ES2396159T3 - Método para identificar inhibidores de ácido lipoteicoico sintasa - Google Patents
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Abstract
Un metodo para identificar un inhibidor de LtaS que comprende: (a) proporcionar bacterias gram positivas en las que las bacterias comprenden una mutacion en el gen mbl uhomologo del mismo que altera la funcion del gen mbl u homologo del mismo; (b) cultivar las bacterias de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menorde 3 mM; (c) supervisar el crecimiento de las bacterias; en el que el crecimiento o crecimiento mas rapido de las bacterias en comparacion con crecimiento en ausencia dela sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS.
Description
Método para identificar inhibidores de ácido lipoteicoico sintasa
La invención se refiere a métodos o ensayos para identificar agentes que pueden usarse como agentes antibacterianos, por ejemplo, como antibióticos.
Se ha mostrado recientemente que el ácido lipoteicoico (LTA) es esencial para la viabilidad de Staphylococcus aureus. También se ha descrito una enzima responsable del ensamblaje de LTA en S. aureus. Esta enzima se ha nombrado ácido lipoteicoico sintasa, LtaS. Véase Gründling y Schneewind, 2007, PNAS 104: 8478-8483.
15 También existen homólogos de LtaS en otras bacterias. Por ejemplo, las cepas de Bacillus expresan un homólogo, previamente denominado yflE. Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente) demostraron que el homólogo de ltaS de Bacillus subtilis puede restaurar la síntesis de LTA y el crecimiento de estafilococos mutantes para ltaS. La inhibición de ltaS puede usarse por lo tanto como una diana para tratar infecciones humanas provocadas por S. aureus u otros patógenos bacterianos. Aunque Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente) sugieren que LtaS podría ser una diana útil para la identificación de inhibidores que podrían usarse como compuestos antibacterianos, no se sugiere ningún método de ensayo específico. El ensayo usado por Gründling y Schneewind para encontrar el gen ltaS no sería fácilmente adaptable para exploración de compuestos.
25 En consecuencia, existe la necesidad de un ensayo para identificar inhibidores de LtaS.
Mbl es un homólogo de actina bacteriano que se cree que tiene un papel en la determinación de la forma celular situando la maquinaria sintética de la pared celular. También se cree que está implicado en el control de otras funciones incluyendo pluralidad celular y segregación de cromosomas en diversos organismos. Bacillus subtilis y muchas otras bacterias gram positivas tienen tres isoformas de actina, una de las cuales es Mbl, que se localiza conjuntamente con otras dos isoformas de actina MreB y MreBH en estructuras helicoidales que abarcan la longitud de la célula, cerca de la superficie interna de la membrana citoplasmática.
Estudios llevados a cabo con Bacillus subtilis han mostrado que los mutantes del gen mbl son inviables a niveles de
35 Mg2+ normales. La aportación de altas concentraciones de Mg2+, por ejemplo, 20 mM, rescata tales cepas de Bacillus. Véase Carballido-López et al., 2006, Developmental Cell 11, 399-409.
Los presentes inventores han identificado que la mutagénesis de transposón puede rescatar mutantes de mbl. En particular, las cepas de Bacillus que comprenden mutaciones de mbl pueden someterse a mutagénesis de transposón y sembrarse en placas en un medio de Mg2+ bajo para identificar y seleccionar mutaciones supresoras que permitan el crecimiento de las bacterias. El análisis de los mutantes de transposón identificó que la inactivación del gen ltaS provoca rescate de mutantes de mbl de modo que tales cepas puedan crecer en condiciones de Mg2+
45 bajo. En consecuencia, los presentes inventores describen ensayos para identificar inhibidores de LtaS identificando sustancias que pueden rescatar el crecimiento de mutantes de mbl en medio de Mg2+ bajo. Estos ensayos son métodos de exploración basados en células fáciles y económicos que posibilitan la exploración de un gran número de compuestos de una manera sencilla.
Por lo tanto, de acuerdo con los primeros aspectos de la presente invención, se proporciona un método para identificar un inhibidor de LtaS que comprende:
(a) proporcionar una bacteria gram positiva que comprende una mutación en el gen mbl u homólogo del mismo que interrumpe la función del gen mbl u homólogo del mismo;
55 (b) cultivar la bacteria de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menor de 3 mM;
(c) supervisar el crecimiento de las bacterias;
en el que en el crecimiento o el crecimiento más rápido de las bacterias en comparación con crecimiento en ausencia de la sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS.
Figura 1 -B. subtilis Δmbl depende de Mg2+
65 A. Eficacia de siembra después de transformación seleccionando deleción de mbl con (izquierda) y sin (derecha) adición de Mg2+ 20 mM. B. Curva de crecimiento de B. subtilis de tipo silvestre (triángulos) y mutante de mbl
(cuadrados) a 37 ºC en medio PAB sin (símbolos cerrados) y con (símbolos abiertos) adición de Mg2+ 20 mM. C-E. Morfología (microscopía de contraste de fases) de B. subtilis Δmbl cultivado en PAB (C) o en PAB complementado con Mg2+ 20 mM (D) en comparación con una cepa de tipo silvestre cultivada en PAB (E). Barra de escala 5 μm.
5 Figura 2 -La deleción de ltas suprime la dependencia de Mg2+ de mutantes de mbl:
A. Crecimiento de tipo silvestre (168), mutante de mbl (2505), mutante de ItaS (4283) y mutante de mbl suprimido (Δmbl ΔltaS, 4298) en placas NA con (izquierda) o sin (derecha) adición de Mg2+ 20 mM. B. Curvas de crecimiento de tipo silvestre (168, ♦), mutante de mbl (2505, ■), mutante de ltaS (4283, A) y mutante de mbl suprimido (Δmbl
10 ΔltaS, 4298, O) en medio PAB a 37 ºC. C. Microscopía de contraste de fases de tipo silvestre (168), mutante de mbl (2505), mutante de ItaS (4283) y doble mutante de mbl ItaS (4298) cultivados en medio PAB a 37 ºC. Barra de escala 5 μm.
15 A. Crecimiento de tipo silvestre (168) y mutante de ItaS (cepa 4286) a 37 ºC en placas NA sin aditivos (izquierda) que contienen Mg2+ 0,5 mM (medio) o con adición de Mn2+ 0,05 mM (derecha). B. Crecimiento de mutante de ItaS (cepa 4283, izquierda) y tipo silvestre (cepa 168, derecha) en placas de medio mínimo que contienen Mg2+ 10, 100 y 500 μM según se indica.
La Tabla 4 a continuación expone las secuencias de los genes como se analizan en más posteriormente.
SEC ID Nº: 1 y 2 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de yflE de Bacillus subtilis. 25 SEC ID Nº: 3 y 4 son las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de mbl de Bacillus subtilis.
La presente invención proporciona un método para la identificación de un inhibidor de LtaS. LtaS es una ácido
30 lipoteicoico sintasa. LtaS de Staphylococcus aureus se ha identificado en la técnica anterior y se describe por ejemplo en Gründling y Schneewind (mencionado anteriormente). También se conocen homólogos de este gen en otras cepas bacterianas. Por ejemplo, Bacillus subtilis porta un homólogo previamente identificado como yflE. La secuencia para este gen se expone en SEC ID Nº: 1 y 2.
35 De acuerdo con la presente invención se proporciona una cepa bacteriana de bacterias gram positivas, preferiblemente Bacillus, preferiblemente B. subtilis. La cepa bacteriana se selecciona o modifica para incluir una mutación funcional en el gen mbl de B. subtilis o un homólogo del mismo de otras bacterias gram positivas. Mbl es un homólogo de actina y se ha descrito previamente, por ejemplo, en Abhayawardhane y Stewart, 1995, J. of Bacteriol. 177: 765-773 y Jones et al., Cell 104, 2001, 913-922.
40 Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para Mbl se exponen en la Tabla 4, y se marcan como SEC ID Nº: 3 y 4 respectivamente. Típicamente, un homólogo de mbl de otra bacteria es uno que tiene más de aproximadamente 50%, 55% o 65% de identidad, preferiblemente al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y particularmente preferiblemente al menos 95%, al menos 97% o al menos 99% de identidad, con la secuencia de aminoácidos de
45 SEC ID Nº: 4. Tales variantes pueden incluir variantes alélicas. La identidad de variantes de SEC ID Nº: 4 puede medirse sobre una región de al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 330 o más aminoácidos contiguos de la secuencia mostrada en SEC ID Nº: 4 o más preferiblemente a lo largo de la longitud completa de SEC ID Nº: 4.
50 La identidad de aminoácidos puede calcularse usando cualquier algoritmo adecuado. Por ejemplo el paquete UWGCG proporciona el programa BESTFIT que puede usarse para calcular la homología (por ejemplo usado en sus ajustes por defecto) (Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Research 12, 387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST pueden usarse para calcular la homología o alinear secuencias (tal como identificar secuencias bivalentes o correspondientes (típicamente en sus ajustes por defecto)), por ejemplo como se describe en Altschul S. F. (1993) J
55 Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S. F. et al. (1990) J Mol Biol 215: 403-10.
Está disponible software para realizar análisis de BLAST públicamente a través del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (http://www.ncbl.nlm.nlh.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta que 60 coinciden o satisfacen alguna puntuación umbral de valor positivo T cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se denomina el umbral de puntuación de palabra de cercanía (Altschul et al., mencionado anteriormente). Estos aciertos de palabra de cercanía iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP que los contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia tanto como pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. 65 Las extensiones para los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineamiento
acumulativa queda fuera de la cantidad X de su valor máximo conseguido; la puntuación acumulativa llega a cero o menos, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se alcanza el final de una de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLAST usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación
5 BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10915-10919), alineamientos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=4 y una comparación de ambas cadenas.
El algoritmo BLAST realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; véase por ejemplo, Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5873-5787. Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la mínima probabilidad de suma (P(N)), que proporciona un indicio de la probabilidad con la que se produciría por azar una coincidencia entre dos secuencias polinucleotídicas o de aminoácidos. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la menor probabilidad de suma en la comparación de la primera secuencia con la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y más preferiblemente menor de aproximadamente
15 0,001.
La mutación funcional puede ser cualquier mutación que altere la función del gen mbl. Las mutaciones adecuadas incluyen mutaciones que interrumpen la fase abierta de lectura de modo que no puede expresarse una proteína Mbl funcional. Como alternativa, la mutación puede comprender una inserción, por ejemplo, por mutagénesis de transposón para alterar la expresión del gen. En una realización, se suprime parte de o todo el gen mbl. Típicamente, cuando se suprime el gen, se suprime al menos el 50% del gen mbl, por ejemplo, al menos el 60%, 70%, 80%, 90% o 95%. Pueden incluirse deleciones más pequeñas, por ejemplo, deleciones de una base para interrumpir la fase abierta de lectura o deleciones más pequeñas, por ejemplo en la región codificante N-terminal de modo que ya no se exprese una proteína funcional. Otras mutaciones que pueden incorporarse son las mutaciones
25 que provocan sustituciones de aminoácidos en sitios críticos en la proteína, tales como las requeridas para unión de ATP. Puede usarse cualquier mutación en o cerca del gen mbl que genere un fenotipo en el que las células se hagan más dependientes de altas concentraciones de Mg2+ en el medio de crecimiento.
Los mutantes de mbl dependen de Mg2+ para su crecimiento. Por lo tanto, los mutantes mbl útiles de acuerdo con la presente invención son inviables o crecen poco en condiciones de Mg2+ bajo. La complementación del medio de cultivo con Mg2+ restaura el crecimiento celular a tales mutantes bacterianos.
Las mutaciones funcionales en el gen mbl pueden romper la función del gen de modo que ya no se exprese una proteína funcional. Por lo tanto, tales mutaciones pueden afectar a la segregación de los cromosomas o al
35 posicionamiento de la maquinaria sintética de pared celular. La identificación de mutantes adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo a través de un análisis simple de la capacidad de tales mutantes para crecer con Mg2+ bajo o normal. Como se ha explicado anteriormente, los mutantes de mbl dependen de Mg2+ para su crecimiento. Los métodos de ensayo de acuerdo con la presente invención usan niveles altos de Mg2+, y por lo tanto, un mutante adecuado para su uso de acuerdo con la presente invención es uno en el que una mutación del gen mbl conduce a una bacteria que es inviable, o que crece poco en condiciones de Mg2+ bajo, por ejemplo, en las que el tiempo de duplicación de un mutante tal a concentraciones de magnesio de menos de 5 mM es típicamente mayor de 12 horas o mayor de 24 horas.
De acuerdo con los métodos de ensayo de la presente solicitud, las cepas mutantes de mbl se cultivan en
45 condiciones de Mg2+ bajo en presencia de una sustancia de ensayo. Una sustancia de ensayo que actúa como un inhibidor de LtaS restaura la viabilidad de las cepas bacterianas en tales condiciones de Mg2+ bajo.
Antes de llevar a cabo los métodos de ensayo de la presente invención, en presencia de una sustancia de ensayo, las cepas mutantes de mbl pueden cultivarse en condiciones de Mg2+ alto o complementado, de modo que las bacterias puedan crecer en estas condiciones. Típicamente, para crecimiento bacteriano de mutantes de mbl, Mg2+ está presente en el intervalo de 1 a 100 mM, preferiblemente 3 mM a 50 mM, preferiblemente 5 mM a 30 mM. Por ejemplo, el medio de crecimiento puede complementarse con Mg2+ aproximadamente 20 mM. Para el fin de un ensayo, y la compleción del ensayo en un periodo de tiempo conveniente, puede usarse cualquier medio que soporte una tasa de crecimiento razonable del mutante de mbl (por ejemplo tiempo de duplicación mayor de 120
55 minutos a 37 ºC).
Típicamente, un cultivo bacteriano de un mutante de mbl cultivado en condiciones de Mg2+ alto puede diluirse y situarse en un pocillo de muestra. Como alternativa, dichas bacterias pueden sembrarse en placas adecuadas con medio de crecimiento apropiado tales como placas de agar, en condiciones de Mg2+ bajo. Las referencias a condiciones de Mg2+ bajo se refieren a concentraciones de magnesio de menos de 3 mM, típicamente menos de 1 mM. Típicamente, las bacterias pueden cultivarse en medio de cultivo que no se ha complementado con Mg2+. Por lo tanto, una vez que las bacterias mutantes de mbl se han diluido o sembrado en placas en condiciones de Mg2+ bajo, su crecimiento se ralentizará o se detendrá.
65 También puede identificarse condiciones de Mg2+ bajo y definirse con respecto a cultivos bacterianos complementados con Mg2+ 20 mM. Por ejemplo, puede usarse una concentración de Mg2+ que conduzca a una tasa de crecimiento de menos del 50%, típicamente menos del 20% o menos del 10% de la tasa de crecimiento de mutantes de mbl cultivados en medio 20 mM para identificar condiciones de Mg2+ bajo adecuadas para realizar los ensayos de acuerdo con la presente invención.
5 Para llevar a cabo los ensayos de la presente invención, se añaden sustancias de ensayo a las bacterias mutantes de mbl que crecen en condiciones de Mg2+ bajo. Por ejemplo, pueden añadirse sustancias de ensayo a los pocillos de muestra o aplicarse puntualmente en placas
De acuerdo con los ensayos de la presente invención, el crecimiento bacteriano de los mutantes de mbl se supervisa
10 en presencia de la sustancia de ensayo. Típicamente, las bacterias se cultivan en condiciones de temperatura y tiempo habituales, por ejemplo, entre 30 y 45 ºC, típicamente 37 ºC. Los niveles de crecimiento bacteriano pueden medirse en un punto temporal definido, por ejemplo, después de 2 horas, 4 horas, 6 horas, 8 horas, 12 horas o 24 horas. Como alternativa, el crecimiento bacteriano puede supervisarse a intervalos regulares por ejemplo cada 15 minutos, 30 minutos, cada hora, cada 2 horas o cada 4 horas. Como alternativa, el crecimiento bacteriano puede
15 supervisarse de forma continua.
El crecimiento bacteriano puede medirse por cualquier método adecuado. Típicamente, puede llevarse a cabo evaluación visual o de densidad óptica del crecimiento de las bacterias. Otros métodos adecuados incluyen el uso de un colorante que genera un cambio de color durante el crecimiento (por ejemplo, debido a cambio de pH), 20 centrifugación seguida de medición de masa húmeda, secado seguido de medición de masa seca, determinación química de un componente macromolecular de células, tal como ADN o proteína, o recuento del número de células por microscopía o mediante un dispositivo electrónico tal como un contador Coulter o citómetro de flujo, recuento de células viables por dilución y siembra en placas en un medio de crecimiento adecuado, complementado con Mg2+. La medición del crecimiento bacteriano identifica los mutantes cuyo crecimiento se ha rescatado a pesar de las
25 condiciones de Mg2+ bajo. La capacidad de una sustancia de ensayo para rescatar tal crecimiento identifica la sustancia de ensayo como un inhibidor de LtaS.
Una vez que se ha identificado un agente con un inhibidor de LtaS, puede llevarse a cabo estudios adicionales, por ejemplo, para evaluar si dicho agente es específico para LtaS. Típicamente, tales sustancias de ensayo pueden
30 formularse como composiciones farmacéuticas para administración posterior como antibióticos.
Pueden usarse agentes identificados de acuerdo con la presente invención como antibióticos contra bacterias gram positivas, y en particular las que comprenden LtaS o un homólogo de la misma. Tales agentes son útiles en el tratamiento de infección por Staphylococcus aureus. Tales agentes pueden usarse solos o en combinación con otros
35 antibióticos.
Se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una diversidad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, vía de administración, tasa de excreción, combinación farmacológica y la
40 gravedad de la enfermedad particular para la que se realiza el tratamiento. Los niveles de dosis y frecuencia de dosificación óptimos se determinarán por ensayo clínico, pero una dosificación ejemplar sería de 0,1-1000 mg por día.
Los compuestos identificados de acuerdo con la presente invención pueden prepararse para administración por
45 cualquier vía coherente con sus propiedades farmacocinéticas. Las composiciones administrables por vía oral pueden estar en forma de comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, grageas, preparaciones líquidas o en gel, tales como soluciones o suspensiones orales, tópicas o parenterales estériles. Los comprimidos y cápsulas para administración oral pueden estar en forma de presentación de dosis unitaria, y pueden contener excipientes convencionales tales como agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, goma arábiga, gelatina, sorbitol, goma de
50 tragacanto o polivinilpirrolidona; cargas, por ejemplo lactosa, azúcar, almidón de maíz, fosfato cálcico, sorbitol o glicina; lubricante de formación de comprimidos, por ejemplo, estearato de magnesio, talco, polietilenglicol o sílice; disgregantes, por ejemplo almidón de patata, o agentes humectantes aceptables tales como lauril sulfato sódico. Los comprimidos pueden recubrirse de acuerdo con métodos bien conocidos en la práctica farmacéutica normal. Las preparaciones líquidas orales pueden estar en forma de, por ejemplo, suspensiones, soluciones, emulsiones,
55 jarabes o elixires acuosos u oleosos, o pueden presentarse como un producto seco para reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Tales preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales tales como agentes de suspensión, por ejemplo sorbitol, jarabe, metilcelulosa, jarabe de glucosa, grasas comestibles hidrogenadas de gelatina; agentes emulsionantes, por ejemplo lecitina, sorbitán monooleato o goma arábiga; vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles), por ejemplo aceite de almendra, aceite de coco
60 fraccionado, ésteres oleosos tales como glicerina, propilenglicol o alcohol etílico; conservantes, por ejemplo metil o propil p-hidroxibenzoato o ácido sórbico, y si se desea agentes saporíferos o colorantes convencionales.
El principio activo también puede administrarse por vía parenteral en un medio estéril. Dependiendo del vehículo y concentración usados, el fármaco puede estar suspendido o disuelto en el vehículo.
65 La invención se describe a continuación en este documento en más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1
El homólogo de actina Mbl se ha descrito como no esencial en B. subtilis (Abhayawardhane y Stewart, 1995; Jones et al, 2001), pero los anteriores autores ya habían indicado que los mutantes de mbl crecen lentamente y tienden a captar mutaciones que potencian el crecimiento. La dependencia de Mg2+ indicada de mutantes tanto mreB (Formstone y Errington, 2005) como (aunque solo a niveles bajos) mreBH (Carballido-López et al., 2006) condujo a los inventores a reconstruir la cepa de deleción de mbl en presencia de Mg2+ 20 mM. La selección de transformantes en estas condiciones dio como resultado un aumento de 10 veces de la eficacia de siembra dando colonias relativamente pequeñas pero de forma uniforme (Figura 1A). Las colonias que se seleccionaron continuaron creciendo en placas de Agar Nutriente complementadas con Mg2+, pero no crecieron en placas no complementadas
15 (Figura 3A). En cultivo líquido (medio PAB) una concentración de magnesio elevada mejoró de nuevo en gran medida la tasa de crecimiento (Figura 1B). El examen microscópico de células de tipo silvestre y mutantes reveló la morfología enrollada e hinchada característica del mutante en el medio no complementado (Figura 1C). Sin embargo, en presencia de Mg2+, la morfología celular mejoró en gran medida (Figura 1D). No obstante, en condiciones de Mg2+ alto las células mutantes de mbl aún diferían del tipo silvestre de dos maneras: en primer lugar, estaban ligeramente curvadas y tenían forma irregular; en segundo lugar, su diámetro medio era aproximadamente 12% mayor (Tabla 1). Las células de tipo silvestre tenían su morfología de bastón recto típica en ambas condiciones (no mostrado).
25 Para obtener información sobre la función de Mbl los inventores exploraron con respecto a mutantes en los que la dependencia de Mg2+ del mutante se suprimió. El plásmido pMarB que portaba el transposón mariner (Le Breton et al., 2006) se introdujo en un fondo de cepa Δmbl de nueva construcción en presencia de Mg2+ 20 mM. Se sembró en placas una biblioteca de aproximadamente 60.000 mutantes con selección con respecto al crecimiento independiente de Mg2+. La pérdida del plásmido pMarB (ErmR), presencia del transposón (KanR) e interrupción de mbl (SpcR) se verificaron mediante parcheado en placas complementadas con antibióticos apropiados. Se seleccionaron diez cepas supresoras fuertes y se comprobaron con respecto a unión de la inserción del transposón con el fenotipo de supresión mediante tres retrocruces consecutivos en el fondo del mutante Δmbl. Los sitios de inserción de transposón se determinaron mediante secuenciación de los productos de reacciones PCR inversa
35 usando los cebadores IPCR1-3 (Le Breton et al., 2006).
En dos de las diez cepas supresoras, se descubrió que el transposón se había insertado de forma independiente en el gen rsgl (previamente ykrl). Rsgl actúa como un factor anti-sigma para Sigl (Asai et al., 2007). Otro acierto en la exploración fue en yflE (tres inserciones independientes), que codifica un homólogo de la ácido lipoteicoico sintasa LtaS de S. aureus (Gründling y Schneewind, 2007). Se descubrieron dos inserciones independientes en ylxA (sinónimos yllC o mraW) que queda en un operón con yllB, ftsL y pbpB y codifica una proteína de función desconocida. Sin embargo, la deleción de ylxA demostró no ser muy potente en la supresión de la dependencia de Mg2+ de B. subtilis Δmbl (no mostrado). Se descubrió una inserción de transposón en cada una en yaaT que codifica una proteína de función desconocida implicada en la cascada de fosfotransferencia durante el inicio de la
45 esporulación (Hosoya et al., 2002), en el gen para el transportador de glutamato GltT (Slotboom et al., 2001; Tolner et al., 1992), y en pnpA que codifica polinucleótido fosforilasa (Luttinger et al., 1996; Mitra et al., 1996; Wang y Bechhofer, 1996).
El hallazgo de que los mutantes de homólogos de actina de B. subtilis MreB y MreBH son sensibles a una concentración de Mg2+ baja (Carballido-López et al., 2006; Formstone y Errington, 2005) condujo a los inventores a reconstruir el mutante de mbl en presencia de altas concentraciones de Mg2+. El aumento de la eficacia de siembra en placas, uniformidad de la forma de las colonias y mejora de la morfología celular recapituló los hallazgos
55 anteriores realizados para los mutantes de mreB y mreBH. Sin embargo, los mutantes varían en los niveles óptimos de Mg2+: el mutante de mreBH requiere solamente Mg2+ aproximadamente 100-200 μM para viabilidad y las células presentan una anchura celular reducida (Carballido-López et al., 2006); el mutante de mreB tiene un requisito mayor de Mg2+ (2,5 mM) y el agotamiento del catión da como resultado un aumento del diámetro celular y en última instancia lisis (Formstone y Errington, 2005); finalmente, el mutante de mbl de nueva construcción requiere adición de Mg2+ aproximadamente 3 mM que está en un intervalo similar del mutante de mreB previamente descrito. En medio no complementado la cepa crece lentamente, las células tienden a enrollarse, formar cadenas, hincharse a lo largo de su longitud y son propensas a lisis.
En un fondo por lo demás de tipo silvestre, el único mutante doble viable fue Δmbl ΔmreBH, que tiene un fenotipo 65 similar al de un mutante sencillo de mbl. Las combinaciones con ΔmreB fueron letales, y el agotamiento de MreB en
fondos mutantes de mbl o mreBH condujo a una pérdida de forma de bastón y muerte celular (Defeu Soufo y Graumann, 2006; A. Formstone y J. Errington, no publicado) independientemente de los niveles de Mg2+. Por lo tanto, las tres proteínas de tipo MreB parecen tener funciones solapantes, debido a que mreB es esencial en cepas suprimidas con respecto a cualquiera de los otros dos homólogos. Sin embargo, aunque los tres mutantes
5 comparten ciertas características como la dependencia de Mg2+ y los efectos en la forma celular, las diferencias fenotípicas entre los mutantes sencillos muestran que cada uno tiene una función parcialmente diferenciada.
10 Se enumeran cepas de B. subtilis y plásmidos usados en el presente estudio en la Tabla 2, oligonucleótidos en la Tabla 3.
15 Se dejaron crecer cultivos líquidos de cepas de B. subtilis en Medio Antibiótico de Difco 3 (PAB) a 37 o 50 ºC según se indique. Se usaron placas de agar nutriente (Oxoid) para crecimiento en medio sólido. Las concentraciones mínimas de Mg2+ requeridas para el crecimiento se determinaron en Agar Nutriente o Medio de Sales Modificadas (Carballido-López et al., 2006). Se añadió MgSO4 a todos los medios a la concentración final indicada de Mg2+. Se llevaron a cabo manipulaciones de ADN y transformaciones de E. coli DH5α usando métodos convencionales
20 (Sambrook, 1989). Se transformaron cepas de B. subtilis de acuerdo con el método de Anagnostopoulos y Spizizen (1961) como se modificó por Jenkinson (1983). La selección de transformantes de B. subtilis se llevó a cabo en agar nutriente (Oxoid), complementado con antibióticos, según se requirió, con: kanamicina (5 mg ml-1), cloranfenicol (5 mg ml-1), eritromicina (1 mg ml-1), lincomicina (25 mg ml-1) y/o espectinomicina (50 mg ml-1). Se añadió IPTG (1 mM) según se indica.
Se realizó mutagénesis de transposones aleatoria usando el transposón basado en mariner tnYLB-1 como se ha descrito anteriormente (Le Breton et al., 2006). Brevemente, el plásmido pMarB se introdujo en una cepa mutante de 30 mbl (2505) a 30 ºC en presencia de concentraciones de Mg2+ altas. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron en medio LB a 37 ºC durante 8 h, y después se sembraron en placas de agar nutriente no complementado con Mg2+ pero que contenía kanamicina para seleccionar las inserciones de transposón creando cepas independientes de Mg2+. Se seleccionaron colonias individuales y se comprobó la deleción de mbl (spcr), integración del transposón tnYLB-1 (neor) y pérdida del plásmido (erms) por parcheado en placas que contenían el antibiótico
35 apropiado. La unión entre la inserción de transposón y la independencia de Mg2+ se verificó mediante retrocruzamiento de ADN cromosómico de colonias sencillas tres veces en un fondo mutante de mbl. Se seleccionaron tres supresores fuertes y se determinó el sitio de inserción del transposón mediante amplificación por PCR inversa y secuenciación como se ha descrito previamente (Le Breton et al., 2006).
Se amplificaron por PCR regiones cromosómicas de aproximadamente 2,5 -3 kb que flanqueaban el gen o los genes para suprimir usando cebadores mbl-A/mbl-B y mbl-C/mbl-D para la deleción de mbl. Estos productos de PCR se ligaron después con un casete de resistencia a antibióticos (cat de pCotC; Veening et al., 2006) y después se
45 volvieron a amplificar usando los cebadores externos B + D. La transformación de los productos de PCR resultantes en B. subtilis 168 con selección del antibiótico adecuado dio lugar después a cepas en las que el gen diana se sustituye por un casete de resistencia a antibióticos. La deleción del gen e inserción del casete de resistencia se verificó mediante PCR.
Para microscopía, se diluyeron células a partir de un cultivo líquido o sólido durante una noche en medio PAB complementado con MgSO4 20 mM cuando se requirió y se cultivaron a 37 ºC o 50 ºC. Las células se montaron en portaobjetos de microscopio cubiertos con una película delgada de agarosa 1% en medio mínimo (Glaser et al., 55 1997). Se consiguió tinción de la membrana mezclando 2 μl de solución de Rojo Nilo (Molecular Probe) (12,5 mg ml1) con 600 μl de agarosa en el portaobjetos. Los nucleoides se tiñeron mezclando 8 μl de la suspensión celular con 2 μl de solución de DAPI (Sigma) (1 mg ml-1 en glicerol 50%) en un tubo Eppendorf antes de montar la muestra en el portaobjetos cubierto con agarosa. Se adquirieron imágenes con una cámara CCD enfriada 14 Sony CoolSnap HQ (Roper Scientific) unida a un microscopio Zeiss Axiovert M135 o a un microscopio Zeiss 15 Axiovert 200M. Se usó
60 ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/) para analizar las imágenes, la manipulación se limitó a alterar el brillo y el contraste para obtener impresiones óptimas.
Tabla 1. Dimensiones celulares de cepas de tipo silvestre y mutantes
Cepa Genotipo relevante Temperatura Mg2+ añadido Diámetro medio (± DT)
168 37 ºC 0,92 (0,07) 168 37 ºC 20 mM 0,91 (0,07) 168 50 ºC 0,97(0,10) 2505 Δmbl 37 ºC 20 mM 1,00 (0,09) 2505 Δmbl 50 ºC 1,12 (0,12)
Los cultivos se dejaron crecer en medio PAB en las condiciones indicadas.
Tabla 2. Cepas bacterianas y plásmidos
Cepa/plásmi
Genotipo relevante Referencia/construcción
do
B. subtilis 168 trpC2 reserva de laboratorio 3728 trpC2 Ωneo3427Δ mreB Formstone y Errington, 2005 2505 trpC2 Ω(mbl::σπχ) (Jones et al., 2001) 4261 trpC2 Δmbl:: χατ el presente trabajo 4283 trpC2 ΔltaS::νεο el presente trabajo 4284 trpC2 ΔltaS:σπχ el presente trabajo 4285 trpC2 ΔltaS::χατ el presente trabajo 4286 trpC2 ΔltaS::ερμ el presente trabajo 4298 trpC2 Ω(mbl::σπχ)ΔltaS::νεο el presente trabajo
Plásmidos PMarB bla erm Pctc-Himar1 kan (TnYLB-1) Le Breton et al., 2006 pBEST501 bla neo Itaya et al., 1989 pVK71 bla neor::spc Chary et al., 1997 PMUTIN4 bla erm Pspac-lacZ lacl Vagner et al., 1998 pCotC-GFP bla cat PcotC-cotC-gfp Veening et al., 2006
pLOSS* Bla spc Pspac-mcs P div lVA-lacZ lacl reppLS20 Claessen et al., 2008
Nombre Secuencia Descripción
IPCR1 GCTTGTAAATTCTATCATAATTG Amplificación por IPCR IPCR2 AGGGAATCATTTGAAG GTTGG Amplificación por IPCR IPCR3 GCATTTAATACTAGCGACGCC Secuenciación de ADN por IPCR mbl-A GCTCACTCTAGACCGAGGTCAATACCAATATCC Xbal mbl-B GTGATGAAGCGTCCTATG mbl-C CTGAGCGAATTCCGCAAACTAAGCTGATTTCAC EcoRI mbl-D CCTATATGGCCTGGAAGAC mbl-dir CTCGAGGATCCACCTGGCATTGCCTTCTTG BamHI mbl-inv CATACTGAATTCCATGACACCT GTGCCCGATG EcoRI yflE-A1 CTAGCAGCATGCGTTCGAGCGAAACGATAG Sphl yflE_A2 GTACGGTCTAGAGTTCGAGCGAAACGATAG Xbal
Nombre Secuencia Descripción
yflE-B CATCGTGATTCCGGCACTC yflE-Cl CATCTAGGTACCGAGAGGTTGCCCTCTCC Kpnl yflE_C2 CTAGCTGAATTCGAGAGGTTGCCCTCTCC EcoRI yflE-D CTGCCGTAATGCATGTCAG yflEdir G ACAGTGGATCCCACTTTCTCCCTCATACG BamHI yflEinv CATCCAGAATTCGCAGCTGAGGAATTGAGG EcoRI
Ejemplo 2
La deleción de la LTA sintasa YflE suprime la dependencia de Mg2+ de los mutantes de mbl
5 Los inventores han mostrado anteriormente que los mutantes de mbl no son viables a [Mg2+] bajo y que las mutaciones que suprimen este fenotipo pueden obtenerse fácilmente. En una recogida de mutantes suprimidos inducidos por transposón había tres cepas con inserciones en el gen yflE. El gen de tipo silvestre codifica una proteína de 649 aminoácidos con un peso molecular predicho de 74,2 kDa. La secuenciación de ADN mostró que
10 cada inserción interrumpiría la fase abierta de lectura de yflE, después de los codones 41, 72 y 387, respectivamente. Mientras se estaba realizando el trabajo, (Gründling y Schneewind, 2007) mostraron que un gen cercanamente relacionado (79% idéntico) en Staphylococcus aureus codifica LTA sintasa. También mostraron que el gen yflE de B. subtilis podría complementar el fenotipo letal de ltaS en S. aureus restaurando la síntesis de LTA. Por lo tanto, en lo sucesivo los inventores renombran el gen yflE de B. subtilis como ltaS.
15 Los inventores construyeron una deleción completa del gen ltaS (cepas 4283) y confirmaron que el mutante doble de ltaS mbl (cepa 4298) no es dependiente de Mg2+ (Figura 2). Tanto en placas como en medio líquido (PAB o LB) el mutante doble creció sin Mg2+ añadido (Figura 2A y B), aunque el crecimiento fue más lento que para el cultivo de tipo silvestre. Resulta interesante que la deleción de ltas también contrarrestaba el hinchamiento y enrollamiento
20 típicos de células mutantes de mbl; en su lugar el mutante doble parecía similar al mutante sencillo de ltaS (Figura 2C) (véase posteriormente).
25 El mutante de ltaS también mostró crecimiento alterado dependiendo del medio de crecimiento. Para entender las consecuencias de la pérdida de actividad de LTA sintasa los inventores caracterizaron el crecimiento del mutante en una serie de condiciones. El mutante tenía una tasa de crecimiento lenta en medio rico tal como PAB (véase posteriormente) y no crecía en absoluto en medio CH o S. El análisis sistemático de los efectos de los componentes de estos medios añadidos a PAB mostró que la cepa mutante era particularmente sensible a niveles elevados de
30 Mn2+. En los ejemplos mostrados en la Figura 3A, la adición de MnSO4 0,05 mM a agar nutriente (NA) suprimió el crecimiento del mutante, mientras que el crecimiento del tipo silvestre no se vio afectado. La adición de Mg2+ 0,5 mM no tuvo ningún efecto en el crecimiento del mutante, lo que muestra que el efecto no era una sensibilidad general a cationes divalentes. Por otro lado los inventores observaron que en placas de medio mínimo con concentraciones de Mg2+ definidas el mutante de ltaS crecía a concentraciones de Mg2+ menores que la cepa de tipo silvestre (Figura
35 3B). La menor necesidad de Mg2+ podría ser la razón por la que una deleción de ltaS suprime el fenotipo dependiente de Mg2+ de mutantes de mbl y mreB (Formstone y Errington, 2005). Los inventores proponen que, de forma coherente con funciones previamente sugeridas de LTA en la eliminación de iones de Mg2+ (Neuhaus y Baddiley, 2003), la ausencia de LTA (sintetizado por LtaS) conduce a una pérdida de una zona de tamponamiento alrededor de la envoltura bacteriana. Como consecuencia los iones tienen un acceso más inmediato a la célula, lo
40 que conduce a menores requisitos de iones con alta afinidad tales como Mg2+, que es un cofactor en muchas enzimas bacterianas. Al mismo tiempo, la toxicidad de los iones de Mn2+ aumenta: estos pueden reemplazar Mg2+ debido a sus propiedades químicas similares pero no participan correctamente en la función enzimática (Cowan, 1995). Estos resultados proporcionan pruebas directas de que LTA tiene un papel principal en la fisiología de la pared celular y en particular para proporcionar un ambiente fisicoquímico que favorece la retención de Mg2+ frente a
45 Mn2+.
En el proceso de construcción de la cepa de deleción, los inventores observaron que el mutante de ltaS también era hipersensible a diversos antibióticos y lisozimas. Por ejemplo, el crecimiento del mutante de ltaS (cepa 4285) se suprimió a kanamicina 0,5 μg/ml, una concentración que no tenía ningún efecto discernible en el crecimiento de
50 células de tipo silvestre. En otros experimentos en medio sólido la zona de inhibición de todos los antibióticos ensayados (kanamicina, ampicilina, vancomicina, penicilina, espectinomicina, eritromicina, lincomicina, carbenicilina) era más amplia para el mutante de ltaS que para el tipo silvestre (no mostrado). Finalmente, el mutante también mostró susceptibilidad aumentada a lisozima (no mostrado). El aumento general de la sensibilidad del mutante a antibióticos y lisozima es coherente con la noción de que LTA también proporciona una capa protectora que
55 restringe el acceso de muchos agentes bioactivos a sitios sensibles en la envoltura celular.
Se enumeran cepas de B. subtilis y plásmidos usados en el presente estudio en la Tabla 2 (anteriormente).
5
Se dejaron crecer cultivos líquidos de cepas de B. subtilis en Medio Antibiótico de Difco 3 (PAB), medio CH (Nicholson & Setlow, 1990), o medio S (Karamata & Gross, 1970) a 37 ºC. Se usaron placas de agar nutriente 10 (Oxoid) para cultivo en medio sólido, se prepararon placas de Medio de Sales Modificadas con concentraciones de Mg2+ definidas como se ha descrito previamente (Carballido-López et al, 2006). La concentración dada de Mg2+ se consiguió mediante adición de MgSO4 al medio. Se transformaron cepas de B. subtilis y manipulaciones de ADN de acuerdo con el método de Anagnostopoulos y Spizizen (1961) como se modificó por Jenkinson (1983). Se llevó a cabo selección de transformantes de B. subtilis en agar nutriente (Oxoid), complementado con antibióticos, según se
15 requirió, con: kanamicina (5 mg ml-1), cloranfenicol (5 mg ml-1), eritromicina (1 mg ml-1), lincomicina (25 mg ml-1) y/o espectinomicina (50 mg ml-1). Para ensayar la sensibilidad a cationes, se dejaron crecer cultivos hasta fase de crecimiento semiexponencial en medio PAB, después se resuspendieron en PBS hasta una DO600 de 1,0. Se aplicaron puntualmente 10 μl de diluciones 10-1 a 10-6 en PBS en placas NA que contenían MnSO4 o MgSO4 en las concentraciones indicadas.
Se realizó mutagénesis de transposones aleatoria usando el transposón basado en mariner tnYLB-1 como se ha descrito anteriormente (Le Breton et al., 2006). En resumen, el plásmido pMarB se introdujo en una cepa mutante de 25 mbl (2505) a 30 ºC en presencia de concentraciones altas de Mg2+. Se seleccionaron colonias individuales, se cultivaron en medio LB a 37 ºC durante 8 h y después se sembraron en placas de agar nutriente no complementado con Mg2+ pero que contenía kanamicina para seleccionar las inserciones del transposón creando cepas independientes de Mg2+. Se seleccionaron colonias individuales y se comprobó la deleción de mbl (spcr), integración del transposón tnYLB-1 (neor) y pérdida del plásmido (erms) por parcheado en placas que contenían el antibiótico
30 apropiado. Se verificó la unión entre la inserción del transposón y la independencia de Mg2+ mediante retrocruzamiento de ADN cromosómico de colonias sencillas tres veces en un fondo mutante de mbl. Se seleccionaron diez supresores fuertes y se determinó el sitio de inserción del transposón mediante amplificación por PCR inversa y secuenciación como se ha descrito previamente (Le Breton et al., 2006).
Los genes se suprimieron reemplazando la secuencia codificante con marcadores de resistencia a antibiótico. Por lo tanto, se amplificaron aproximadamente 2500 pb cadena arriba y abajo de los genes diana usando los cebadores yflE-A/yflE-B e yflE-C/yflE-D para la deleción de yflE, se ligaron al casete de resistencia deseado y después se
40 transformó B. subtilis 168 con el producto de ligación, se seleccionaron transformantes en el antibiótico apropiado y se verificaron por PCR. Se derivaron casetes de resistencia mediante restricción o amplificación por PCR a partir de plásmidos [cat de pCotC (Veening et al., 2006); erm de pMUTIN4 (Vagner et al., 1998); neo de pBEST501 (Itaya et al., 1989); spc de pLOSS* (Claessen et al., 2008)].
Tabla 4. Los nucleótidos subrayados en SEC ID Nº: 1 y 3 indican las secciones codificantes de proteína de cada secuencia
5 Abhayawardhane, Y., y G.C. Stewart. 1995. Bacillus subtilis possesses a second determinant with extensive sequence similarity to the Escherichia coli mreB morphogene. Journal of Bacteriology 177: 765-773. Anagnostopoulos, C. y J. Spizizen. 1961. Requirements for transformation in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 81: 741-746. Asai, K., T. Ootsuji, K. Obata, T. Matsumoto, Y. Fujita y Y. Sadaie. 2007. Regulatory role of Rsgl in sigl
10 expression in Bacillus subtilis. Microbiology 153: 92-101. Carballido-López, R., A. Formstone, Y. Li, S.D. Ehrlich, P. Noirot y J. Errington. 2006. Actin homolog MreBH governs cell morphogenesis by localization of the cell wall hydrolase LytE. Developmental Cell 11: 399-409. Chary, V.K., E.I. Amaya y P.J. Piggot. 1997. Neomycin-and spectinomycin-resistance replacement vectors for Bacillus subtilis. FEMS Microbiology Letters 153: 135-139.
15 Claessen, D., R. Emmins, L.W. Hamoen, R.A. Daniel, J. Errington y D.D. Edwards. 2008. Control of the cell elongation-division cycle by shuttling of PBP1 protein in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 68: 1029-1046. Defeu Soufo, H.J. y P.L. Graumann. 2006. Dynamic localization and interaction with other Bacillus subtilis actinlike proteins are important for the function of MreB. Molecular Microbiology 62: 1340-1356. Formstone, A. y J. Errington. 2005. A magnesium-dependent mreB null mutant: implications for the role of mreB
20 in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology 55: 1646-1657. Glaser, P., M.E. Sharpe, B. Raether, M. Perego, K. Ohlsen y J. Errington. 1997. Dynamic, mitotic-like behavior of a bacterial protein required for accurate chromosome partitioning. Genes Dev. 11: 1160-1168. Gründling, A. y O. Schneewind. 2007. Synthesis of glycerol phosphate lipoteichoic acid in Staphylococcus aureus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104: 8478-8483.
25 Hoper, D., U. Volker y M. Hecker. 2005. Comprehensive characterization of the contribution of individual SigBdependent general stress genes to stress resistance of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 187: 2810-2826. Hosoya, S., K. Asai, N. Ogasawara, M. Takeuchi y T. Sato. 2002. Mutation in yaaT leads to significant inhibition of phosphorelay during sporulation in Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology 184: 5545-5553. Itaya, M., K. Kondo y T. Tanaka. 1989. A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy state in
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LISTADO DE SECUENCIAS
25 <110> UNIVERSITY OF NEWCASTLE UPON TYNE
<120> MÉTODO
<130> N105675A SER 30
<150> GB 0822276.2
<151>
<160> 21 35
<170> Patent In versión 3.5
<210> 1
<211> 2342 40 <212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS 45 <222> (196)..(2192)
<400> 1
<210> 2
<211> 649
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
<210> 3
<211> 1399
5 <212> ADN
<213> Bacillus subtilis
<220>
<221> CDS 10 <222> (201)..(1199)
<400> 3
<210> 4
<211> 333
<212> PRT
<213> Bacillus subtilis
<400> 4
<210> 5
<211> 23
5 <212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220>
<223> Oligonucleótido IPCR1 10
<400> 5 gcttgtaaat tctatcataa ttg 23
<210> 6 15 <211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
<220> 20 <223> Oligonucleótido IPCR2
<400> 6 agggaatcat ttgaaggttg g 21
25 <210> 7
<211> 21
<212> ADN
<213> Secuencia artificial
- <220> <223> Oligonucleótido IPCR3
- 5
- <400> 7 gcatttaata ctagcgacgc c 21
- 10
- <210> 8 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Oligonucleótido mbl-A
- 15
- <400> 8 gctcactctagaccgaggtc aataccaata tcc 33
- 20
- <210> 9 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 25
- <220> <223> Oligonucleótido mbl-B <400> 9 gtgatgaagc gtcctatg 18
- 30
- <210> 10 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 35
- <220> <223> Oligonucleótido mbl-C
- <400> 10 ctgagcgaat tccgcaaact aagctgattt cac
- 33
- 40
- <210> 11 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 45
- <220> <223> Oligonucleótido mbl-D
- 50 55
- <400> 11 cctatatggc ctggaagac 19 <210> 12 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido mbl-fw
- 60
- <400> 12 ctcgaggatc cacctggcat tgccttcttg 30
- 65
- <210> 13 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Oligonucleótido mbl-rev
- 5
- <400> 13 catactgaat tccatgacac ctgtgcccga tg 32
- 10
- <210> 14 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Oligonucleótido yflE-A1
- 15
- <400> 14 ctagcagcat gcgttcgagc gaaacgatag 30
- 20
- <210> 15 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 25
- <220> <223> Oligonucleótido yflE_A2 <400> 15 gtacggtcta gagttcgagc gaaacgatag 30
- 30
- <210> 16 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 35
- <220> <223> Oligonucleótido yflE-B
- <400> 16 catcgtgatt ccggcactc
- 19
- 40
- <210> 17 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 45
- <220> <223> Oligonucleótido yflE-C1
- 50 55
- <400> 17 catctaggta ccgagaggtt gccctctcc <210> 18 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligonucleótido yflE_C2 29
- 60
- <400> 18 ctagctgaat tcgagaggtt gccctctcc 29
- 65
- <210> 19 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- <220> <223> Oligonucleótido yflE-D
- 5
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- 10
- <210> 20 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
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- 15
- <400> 20 gacagtggat cccactttct ccctcatacg 30
- 20
- <210> 21 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial
- 25
- <220> <223> Oligonucleótido yflErev <400> 21 catccagaat tcgcagctga ggaattgagg 30
Claims (12)
- REIVINDICACIONES1. Un método para identificar un inhibidor de LtaS que comprende:5 (a) proporcionar bacterias gram positivas en las que las bacterias comprenden una mutación en el gen mbl u homólogo del mismo que altera la función del gen mbl u homólogo del mismo;
- (b)
- cultivar las bacterias de (a) en presencia de una sustancia de ensayo en condiciones de magnesio menor de 3 mM;
- (c)
- supervisar el crecimiento de las bacterias;
10 en el que el crecimiento o crecimiento más rápido de las bacterias en comparación con crecimiento en ausencia de la sustancia de ensayo es indicativo de que la sustancia de ensayo es un inhibidor de LtaS. - 2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la mutación en el gen mbl comprende deleción de parte 15 de o todo el gen mbl.
-
- 3.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que se suprime el gen mbl completo.
-
- 4.
- Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las condiciones de magnesio bajo comprenden una
20 cantidad de magnesio tal que la bacteria crezca a menos del 10% de la velocidad de las bacterias que tienen la misma deleción de mbl cuando crecen en condiciones de Mg2+ 20 mM. - 5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las condiciones de magnesio bajo comprenden Mg2+menor de 1 mM. 25
- 6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que las bacterias se cultivan en medio no complementado con Mg2+ adicional.
- 7. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (c) comprende supervisar la densidad óptica del 30 cultivo para supervisar con respecto al crecimiento.
- 8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el método comprende cultivar una cepa de bacterias mutantes de mbl en presencia de Mg2+ alto, diluirla en medio de Mg2+ bajo y transferirla a un tubo de muestra, añadir una sustancia de ensayo y supervisar con respecto al crecimiento bacteriano supervisando la densidad óptica en el35 pocillo de muestra.
- 9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las bacterias se cultivan en una placa de agar que contiene medio Mg2+ bajo, se aplica puntualmente sustancia de ensayo en la placa y se detecta crecimiento bacteriano mediante inspección visual de la placa.
- 10. Un método de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se cultivan bacterias que comprenden el mutante de mbl en Mg2+ alto antes de dilución y proliferación en las placas de agar.
- 11. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la bacteria gram positiva es un bacilo. 45
- 12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en el que el bacilo es B. subtilis.
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB0822276D0 (en) | 2009-01-14 |
| EP2366028A1 (en) | 2011-09-21 |
| EP2366028B1 (en) | 2012-10-10 |
| US20110282028A1 (en) | 2011-11-17 |
| WO2010064021A1 (en) | 2010-06-10 |
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