visualización para visualizar imágenes adquiridas por los medios de captación asociadas a la muestra, unos medios de procesamiento de las imágenes adquiridas. Los medios de procesamiento identifican bordes de zonas de la posible partícula y permiten identificar una pluralidad de regiones de la imagen delimitadas por los bordes, para asociarlas al fondo de la 20 imagen o para asociarlas a una zona de posible partícula. También permiten comprobar si cumple con una condición preestablecida basada en al menos uno de los siguientes parámetros geométricos: longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado. También permiten contabilizar como partículas aquellas zonas que cumplen con la condición preestablecida. 25 Los medios de procesamiento pueden opcionalmente convertir la imagen adquirida a una escala de tonalidades de acuerdo con su intensidad luminosa y longitud de onda. Opcionalmente, los medios de visualización pueden marcar distintivamente las zonas 30 de posible partícula que han sido contabilizadas.
Opcionalmente, los medios de visualización pueden comprender una interfaz para verificar mediante la comprobación interactiva por un usuario de una zona de posible partícula contabilizada para permitir descartarla como contabilizada. 5 Opcionalmente, los medios de procesamiento permiten además asignar un valor en la escala de tonalidades a las regiones identificadas como fondo de la imagen. 10 Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden asociar un tamaño de partícula de acuerdo con el número de píxeles en la imagen correspondiente. Ventajosamente, los medios de procesamiento pueden calcular la concentración de partículas por unidad de volumen cuando la muestra se sitúa en un contenedor de dimensiones conocidas. 15 Favorablemente, los medios de procesamiento pueden excluir de una imagen adquirida una región de exclusión de acuerdo con lo definido por un usuario a través de la interfaz de los medios de visualización. 20 Opcionalmente, la imagen captada se convierte a una imagen en escala de grises. El sistema es aplicable en particular cuando las partículas son microorganismos biológicos. Los microorganismos biológicos pueden ser, entre otros, células, hongos, algas o plaquetas. 25 Los medios de procesamiento pueden realizar opcionalmente un conteo selectivo en la imagen captada al ser filtrada cuando se ilumina con luz de una longitud de onda asociada a una determinada característica de los microorganismos biológicos, si dichos microorganismos fueron previamente marcados con un marcador sensible a tal longitud de onda. 30
Opcionalmente, los medios de visualización permiten detectar la iluminación de la muestra y modificar la intensidad luminosa aplicada a la muestra celular. Opcionalmente, los medios de captación de imágenes comprenden una cámara digital 5 y/o una pantalla táctil. 10 El sistema es aplicable, tanto si el dispositivo óptico es una lupa como si es un microscopio. Figuras Se representan en los siguientes dibujos, de forma esquemática, aspectos relacionados con una realización de la invención. 15 Figura 1. Esquema de sistema de conteo adaptado para un microscopio (4). Figura 2. Ejemplo de definición de una zona de exclusión (14) para evitar falsas detecciones. Figura 3. Ejemplo de varias operaciones llevadas a cabo por el sistema de conteo con la imagen esquemática producida por cada operación: captación de imagen (21), 20 detección de bordes (22), delimitación de áreas de posibles partículas (23), filtrado según criterios geométricos (24) y conteo resultante (25). 25 Descripción detallada de la invención En las próximas páginas, la invención se ilustra adicionalmente y sin carácter limitativo mediante su integración en un microscopio óptico (4) (de contraste de fases, fluorescencia, etc.) con unos medios de acoplamiento a la cámara digital (2). 30 No obstante, para el conteo de partículas y más en concreto de microorganismos la invención es aplicable tanto a un microscopio como a una lupa. Por ejemplo, dichos medios de acoplamiento se pueden realizar en:
1) el trinocular del microscopio si existiese (normalmente se utilizará un acople de cámara digital al tubo de anillo C, o de rosca C de 25 mm de diámetro aproximadamente, aunque también se dispone de acoples para rosca de cámara fotográfica, acople para bayoneta, etc.). 5 2) si no existiese trinocular, se realizaría un acople a una de las lentes del binocular, que tienen un diámetro generalmente de 25 mm. Esta opción es más incómoda ya que se pierde una de las lentes que permiten realizar visualización con el microscopio. En sistemas monoculares no existe posibilidad de visualización más que por la pantalla de la invención. 10 Otra posibilidad es la adaptación a la cámara de toma de imágenes existente en el microscopio (si existiese). El sistema puede incluir además los siguientes elementos: Cámara de toma de imagen (2). 15 Dispositivo de procesamiento (1) (PC o equivalente) con capacidad de almacenamiento. Interfaz visual/pantalla (3). Cable de comunicaciones entre la cámara y el dispositivo de procesamiento Dispositivo de calibración (puede ser una cámara de Neubauer o una cámara 20 donde podamos tomar una medida de referencia, un calibrador de microscopio, etc.). 25 30 35 Cámara de contención de la muestra (6) (puede ser una cámara de Neubauer, una cámara de Thoma, etc. El único requisito es que la profundidad de la cámara ha de ser conocida). La cámara de contención puede ser lavable o desechable. Es necesario también disponer de un microscopio (4) donde adaptar el sistema. El microscopio debe estar limpio, en la medida de lo posible, disponer de luz para iluminación de las muestras y disponer cómo mínimo de una óptica, preferentemente de 10x al menos. El sistema también se puede acoplar opcionalmente a la red local de datos a través de una conexión Ethernet RJ45, wifi o similar, con el objeto de: 1) realizar copias de seguridad en el servidor 2) enviar imágenes a la central receptora de datos para labores de mantenimiento, control de calidad, detección de descalibrado / mal funcionamiento del sistema, actualizaciones, etc.
Se prevé la opción de utilizar unas credenciales de identificación en el mismo dispositivo, para facilitar las labores de trazabilidad. 5 Ventajas: trazabilidad completa con identificación de usuario, barreras de acceso para personal externo, incremento de la responsabilidad en la toma de muestras por parte del personal, mejora la calidad de las medidas ya que los empleados se esmerarán más en la preparación de la muestra, diluciones etc. al quedar registradas sus operaciones de medida. 10 El sistema admite conexión con otros periféricos como teclado, ratón y/o lápiz de plástico para tableta pe. Incluso, el sistema permite a través de una pantalla táctil (3), ser utilizado con el dedo. 15 Se seleccionan las opciones mediante pulsaciones en la pantalla táctil y mediante el uso de un teclado virtual que aparece en la pantalla cuando es requerido.
Conteo en cámara de Neubauer Problema Errores humanos de conteo Errores estadísticos Errores de cálculo de concentración, al aplicar la fórmula Baja reproductibilidad / alta varianza Proceso tedioso y monótono Proceso difícil para problemas con deficiencias visuales Proceso fatigante para la vista Gasto en material desechable Gasto en reactivos Solución La automatización del conteo permite resultados reproductibles El error estadístico se reduce aumentando el número de muestras, y el área analizada por el sistema. (Con conteo humano supone una inversión en tiempo considerable por parte del personal de laboratorio) La automatización elimina este tipo de errores El sistema realiza un muestreo de un mayor número de muestras, reduciendo significativamente la varianza, y el error estadístico. La parte de conteo es eliminada completamente con el conteo automático. Pantalla de visualización permite a las personas con deficiencias realizar conteo y observar imágenes al microscopio. Pantalla de visualización permite realizar conteos con menos fatiga visual. Permite el uso de cámaras de recuento lavables El uso del microscopio permite contar células sin usar reactivos Las ventajas de realizar el conteo automático con respecto a soluciones tradicionales 5 son: 1) Reproductibilidad. El error que introduce el sistema está acotado, y es sistemático. No depende del personal de laboratorio que realiza el conteo.
2) Fiabilidad. Se eliminan errores humanos, la toma de más imágenes permite reducir el error estadístico. 3) Eliminación del tedioso proceso de conteo manual. La medición mediante conteo manual al microscopio puede tomar entre 1 y 10 minutos de un técnico 5 de laboratorio, dependiendo de la concentración 4) Menos mantenimiento, menor tiempo de configuración y limpieza que un citómetro de flujo. 5) Trazabilidad (imágenes y conteos asociados a un usuario y determinados en el tiempo) 10 6) Recuperación de imágenes 15 7) Detección visual de contaminación Las ventajas de realizar el conteo semi-asistido con respecto a soluciones tradicionales son: 8) Fiabilidad. Se eliminan ciertos errores humanos en los cálculos de la concentración. 9) Usabilidad. Reducción de la fatiga visual, y permite a personal con ciertas deficiencias visuales utilizar el microscopio. 20 10) Usabilidad. Reducción de la fatiga intelectual. El sistema guarda 25 automáticamente las células que lleva contadas, y mediante la marca en pantalla de las que han sido contadas permite al personal "despistarse" sin perder la cuenta. 11) Responsabilidad. Los conteos realizados quedan registrados con el nombre del personal de laboratorio que ha realizado el recuento. Los recuentos mal hechos pueden relacionarse con una persona determinada, mejorando posteriormente sus hábitos mediante training, etc. 12) Menos mantenimiento, menor tiempo de setup y limpieza que un citó metro de flujo. 30 13) Trazabilidad (imágenes y conteos asociados a un usuario y determinados en el tiempo) 14) Recuperación posterior de imágenes, y de los conteos junto con la información de lo que se ha considerado célula / partícula a contar. 15) Detección visual de contaminación
5 10 16) Conteo de elementos con alta complejidad visual (células adherentes, muestras con mucha suciedad etc.) donde el sistema no puede ser configurado para contar de forma automática. 17) Usado en conjunción con el conteo automático, el conteo semi-asistido permite validar el calibrado realizado para el modo de funcionamiento automático, y comprobar que el sistema está funcionando dentro de los rangos de funcionamiento aceptables. La utilización del sistema por primera vez requiere los siguientes pasos, en este orden 1) Calibración en tamaño. 2) Definición de perfil celular 3) Lanzamiento de conteo celular 15 En un segundo uso, podrá lanzarse el conteo celular de forma directa, sin tener que realizar la calibración en tamaño y definición de perfil, siempre y cuando se use el mismo microscopio, y el tipo de célula a contar sea el mismo (o haya sido definido previamente ). 20 A continuación se describen cada uno de los pasos. CONFIGURACiÓN Y CALIBRADO DEL SISTEMA PREVIO A LA REALIZACiÓN DEL CONTEO. 25 1) Se realiza un calibrado del sistema, donde se realizan las siguientes acciones 30 35 (A) Calibrado en tamaño. Se toma como referencia una distancia conocida en el microscopio (4), para obtener la relación distancia real con número de píxeles en pantalla (calibración de tamaño). (B) Definición del perfil biológico. Para ello se define: a. Profundidad del recipiente de conteo (6). (calibración de distancia / profundidad en el eje Z del microscopio (4)) b. Tamaño máximo y mínimo de células
5 10 c. Iluminación mínima y máxima (no se selecciona, se detecta de forma automática) d. Sensibilidad y contraste de la muestra e. Otras características morfológicas del tipo de célula a medir (redondez, factor de forma, etc.). f. Características dependientes de la longitud de onda del elemento a analizar (por ejemplo, en el espectro visible) A continuación se definen en más detalle estos ajustes. (A) CALIBRADO EN TAMAÑO. El calibrado puede realizarse de diferentes modos, aunque siempre ha de realizarse con un objeto en el cual conozcamos la distancia exacta entre 2 puntos al microscopio. 15 Pueden utilizarse entre otros, los siguientes elementos de calibración. 20 25 30 1) Placa de calibración estándar de microscopio. Viene de serie con algunos microscopios comerciales. Se trata de una placa donde viene impreso un patrón con líneas, donde la distancia entre las líneas es conocida. 2) Una cámara de Neubauer, cámara de Thoma, cámara de Neubauer Improved, cámara desechable o cualquier otro tipo de cámara de profundidad conocida. En este tipo de cámaras, aparece una rejilla / cuadricula al microscopio en la parte central. Esta rejilla se ha utilizado históricamente como referencia para realizar conteos manuales en el microscopio. Las distancias y dimensiones de la cuadrícula están por regla general escritas en la parte superior de la cámara. 3) Otros sistemas. La calibración del sistema puede realizarse con cualquier sistema, siempre y cuando se conozca la distancia exacta entre 2 puntos visibles al microscopio. (B) DEFINICiÓN DEL PERFIL BIOLÓGICO. El calibrado del perfil biológico determina las características morfológicas, de tamaño, forma, textura, color y/o absorbancia en el espectro visible (o invisible dependiendo del 35 captor de imagen), y contraste en la muestra.
El calibrado del perfil biológico se realiza siempre posteriormente al calibrado en tamaño, ya que para realizar este calibrado debemos conocer las distancias de los elementos que estamos visualizando en la pantalla, para poder seleccionar el rango de parámetros geométricos máximo y mínimo de los elementos biológicos que el 5 sistema va a contar. En el perfil biológico, el usuario selecciona las características de los elementos de la imagen que desea contar. 10 -Sensibilidad (valor entre 1 y 100). Determina el contraste mínimo que ha de tener el cuerpo o borde del elemento biológico (célula o equivalente) para ser considerado válido para conteo. Si seleccionamos una sensibilidad demasiado alta, el sistema captará elementos extraños de la imagen, como suciedad de la cámara o el microscopio, artefactos, etc. 15 Produciéndose falsos positivos (detecciones de elementos donde no debería haberlas) 20 Si seleccionamos una sensibilidad demasiado baja, el sistema ignorará elementos de la imagen que deberían ser tenidos en cuenta en el recuento. Produciéndose falsos negativos (no detecciones de elementos donde debería haberlas). -Parámetros Geométricos (24): Determina el tamaño (longitud máxima, longitud mínima, perímetro, área o coincidencia con un patrón de contorno prefijado) que ha de tener el elemento biológico para ser tenido en cuenta en el conteo (25). 25 -Calibrado por color / absorbancia de luz: Este filtro determina el rango de colores aceptables para el conteo de los elementos. Por ejemplo, si se selecciona el color rojo para las células, porque se desean contar únicamente las células que han absorbido un colorante rojo, el sistema ignorará las células/elementos que sean de colores muy distintos al rojo, y contará los elementos de la tonalidad de rojo seleccionada, así como 30 las de tonalidades parecidas y similar (próximas en el espectro de color, y de frecuencias) Los filtros de perfil pueden activarse o desactivarse. Si el filtro de perfil está desactivado, no se realizará discriminación de los elementos según la característica 35 del perfil. Por ejemplo, si el filtro de color está desactivado, el sistema ignorará el color
a la hora de considerar los elementos para el conteo, contando todos los elementos de la imagen que cumplan el resto de los filtros, e ignorando el color ello. -Viabilidad: El sistema permite un calibrado específico para la medida de viabilidad 5 celular (porcentaje de células muertas sobre células totales, vivas y muertas). La medición de viabilidad puede estar desactivada. El sistema realiza un conteo simple y proporciona únicamente la concentración celular en células I mi, o activada, en cuyo caso se proporcionará la concentración celular en células Iml totales y el porcentaje de células vivas de la muestra, en tanto por cien. 10 En el caso de activación de la medida de viabilidad, han de definirse los filtros de color específicos para células vivas (blancas generalmente) y muertas (azules generalmente cuando se utiliza tinción con trypan blue) 15 -Óptica utilizada: El usuario selecciona la óptica utilizada. Esto es necesario para tener en cuenta las distancias en la imagen, y realizar los ajustes pertinentes una vez realizado el calibrado inicial. Las ópticas más comunes en microscopios ópticos son 4x,1 Ox, 40x y 100x. 20 -Profundidad de la cámara I Contenedor: Por regla general, las cámaras comerciales (Neubauer, Thoma, etc) tienen una profundidad estándar y conocida, y además dicha profundidad está escrita en la superficie de la cámara. Para realizar esta calibración, ha de introducirse en el sistema la profundidad exacta 25 del recipiente de medición en mm. Las profundidades más comunes son 0,1 mm y 0,2 mm. 30 Es por tanto independiente del microscopio utilizado, la cámara (captor de imágenes) y las muestras biológicas que se deseen medir. TIPO DE CONTEO [automático] vs [semi-asistido] En casos en que el que la naturaleza de las imágenes o el tipo de célula a contar no 35 permitan realizar un conteo automático con suficiente fiabilidad, el sistema permite configurar un perfil para conteo semi-asistido.
En el caso en que se seleccione conteo semi-asistido en un perfil celular, el sistema ignorará todos los filtros anteriormente descritos y no realizará un análisis automático de las imágenes, sino que será el usuario el que indicará de forma manual o semi-5 asistida lo que considera una célula en cada una de las imágenes capturadas en la pantalla (pulsando con el dedo o con el ratón). 10 LA CONFIGURACiÓN DEL PERFIL BIOLÓGICO PASO A PASO. Mientras que las características de calibrado en tamaño son comunes y no varían, siempre que no se cambie de cámara (captor de imagen) y de microscopio, las características del perfil biológico cambian con cada tipo de partícula o célula a medir. Por tanto el usuario deberá definir un perfil biológico diferente para cada tipo de 15 elemento biológico que desea medir. El sistema permite el almacenamiento de las características definidas para cada perfil en la memoria del sistema, para su recuperación posterior. 20 Ejemplo de nombre de perfil: hepatocitos-tipo-a-10x-viabilidad-María. Las operaciones para la realización del calibrado del perfil biológico son las siguientes: 1) Preparación de muestra biológica del tipo de célula / microorganismo a medir 25 2) Introducción en una cámara de Neubauer o similar de la muestra. Si es 30 necesario previamente se ha hecho una dilución introduciendo con un asa de siembra en un tubo de ensayo una muestra. Este paso se realiza para conseguir una concentración adecuada que permite el análisis visual en la pantalla. Se estima que el sistema puede realizar un calibrado si podemos visualizar en la pantalla o al microscopio entre 1 y 2 células como mínimo y unas 50-100 células como máximo. Lo que corresponde a una concentración de entre 200.000 cel / mi y 10.000.000 cel / mi (aproximadamente) 3) Se selecciona la sección Configuración en el dispositivo. 4) Se selección un Perfil de conteo (una serie de parámetros que definirán lo 35 que ha de contarse y lo que no en cada imagen).
5 10 15 20 5) Se seleccionan los parámetros correspondientes al tipo de célula / elemento que deseamos contar. 6) En el caso de que el microscopio tenga suciedad, o una parte de la imagen aparezca desenfocada por imperfecciones en la lente, se eliminará la parte de la pantalla que suponga un problema mediante una Zona de Exclusión (14) (equivale a una máscara para ignorar las zonas problemáticas). 7) Después del ajuste de los parámetros (y eventual configuración de zona de exclusión) visualmente se podrá comprobar que el sistema detecta las células de la imagen dibujando un circulo (10) coloreado encima de cada célula. La comprobación de que el sistema está bien calibrado consiste en contar de forma manual las células en la imagen, y comprobar que en todas ellas el sistema ha dibujado un círculo superpuesto. 8) En caso de que no se detecten todas las células / elementos de forma correcta se repiten los pasos 5,6,7 hasta que al menos el 90%-95% de las células de la imagen se detecten de forma correcta. 9) Después de la comprobación visual, se mueve el microscopio y se comprueba con 2 o 3 imágenes más que la detección de células se realiza de forma correcta. (detección correcta de al menos el 95% de las células / elementos) 10) Se guardan los datos del perfil, y el sistema está listo para poder realizar conteos con este microscopio concreto, y con el tipo de elemento para el que ha sido configurado. CONTEO DE ELEMENTOS BIOLÓGICOS -MODO AUTOMÁTICO ( CON SISTEMA 25 PREVIAMENTE CALIBRADO / CONFIGURADO ). 30 35 Una vez realizado el calibrado del sistema (ver párrafo anterior) y definido el perfil biológico del elemento que deseamos contar, para realizar un conteo se siguen los siguientes pasos. 1) se prepara la muestra biológica y se introduce en el recipiente de conteo (c. Neubauer, Thoma, Howard, Porta + cubre, o un recipiente propietario y realizado a medida para el sistema, un cámara con marcas especiales para calibración, una placa de 24 o 96 pocillos, una placa de Petri, un frasco de cultivo, etc.)
5 10 15 20 25 30 35 2) Se selecciona el PERFIL que previamente ha sido configurado en el paso 1) para este microscopio y tipo celular concreto. Se toman las imágenes con la cámara digital (se utiliza el dispositivo correspondiente para mover la bandeja del microscopio, y la pantalla táctil o el teclado para indicar al sistema que se puede capturar la imagen). Se captura un número de imágenes que puede variar. Se toman varias imágenes para reducir el error estadístico (de la misma forma que en un conteo manual con cámara de Neubauer, la costumbre es medir 5 cuadrantes y realizar un promedio de los mismos). En nuestro caso, la toma de más imágenes supone un esfuerzo mínimo para el usuario, que se traduce en una reducción significativa del error. Por regla general se tomarán entre 5 y 10 imágenes, aunque en una próxima versión del producto pretendemos tomar 1 sola imagen con alta resolución. Si se desea reducir más el error estadístico es posible tomar tantas imágenes como se desee, siendo el error estadístico inversamente proporcional al número de imágenes tomadas. 3) las imágenes son enviadas al sistema de procesado de datos (1). 4) En caso de que las imágenes no tengan la suficiente iluminación o excesiva iluminación, el sistema realizará los ajustes pertinentes a. Mediante el ajuste del nivel de iluminación en la imagen captada b. Mediante un bucle de ajuste, donde la unidad de proceso envía una señal a la unidad de control de intensidad de la fuente luminosa indicando que se incremente o disminuya la intensidad de la fuente luminosa. c. Se vuelve al punto 4 (y se itera hasta la iluminación caiga dentro del rango) d. Si no fuese posible realizar un ajuste automático, se indicará al usuario que los niveles de iluminación están fuera del rango y que el sistema está fuera de rango para realizar el conteo.
5 10 5) En caso de que el nivel de enfoque de las imágenes no sea el adecuado, el sistema realizará los ajustes pertinentes. a. Mediante un bucle de ajuste, donde la unidad de proceso (1) envía una señal a la unidad de control de enfoque del microscopio (4) indicando que el microscopio se acerque o aleje de la muestra b. Se vuelve al punto 4 (y se itera hasta el enfoque caiga dentro del rango) c. Si no fuese posible realizar un ajuste automático del enfoque (porque el microscopio no incorpora control del enfoque), el sistema indica sistemáticamente en cada imagen analizada los elementos que está reconociendo, de modo de que si el sistema no está correctamente enfocado, el usuario puede ver en la pantalla que las células no están siendo detectadas correctamente. 15 6) El sistema de análisis procesa las imágenes, aplicando: 20 25 7) 30 35 a. filtros de tamaño b. filtros sobre la morfología del objeto c. filtros sobre la longitud de onda que atraviesa el elemento / o es reflejada por el elemento. d. filtros sobre la excentricidad del elemento (similar a la excentridad de una elipse) e. filtros sobre la longitud del contorno del objeto f. filtros sobre el area del objeto g. filtros sobre el área a analizar (áreas de exclusión (14) ) h. eliminación de la "imagen de fondo (12)" (ruido y suciedad de la imagen que permanece constante en cada imagen) a. calcula el número de células en cada imagen. b. Realiza un promediado de las mismas c. Posteriormente multiplica por el volumen medio de la imagen (este volumen medio se calcula a partir de la calibración en tamaño y la profundidad de la cámara utilizada -detallada en el perfil biológico previamente definido).
El sistema muestra en pantalla los resultados del recuento de elementos: El sistema proporciona: 5 -Concentración celular o de partículas por unidad de volumen. También puede proporcionar: -Número total de células contadas en pantalla. 10 -Grado de confluencia celular (la confluencia celular es el porcentaje de superficie ocupada por las células o partículas respecto al porcentaje total de la pantalla). -Porcentaje de células de un tipo o perfil celular con respecto al número de celulas totales. -Porcentaje de células de un tipo o perfil celular con respecto al número de celulas de 15 otro perfil celular. 20 -Porcentaje de células vivas con respecto a celulas totales. -Porcentaje de células muertas con respecto a celular totales. 8) El sistema almacena las muestras e imágenes para su posterior consulta, generación de gráficas de crecimiento, etc. La muestra de resultados, imágenes y gráficas se realiza a través del interfaz gráfico (pantalla) CONTEO DE ELEMENTOS BIOLÓGICOS -MODO SEMI-ASISITIDO ( CON 25 SISTEMA PREVIAMENTE CALIBRADO / CONFIGURADO ). El sistema permite el conteo semi-asistido de elementos al microscopio. En este modo de funcionamiento el sistema no aplica ningún filtro definido en el perfil 30 biológico ni realiza ningún análisis automático de la imagen (es el propio usuario quien realiza el conteo de forma manual, y su propia inteligencia la que se utiliza para seleccionar las células en la pantalla). Los pasos a seguir en este caso son: 35 1) calibrado en tamaño. (que se realiza una única vez para cada microscopio)
2) definición del perfil biológico (en este caso solo se ha de definir la profundidad de la cámara utilizada y la óptica) 3) se realiza el punto 2) del método automático 4) se realiza el punto 3) del método automático. 5 5) se toman las imágenes con la cámara digital (se utiliza el dispositivo 10 15 20 25 correspondiente para mover la bandeja del microscopio, y la pantalla táctil o el teclado para indicar al sistema que se puede capturar la imagen). Se captura un número determinado de imágenes. Se toman varias imágenes para reducir el error estadístico En modo semi-asistido, después de la captura de cada imagen las células han de marcarse de forma manual en la pantalla usando el ratón, el dedo o el lápiz de plástico. Cada vez que una célula se ha marcado, se dibuja un círculo semitransparente sobre la célula para indicar al usuario que la célula ya ha sido contada. 6) El sistema muestra en pantalla la concentración celular (caso de conteo simple) o la concentración celular junto con la viabilidad en porcentaje (en caso de conteo con viabilidad). El sistema proporciona: -Concentración celular o de partículas por unidad de volumen. También puede proporcionar: -Número total de células contadas en pantalla 7) El sistema almacena las muestras e imágenes para su posterior consulta, generación de gráficas de crecimiento, etc. La muestra de resultados, imágenes y gráficas se realiza a través del interfaz gráfico (pantalla) 30 En este caso el procesamiento de datos se ha limitado al cálculo de la concentración celular o al cálculo de la suma total de células marcadas por el usuario en la pantalla. 35 El cálculo de la concentración celular puede realizarse en este caso gracias al innovador sistema de calibrado del sistema.
Una de las componentes innovadoras más ventajosa del sistema es el acoplamiento a cualquier microscopio del mercado. Esto se logra gracias al conjunto de los siguientes factores: a. la adaptación mecánica, que se realiza a través de adaptadores mecánicos 5 comunes, que existen generalmente en el mercado b. el calibrado en tamaño. c. la detección de los cambios de luminosidad y ajustes en luminosidad d. la detección de desenfoque y ajuste del enfoque. e. el detector de bordes, que evita problemas de iluminación. 10 f. las zonas de exclusión. 15 El sistema también puede considerarse un todo, unido a un microscopio concreto y precalibrado para el juego de lentes del microscopio. Referencias numéricas 1 Unidad de proceso. 2 Cámara fotográfica. 3 Pantalla táctil. 20 4 Microscopio. 5 Ocular. 6 Recipiente para muestra. 10 Borde de partícula/célula. 11 Partícula. 25 12 Fondo fotografía. 13 Área de inclusión. 14 Área de exclusión. 21 Captación de imagen. 22 Detección de bordes. 30 23 Delimitación de áreas de posibles partículas/células. 24 Filtrado según criterios geométricos. 25 Conteo.
5 PARTICLE COUNTING SYSTEM ADAPTABLE TO AN OPTICAL INSTRUMENT Technical Field of the Invention The present invention relates to the field of cell and particle counting. In particular, it refers to cell and particle counting systems with microscope or magnifying glass. 10 More specifically, it refers to counting systems with microscope or magnifying glass based on image analysis that perform automatic, semi-automatic or semi-assisted counting. 15 20 25 30 State of the Art Various ancient cell counting techniques are known, such as that disclosed by US-5135302 (Flow cytometer) or US-1918351 (hemacytometer / Neubauer Chamber). These techniques present various disadvantages and problems. Among which the following stand out: Neubauer's chamber counting has the following disadvantages and problems: (a) human counting errors; (b) statistical errors; (c) errors in the concentration calculation, when applying the corresponding mathematical formula; (d) low reproducibility / high variance in the measurements made; (e) very tedious and monotonous process for laboratory technicians; (f) difficult process for people with visual impairments; (g) fatigue process for the eyes of the laboratory technician. The flow cytometer count has the following disadvantages and problems: (a) destruction of the sample when the count is made;
5 (b) system with a high maintenance cost; (c) system requires periodic calibrations; (d) if the system is not used often, it breaks down; (e) the system does not allow visual observation of samples by technicians. Counting chambers of the type described by US 1918351 (Neubauer camera) are cameras adapted to the light-field microscope or to the phase contrast microscope. They consist, in general, of a slide with a depression in the center, at the bottom of which a grid with given dimensions has been marked with the help of a diamond, with a known separation between two consecutive lines. To count the cells, the reticule is observed under the microscope with the appropriate magnification and the cells are counted. 15 Based on the number of cells counted, knowing the volume of liquid that the reticulum field admits, the concentration of cells per unit volume of the initial liquid sample is calculated. 20 One of the problems of this technique lies in the inaccuracy that occurs when counting is performed, since a statistical formula that introduces a certain error is used, and in addition the human error is also present. This inaccuracy translates into lower reliability and reproducibility (reliability = lack of measurement error, reproducibility = accuracy = consistency in measurements of the same concentration). US 5135302 describes a Cited flow meter. Flow cytometry is a cell analysis technique that involves measuring the light scattering and fluorescence characteristics that cells possess as they are passed through a beam of light. For analysis by flow cytometry, the cells must be individually suspended in a fluid. By crossing the ray of light, the cells interact with it causing light scattering. Based on the diffraction of the light in the frontal direction, the size of the passing cells can be evaluated and when measuring the reflection of the light laterally, the granularity or complexity of these is evaluated. In addition to light scattering, if prior to analysis, cells are placed in the presence of monoclonal antibodies labeled with molecules
fluorescent, it can be evaluated which cells possess the antigens complementary to the monoclonal antibodies used. An important problem with this technique lies in the destruction of the sample that is going to be used to perform the count, since by exposing the cells to the light ray and fluorescence we are destroying the extracted sample. Various techniques based on other principles for cell counting are also known. Examples are patents and patent applications such as US 10 2007/0143033 which discloses systems and methods for counting particles by Beckam Coulter, US 2007/0012784 deals with product authentication by Thomas J. Mercolino, US 2008/0050619 "Fuel celllife counter and method of managing remaining life" by Life Technologies, US 3973194 of 1976 by Daniel W. McMorris and William J. Skidmore, US 5159642 of 1992 by Tokihiro Kosaka or US 5741648 of 1998 by 15 George P. Hemstreet describing a cell analysis method using quantitative fluorescent image analysis. BRIEF DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention proposes a system adaptable to any microscope or magnifying glass. Currently, automatic cell counting systems are closed machines that only allow cell counts. The claimed system takes advantage of existing microscopes and converts them into cell counting machines allowing counting and measurement in a wider range. Mounting on the microscope also saves space in the workbench. Advantageously, the invention also allows automatic counting in any container of known depth that can be observed in the microscope. To achieve these objectives, several difficulties have been resolved: Problems with the illumination of some microscopes. Depending on the microscope, it may be necessary to incorporate a brightness detector, and include a brightness parameter associated with each cellular profile. If when you try to count you have
Changing the brightness with which the system was configured forces the profile to be redefined. Blur problems. There are microscopes that blur in a matter of seconds or by moving the plate. This problem has been alleviated by instantly displaying the analysis on the screen (if the analysis is incorrect, it is usually a blurring problem and the user immediately notices and corrects it). Problems with artifacts, dirt from the microscope and lens aberrations in low-quality, used microscopes, etc. Exclusion areas 10 can be defined to eliminate especially problematic areas of the screen and prevent them from being used in counting. Particle counting system adaptable to an optical instrument that includes means for capturing images to acquire images of a container with a sample through the optical instrument, display means for displaying images acquired by the capture means associated with the shows, a means of processing the acquired images. The processing means identify edges of areas of the possible particle and allow to identify a plurality of regions of the image delimited by the edges, to associate them with the background of the image or to associate them with an area of possible particle. They also allow you to check if you meet a pre-established condition based on at least one of the following geometric parameters: maximum length, minimum length, perimeter, area or coincidence with a preset contour pattern. They also allow counting as particles those areas that meet the pre-established condition. The processing means can optionally convert the acquired image to a scale of tones according to its light intensity and wavelength. Optionally, the display means can distinctly mark the zones 30 of possible particles that have been accounted for.
Optionally, the display means may comprise an interface to verify by means of the interactive verification by a user of an area of possible accounted particle to allow discarding it as counted. 5 Optionally, the processing means also allow to assign a value in the scale of tones to the regions identified as background of the image. 10 Advantageously, the processing means can associate a particle size according to the number of pixels in the corresponding image. Advantageously, the processing means can calculate the concentration of particles per unit volume when the sample is placed in a container of known dimensions. 15 Favorably, the processing means may exclude an exclusion region from an acquired image as defined by a user through the display media interface. 20 Optionally, the captured image is converted to a grayscale image. The system is particularly applicable when the particles are biological microorganisms. Biological microorganisms can be, among others, cells, fungi, algae or platelets. The processing means can optionally perform a selective count on the image captured when filtered when it is illuminated with light of a wavelength associated with a certain characteristic of biological microorganisms, if said microorganisms were previously marked with such a sensitive marker. wavelength. 30
Optionally, the display means allow to detect the illumination of the sample and to modify the light intensity applied to the cell sample. Optionally, the image capture means comprise a digital camera 5 and / or a touch screen. 10 The system is applicable, whether the optical device is a magnifying glass or a microscope. Figures The following drawings are schematically represented aspects related to an embodiment of the invention. 15 Figure 1. Scheme of counting system adapted for a microscope (4). Figure 2 Example of defining an exclusion zone (14) to avoid false detections. Figure 3 Example of several operations carried out by the counting system with the schematic image produced by each operation: image capture (21), 20 edge detection (22), delimitation of areas of possible particles (23), filtered according to geometric criteria (24) and resulting count (25). DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In the following pages, the invention is further illustrated and without limitation by integration into an optical microscope (4) (phase contrast, fluorescence, etc.). ) with means for coupling to the digital camera (2). However, for the counting of particles and more specifically of microorganisms the invention is applicable to both a microscope and a magnifying glass. For example, said coupling means can be realized in:
1) the microscope trinocular if it exists (a digital camera coupling to the C-ring tube, or approximately 25 mm diameter C thread will normally be used, although photo camera thread couplings, bayonet coupling are also available, etc. ). 5 2) if there was no trinocular, an attachment would be made to one of the binocular lenses, which generally have a diameter of 25 mm. This option is more uncomfortable since one of the lenses that allow visualization with the microscope is lost. In monocular systems there is no possibility of visualization except for the screen of the invention. 10 Another possibility is the adaptation to the existing imaging camera in the microscope (if it exists). The system may also include the following elements: Image camera (2). 15 Processing device (1) (PC or equivalent) with storage capacity. Visual interface / screen (3). Communication cable between the camera and the processing device Calibration device (it can be a Neubauer camera or a camera 20 where we can take a reference measurement, a microscope calibrator, etc. ). 25 30 35 Sample containment chamber (6) (can be a Neubauer chamber, a Thoma chamber, etc. The only requirement is that the camera depth must be known). The containment chamber can be washable or disposable. It is also necessary to have a microscope (4) to adapt the system. The microscope should be clean, as far as possible, to have light to illuminate the samples and have at least one optic, preferably at least 10x. The system can also optionally be connected to the local data network via an RJ45 Ethernet connection, Wi-Fi or similar, in order to: 1) make backup copies on the server 2) send images to the central data receiver to maintenance work, quality control, detection of decalibration / system malfunction, updates, etc.
The option of using identification credentials on the same device is provided, to facilitate traceability. 5 Advantages: complete traceability with user identification, access barriers for external staff, increased responsibility in the collection of samples by staff, improves the quality of the measures since employees will take more care in preparing the sample , dilutions etc. when its measurement operations are registered. 10 The system supports connection with other peripherals such as keyboard, mouse and / or plastic pen for tablet pe. Even, the system allows through a touch screen (3), to be used with the finger. 15 The options are selected by pressing on the touch screen and by using a virtual keyboard that appears on the screen when required.
Neubauer chamber counting Problem Human counting errors Statistical errors Concentration calculation errors, when applying the formula Low reproducibility / high variance Tedious and monotonous process Difficult process for problems with visual impairments Fatigued vision process Disposable material expense Reagent expenditure Solution Counting automation allows reproducible results. Statistical error is reduced by increasing the number of samples and the area analyzed by the system. (With human counting, this involves considerable time investment by laboratory staff) Automation eliminates these types of errors The system samples a larger number of samples, significantly reducing variance and statistical error. The counting part is completely eliminated with automatic counting. Display screen allows people with deficiencies to count and observe images under a microscope. Display screen allows counting with less visual fatigue. Allows the use of washable counting chambers The use of the microscope allows cells to be counted without using reagents The advantages of automatic counting with respect to traditional solutions 5 are: 1) Reproducibility. The error introduced by the system is limited, and it is systematic. It does not depend on the laboratory staff that performs the count.
2) Reliability. Human errors are eliminated, taking more images allows reducing the statistical error. 3) Elimination of the tedious manual counting process. The measurement by manual counting to the microscope can take between 1 and 10 minutes of a laboratory technician 5, depending on the concentration 4) Less maintenance, less setup and cleaning time than a flow cytometer. 5) Traceability (images and counts associated with a user and determined over time) 10 6) Image recovery 15 7) Visual contamination detection The advantages of performing semi-assisted counting with respect to traditional solutions are: 8) Reliability. Certain human errors are eliminated in the concentration calculations. 9) Usability. Reduction of visual fatigue, and allows personnel with certain visual impairments to use the microscope. 20 10) Usability. Reduction of intellectual fatigue. The system automatically saves the cells it has counted, and by means of the on-screen mark of those that have been counted, it allows staff to "mislead" without losing count. 11) Responsibility. The counts made are registered with the name of the laboratory staff that has performed the count. Badly done counts can relate to a specific person, subsequently improving their habits through training, etc. 12) Less maintenance, less setup and cleaning time than a flow meter. 30 13) Traceability (images and counts associated with a user and determined in time) 14) Subsequent recovery of images, and counts along with the information of what has been considered cell / particle to count. 15) Visual pollution detection
5 10 16) Counting elements with high visual complexity (adherent cells, samples with a lot of dirt etc. ) where the system cannot be configured to count automatically. 17) Used in conjunction with automatic counting, semi-assisted counting allows you to validate the calibration performed for the automatic mode of operation, and verify that the system is operating within acceptable operating ranges. Using the system for the first time requires the following steps, in this order 1) Calibration in size. 2) Definition of cell profile 3) Launch of cell count 15 In a second use, the cell count can be launched directly, without having to perform the calibration in size and profile definition, as long as the same microscope is used, and the type of cell to be counted is the same (or has been previously defined). 20 Each of the steps is described below. CONFIGURATION AND CALIBRATION OF THE SYSTEM PRIOR TO THE CONDUCT OF THE COUNT. 25 1) A system calibration is performed, where the following actions are performed 30 35 (A) Size calibration. A known distance in the microscope (4) is taken as reference, to obtain the real distance relation with the number of pixels on the screen (size calibration). (B) Definition of the biological profile. For this, it is defined: a. Depth of the counting vessel (6). (distance / depth calibration on the Z axis of the microscope (4)) b. Maximum and minimum cell size
5 10 c. Minimum and maximum illumination (not selected, detected automatically) d. Sensitivity and contrast of the sample e. Other morphological characteristics of the type of cell to be measured (roundness, form factor, etc. ). F. Features dependent on the wavelength of the element to be analyzed (for example, in the visible spectrum) These settings are defined in more detail below. (A) SIZE CALIBRATION. The calibration can be done in different ways, although it must always be done with an object in which we know the exact distance between 2 points under the microscope. 15 The following calibration elements can be used among others. 20 25 30 1) Standard microscope calibration plate. It comes standard with some commercial microscopes. It is a plate where a pattern with lines is printed, where the distance between the lines is known. 2) A Neubauer camera, Thoma camera, Neubauer Improved camera, disposable camera or any other type of camera of known depth. In this type of cameras, a grid / grid appears under the microscope in the central part. This grid has historically been used as a reference to perform manual counts in the microscope. The distances and dimensions of the grid are as a rule written on the top of the chamber. 3) Other systems. System calibration can be performed with any system, as long as the exact distance between 2 visible points under the microscope is known. (B) DEFINITION OF THE BIOLOGICAL PROFILE. The calibration of the biological profile determines the morphological characteristics of size, shape, texture, color and / or absorbance in the visible spectrum (or invisible depending on the image capture), and contrast in the sample.
The calibration of the biological profile is always carried out after the calibration in size, since to perform this calibration we must know the distances of the elements that we are visualizing on the screen, in order to select the range of maximum and minimum geometric parameters of the biological elements that The 5 system will count. In the biological profile, the user selects the characteristics of the elements of the image he wishes to count. 10 -Sensitivity (value between 1 and 100). Determine the minimum contrast that the body or edge of the biological element (cell or equivalent) must have to be considered valid for counting. If we select a sensitivity that is too high, the system will capture foreign elements from the image, such as dirt from the camera or microscope, artifacts, etc. 15 Producing false positives (detections of elements where there should not be any) 20 If we select too low sensitivity, the system will ignore elements of the image that should be taken into account in the count. Producing false negatives (no detection of elements where there should be). -Geometric parameters (24): Determine the size (maximum length, minimum length, perimeter, area or coincidence with a preset contour pattern) that the biological element must have to be taken into account in the count (25). 25 -Calibrated by color / light absorbance: This filter determines the range of colors acceptable for counting the elements. For example, if the color red is selected for the cells, because it is desired to count only the cells that have absorbed a red dye, the system will ignore the cells / elements that are of colors very different from the red, and will count the elements of the hue of selected red, as well as 30 of similar and similar shades (next in the color spectrum, and of frequencies) Profile filters can be activated or deactivated. If the profile filter is deactivated, the elements will not be discriminated according to profile feature 35. For example, if the color filter is off, the system will ignore the color
when considering the elements for counting, counting all the elements of the image that meet the rest of the filters, and ignoring the color. -Viability: The system allows a specific calibration for the measurement of cell viability (percentage of dead cells over total, live and dead cells). Feasibility measurement may be disabled. The system performs a simple count and provides only the cell concentration in I, or activated, cells, in which case the cell concentration in total Iml cells and the percentage of live cells in the sample will be provided, in percent. 10 In the case of activation of the feasibility measure, the specific color filters must be defined for living (usually white) and dead (blue usually when staining with trypan blue) 15 -Optics used: The user selects the optics used This is necessary to take into account the distances in the image, and make the appropriate adjustments once the initial calibration has been performed. The most common optics in optical microscopes are 4x, 1 Ox, 40x and 100x. 20 -Depth of the chamber I Container: As a rule, commercial cameras (Neubauer, Thoma, etc.) have a standard and known depth, and in addition said depth is written on the surface of the chamber. To perform this calibration, the exact depth 25 of the measuring vessel in mm must be entered into the system. The most common depths are 0.1 mm and 0.2 mm. 30 It is therefore independent of the microscope used, the camera (image capture) and the biological samples to be measured. TYPE OF COUNT [automatic] vs [semi-assisted] In cases where the nature of the images or the type of cell to be counted does not allow automatic counting with sufficient reliability, the system allows you to configure a profile for semi-counting -assisted.
In the case where semi-assisted counting is selected in a cellular profile, the system will ignore all the filters described above and will not perform an automatic analysis of the images, but it will be the user who will indicate manually or semi-assisted 5 what a cell considers in each of the images captured on the screen (by pressing with your finger or with the mouse). 10 THE CONFIGURATION OF THE BIOLOGICAL PROFILE STEP BY STEP. While the size calibration characteristics are common and do not vary, as long as the camera (image capturer) and microscope are not changed, the characteristics of the biological profile change with each type of particle or cell to be measured. Therefore the user must define a different biological profile for each type of biological element that he wishes to measure. The system allows the storage of the characteristics defined for each profile in the system memory, for later recovery. 20 Example of profile name: hepatocytes-type-a-10x-viability-Maria. The operations for carrying out the calibration of the biological profile are the following: 1) Preparation of a biological sample of the type of cell / microorganism to be measured 25 2) Introduction into a Neubauer chamber or similar of the sample. If necessary, a dilution has previously been made by inserting a sample with a seeding handle into a test tube. This step is performed to achieve an adequate concentration that allows visual analysis on the screen. It is estimated that the system can perform a calibration if we can visualize on the screen or under a microscope between 1 and 2 cells at least and about 50-100 cells at most. Which corresponds to a concentration of between 200. 000 cel / mi and 10. 000 000 cel / mi (approximately) 3) The Configuration section on the device is selected. 4) A Counting Profile is selected (a series of parameters that will define what has to be counted and what not in each image).
5 10 15 20 5) The parameters corresponding to the type of cell / element we wish to count are selected. 6) In the event that the microscope has dirt, or a part of the image is out of focus due to imperfections in the lens, the part of the screen that supposes a problem through an Exclusion Zone (14) will be eliminated (equivalent to a mask to ignore problem areas). 7) After adjusting the parameters (and eventual exclusion zone configuration), you can visually verify that the system detects the cells in the image by drawing a colored circle (10) on top of each cell. The verification that the system is well calibrated consists of manually counting the cells in the image, and verifying that in all of them the system has drawn an overlapping circle. 8) If not all cells / elements are detected correctly, steps 5,6,7 are repeated until at least 90% -95% of the cells in the image are detected correctly. 9) After the visual check, the microscope is moved and checked with 2 or 3 more images that cell detection is performed correctly. (correct detection of at least 95% of the cells / elements) 10) The profile data is saved, and the system is ready to be able to perform counts with this specific microscope, and with the type of element for which it has been configured . COUNT OF BIOLOGICAL ELEMENTS - AUTOMATIC MODE (WITH SYSTEM 25 PREVIOUSLY CALIBRATED / CONFIGURED). 30 35 Once the system calibration has been carried out (see previous paragraph) and the biological profile of the element we wish to count has been defined, the following steps are taken to make a count. 1) the biological sample is prepared and introduced into the counting vessel (c. Neubauer, Thoma, Howard, Porta + covers, or a proprietary and custom-made container for the system, a camera with special calibration marks, a 24 or 96 well plate, a Petri dish, a culture flask, etc. )
5 10 15 20 25 30 35 2) The PROFILE selected previously in step 1) is selected for this microscope and specific cell type. The images are taken with the digital camera (the corresponding device is used to move the microscope tray, and the touch screen or keyboard to indicate to the system that the image can be captured). A number of images that can vary is captured. Several images are taken to reduce the statistical error (in the same way as in a manual count with Neubauer camera, the custom is to measure 5 quadrants and average them). In our case, taking more images means a minimum effort for the user, which translates into a significant reduction in error. As a general rule, between 5 and 10 images will be taken, although in a next version of the product we intend to take 1 single image with high resolution. If it is desired to reduce the statistical error further, it is possible to take as many images as desired, the statistical error being inversely proportional to the number of images taken. 3) the images are sent to the data processing system (1). 4) In case the images do not have sufficient illumination or excessive illumination, the system will make the appropriate adjustments a. By adjusting the lighting level in the captured image b. Through an adjustment loop, where the process unit sends a signal to the intensity control unit of the light source indicating that the intensity of the light source is increased or decreased. C. Return to point 4 (and iterate until lighting falls within range) d. If it is not possible to perform an automatic adjustment, the user will be informed that the lighting levels are out of range and that the system is out of range for counting.
5 10 5) If the focus level of the images is not adequate, the system will make the appropriate adjustments. to. Through an adjustment loop, where the process unit (1) sends a signal to the focus control unit of the microscope (4) indicating that the microscope approaches or moves away from the sample b. Return to point 4 (and iterate until the focus falls within the range) c. If it is not possible to perform an automatic focus adjustment (because the microscope does not incorporate focus control), the system systematically indicates in each image analyzed the elements it is recognizing, so that if the system is not correctly focused, the user can see on the screen that the cells are not being detected correctly. 15 6) The analysis system processes the images, applying: 20 25 7) 30 35 a. size filters b. filters on the morphology of the object c. filters on the wavelength that the element goes through is reflected by the element. d. filters on the eccentricity of the element (similar to the eccentricity of an ellipse) e. filters on the length of the contour of the object f. filters over the area of the object g. filters on the area to be analyzed (exclusion areas (14)) h. elimination of the "background image (12)" (noise and dirt from the image that remains constant in each image) a. Calculate the number of cells in each image. b. Make an average of them c. Then multiply by the average volume of the image (this average volume is calculated from the calibration in size and the depth of the camera used - detailed in the previously defined biological profile).
The system displays the results of the element count on the screen: The system provides: 5 -Cell or particle concentration per unit volume. It can also provide: -Total number of cells counted on screen. 10 -Degree of cell confluence (cell confluence is the percentage of surface area occupied by cells or particles with respect to the total percentage of the screen). -Percentage of cells of a type or cell profile with respect to the number of total cells. -Percentage of cells of one type or cell profile with respect to the number of cells of another cell profile. 20-Percentage of living cells with respect to total cells. -Percentage of dead cells with respect to total cell. 8) The system stores the samples and images for later reference, generation of growth graphs, etc. The sample of results, images and graphs is carried out through the graphic interface (screen) BIOLOGICAL ELEMENTS-SEMI-ASSISTED MODE (WITH 25 SYSTEM PREVIOUSLY CALIBRATED / CONFIGURED). The system allows semi-assisted counting of elements under a microscope. In this mode of operation the system does not apply any filter defined in the biological profile 30 or perform any automatic image analysis (it is the user himself who performs the counting manually, and his own intelligence that is used to select the cells on the screen). The steps to follow in this case are: 35 1) calibrated in size. (which is done only once for each microscope)
2) definition of the biological profile (in this case only the depth of the camera used and the optics have to be defined) 3) point 2) of the automatic method is performed 4) point 3) of the automatic method is performed. 5 5) the images are taken with the digital camera (the corresponding device 10 15 20 25 is used to move the microscope tray, and the touch screen or keyboard to indicate to the system that the image can be captured). A certain number of images are captured. Several images are taken to reduce the statistical error In semi-assisted mode, after the capture of each image the cells must be marked manually on the screen using the mouse, finger or plastic pencil. Each time a cell has been marked, a semi-transparent circle is drawn on the cell to indicate to the user that the cell has already been counted. 6) The system displays on the screen the cell concentration (case of simple counting) or the cell concentration together with the viability in percentage (in case of counting with viability). The system provides: - Cellular or particle concentration per unit volume. It can also provide: -Total number of cells counted on screen 7) The system stores the samples and images for later reference, generation of growth graphs, etc. The sample of results, images and graphics is done through the graphic interface (screen) 30 In this case the data processing has been limited to the calculation of the cell concentration or to the calculation of the total sum of cells marked by the user in the screen. 35 The calculation of the cell concentration can be done in this case thanks to the innovative system calibration system.
One of the most advantageous innovative components of the system is the coupling to any microscope in the market. This is achieved thanks to the set of the following factors: a. mechanical adaptation, which is done through common mechanical adapters 5, which generally exist in the market b. The size calibration. C. the detection of changes in brightness and brightness settings d. Blur detection and focus adjustment. and. the edge detector, which prevents lighting problems. 10 f. The exclusion zones. 15 The system can also be considered as a whole, together with a specific microscope and precalibrated for the microscope lens set. Numerical references 1 Process unit. 2 Camera 3 Touch screen. 20 4 Microscope. 5 Eyepiece. 6 Sample container. 10 Particle / cell edge. 11 Particle. 25 12 Photography background. 13 Inclusion area. 14 Exclusion area. 21 Image capture. 22 Edge detection. 30 23 Delimitation of areas of possible particles / cells. 24 Filtered according to geometric criteria. 25 count.